BR112021002276A2 - proteínas de ligação a nkg2d, cd16 e um antígeno associado ao tumor - Google Patents

proteínas de ligação a nkg2d, cd16 e um antígeno associado ao tumor Download PDF

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Ann F. Cheung
Jinyan DU
Asya Grinberg
William Haney
Bradley M. LUNDE
Bianka Prinz
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Abstract

Proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D, CD16, e a um antígeno associado ao tumor selecionado de c-MET, KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL são descritas, bem como composições farmacêuticas e métodos terapêuticos úteis para o tratamento de câncer.

Description

“PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A NKG2D, CD16 E UM ANTÍGENO ASSOCIADO AO TUMOR”
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Este pedido reivindica o benefício e prioridade do Pedido de Patente Provisório dos EUA No 62/716.110, depositado em 8 de agosto de 2018, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002]O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 6 de agosto de 2019, é denominada DFY-061W0 ST25.txt e tem 342.008 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003]A invenção se refere às proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a NKG2D, CD16, e pelo menos um antígeno associado ao tumor.
ANTECEDENTES
[004]O câncer continua a ser um problema de saúde significativo, apesar dos esforços substanciais de pesquisa e avanços científicos relatados na literatura para tratar esta doença. Os cânceres do sangue e da medula óssea são tipos de câncer frequentemente diagnosticados, incluindo mielomas múltiplos, leucemia e linfomas.
As opções de tratamento atuais para estes cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecer difíceis de tratar com as opções terapêuticas existentes.
[005]As imunoterapias contra o câncer são desejáveis porque são altamente específicas e podem facilitar a destruição de células cancerosas usando o sistema imunológico do paciente. As proteínas de fusão, tais como engajadores de células T biespecíficas são imunoterapias contra o câncer descritas na literatura que se ligam às células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Os anticorpos que se ligam a certos antígenos associados ao tumor e a certas células imunológicas foram descritos na literatura. Ver, e.g., WO 2016/134371 e WO 2015/095412.
[006]As células matadoras naturais (NK) são um componente do sistema imunológico inato e constituem aproximadamente 15 % de linfócitos circulantes. As células NK se infiltram virtualmente em todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua capacidade de matar células tumorais eficazmente sem a necessidade de sensibilização prévia. As células NK ativadas matam células alvo por meios semelhantes às células T citotóxicas - i.e., através de grânulos citolíticos que contêm perforina e granzimas, bem como através de vias de receptor de morte. As células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias, tais como IFN-y e quimiocinas que promovem oi recrutamento de outros leucócitos ao tecido alvo.
[007]As células NK respondem a sinais através de uma variedade de receptores de ativação e inibitórios em sua superfície. Por exemplo, quando as células NK encontram autocélulas saudáveis, sua atividade é inibida através da ativação dos receptores semelhantes à imunoglobulina de células matadoras (KIRs).
Alternativamente, quando as células NK encontram células estranhas ou células cancerosas, elas são ativadas através de seus receptores de ativação (e.g., NKG2D, NCRs, DNAM1). As células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas através dos receptores CD16 em sua superfície. A sensibilidade geral de células NK à ativação depende da soma de sinais estimuladores e inibitórios. NKG2D é uma proteína transmembrana do tipo II que é expressada essencialmente por todas as células matadoras naturais onde NKG2D serve como um receptor de ativação. NKG2D também pode ser encontrado em células T, onde atua como um receptor coestimulador. A capacidade de modular a função da célula NK através de NKG2D é útil em vários contextos terapêuticos incluindo malignidade.
SUMÁRIO
[008]A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Tais proteínas podem envolver mais de um tipo de receptor de ativação de NK, e podem bloquear a ligação de ligantes naturais a NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em seres humanos. Em algumas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em seres humanos e em outra espécie, tal como roedores e macacos cynomolgus. Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em detalhes abaixo.
[009]Consequentemente, um aspecto da invenção fornece uma proteína que incorpora um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL; e um domínio Fc de anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.
[010]Os sítios de ligação ao antígeno podem incorporar um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (e.g., arranjados como em um anticorpo, ou fundidos a partir de um scFv), ou um ou mais dos sítios de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, tal como um anticorpo VHH como um anticorpo de camelídeo ou um anticorpo VNAR como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos.
[011]Em um aspecto, a presente invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas, que incluem um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D, um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, um domínio Fc de anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16, e um sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor como o segundo sítio associado ao tumor (e.g., um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL).
[012]A presente invenção fornece uma proteína em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um fragmento variável de cadeia única (scFv), e o segundo e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL é um fragmento Fab. A presente divulgação também fornece uma proteína em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um scFv, e o segundo e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL é um scFv.
[013]A presente invenção fornece uma proteína em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um fragmento Fab, e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL é um scFv.
[014]A presente invenção fornece uma proteína em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um scFv, e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3,
IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c- MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL é um fragmento Fab.
[015]Os sítios de ligação ao antígeno podem incorporar um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (e.g., arranjados como em um anticorpo, ou fundidos a partir de um scFv), ou um ou mais dos sítios de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, tal como um anticorpo VHH como um anticorpo de camelídeo ou um anticorpo VNAR como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos.
[016]Em um aspecto, a presente invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c- MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. O primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incluir um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 93.
[017]O primeiro sítio de ligação ao antígeno, que se liga a NKG2D, em algumas modalidades pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1, tal como por ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 1, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 105), CDR2 (SEQ ID NO: 106) e CDR3 (SEQ ID NO: 107) de SEQ ID NO: 1. O domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1 pode ser acoplado com uma variedade de domínios variáveis de cadeia leve para formar um sítio de ligação a NKG2D. Por exemplo, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que incorpora um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ
ID NO: 1 pode incorporar ainda um domínio variável de cadeia leve selecionado de qualquer uma das sequências relacionadas à SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40. Por exemplo, o primeiro sítio de ligação ao antígeno incorpora um domínio variável de cadeia pesada com sequências de aminoácidos pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 1 e um domínio variável de cadeia leve com sequências de aminoácidos pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas a qualquer uma das sequências selecionadas de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40.
[018]Alternativamente, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 42. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 41, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 43 ou 431), CDR2 (SEQ ID NO: 44) e CDR3 (SEQ ID NO: 45 ou 432) de SEQ ID NO: 41. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 42, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 46), CDR2 (SEQ ID NO: 47) e CDR3 (SEQ ID NO: 48) de SEQ ID NO: 42.
[019]Em outras modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 49 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 50.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 49, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 51 ou 433), CDR2 (SEQ ID NO: 52) e CDR3 (SEQ ID NO: 53 ou 434) de SEQ ID NO: 49. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 50, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 55) e CDR3 (SEQ ID NO: 56) de SEQ ID NO: 50.
[020]Alternativamente, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 57 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 58, tal como por ter sequências de aminoácidos pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 57 e pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 58, respectivamente.
[021]Em uma outra modalidade, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 59 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 60, Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 59, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 134), CDR2 (SEQ ID NO: 135) e CDR3 (SEQ ID NO: 136) de SEQ ID NO: 59. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 60, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 137), CDR2 (SEQ ID NO: 138) e CDR3 (SEQ ID NO: 139) de SEQ ID NO: 60.
[022]O primeiro sítio de ligação ao antígeno, que se liga a NKG2D, em algumas modalidades pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 61 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 62. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 61, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 63 ou 435), CDR2 (SEQ ID NO: 64) e CDR3 (SEQ ID NO: 65 ou 436) de SEQ ID NO: 61.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 62, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 66), CDR2 (SEQ ID NO: 67) e CDR3 (SEQ ID NO: 68) de SEQ ID NO: 62.
[023]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 70.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 69, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 71 ou 437), CDR2 (SEQ ID NO: 72) e CDR3 (SEQ ID NO: 73 ou 408) de SEQ ID NO: 69. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 70, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 74), CDR2 (SEQ ID NO: 75) e CDR3
(SEQ ID NO: 76) de SEQ ID NO: 70.
[024]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 78.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 77, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 79 ou 409), CDR2 (SEQ ID NO: 80) e CDR3 (SEQ ID NO: 81 ou 411) de SEQ ID NO: 77. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 78, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83) e CDR3 (SEQ ID NO: 84) de SEQ ID NO: 78.
[025]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 85, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 89 ou 412) de SEQ ID NO: 85. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[026]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 93 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 94.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 93, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 95 ou 421), CDR2 (SEQ ID NO: 96) e CDR3 (SEQ ID NO: 97 ou 422) de SEQ ID NO: 93. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 94, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 98), CDR2 (SEQ ID NO: 99) e CDR3 (SEQ ID NO: 100) de SEQ ID NO: 94.
[027]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 101 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 102, tal como por ter sequências de aminoácidos pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 101 e pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 102, respectivamente.
[028]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 103 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 104, tal como por ter sequências de aminoácidos pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 103 e pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 104, respectivamente.
[029]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 388 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 388, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 389 ou 390) de SEQ ID NO: 388. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[030]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 391 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 391, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 392 ou 393) de SEQ ID NO: 391. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[031]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 394 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 394, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 395 ou 396) de SEQ ID NO: 394. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[032]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 397 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 397, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 398 ou 399) de SEQ ID NO: 397. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[033]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 400 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 400, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 401 ou 402) de SEQ ID NO: 400. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[034]Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 403 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 403, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou 387), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 404 ou 405) de SEQ ID NO: 403. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) de SEQ ID NO: 86.
[035]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a KIT pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 109 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 113.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 109, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 110), CDR2 (SEQ ID NO: 111) e CDR3 (SEQ ID NO: 112) de SEQ ID NO: 109.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 113, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 114), CDR2 (SEQ ID NO: 115) e CDR3 (SEQ ID NO: 116) de SEQ ID NO: 113.
[036]Alternativamente, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a KIT pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 117 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 121. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 117, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 118), CDR2 (SEQ ID NO: 119) e CDR3 (SEQ ID NO: 120) de SEQ ID NO: 117. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 121, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) e CDR3 (SEQ ID NO: 124) de SEQ ID NO: 121.
[037]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a F3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 126 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 130. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 126, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 127), CDR2 (SEQ ID NO: 128) e CDR3 (SEQ ID NO: 129) de SEQ ID NO: 126. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 130, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 131), CDR2 (SEQ ID NO: 132) e CDR3 (SEQ ID NO: 133) de SEQ ID NO: 130.
[038]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a F3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 140 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 144. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 140, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 141), CDR2 (SEQ ID NO: 142) e CDR3 (SEQ ID NO: 143) de SEQ ID NO: 140. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 144, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 145), CDR2 (SEQ ID NO: 146) e CDR3 (SEQ ID NO: 147) de SEQ ID NO: 144.
[039]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a IGF1R pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 149 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 153.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96
%, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 149, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 150), CDR2 (SEQ ID NO: 151) e CDR3 (SEQ ID NO: 152) de SEQ ID NO: 149.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 153, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 154), CDR2 (SEQ ID NO: 155) e CDR3 (SEQ ID NO: 156) de SEQ ID NO: 153.
[040]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a IGF1R pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 157 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 161.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 157, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 158), CDR2 (SEQ ID NO: 159) e CDR3 (SEQ ID NO: 160) de SEQ ID NO: 157.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 161, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 162), CDR2 (SEQ ID NO: 163) e CDR3 (SEQ ID NO: 164) de SEQ ID NO: 161.
[041]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a Lewis Y pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 166 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
170. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 166, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 167), CDR2 (SEQ ID NO: 168) e CDR3 (SEQ ID NO: 169) de SEQ ID NO: 166.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 170, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 171), CDR2 (SEQ ID NO: 172) e CDR3 (SEQ ID NO: 173) de SEQ ID NO: 170.
[042]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a Lewis Y pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 174 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
178. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 174, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 175), CDR2 (SEQ ID NO: 176) e CDR3 (SEQ ID NO: 177) de SEQ ID NO: 174.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 178, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 179), CDR2 (SEQ ID NO: 180) e CDR3 (SEQ ID NO: 181) de SEQ ID NO: 178.
[043]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a MUC13 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 182 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
186. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 182, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 183),
CDR2 (SEQ ID NO: 184) e CDR3 (SEQ ID NO: 185) de SEQ ID NO: 182.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 186, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 187), CDR2 (SEQ ID NO: 188) e CDR3 (SEQ ID NO: 189) de SEQ ID NO: 186.
[044]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a uma porção de MUC4 (SEQ ID NO: 191).
[045]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a MCAM pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 192 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 196.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 192, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 193), CDR2 (SEQ ID NO: 194) e CDR3 (SEQ ID NO: 195) de SEQ ID NO: 192.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 196, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 197), CDR2 (SEQ ID NO: 198) e CDR3 (SEQ ID NO: 199) de SEQ ID NO: 196.
[046]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a MCAM pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 200 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 204.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 200, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 201), CDR2 (SEQ ID NO: 202) e CDR3 (SEQ ID NO: 203) de SEQ ID NO: 200.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 204, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 205), CDR2 (SEQ ID NO: 206) e CDR3 (SEQ ID NO: 207) de SEQ ID NO: 204.
[047]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a LRRC32 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
213. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 209, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 210), CDR2 (SEQ ID NO: 211) e CDR3 (SEQ ID NO: 212) de SEQ ID NO: 209.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 213, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 214), CDR2 (SEQ ID NO: 215) e CDR3 (SEQ ID NO: 216) de SEQ ID NO: 213.
[048]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a LRRC32 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
221. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 217, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 218),
CDR2 (SEQ ID NO: 219) e CDR3 (SEQ ID NO: 220) de SEQ ID NO: 217.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 221, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 222), CDR2 (SEQ ID NO: 223) e CDR3 (SEQ ID NO: 224) de SEQ ID NO: 221.
[049]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a sialil-Tn pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 226 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
230. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 226, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 227), CDR2 (SEQ ID NO: 228) e CDR3 (SEQ ID NO: 229) de SEQ ID NO: 226.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 230, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 231), CDR2 (SEQ ID NO: 232) e CDR3 (SEQ ID NO: 233) de SEQ ID NO: 230.
[050]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a sialil-Tn pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 234 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
238. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 234, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 235), CDR2 (SEQ ID NO: 236) e CDR3 (SEQ ID NO: 237) de SEQ ID NO: 234.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 238, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 239), CDR2 (SEQ ID NO: 240) e CDR3 (SEQ ID NO: 241) de SEQ ID NO: 238.
[051]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a gpA33 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 242 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 246.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 242, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 243), CDR2 (SEQ ID NO: 244) e CDR3 (SEQ ID NO: 245) de SEQ ID NO: 242.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 246 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 247), CDR2 (SEQ ID NO: 248) e CDR3 (SEQ ID NO: 249) de SEQ ID NO: 246.
[052]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a gpA33 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 250 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 254.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 250, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 251), CDR2 (SEQ ID NO: 252) e CDR3 (SEQ ID NO: 253) de SEQ ID NO: 250.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 254 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 255), CDR2 (SEQ ID NO: 256) e CDR3 (SEQ ID NO: 257) de SEQ ID NO: 254.
[053]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a GD3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 259 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 263.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 259, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 260), CDR2 (SEQ ID NO: 261) e CDR3 (SEQ ID NO: 262) de SEQ ID NO: 259.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 263 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 264), CDR2 (SEQ ID NO: 265) e CDR3 (SEQ ID NO: 266) de SEQ ID NO: 263.
[054]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a GD3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 267 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 271.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 267, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 268), CDR2 (SEQ ID NO: 269) e CDR3 (SEQ ID NO: 270) de SEQ ID NO: 267.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96
%, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 271 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 272), CDR2 (SEQ ID NO: 273) e CDR3 (SEQ ID NO: 274) de SEQ ID NO: 271.
[055]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a GM2 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 275 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 279.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 275, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 276), CDR2 (SEQ ID NO: 277) e CDR3 (SEQ ID NO: 278) de SEQ ID NO: 275.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 279 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 280), CDR2 (SEQ ID NO: 281) e CDR3 (SEQ ID NO: 282) de SEQ ID NO: 279.
[056]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a GM2 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 283 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 287.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 283, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 284), CDR2 (SEQ ID NO: 285) e CDR3 (SEQ ID NO: 286) de SEQ ID NO: 283.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 287 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 288), CDR2 (SEQ ID NO: 289) e CDR3 (SEQ ID NO: 290) de SEQ ID NO: 287.
[057]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a c-MET pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 291 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 295.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 291, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 292), CDR2 (SEQ ID NO: 293 ou 406) e CDR3 (SEQ ID NO: 294) de SEQ ID NO: 291.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 295 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 296), CDR2 (SEQ ID NO: 297 ou 407) e CDR3 (SEQ ID NO: 298) de SEQ ID NO: 295.
[058]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a c-MET pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 299 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 303.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 299, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 300), CDR2 (SEQ ID NO: 301) e CDR3 (SEQ ID NO: 302) de SEQ ID NO: 299.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 303 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 304 ou 410), CDR2
(SEQ ID NO: 305) e CDR3 (SEQ ID NO: 306) de SEQ ID NO: 303.
[059]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a c-MET pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 413 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 417.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 413, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 414), CDR2 (SEQ ID NO: 415) e CDR3 (SEQ ID NO: 416) de SEQ ID NO: 413.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 417 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 418), CDR2 (SEQ ID NO: 419) e CDR3 (SEQ ID NO: 420) de SEQ ID NO: 417.
[060]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a EPHA3 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 308 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
312. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 308, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 309), CDR2 (SEQ ID NO: 310) e CDR3 (SEQ ID NO: 311) de SEQ ID NO: 308.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 312 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 313), CDR2 (SEQ ID NO: 314) e CDR3 (SEQ ID NO: 315) de SEQ ID NO: 312.
[061]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a TNFRSF10 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 317 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 321. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 317, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 318), CDR2 (SEQ ID NO: 319) e CDR3 (SEQ ID NO: 320) de SEQ ID NO: 317.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 321 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 322), CDR2 (SEQ ID NO: 323) e CDR3 (SEQ ID NO: 324) de SEQ ID NO: 321.
[062]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a TNFRSF10 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 325 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 329. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 325, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 326), CDR2 (SEQ ID NO: 327) e CDR3 (SEQ ID NO: 328) de SEQ ID NO: 325.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 329 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 330), CDR2 (SEQ ID NO: 331) e CDR3 (SEQ ID NO: 332) de SEQ ID NO: 329.
[063]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a TNFSF11 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 334 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
338. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 334, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 335), CDR2 (SEQ ID NO: 336) e CDR3 (SEQ ID NO: 337) de SEQ ID NO: 334.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 338 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 339), CDR2 (SEQ ID NO: 340) e CDR3 (SEQ ID NO: 341) de SEQ ID NO: 338.
[064]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a TNFSF11 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 342 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO:
346. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 342, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 343), CDR2 (SEQ ID NO: 344) e CDR3 (SEQ ID NO: 345) de SEQ ID NO: 342.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 346 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 347), CDR2 (SEQ ID NO: 348) e CDR3 (SEQ ID NO: 349) de SEQ ID NO: 346.
[065]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD74 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à
SEQ ID NO: 351 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 355.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 351, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 352), CDR2 (SEQ ID NO: 353) e CDR3 (SEQ ID NO: 354) de SEQ ID NO: 351.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 355 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 356), CDR2 (SEQ ID NO: 357) e CDR3 (SEQ ID NO: 358) de SEQ ID NO: 355.
[066]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD74 pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 359 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 363.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 359, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 360), CDR2 (SEQ ID NO: 361) e CDR3 (SEQ ID NO: 362) de SEQ ID NO: 359.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 363 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 364), CDR2 (SEQ ID NO: 365) e CDR3 (SEQ ID NO: 366) de SEQ ID NO: 363.
[067]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a PMEL pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 369 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 373.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 369, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 370), CDR2 (SEQ ID NO: 371) e CDR3 (SEQ ID NO: 372) de SEQ ID NO: 369.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 373 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 374), CDR2 (SEQ ID NO: 375) e CDR3 (SEQ ID NO: 376) de SEQ ID NO: 373.
[068]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a PMEL pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 377 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 381.
Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 377, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 378), CDR2 (SEQ ID NO: 379) e CDR3 (SEQ ID NO: 380) de SEQ ID NO: 377.
Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser pelo menos 90 % (e.g., 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 381 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 382), CDR2 (SEQ ID NO: 383) e CDR3 (SEQ ID NO: 384) de SEQ ID NO: 381.
[069]Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno incorpora um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve presente no primeiro sítio de ligação ao antígeno.
[070]Em algumas modalidades, a proteína incorpora uma porção de um domínio Fc de anticorpo (por exemplo, uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para se ligar a CD16), em que o domínio Fc de anticorpo compreende uma dobradiça e um domínio CH2 (por exemplo, uma dobradiça e um domínio CH2 de um anticorpo IgG1 humano), e/ou sequências de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à sequência de aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG humano. Mutações podem ser introduzidas no domínio constante de anticorpo para permitir a heterodimerização com um outro domínio constante de anticorpo. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio Fc de anticorpo inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica ao domínio Fc de anticorpo de IgG1 humana e difere por uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439. Em algumas modalidades, o domínio Fc de anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano, e difere por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
[071]Formulações contendo qualquer uma das proteínas aqui descritas; células contendo um ou mais ácidos nucleicos que expressam as proteínas, e métodos de intensificar morte celular tumoral usando as proteínas também são fornecidos.
[072]Um outro aspecto da invenção fornece um método de tratar câncer em um paciente. O método compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas de ligação multiespecíficas aqui descritas. Cânceres exemplares a serem tratados usando as proteínas de ligação multiespecíficas incluem leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia de células T, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia de células pilosas.
[073]Em um aspecto, uma proteína da presente invenção inclui um fragmento variável de cadeia única (scFv) que é ligado a um domínio constante de anticorpo através de uma sequência de dobradiças. Em algumas modalidades, a dobradiça compreende aminoácidos Ala-Ser. Em algumas outras modalidades, a dobradiça compreende aminoácidos Ala-Ser e Thr-Lys-Gly. O scFv pode incluir um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o scFv se liga a NKG2D ou um antígeno associado ao tumor. A sequência de dobradiças fornece flexibilidade de ligação a um antígeno alvo, por exemplo, um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
[074]Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável de cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável de cadeia leve. Por exemplo, uma ponte dissulfeto pode ser formada entre o resíduo C44 do domínio variável de cadeia pesada e o resíduo C100 do domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada é ligado ao domínio variável de cadeia leve através de um conector flexível, tal como um conector de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (“(G4S)4”) (SEQ ID NO: 386). Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é posicionado no terminal N do domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é posicionado no terminal C do domínio variável de cadeia leve.
[075]Em algumas modalidades, o domínio constante de anticorpo ligado ao scFv ou ao fragmento Fab é capaz de se ligara a CD16. Em algumas modalidades, o domínio constante de anticorpo compreende um domínio CH2 e um domínio CH3 de um anticorpo IgG, por exemplo, um anticorpo IgGl humano. Em algumas modalidades, o domínio constante de anticorpo compreende uma dobradiça e um domínio CH2 e/ou sequências de aminoácidos pelo menos 90 % idênticas à sequência de aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG humano. Em algumas modalidades, mutações são introduzidas no domínio constante de anticorpo para permitir a heterodimerização com um outro domínio constante de anticorpo. Por exemplo, se o domínio constante de anticorpo é derivado do domínio constante de uma IgGl humana, o domínio constante de anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgGl humano, e difere por uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439. Em algumas modalidades, o domínio constante de anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgGl humano, e difere por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y4071, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
[076]Em algumas modalidades, uma proteína da presente invenção inclui: um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado do grupo que consiste em KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, e um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16. Em algumas modalidades, a proteína inclui um sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor como o segundo sítio de ligação ao antígeno (e.g., um antígeno associado ao tumor selecionado do grupo que consiste em KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL). Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um fragmento variável de cadeia única (scFv), e o segundo e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor é um fragmento Fab. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um scFv, e o segundo e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor é um scFv. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um fragmento Fab, e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor é um scFv.
[077]Em algumas modalidades de uma proteína aqui descrita, o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D em seres humanos.
[078]Em algumas modalidades, o primeiro, o segundo, e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional inclui um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, dentro do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é posicionado no terminal N ou no terminal C do domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o scFv é ligado a um domínio constante de anticorpo ou uma porção de um domínio constante de anticorpo que é suficiente para se ligar a CD16, através de uma dobradiça compreendendo Ala-Ser, onde o scFv inclui um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, dentro do scFv, a dobradiça inclui ainda uma sequência de aminoácidos Thr-Lys-Gly.
[079]Em algumas modalidades da proteína, o domínio variável de cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, a ponte dissulfeto é formada entre C44 a partir do domínio variável de cadeia pesada e C100 a partir do domínio variável de cadeia leve.
[080]Em algumas modalidades, dentro do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é ligado ao domínio variável de cadeia leve através de um conector flexível.
Em algumas modalidades, dentro do scFv, o conector flexível compreende (G4S)4.
[081]Em um outro aspecto, é fornecida aqui uma formulação que inclui uma proteína aqui descrita e um portador farmaceuticamente aceitável.
[082]Ainda em um outro aspecto, é aqui fornecida uma célula que inclui um ou mais ácidos nucleicos que expressam uma proteína aqui descrita.
[083]Em um outro aspecto, a divulgação fornece um método de intensificar morte celular tumoral expondo-se uma célula tumoral e uma célula matadora natural a uma quantidade eficaz de uma proteína aqui descrita, onde a célula tumoral expressa um antígeno associado ao tumor selecionado do grupo que consiste em KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
[084]Também é aqui fornecido um método de tratar câncer administrando-se uma quantidade eficaz de uma proteína ou uma formulação aqui descrita a um paciente. Por exemplo, a divulgação fornece um método de tratar câncer administrando-se uma quantidade eficaz de uma proteína ou uma formulação que inclui tal uma proteína a um paciente, onde a proteína inclui um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis
Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL; e um domínio Fc de anticorpo (ou uma porção de um domínio Fc de anticorpo) suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a KIT, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, tumor estromal gastrointestinal, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado e câncer testicular. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a F3, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, sarcomas e câncer colorretal. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a IGF1R, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer de próstata, sarcoma, câncer da tireoide, câncer renal, câncer colorretal, câncer pancreático, gliobastoma e câncer de fígado.
Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a Lewis Y, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo e leucemia mieloide aguda. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a MUC13, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal, câncer cervical e colangiocarcinoma. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a MUC4, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, leucemia linfoblástica aguda, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata.
Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a MCAM, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas, sarcoma, câncer colorretal, câncer pancreático e câncer renal. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a LRRC32, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer renal, câncer pancreático, sarcoma, câncer ovariano, câncer de pulmão, gliobastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de mama e câncer cervical. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a sialil-Tn, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de mama. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a gpA33, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer gástrico e câncer esofágico. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a GD3, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, glioma, câncer de mama, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático e neuroblastoma. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a GM2, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, câncer cervical, neuroblastoma, melanoma, câncer de pulmão, mesotelioma e câncer de fígado. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a c- MET, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer renal, câncer da tireoide, melanoma, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer colorretal e câncer de cabeça e pescoço. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a EPHA3, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão e sarcoma. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a TNFRSF10A, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a TNFSF11, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de próstata e um câncer ósseo metastático. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a CD74, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer difuso de grandes células B, uma malignidade de células B, câncer renal, câncer de pulmão, câncer ovariano, melanoma, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de bexiga, glioma, câncer de mama e leucemia. Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a PMEL, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em melanoma e um sarcoma.
[085]Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína que contém o scFv ligado a uma região constante de anticorpo descrita acima ou o fragmento Fab ligado a uma região constante de anticorpo descrita acima. Em algumas modalidades, a proteína inclui um primeiro sítio de ligação ao antígeno, que compreende o scFv ligado a um domínio constante de anticorpo ou o fragmento Fab ligado a um domínio constante de anticorpo; um segundo sítio de ligação ao antígeno que pode ter o fragmento Fab ou o formato scFv descrito aqui; e um segundo domínio constante de anticorpo ligado ao segundo sítio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a proteína é multiespecífica, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D, o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor (por exemplo, um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL), e as regiões constantes de anticorpo se ligam a CD16.
[086]Em algumas modalidades, a proteína é multiespecífica, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL; o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D; e as regiões constantes de anticorpo se ligam a CD16. A região constante de anticorpo ligado ao scFv ou ao fragmento Fab pode heterodimerizar com uma segunda região constante de anticorpo.
As proteínas de ligação multiespecíficas nestas modalidades se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e a um antígeno associado ao tumor (por exemplo, um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL) em células cancerosas. Tais proteínas podem envolver mais de um tipo de receptor de ativação de NK, e podem bloquear a ligação de ligantes naturais a NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em seres humanos. Em algumas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em seres humanos, e/ou em outra espécie, tal como roedores e/ou macacos cynomolgus.
[087]Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação multiespecífica, e a proteína contém um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3,
TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor como o primeiro sítio de ligação ao antígeno; um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; e uma região constante de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um quarto sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16. Qualquer um dos sítios de ligação ao antígeno pode ter a forma de um fragmento nFab ou um scFv, tal como descrito acima. A proteína multiespecífica aqui fornecida fornece engajamento bivalente de antígeno associado ao tumor, estabilizando assim o antígeno associado ao tumor na superfície de célula cancerosa, e realça citotoxicidade para as células cancerosas pelas células NK.
[088]Em algumas modalidades, o engajamento bivalente de antígenos associados ao tumor pelas proteínas multiespecíficas aqui descritas conferem uma ligação mais forte das proteínas multiespecíficas às células cancerosas, facilitando assim uma resposta citotóxica mais forte de células NK para as células cancerosas, especialmente, para as células cancerosas que expressam um baixo nível de um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
[089]O sítio de ligação de antígeno associado ao tumor descrito acima pode ser um sítio que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c- MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
[090]As formulações contendo qualquer uma das proteínas aqui descritas; células contendo um ou mais ácidos nucleicos que expressam as proteínas, e métodos de intensificar morte celular tumoral usando as proteínas também são fornecidos.
[091]Um outro aspecto da invenção fornece um método de tratar câncer em um paciente. O método compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas multiespecíficas aqui descritas. Os cânceres a serem tratados podem incluir leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica aguda, linfoma de células B, uma malignidade de células B, câncer de bexiga, um câncer ósseo metastático, câncer de mama, câncer cervical, colangiocarcinoma, câncer colorretal, linfoma difuso de grandes células B, câncer esofágico, sarcoma de Ewing, linfoma folicular, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal, glioblastoma, glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neuroblastoma, câncer renal, carcinoma de células renais, neuroblastoma, câncer de pulmão de células não pequenas, tumor neuroendócrino, câncer ovariano e câncer pancreático, câncer de próstata, sarcomas, câncer de pulmão de células pequenas, linfoma de células T, câncer de testículo, carcinoma tímico, câncer da tireoide, câncer urotelial, câncer uterino, cânceres infiltrados por células supressoras derivadas de mieloide, cânceres infiltrados por células T reguladoras, cânceres com deposição de matriz extracelular, cânceres com altos níveis de estroma reativo e cânceres com neoangiogênese.
[092]Um outro aspecto da invenção fornece um método de tratar câncer em um paciente. O método compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas de ligação multiespecíficas aqui descritas. Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam KIT incluem qualquer câncer que expressa KIT, por exemplo, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, tumor estromal gastrointestinal, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado e câncer testicular. Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam F3 incluem qualquer câncer que expressa F3, por exemplo, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão,
câncer pancreático, câncer de próstata, sarcoma e câncer colorretal.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam IGF1R incluem qualquer câncer que expressa IGF1R, por exemplo, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma,
câncer ovariano, câncer de próstata, sarcoma, câncer da tireoide, câncer renal, câncer colorretal, câncer pancreático, gliobastoma e câncer de fígado.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam Lewis Y incluem qualquer câncer que expressa Lewis Y, por exemplo, câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo e leucemia mieloide aguda.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam MUC13 incluem qualquer câncer que expressa MUC13, por exemplo, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal,
câncer cervical e colangiocarcinoma.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam MUC4 incluem qualquer câncer que expressa
MUC4, por exemplo, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, leucemia linfoblástica aguda, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam MCAM incluem qualquer câncer que expressa MCAM, por exemplo, melanoma, câncer de mama,
câncer de pulmão de células pequenas, sarcoma, câncer colorretal, câncer pancreático e câncer renal.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam LRRC32 incluem qualquer câncer que expressa
LRRC32, por exemplo, câncer renal, câncer pancreático, sarcoma, câncer ovariano,
câncer de pulmão, gliobastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata,
câncer de fígado, câncer de mama e câncer cervical.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam sialil-Tn incluem qualquer câncer que expressa sialil-Tn, por exemplo, câncer ovariano, câncer pancreático,
câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de mama.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam gpA33 incluem qualquer câncer que expressa gpA33, por exemplo, câncer colorretal, câncer gástrico e câncer esofágico.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam GD3 incluem qualquer câncer que expressa GD3, por exemplo, câncer de pulmão, glioma, câncer de mama, melanoma,
câncer ovariano, câncer pancreático e neuroblastoma.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam GM2 incluem qualquer câncer que expressa GM2, por exemplo, câncer gástrico, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, câncer cervical, neuroblastoma, melanoma, câncer de pulmão, mesotelioma e câncer de fígado.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam c-MET incluem qualquer câncer que expressa c-MET, por exemplo, câncer renal, câncer da tireoide, melanoma, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer colorretal ou câncer de cabeça e pescoço.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam EPHA3 incluem qualquer câncer que expressa EPHA3,
por exemplo, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão e sarcoma.
Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam TNFRSF10A incluem qualquer câncer que expressa TNFRSF10A, por exemplo, câncer de mama,
câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço.
Cânceres a serem tratados usando TNFSF11-proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam incluem qualquer câncer que expressa
TNFSF11, por exemplo, câncer de mama, câncer de próstata e um câncer ósseo metastático. Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam CD74 incluem qualquer câncer que expressa CD74, por exemplo, câncer difuso de grandes células B, uma malignidade de células B, câncer renal, câncer de pulmão, câncer ovariano, melanoma, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de bexiga, glioma, câncer de mama e leucemia. Cânceres a serem tratados usando proteínas de ligação multiespecíficas que alvejam PMEL incluem qualquer câncer que expressa PMEL, por exemplo, melanoma e sarcoma.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[093]A FIG. 1 é uma representação de um anticorpo multiespecífico heterodimérico, e.g., uma proteína de ligação triespecífica (TriNKET). Cada braço pode representar o domínio de ligação a NKG2D ou o domínio de ligação correspondente a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Em algumas modalidades, os domínios de ligação a NKG2D e ao antígeno associado ao tumor podem compartilhar uma cadeia leve comum.
[094]As FIGs. 2A a 2E ilustram cinco formatos exemplificativos de uma proteína de ligação multiespecífica, e.g., uma proteína de ligação triespecífica (TriNKET). Como mostrado na FIG. 2A, o domínio de ligação a NKG2D ou domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor pode assumir o formato scFv (braço esquerdo). Um anticorpo que contém um scFv que alveja NKG2D, um fragmento Fab que alveja o antígeno associado ao tumor e uma região constante do anticorpo heterodimerizado é referido aqui como o F3-TriNKET. Um anticorpo que contém um scFv que alveja o antígeno associado ao tumor, um fragmento Fab que alveja NKG2D e uma região constante do anticorpo heterodimerizado/domínio que se liga a CD16 é referido aqui como o F3’-TriNKET (FIG. 2E). Como mostrado na FIG. 2B, o domínio de ligação a NKG2D e domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor podem assumir o formato scFv. As FIGs. 2C a 2D são ilustrações de um anticorpo com três sítios de ligação ao antígeno, incluindo dois sítios de ligação ao antígeno que se ligam a um antígeno associado ao tumor, e o sítio de ligação a NKG2D fundido à região constante do anticorpo heterodimerizado. Esses formatos de anticorpo são referidos aqui como F4-TriNKET. A FIG. 2C ilustra que os dois sítios de ligação ao antígeno associados ao tumor estão no formato de fragmento Fab, e o sítio de ligação a NKG2D no formato scFv. A FIG. 2D ilustra que os sítios de ligação ao antígeno associados ao tumor no formato scFv e o sítio de ligação a NKG2D no formato scFv. A FIG. 2E representa um anticorpo triespecífico (TriNKET) que contém um scFv que alveja o tumor, um fragmento Fab que alveja NKG2D e uma região constante do anticorpo heterodimerizado/domínio (“CD domínio”) que se liga a CD16. O formato do anticorpo é referido aqui como F3’-TriNKET. Em certas proteínas de ligação multiespecíficas exemplificativas, as mutações de heterodimerização na região constante de anticorpo incluem K360E e K409W em um domínio constante; e Q347R, D399V e F405T no domínio constante oposto (mostrado como uma forma triangular de fechadura e chave nos domínios CD). A barra em negrito entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada dos fragmentos Fab representa uma ligação dissulfeto.
[095]A FIG. 3 são gráficos de linha que demonstram a afinidade de ligação dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D recombinante humano em um ensaio ELISA.
[096]A FIG. 4 são gráficos de linha que demonstram a afinidade de ligação dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D recombinante de cynomolgus em um ensaio ELISA.
[097]A FIG. 5 são gráficos de linha que demonstram a afinidade de ligação dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D recombinante de camundongo em um ensaio ELISA.
[098]A FIG. 6 são gráficos de barras que demonstram a ligação dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) às células EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo mostrando a intensidade de fluorescência média (MFI) multiplicada pela anterior (FOB).
[099]A FIG. 7 são gráficos de barras que demonstram a ligação dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) às células EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo mostrando a intensidade de fluorescência média (MFI) multiplicada pela anterior (FOB).
[0100]A FIG. 8 são gráficos de linha que demonstram a afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) para o NKG2D- Fc recombinante humano por competição com o ligante natural ULBP-6.
[0101]A FIG. 9 são gráficos de linha que demonstram a afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) para o NKG2D- Fc recombinante humano por competição com o ligante natural MICA.
[0102]A FIG. 10 são gráficos de linha que demonstram a afinidade de ligação específica de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) para o NKG2D-Fc recombinante de camundongo por competição com o ligante natural Rae-1 delta.
[0103]A FIG. 11 são gráficos de barras mostrando a ativação de NKG2D humano por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) quantificando-se a porcentagem de células positivas para TNF-a, que expressam proteínas de fusão NKG2D-CD3 zeta humanas.
[0104]A FIG. 12 são gráficos de barras mostrando a ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) quantificando- se a porcentagem de células positivas para TNF-a, que expressam proteínas de fusão NKG2D-CD3 zeta de camundongo.
[0105]A FIG. 13 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK humanas por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0106]A FIG. 14 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK humanas por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0107]A FIG. 15 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0108]A FIG. 16 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0109]A FIG. 17 são gráficos de barras mostrando o efeito citotóxico de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) em células tumorais.
[0110]A FIG. 18 são gráficos de barras mostrando a temperatura de fusão de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) medida por fluorimetria de varredura diferencial.
[0111]As FIGs. 19A a 19C são gráficos de barras da ativação sinergística de células NK usando CD16 e ligação a NKG2D. A FIG. 19A demonstra níveis de CD107a; a FIG. 19B demonstra níveis de IFN-y; a FIG. 19C demonstra níveis de CD107a e IFN-y. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± SD. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes.
[0112]A FIG. 20 é uma representação de um TriNKET na forma Triomab, que é um anticorpo biespecífico trifuncional que mantém uma forma semelhante a IgG.
Esta quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada uma com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que se originam de dois anticorpos parentais. A forma Triomab pode ser um construto heterodimérico contendo 1/2 de anticorpo de rato e 1/2 de anticorpo de camundongo.
[0113]A FIG. 21 é uma representação de um TriNKET na forma de Cadeia leve Comum KiH, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). KiH é um heterodímero contendo 2 fragmentos Fab de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. TriNKET no formato KiH pode ser um construto heterodimérico com 2 fragmentos Fab de ligação ao alvo 1 e alvo 2, contendo duas diferentes cadeias pesadas e uma cadeia leve comum que emparelha com ambas as cadeias pesadas.
[0114]A FIG. 22 é uma representação de um TriNKET na forma de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-IgTM), que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de conectores flexíveis que ocorrem naturalmente, e produz uma molécula semelhante a IgG tetravalente. DVD- IgTM é um construto homodimérico onde o domínio variável que alveja o antígeno 2 é fundido ao terminal N de um domínio variável do fragmento Fab que alveja o antígeno 1. A forma DVD-IgTM contém Fc normal.
[0115]A FIG. 23 é uma representação de um TriNKET na forma de interface de fragmento Fab Ortogonal (Fab-Orto), que é um construto heterodimérico que contém 2 fragmentos Fab de ligação ao alvo 1 e alvo 2 fundido a Fc. O emparelhamento da cadeia leve (LC)-cadeia pesada (HC) é assegurado pela interface ortogonal. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.
[0116]A FIG. 24 é uma representação de um TriNKET no formato Ig 2 em 1.
[0117]A FIG. 25 é uma representação de um TriNKET na forma ES, que é um construto heterodimérico contendo dois diferentes fragmentos Fab de ligação ao alvo 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc.
[0118]A FIG. 26 é uma representação de um TriNKET na forma de Troca de Braço Fab: anticorpos que trocam braços de fragmentos Fab trocando-se uma cadeia pesada e cadeia leve ligadas (meia molécula) com um par de cadeia leve-pesada de outra molécula, resultando em anticorpos biespecíficos. A forma de Troca de Braço Fab (cFae) é um heterodímero contendo 2 fragmentos Fab de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.
[0119]A FIG. 27 é uma representação de um TriNKET na forma de SEED
Body, que é um heterodímero contendo 2 fragmentos Fab de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização.
[0120]A FIG. 28 é uma representação de um TriNKET na forma LuZ-Y, em que um zíper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de duas diferentes HCs. A forma LuZ-Y é um heterodímero contendo duas diferentes scFabs de ligação ao alvo 1 e 2, fundidas a Fc. A heterodimerização é assegurada por meio de motivos de zíper de leucina fundidos ao terminal C de Fc.
[0121]A FIG. 29 é uma representação de um TriNKET na forma de Cov-X- Body.
[0122]As FIGs. 30A a 30B são representações de TriNKETs nas formas l(X.- Body, que são construtos heterodiméricos com dois diferentes fragmentos Fab fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: um fragmento Fab que alveja antígeno 1 contém LC de kappa, e o segundo fragmento Fab que alveja antígeno 2 contém LC de lambda. A FIG. 30A é uma representação exemplificativa de uma forma de um kX.-Body, a FIG. 30B é uma representação exemplificativa de outro KX.-Body.
[0123]A FIG. 31 é um construto heterodimérico Oasc-Fab que inclui fragmento Fab de ligação ao alvo 1 e scFab de ligação ao alvo 2, ambos fundidos ao domínio Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no domínio Fc.
[0124]A FIG. 32 é um DuetMab, que é um construto heterodimérico contendo dois diferentes fragmentos Fab de ligação aos antígenos 1 e 2, e um Fc que é estabilizado por mutações de heterodimerização. Os fragmentos Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que asseguram o emparelhamento correto da cadeia leve e cadeia pesada.
[0125]A FIG. 33 é um CrossmAb, que é um construto heterodimérico com dois diferentes fragmentos Fab de ligação aos alvos 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Os domínios CL e CH1 e domínios VH e VL são trocados, e.g., CH1 é fundido em linha com VL, enquanto o CL é fundido em linha com VH.
[0126]A FIG. 34 é um Fit-Ig, que é um construto homodimérico onde o fragmento Fab de ligação ao antígeno 2 é fundido ao terminal N da HC do fragmento Fab que se liga ao antígeno 1. O construto contém Fc de tipo selvagem.
[0127]A FIG. 35 é um gráfico de linha mostrando a ligação de anticorpos monoclonais anti-c-MET e TriNKETs que alvejam c-MET para células de câncer de cólon HT29 positivas para c-MET.
[0128]A FIG. 36 é um gráfico de linha mostrando a ligação de anticorpos monoclonais anti-c-MET e TriNKETs que alvejam c-MET para células de câncer de cólon HCT-116 positivas para c-MET.
[0129]As FIGs. 37A a 37C são gráficos de linha mostrando a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c-MET por células NK derivadas de três diferentes doadores humanos saudáveis (a FIG. 37A são gráficos de linha mostrando a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c-MET por células NK derivadas do doador 1; a FIG. 37B são gráficos de linha mostrando a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c-MET por células NK derivadas do doador 2; e FIG. 37C são gráficos de linha mostrando a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c-MET por células NK derivadas do doador 3) na presença de mAbs anti-c-MET ou TriNKETs que alvejam c-MET.
[0130]A FIG. 38 é um gráfico de linha mostrando a lise de células de câncer de cólon HCT-116 positivas para c-MET por células NK na presença de mAbs anti-c- MET ou TriNKETs que alvejam c-MET.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0131]A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4,
MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas incluem ainda um sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, ou um outro antígeno associado ao tumor. A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo tais proteínas de ligação multiespecíficas, e métodos terapêuticos usando tais proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, para propósitos tais como tratar o câncer.
[0132]A invenção também fornece uma melhoria em um fragmento variável de cadeia única (scFv) que é ligado a um domínio constante de anticorpo através de uma sequência de dobradiças. A sequência de dobradiças fornece flexibilidade da ligação de scFv a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Esta invenção também fornece proteínas de ligação multiespecíficas que incluem um ou mais scFv, em que as proteínas de ligação multiespecíficas ligam o receptor NKG2D e receptor CD16 nas células matadoras naturais, e um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Esta invenção também fornece proteínas de ligação multiespecíficas que contêm dois sítios de ligação de antígeno associado ao tumor que se ligam ao mesmo antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, e ligam o receptor NKG2D e receptor CD16 nas células matadoras naturais. Composições farmacêuticas compreendendo tais proteínas de ligação multiespecíficas, e métodos terapêuticos usando tais proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas,
para propósitos tais como tratar o câncer também são fornecidos.
[0133]Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo em seções; entretanto, aspectos da invenção descritos em uma seção particular não devem ser limitados a qualquer seção particular.
[0134]Para facilitar a compreensão da presente invenção, vários termos e frases são definidos abaixo.
[0135]Os termos “um” e “uma”, como aqui usado, significa “um ou mais” e incluem o plural, a menos que o contexto seja inapropriado.
[0136]Como aqui usado, o termo “sítio de ligação ao antígeno” se refere à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antígeno. Em anticorpos humanos, o sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis do terminal N (“V”) das cadeias pesada (“H”) e leve (“L”). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesadas e leves são referidos como “regiões hipervariáveis” que são interpostas entre trechos de flanco mais conservados conhecidos como “regiões de estrutura” ou “FR”. Assim, o termo “FR” se refere às sequências de aminoácidos que se encontram naturalmente entre e adjacentes a regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas uma em relação à outra no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. A superfície de ligação ao antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são referidas como “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. Em certos animais, como camelos e peixes cartilaginosos, o sítio de ligação ao antígeno é formado por uma única cadeia de anticorpo fornecendo um “anticorpo de domínio único”. Os locais de ligação ao antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que retém a superfície de ligação ao antígeno, ou em um polipeptídeo recombinante, como um scFv, usando um ligante de peptídeo para conectar o domínio variável da cadeia pesada ao domínio variável da cadeia leve em um único polipeptídeo.
[0137]O termo "antígeno associado a tumor", tal como aqui utilizado, significa qualquer antígeno incluindo, mas não se limitando a uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídeo que está associado ao câncer. Esse antígeno pode ser expresso em células malignas ou no microambiente tumoral, como em vasos sanguíneos associados a tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes.
[0138]Como aqui usado, os termos "sujeito" e "paciente" referem-se a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições aqui descritos. Tais organismos incluem preferencialmente, mas não estão limitados a mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e semelhantes) e, mais preferencialmente, incluem humanos.
[0139]Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para produzir resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada a uma formulação ou via de administração particular. Como aqui usado, o termo “tratar” inclui qualquer efeito, por exemplo, diminuição, redução, modulação, melhoria ou eliminação, que resulta na melhoria da condição, doença, distúrbio e semelhantes, ou melhora um sintoma dos mesmos.
[0140]Como aqui usado, o termo “composição farmacêutica” se refere à combinação de um agente ativo com um portador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.
[0141]Como aqui usado, o termo “transportador farmaceuticamente aceitável”
se refere a qualquer um dos portadores farmacêuticos padrão, como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, tais como emulsões de óleo/água ou água/óleo), e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes. Para exemplos de portadores, estabilizadores e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA.
[0142]Como aqui usado, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) de um composto da presente invenção que, após administração a um sujeito, é capaz de fornecer um composto desta invenção ou um metabólito ativo ou resíduo do mesmo.
Como é conhecido pelos especialistas na técnica, “sais” dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Ácidos exemplares incluem, mas não estão limitados a clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, lático, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, ácido fórmico, benzóico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, benzenossulfônico e semelhantes. Outros ácidos, tais como o oxálico, embora não sejam eles próprios farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregues na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.
[0143]Bases exemplares incluem, mas não estão limitadas a hidróxidos de metal alcalino (por exemplo, sódio), hidróxidos de metal alcalino-terroso (por exemplo, magnésio), amônia e compostos de fórmula NW4+, em que W é alquila C1-4, e semelhantes.
[0144]Sais exemplares incluem, mas não estão limitados a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforossulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato,
etanossulfonato, glicofossulfonato, fumarptanoato, fumarptanoato, fumarptanoato, flucptanoato, fumarptanoato, fumarptanoato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2- naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalenossulfonato, taroinato, taroinato, picrato, pivalcinato, succinato, undecanoato e semelhantes. Outros exemplos de sais incluem aniões dos compostos da presente invenção compostos com um catião adequado, tal como Na+, NH4+ e NW4+ (em que W é um grupo alquila C1-4) e semelhantes.
[0145]Para uso terapêutico, os sais dos compostos da presente invenção são contemplados como sendo farmaceuticamente aceitáveis. No entanto, os sais de ácidos e bases que não são farmaceuticamente aceitáveis também podem encontrar uso, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.
[0146]Como aqui usado, “KIT” (também conhecido como PBT, SCFR, C-Kit, CD117 e MASTC) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot P10721 e isoformas relacionadas.
[0147]Como aqui usado, “F3” (também conhecido como TF; TFA; e CD142) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot P13726 e isoformas relacionadas.
[0148]Como aqui usado, “IGF1R” (também conhecido como IGFR; CD221; IGFIR; JTK13) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot P08069 e isoformas relacionadas.
[0149]Como aqui usado, “Lewis Y” (também conhecido como Le(y); Lewis y Tetrassacarídeo; Fucalfal-3(Fucalfal-2Galbetal-4)Gc1NAc; CHEBI: 59045; e Fucalfal- 2Galbetal-4(Fucalfal-3)) se refere ao carboidrato de Lewis Y de PubChem CID: 45266908, e variantes relacionadas.
[0150]Como aqui usado, “MUC13” (também conhecido como DRCC1 e MUC- 13) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. Q9H3R2 e isoformas relacionadas.
[0151]Como aqui usado, “MUC4” (também conhecido como ASGP; MUC-4; e HSA276359) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. Q99102 e isoformas relacionadas.
[0152]Como aqui usado, “MCAM” (também conhecido como CD146; e MUC18) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. P43121 e isoformas relacionadas.
[0153]Como aqui usado, “LRRC32” (também conhecido como D11S833E e GARP) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. Q14392 e isoformas relacionadas.
[0154]Como aqui usado, “sialil-Tn” (também conhecido como Tn Antígeno, NeuAc(alfa->6)Ga1NAc(alfal->0)Ser, Aandgs, 3-0-(2-Acetamido-6-0-(N- acetilneuraminil)-2-desoxigalactosil)serina, 114661-01-7.0 4N-acetil-alfa-neuraminil- (2->6)-N-acetil-alfa-D-galactosaminil]-L-serina, 0-[(ácido 5-acetamido-3,5-didesóxi-D- glicero-alfa-D-galacto-nonulopiranosilônico)-(2->6)-2-acetamido-2-desóxi-alfa-D- galactopiranosil-L-serina, AC1L4ZFL, CHEBI:53610, e ZINC77313113) se refere ao composto de PubChem CID: 195103, e variantes relacionadas.
[0155]Como aqui usado, “gpA33” (também conhecido como A33) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. Q99795 e isoformas relacionadas.
[0156]Como aqui usado, “GD3” (também conhecido como Gangliosídeo GD3 (d18:1/16:0) e CHEBI:89636) se refere ao gangliosídeo de PubChem CID: 20057323 e variantes relacionadas.
[0157]Como aqui usado, “GM2” (também conhecido como Gangliosódeo G(M2), Gangliosídeo GM2, lipídeo GM2, CHEBI:60327, (2S,3R,4E)-3-hidróxi-2- (octadecanoilamino)octadec-4-en-1-il 2-acetamida-2-desóxi-beta-D- galactopiranosil(1->4)-[5-acetamida-3,5-didesóxi-D-glicero-alfa-D-galacto-non-2- ulopiranonosil-(2->3)]-beta-D-galactopiranosil-(1->4)-beta-D-glucopiranosídeo, beta- D-GalNAc-(1->4)-[alfa-Neu5Ac-(2->3)]-beta-D-Gal-(1->4)-beta-D-Glc-(1<->1)-N-
octadecanoil esfingosina, GANGLIOSÍDEO G(M2), gangliosídeo GM2, monosialogangliosídeo GM2, Epítopo ID:139972, e gangliosídeo GM2 (18:1/18:0)) se refere à proteína de PubChem CID 9898635 e variantes relacionadas.
[0158]Como aqui usado, “c-MET” (também conhecido como HGFR; AUTS9; RCCP2; e c-Met; DFNB97) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. P08581 e isoformas relacionadas.
[0159]Como aqui usado, “EPHA3” (também conhecido como EK4; ETK; HEK; ETK1; HEK4; e TYRO4) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. P29320 e isoformas relacionadas.
[0160]Como aqui usado, “TNFRSF10A” (também conhecido como DR4; APO2; CD261; TRAILR1; e TRAILR-1) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot.
000220 e isoformas relacionadas.
[0161]Como aqui usado, “TNFSF11” (também conhecido como ODF; OPGL; sOdf; CD254; OPTB2; RANKL; TNLG6B; TRANCE; e hRANKL2) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. 014788 e isoformas relacionadas.
[0162]Como aqui usado, “CD74” (também conhecido como Ii; CLIP; DHLAG; HLADG; e Ia-GAMA) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. P04233 e isoformas relacionadas.
[0163]Como aqui usado, “PMEL” (também conhecido como proteína melanossoma; P1; SI; SIL; ME20; P100; SILV; ME20M; gp100; ME20-M; PMEL17; e D12S53E) se refere à proteína de No de Acesso Uniprot. P40967 e isoformas relacionadas.
[0164]Ao longo da descrição, onde as composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, ou onde os processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é contemplado que, adicionalmente, existem composições de presente invenção que consiste essencialmente em, ou consistem em, os componentes recitados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente em, ou consistem em, etapas de processamento recitadas.
[0165]Em geral, as composições que especificam uma porcentagem são em peso, a menos que especificado de outra forma. Além disso, se uma variável não for acompanhada por uma definição, então a definição anterior da variável controla.
I. PROTEÍNAS
[0166]A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. As proteínas de ligação multiespecíficas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos aqui descritos. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas ao receptor NKG2D e receptor CD16 em uma célula matadora natural aumenta a atividade da célula matadora natural para a destruição de células tumorais que expressam um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas às células que expressam antígeno associado ao tumor traz as células cancerosas em proximidade com a célula matadora natural, que facilita direta e indiretamente a destruição das células cancerosas pela célula matadora natural. Outra descrição de algumas proteínas de ligação multiespecíficas exemplares é fornecida abaixo.
[0167]O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam receptor NKG2D, que pode incluir, mas não se limitando às células NK, células yi5 T e células CD8+ af3 T. Após a ligação de NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear ligantes naturais, tais como ULBP6 e MICA, de se ligar a NKG2D e ativar células NK.
[0168]O segundo componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y,
MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3,
TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
Células que expressam antígeno associado ao tumor podem ser encontradas em leucemia, por exemplo, leucemia mieloide aguda e leucemia de células T.
Células que expressam antígeno associado ao tumor podem ser encontradas em associação com outros cânceres e tipos de tumor, por exemplo,
mas não se limitando a câncer colorretal, um tumor estromal gastrointestinal,
melanoma, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado, câncer testicular,
câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer uterino, glioma,
glioblastoma, neuroblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, sarcoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer da tireoide, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer esofágico, colangiocarcinoma,
leucemia linfoblástica aguda, um câncer ósseo metastático, câncer difuso de grandes células B, e uma malignidade de células B.
Células que expressam KIT podem ser encontradas em, por exemplo, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, tumor estromal gastrointestinal, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado e câncer testicular.
Células que expressam F3 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, sarcoma e câncer colorretal.
Células que expressam IGF1R podem ser encontradas em, por exemplo, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer de próstata, sarcoma,
câncer da tireoide, câncer renal, câncer colorretal, câncer pancreático, gliobastoma e câncer de fígado.
Células que expressam Lewis Y podem ser encontradas em, por exemplo, câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo e leucemia mieloide aguda. Células que expressam MUC13 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal, câncer cervical e colangiocarcinoma. Células que expressam MUC4 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, leucemia linfoblástica aguda, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata. Células que expressam MCAM podem ser encontradas em, por exemplo, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas, sarcoma, câncer colorretal, câncer pancreático e câncer renal. Células que expressam LRRC32 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer renal, câncer pancreático, sarcoma, câncer ovariano, câncer de pulmão, gliobastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de mama e câncer cervical. Células que expressam sialil-Tn podem ser encontradas em, por exemplo, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de mama. Células que expressam gpA33 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer colorretal, câncer gástrico e câncer esofágico. Células que expressam GD3 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer de pulmão, glioma, câncer de mama, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático e neuroblastoma.
Células que expressam GM2 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer gástrico, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, câncer cervical, neuroblastoma, melanoma, câncer de pulmão, mesotelioma e câncer de fígado.
Células que expressam c-MET podem ser encontradas em, por exemplo, câncer renal, câncer da tireoide, melanoma, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer colorretal ou câncer de cabeça e pescoço. Células que expressam
EPHA3 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão e sarcoma. Células que expressam TNFRSF10A podem ser encontradas em, por exemplo, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço. Células que expressam TNFSF11 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer de mama, câncer de próstata e um câncer ósseo metastático. Células que expressam CD74 podem ser encontradas em, por exemplo, câncer difuso de grandes células B, uma malignidade de células B, câncer renal, câncer de pulmão, câncer ovariano, melanoma, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de bexiga, glioma, câncer de mama e leucemia. Células que expressam PMEL podem ser encontradas em, por exemplo, melanoma e sarcomas.
[0169]O terceiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam CD16, um receptor Fc na superfície de leucócitos incluindo células matadoras naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.
[0170]As proteínas de ligação multiespecíficas aqui descritas podem ter vários formatos. Por exemplo, um formato é um anticorpo multiespecífico heterodimérico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina (FIG. 1). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável de cadeia pesada e, opcionalmente, um primeiro domínio de cadeia pesada CH1. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um primeiro domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, um primeiro domínio constante de cadeia leve. A primeira cadeia leve de imunoglobulina, junto com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina,
forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável de cadeia pesada e, opcionalmente, um segundo domínio de cadeia pesada CH1. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um segundo domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, um segundo domínio constante de cadeia leve. A segunda cadeia leve de imunoglobulina, junto com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. O primeiro domínio Fc e segundo domínio Fc são capazes de se ligar a CD16 (FIG. 1). Em algumas modalidades, a primeira cadeia leve de imunoglobulina é idêntica à segunda cadeia leve de imunoglobulina.
[0171]Um outro formato exemplar envolve um anticorpo multiespecífico heterodimérico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina (FIG.
2A). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido através de um conector ou uma dobradiça de anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto de um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve que se emparelha e se liga a NKG2D, ou se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável de cadeia pesada e um domínio de cadeia pesada CH1. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina emparelha com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga a NKG2D ou se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc são capazes de se ligar a CD16 (FIG.
2A).
[0172]Um outro formato exemplar envolve um anticorpo multiespecífico heterodimérico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina (FIG. 2B). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido através de um conector ou uma dobradiça de anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto de um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve que se emparelha e se liga a NKG2D, ou se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido através de um conector ou uma dobradiça de anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto de um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve que se emparelha e se liga a NKG2D, ou se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc são capazes de se ligar a CD16 (FIG. 2B).
[0173]Em algumas modalidades, o fragmento variável de cadeia única (scFv) descrito acima é ligado ao domínio constante de anticorpo através de uma sequência de dobradiças. Em algumas modalidades, a dobradiça compreende aminoácidos Ala- Ser. Em algumas outras modalidades, a dobradiça compreende aminoácidos Ala-Ser e Thr-Lys-Gly. A sequência de dobradiças pode fornecer flexibilidade de ligação ao antígeno alvo, e equilíbrio entre flexibilidade e ótima geometria.
[0174]Em algumas modalidades, o fragmento variável de cadeia única (scFv) descrito acima inclui um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável de cadeia leve para intensificar a estabilidade do scFv. Por exemplo, uma ponte dissulfeto pode ser formada entre o resíduo C44 do domínio variável de cadeia pesada e o resíduo C100 do domínio variável de cadeia leve, as posições de aminoácidos numeradas sob Kabat. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada é ligado ao domínio variável de cadeia leve através de um conector flexível. Qualquer conector adequado pode ser usado, por exemplo, o conector (G4S)4. Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é posicionado no terminal N do domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é posicionado no terminal C do domínio variável de cadeia leve.
[0175]As proteínas de ligação multiespecíficas aqui descritas podem incluir ainda um ou mais sítios de ligação ao antígeno adicionais. Os sítios de ligação ao antígeno adicionais podem ser fundidos ao terminal N do domínio de região constante CH2 ou ao terminal C do domínio de região constante CH3, opcionalmente, através de uma sequência de conectores. Em certas modalidades, os sítios de ligação ao antígeno adicionais têm a forma de uma região variável de cadeia única (scFv) que é opcionalmente estabilizada por dissulfeto, resultando em uma proteína de ligação multispecífica tetravalente ou trivalente. Por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica inclui um sítio de ligação a NKG2D, um sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor onde o antígeno associado ao tumor é selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c- MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor, e uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar a CD16, ou um quarto sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16. Qualquer um destes sítios de ligação ao antígeno pode ter a forma de um fragmento Fab ou um scFv, tal como o scFv descrito acima.
[0176]Em algumas modalidades, o terceiro sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado tumor diferente a partir do sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Em algumas modalidades, o terceiro sítio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor como o sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Em algumas modalidades, o terceiro sítio de ligação ao antígeno compreende as mesmas sequências de CDR de cadeia pesada e cadeia leve como o sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Em algumas modalidades, o terceiro sítio de ligação ao antígeno compreende as mesmas sequências de domínio variável de cadeia pesada e cadeia leve como o sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Em algumas modalidades, o terceiro sítio de ligação ao antígeno tem as mesmas sequências de aminoácido como o sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Formatos exemplares são mostrados nas FIGs. 2C e 2D. Consequentemente, as proteínas de ligação multiespecíficas podem fornecer engajamento bivalente de um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Engajamento bivalente de um antígeno associado ao tumor pelas proteínas multiespecíficas pode estabilizar o antígeno associado ao tumor na superfície de célula cancerosa, e intensificar citotoxicidade de células NK para as células cancerosas. Engajamento bivalente de um antígeno associado ao tumor pelas proteínas multiespecíficas pode conferir ligação mais forte das proteínas multiespecíficas às células cancerosas, facilitando assim resposta citotóxica mais forte de células NK para as células cancerosas, especialmente para células cancerosas que expressam um baixo nível de um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
[0177]As proteínas de ligação multiespecíficas podem ter formatos adicionais.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecífico trifuncional que mantém uma forma como IgG. Esta quimera consiste de dois semianticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que se originam de dois anticorpos parentais.
[0178]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é a KiHform, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KiHs). A KiH envolve manipular os domínios CH3 para criar um “botão” ou um “buraco” em cada cadeia pesada para promover heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia Fc “Knobs-into-holes (KiH)” foi para introduzir um “botão” em um domínio CH3 (CH3A) pela substituição de um pequeno resíduo com um volumoso (e.g., T366WcH3A na numeração da EU).
Para acomodar o “botão”, uma superfície de “buraco” complementar foi criada no outro domínio CH3 (CH3B) substituindo-se os resíduos vizinhos mais próximos pelo botão com um menor (e.g., T366S/L368A/Y407VcH3B). A mutação de “buraco” foi otimizada por triagem de biblioteca de fagos guiada e estruturada (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). Estruturas cristalinas de raios X de variantes de KiH Fc (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol.
Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for for FcyRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8) demonstrou que a heterodimerização é termodinamicamente favorecida por interações hidrofóbicas impulsionadas por complementaridade estérica na interface de núcleo de domínio inter-CH3, enquanto as interfaces de botão-botão e buraco-burado não favorecem a homodimerização devido ao impedimento estérico e interrupção das interações favoráveis, respectivamente.
[0179]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de imunoglobulina de domínio de variável duplo (DVD-IgTM), que combina os domínios de ligação alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de conectores flexíveis que ocorrem naturalmente, e produz uma molécula como IgG tetravalente.
[0180]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de interface Fab Ortogonal (Fab-Orto). No método de IgG de Fab orto (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat.
Biotechnol. (2014) 32(2):191-8), projeto regional com base na estrutura introduz mutações complementares na interface LC e HCvH-an em apenas um fragmento Fab, sem que nenhuma alteração seja feita no outro fragmento Fab.
[0181]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está no formato de Ig 2 em 1. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de ES, que é um construto heterodimérico contendo dois fragmentos Fab diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc.
[0182]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de kλ-Budy, que é um construto heterodimérico com dois diferentes fragmentos Fab fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: o fragmento Fab que alveja o antígeno 1 contém LC kappa, enquanto o segundo fragmento Fab que alveja o antígeno 2 contém LC lambda. A FIG. 30A é uma representação exemplar de uma forma de um kλ-Body; a FIG. 30B é uma representação exemplar de um outro kλ-Body.
[0183]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Troca de Braço de Fab (anticorpos que trocam braços de fragmento Fab trocando-se uma cadeia pesada e cadeia leve ligada (meia molécula) com um par de cadeia pesada-leve de uma outra molécula, que resulta em anticorpos biespecíficos).
[0184]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de SEED Body. A plataforma de domínio engendrado de troca de fita (SEED) foi projetado para gerar moléculas assimétricas e biespecíficas semelhantes a anticorpos, uma capacidade que expande as aplicações terapêuticas de anticorpos naturais. Esta plataforma de engenharia de proteína é fundamentada na troca de sequências estruturalmente relacionadas de imunoglobulina dentro dos domínios CH3 conservados. O projeto SEED permite a geração eficiente de heterodímeros AG/GA, enquanto desfavorece a homodimerização de domínios CH3 SEED AG e GA. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)).
[0185]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de LuZ-Y, em que um zíper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de dois HC diferentes. (Wranik, BJ. et al.,1 Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).
[0186]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Cov-X-Body. Em CovX-Bodies biespecíficos, dois peptídeos diferentes são reunidos usando um conector azetidinona ramificado e fundidos ao anticorpo de suporte sob condições suaves de uma maneira específica de sítio. Enquanto os farmacóforos são responsáveis pelas atividades funcionais, o suporte de anticorpo transmite meia-vida longa e distribuição semelhante a Ig. Os farmacóforos podem ser quimicamente otimizados ou substituídos com outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecíficos otimizados ou únicos. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616).
[0187]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma heterodimérica Fab Oasc que inclui fragmento Fab que se liga ao alvo 1, e scFab que se liga ao alvo 2 fundido ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.
[0188]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de DuetMab, que é um construto heterodimérico contendo dois diferentes fragmentos Fab que se ligam aos antígenos 1 e 2, e Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Os fragmentos Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que garantem o emparelhamento correto de LC e HC.
[0189]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de CrossmAb, que é um construto heterodimérico com dois fragmentos Fab diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos ao Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios CL e CH1 e domínios VH e VL são trocados, e.g., CH1 é fundido in-frame com VL, enquanto CL é fundido in-frame com VH.
[0190]Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de Fit-Ig, que é um construto homodimérico onde o fragmento Fab que se liga ao antígeno 2 é fundido ao terminal N de HC de fragmento Fab que se liga ao antígeno 1. O construto contém Fc tipo selvagem.
[0191]A Tabela 1 lista sequências de peptídeos de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a NKG2D. Os domínios de ligação a NKG2D podem variar em sua afinidade de ligação a NKG2D, não obstante, todos eles ativam as células NK humanas. Tabela 1 Clones Sequência de aminoácidos de região variável de Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada cadeia leve ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPITF ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1) GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 2) CDR1 (SEQ ID NO: 105) - GSFSGYYWS CDR2 (SEQ ID NO: 106) -
EIDHSGSTNYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO: 107) - ARARGPWSFDP ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSY
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK LAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITF ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3) GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4) ADI-27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 6) ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 8) ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 9) ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK NWYQQKPGQPPKLLIWASTRESGVPDRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTF ARGPWGFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11) GQGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITF ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13) GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14) ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTF ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15) GQGTKVEIK (SEQ ID NO: 16) ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 18) ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 20) ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 21) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 22) ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 24) ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 25) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 26) ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFSTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 28) ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYESYSTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 29) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 30) ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
WSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKS AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSFITFG RGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 31) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 32) ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
WSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKS AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSYPTFG RGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 34) ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWL
WSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKS AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPTFG RGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 35) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 36) ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWL
WSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKS AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYELYSYTF RGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 37) GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 38) ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDTFITFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 39) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 40) ADI-27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSY DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSS
AISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQ NNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIWASTRESGVPD
GRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYS GDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ TPITFGGGTKVEIK ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42) CDR1 (SEQ ID NO: 43) - GTFSSYAIS (não- CDR1 (SEQ ID NO: 46) - Kabat) ou SYAIS (SEQ ID NO: 431) KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR2 (SEQ ID NO: 44) - GIIPIFGTANYAQKFQG CDR2 (SEQ ID NO: 47) - WASTRES CDR3 (SEQ ID NO: 45) - CDR3 (SEQ ID NO: 48) - QQYYSTPIT ARGDSSIRHAYYYYGMDV (não-Kabat) ou GDSSIRHAYYYYGMDV (SEQ ID NO: 432) ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYL
YWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLK AWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPPTF GSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 50) 49) CDR1 (SEQ ID NO: 54) - RASQSVSRYLA CDR1 (SEQ ID NO: 51) - GSISSSSYWG (não- CDR2 (SEQ ID NO: 55) - DASNRAT Kabat) ou SSSYYWG (SEQ ID NO: 433) CDR3 (SEQ ID NO: 56) - QQFDTWPPT CDR2 (SEQ ID NO: 52) - SIYYSGSTYYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO: 53) - ARGSDRFHPYFDY (não-Kabat) ou GSDRFHPYFDY (SEQ ID NO: 434) ADI-29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGY DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWL
YWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLK AWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGS
SRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPTFG ARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 57) GGTKVEIK (SEQ ID NO: 58) ADI-28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSY DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSG
AISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQ NQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIWASTRESGVPD
GRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYS RGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS YPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 59) CDR1 (SEQ ID NO: 137) - CDR1 (SEQ ID NO: 134) - GTFSSYAIS ESSQSLLNSGNQKNYLT CDR2 (SEQ ID NO: 135) - CDR2 (SEQ ID NO: 138) - WASTRES GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO: 139) - QNDYSYPYT CDR3 (SEQ ID NO: 136) -
ARRGRKASGSFYYYYGMDV ADI-29379 (E79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSY EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNL
YMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQK AWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGS
FQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYY GSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPFTF CARGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 61) CDR1 (SEQ ID NO: 66) - RASQSVSSNLA CDR1 (SEQ ID NO: 63) - YTFTSYYMH (não- CDR2 (SEQ ID NO: 67) - GASTRAT Kabat) ou SYYMH (SEQ ID NO: 435) CDR3 (SEQ ID NO: 68) - QQYDDWPFT CDR2 (SEQ ID NO: 64) -
IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO: 65) - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV (não-Kabat) ou GAPNYGDTTHDYYYMDV (SEQ ID NO: 436) ADI-29463 (F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGY EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNL
YMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQ AWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGS
KFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYY GSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDWPPTF CARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 69) CDR1 (SEQ ID NO: 74) - RASQSVSSNLA CDR1 (SEQ ID NO: 71) - YTFTGYYMH (não- CDR2 (SEQ ID NO: 75) - GASTRAT Kabat) ou GYYMH (SEQ ID NO: 437) CDR3 (SEQ ID NO: 76) - QQDDYWPPT CDR2 (SEQ ID NO: 72) -
WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO: 73) - ARDTGEYYDTDDHGMDV (não-Kabat) ou DTGEYYDTDDHGMDV (SEQ ID NO: 408) ADI-27744 (A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWL
AMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTF AKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 78) NO: 77) CDR1 (SEQ ID NO: 82) - RASQGIDSWLA CDR1 (SEQ ID NO: 79) - FTFSSYAMS (não- CDR2 (SEQ ID NO: 83) - AASSLQS Kabat) ou SYAMS (SEQ ID NO: 409) CDR3 (SEQ ID NO: 84) - QQGVSYPRT CDR2 (SEQ ID NO: 80) -
AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO: 81) - AKDGGYYDSGAGDY (não-Kabat) ou DGGYYDSGAGDY (SEQ ID NO: 411) ADI-27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF RGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 86) NO: 85) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 (SEQ ID NO: 87) - FTFSSYSMN (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN(SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 (SEQ ID NO: 88) -
SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO: 89) - ARGAPMGAAAGWFDP (não-Kabat) ou GAPMGAAAGWFDP (SEQ ID NO: 412) ADI-29378 (E78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSY EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLA
YMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQK WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG
FQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYY SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSDNWPFTFG CAREGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTTVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO: 94) (SEQ ID NO: 93) CDR1 (SEQ ID NO: 95) - YTFTSYYMH (não- CDR1 (SEQ ID NO: 98) - RASQSVSSYLA Kabat) ou SYYMH (SEQ ID NO: 421) CDR2 (SEQ ID NO: 99) - DASNRAT CDR2 (SEQ ID NO: 96) - CDR3 (SEQ ID NO: 100) - QQSDNWPFT
IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO: 97) - AREGAGFAYGMDYYYMDV (não-Kabat) ou EGAGFAYGMDYYYMDV(SEQ ID NO: 422) A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF RGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK (SEQ ID NO: 86) NO: 388) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 87) (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN (SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 88) CDR3 (não-Kabat) ARGAPIGAAAGWFDP (SEQ ID NO: 389) ou GAPIGAAAGWFDP (SEQ ID NO: 390) A49MI-HC:
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 423) A49MI-LC:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 424) A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF RGAPQGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK(SEQ ID NO: 86) NO: 391) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 87) (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN (SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 88) CDR3 (não-Kabat) (SEQ ID NO: 392) - ARGAPQGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO: 393) - GAPQGAAAGWFDP A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF RGAPLGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK(SEQ ID NO: 86) NO: 394) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 87) (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN (SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 88) CDR3 (não-Kabat) (SEQ ID NO: 395) - ARGAPLGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO: 396) - GAPLGAAAGWFDP A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF
RGAPFGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK(SEQ ID NO: 86) NO: 397) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 87) (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN (SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 88) CDR3 (não-Kabat) (SEQ ID NO: 398) - ARGAPFGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO: 399) - GAPFGAAAGWFDP A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF RGAPVGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GGGTKVEIK(SEQ ID NO: 86) NO: 400) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 87) (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN (SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 88) CDR3 (não-Kabat) (SEQ ID NO: 401) - ARGAPVGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO: 402) - GAPVGAAAGWFDP A49-consenso EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWL
SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSV AWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGS
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTF RGAPXGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS, em que GGGTKVEIK(SEQ ID NO: 86) X é M, L, I, V, Q ou F (SEQ ID NO: 403) CDR1 (SEQ ID NO: 90) - RASQGISSWLA CDR1 FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 87) (não- CDR2 (SEQ ID NO: 91) - AASSLQS Kabat) ou SYSMN (SEQ ID NO: 387) CDR3 (SEQ ID NO: 92) - QQGVSFPRT CDR2 SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 88) CDR3 (não-Kabat) (SEQ ID NO: 404) - ARGAPXGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO: 405) - GAPXGAAAGWFDP, em que X é M, L, I, V, Q ou F
[0192]Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 101 pode ser emparelhado com um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 102 para formar um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar a NKG2D, conforme ilustrado em US 9.273.136.
SEQ ID NO: 101
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA FIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDG
TYFDWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 102
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYY DDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTK LTVL
[0193]Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 103 pode ser emparelhado com um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 104 para formar um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar a NKG2D, conforme ilustrado em US 7.879.985.
SEQ ID NO: 103
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHI SYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQ
GTMVTVSS SEQ ID NO: 104
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEI K
[0194]Em um aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno KIT. A Tabela 2 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a KIT. Tabela 2 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-KIT (AMG191) (Publicação dos QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS NIVLTQSPASLAVSLGLRATISCRASE o EUA N 2013/0288303Al) GYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGV SVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY
IYSGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSS LASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTI STAYMQINSLTSEDSAVYYCARERDT DPVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGG
RFGNWGQGTLVTVSA GTKLEIKR (SEQ ID NO: 109) (SEQ ID NO: 113) CDR1 (SEQ ID NO: 110) - SYNMH CDR1 (SEQ ID NO: 114) - CDR2 (SEQ ID NO: 111) - RASESVDIYGNSFMH VIYSGNGDTSYNQKFKG CDR2 (SEQ ID NO: 115) - LASNLES CDR3 (SEQ ID NO: 112) - RDTRFGN CDR3 (SEQ ID NO: 116) -
QQNNEDPYT anti-KIT (CDX-0158) (Publicação dos QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKAS DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKA
EUA No 2017/0158778) GYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARI SQNVRTNVAWYQQKPGQSPKALIYS
YPGSGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSS ASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS
TAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGVYYF NVQSEDLADYFCQQYNSYPRTFGGG DYWGQGTTLTVSS TKLEIKR(SEQ ID NO: 121) (SEQ ID NO: 117) CDR1 (SEQ ID NO: 122) - CDR1 (SEQ ID NO: 118) - DYYIN KASQNVRTNVA CDR2 (SEQ ID NO: 119) - CDR2 (SEQ ID NO: 123) - SASYRYS RIYPGSGNTYYNEKFKG CDR3 (SEQ ID NO: 124) - CDR3 (SEQ ID NO: 120) - GWYYFDY QQYNSYPRT
[0195]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a KIT podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 125 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 125
MRGARGAWDELCVLLLLLRVQTGSSQPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVG DEIRLLCTDPGFVKWTFEILDETNENKQNEWITEKAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIY VEVRDPAKLELVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQGKPLPKDLRFIPD PKAGIMIKSVKRAYEIRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVRPAFKAVPVVSVSKASYL LREGEEFTVTCTIKDVSSSVYSTWKRENSQTKLQEKYNSWEIRGDFNYERQATLTIS SARVNDSGVFMCYANNTEGSANVTTTLEVVDKGFINIFPMINTTVEVNDGENVDLIV EYEAFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWEDYPKSENESNIRYVSELEILTRLKGTEGGTY TELVSNSDVNAAIAENVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQCVAAGFPEPTIDWYFCPGTE QRCSASVLPVDVQTLNSSGPPEGKLVVQSSIDSSAFKHNGTVECKAYNDVGKTSAY ENFAFKGNNKEQIHPHTLFTPLLIGEVIVAGMMCIIVMILTYKYLQKPMYEVQWKVVE EINGNNYVYIDPTQLPYDEIKWEEPRNRLSEGKTLGAGAFGKVVEATAYGLIKSDAA MTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNEIMNIVNLLGACTIGGPTLVITEYCC YGDLLNFLRRKRDSFICSKQEDHAEAALYKNLLHSKESSCSDSTNEYMDMKPGVSY VVPTKADKRRSVRIGSYIERDVTPAIMEDDELALDLEDLLSFSYQVAKGMAFLASKN CIHRDLAARNILLTHGRITKICDFGLARDIKNDSNYVVKGNARLPVKWMAPESIFNCV YTFESDVWSYGIFLWELFSLGSSPYPGMPVDSKEYKMIKEGFRMLSPEHAPAEMYD IMKTCWDADPLKRPTEKQIVQLIEKQISESTNHIYSNLANCSPNRQKPVVDHSVRINS VGSTASSSQPLLVHDDV
[0196]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno F3. A Tabela 3 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a F3. Tabela 3 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-F3 (tisotumabvedotina) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF DIQMTQSPPSLSASAGDRVTITCRASQGIS
SNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGDY SRLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVP
TYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ AEDTAVYYCARSPWGYYLDSWGQGTLVT QYNSYPYTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: VSSA (SEQ ID NO: 126) 130) CDR1 (SEQ ID NO: 127) - GFTFSNY CDR1 (SEQ ID NO: 131) - QGISSRLA CDR2 (SEQ ID NO: 128) - SGSGDY CDR2 (SEQ ID NO: 132) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO: 129) - SPWGYYLDS CDR3 (SEQ ID NO: 133) - QQYNSYPYT anti-F3 (TNX-832) EIQLQQSGPELVKPGASVQVSCKTSGYSF DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIDT
TDYNVYWVRQSHGKSLEWIGYIDPYNGITI WLAWYQQKPGKSPQLLIYAATNLADGVPS
YDQNFKGKATLTVDKSSTTAFMULNSLTS RFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVNYYCQ DDSAVYFCARDVTTALDFWGQGTTLTVSS QVYSSPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 140) 144) CDR1 (SEQ ID NO: 141) - GYSFTDY CDR1 (SEQ ID NO: 145) - QTIDTWLA CDR2 (SEQ ID NO: 142) - DPYNGI CDR2 (SEQ ID NO: 146) - AATNLAD CDR3 (SEQ ID NO: 143) - DVTTALDF CDR3 (SEQ ID NO: 147) - QQVYSSPFT
[0197]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a F3 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 148 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 148
METPAWPRVPRPETAVARTLLLGWVFAQVAGASGTTNTVAAYNLTWKSTN FKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARV FSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDER TLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV QAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREIFYIIGAVVFVVIILVIILAISLUKCRKAG VGQSWKENSPLNVS
[0198]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno IGF1R. A Tabela 4 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a IGF1R. Tabela 4 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-IGF1R (cixutumumabe) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS
SSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTAN YYATWYQQKPGQAPILVIYGENKRPSGIPD
YAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE RFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCK DTAVYYCARAPLRFLEWSTQDHYYYYYMD SRDGSGQHLVFGGGTKLTVLG (SEQ ID VWGKGTTVTVSSA(SEQ ID NO: 149) NO: 153) CDR1 (SEQ ID NO: 150) - GGTFSSY CDR1 (SEQ ID NO: 154) - SLRSYYAT CDR2 (SEQ ID NO: 151) - IPIFGT CDR2 (SEQ ID NO: 155) - GENKRPS CDR3 (SEQ ID NO: 152) - CDR3 (SEQ ID NO: 156) - KSRDGSGQHLV
APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV anti-IGF1R (ganitumabe) QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSI DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLL
SSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGS HSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNR TNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVT ASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV
AADTAVYYCARWTGRTDAFDIWGQGTMV GVYYCMQGTHWPLTFGQGTKVEIKR TVSSA (SEQ ID NO: 157) (SEQ ID NO: 161) CDR1 (SEQ ID NO: 158) - GGSISSSN CDR1 (SEQ ID NO: 162) - CDR2 (SEQ ID NO: 159) - YHSGS QSLLHSNGYNYLD CDR3 (SEQ ID NO: 160) - WTGRTDAFDI CDR2 (SEQ ID NO: 163) - LGSNRAS CDR3 (SEQ ID NO: 164) - MQGTHWPLT
[0199]lternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a IGF1R podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 165 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 165
MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRNDYQQLKRLEN CTVIEGYLHILLISKAEDYRSYRFPKLTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKL FYNYALVIFEMTNLKDIGLYNLRNITRGAIRIEKNADLCYLSTVDWSLILDAVSNNYIVG NKPPKECGDLCPGTMEEKPMCEKTTINNEYNYRCWTTNRCQKMCPSTCGKRACT ENNECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPNTYRFEGWRCVDR DFCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFIRNGSQSMYCIPCEGPCPKVCEEE KKTKTIDSVTSAQMLQGCTIFKGNLLINIRRGNNIASELENFMGLIEVVTGYVKIRHSH ALVSLSFLKNLRLILGEEQLEGNYSFYVLDNQNLQQLWDWDEIRNLTIKAGKMYFAF NPKLCVSEIYRMEEVTGTKGRQSKGDINTRNNGERASCESDVLEIFTSTTTSKNRIIIT WEIRYRPPDYRDLISFTVYYKEAPFKNVTEYDGQDACGSNSWNMVDVDLPPNKDV EPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVENDHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSAS NSSSQLIVKWNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKDKIPIRKYADGTI DIEEVTENPKTEVCGGEKGPCCACPKTEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLHNSSEVPR PERKRRDVMQVANTTMSSRSRNTTAADTYNITDPEELETEYPFFESRVDNKERTVI SNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEKLGCSUMSNFVFARTIVIPAEGADDIPGPVTWEPRPE NSIFLKWPEPENPNGLILMYEIKYGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKLNRLNPGNY TARIQATSLSGNGSWTDPVFFYVQAKTGYENFIRLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFEIR KRNNSRLGNGVLYASVNPEYFSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYE GVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASMRERIEFLNEASVMKEFNCHHVVRLLGVVSQ GQPTLVIMELMTRGDLKSYLRSLRPEMENNPVLAPPSLSKMIQMAGEIADGMAYLN ANKFVEIRDLAARNCMVAEDFTVKIGDFGMTRDIYETDYYRKGGKGLLPVRWMSPE SLKDGVFTTYSDVWSFGVVLWEIATLAEQPYQGLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNC PDMLFELMRMCWQYNPKMRPSFLEIISSIKEEMEPGFREVSFYYSEENKLPEPEEL DLEPENMESVPLDPSASSSSLPLPDRHSGEIKAENGPGPGVLVLRASFDERQPYAH MNGGRKNERALPLPQSSTC
[0200]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno Lewis Y. A Tabela 5 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a Lewis Y. Tabela 5 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-Lewis Y (MB311) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSI
FSDYYMYWVRQAPEKRLEWVAYISNGG VHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLISKVS GSSHYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQM NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA
NSLRAEDTALYHCARGMDYGAWFAYW EDVGVYYCFQGSHVPFTFGQGTKLEIK GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 166) (SEQ ID NO: 170) CDR1 (SEQ ID NO: 167) - GFTFSDY CDR1 (SEQ ID NO: 171) - CDR2 (SEQ ID NO: 168) - SNGGGS QSIVHSNGNTYLE CDR3 (SEQ ID NO: 169) - CDR2 (SEQ ID NO: 172) - KVSNRFS GMDYGAWFAY CDR3 (SEQ ID NO: 173) - FQGSHVPFT Anti-Lewis Y (Rebmab 100) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRI o (Patente dos EUA N 6.518.415) TFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYMSN VHSNGNTYLEWYQQTPGKAPKLLIYKVS
VGAITDYPDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQ NRFSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQP
MDSLRPEDTGVYFCARGTRDGSWFAY EDIATYYCFQGSHVPFTFGQGTKLQIT WGQGTPVTVSS (SEQ ID NO: 174) (SEQ ID NO: 178) CDR1 (SEQ ID NO: 175) - DYYMY CDR1 (SEQ ID NO: 179) - CDR2 (SEQ ID NO: 176) - RSSQRIVHSNGNTYLE YMSNVGAITDYPDTVKG CDR2 (SEQ ID NO: 180) - KVSNRFS CDR3 (SEQ ID NO: 177) - CDR3 (SEQ ID NO: 181) - FQGSHVPFT
GTRDGSWFAY
[0201]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a Lewis Y podem ser identificados por triagem para ligação ao antígeno Lewis Y ou um fragmento extracelular maduro do mesmo.
[0202]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno MUC13. A Tabela 6 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a MUC13. Tabela 6 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-MUC13 (Publicação Internacional QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKAS QIVLTQSPTIMSASPGEKVTMTCSAS o N WO 2016/168607) GYAFSTYWMNWVKQRPGQGLEWIG SSVTYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSK
QIYPGDGDTYYNGNFKGKATLTADKS LASGVPARFGGSGSGTSYSLTINSME
SSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAVFW TEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKL DGYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: EIKRAD (SEQ ID NO: 186) 182) CDR1 (SEQ ID NO: 187) - CDR1 (SEQ ID NO: 183) - TYWMN SASSSVTYIH CDR2 (SEQ ID NO: 184) - CDR2 (SEQ ID NO: 188) - DTSKLAS QIYPGDGDTYYNGNFKG CDR3 (SEQ ID NO: 189) - CDR3 (SEQ ID NO: 185) - FWDGY QQWSSNPFT
[0203]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a MUC13 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 190 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
MKAIIHLTLLALLSVNTATNQGNSADAVTTTETATSGPTVAAADTTETNFPET ASTTANTPSFPTATSPAPPIISTHSSSTIPTPAPPIISTHSSSTIPIPTAADSESTTNVNS LATSDIITASSPNDGLITMVPSETQSNNEMSPTTEDNQSSGPPTGTALLETSTLNSTG PSNPCQDDPCADNSLCVKLHNTSFCLCLEGYYYNSSTCKKGKVFPGKISVTVSETF DPEEKHSMAYQDLHSEITSLFKDVFGTSVYGQTVILTVSTSLSPRSEMRADDKFVNV TIVTILAETTSDNEKTVTEKINKAIRSSSSNFLNYDLTLRCDYYGCNQTADDCLNGLA CDCKSDLQRPNPQSPFCVASSLKCPDACNAQHKQCLIKKSGGAPECACVPGYQED ANGNCQKCAFGYSGLDCKDKFQLILTIVGTIAGIVILSMIIALIVTARSNNKTKHIEEENL
IDEDFQNLKLRSTGFTNLGAEGSVFPKVRITASRDSQMQNPYSRHSSMPRPDY (SEQ ID NO: 190)
[0204]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno MUC4. Novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a MUC4 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 191 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
MKGARWRRVPWVSLSCLCLCLLPHVVPGTTEDTLITGSKTAAPVTSTGSTT ATLEGQSTAASSRTSNQDISASSQNHQTKSTETTSKAQTDTLTQMMTSTLFSSPSV HNVMETVTQETAPPDEMTTSFPSSVTNTLMMTSKTITMTTSTDSTLGNTEETSTAG TESSTPVTSAVSITAGQEGQSRTTSWRTSIQDTSASSQNHWTRSTQTTRESQTSTL THRTTSTPSFSPSVHNVTGTVSQKTSPSGETATSSLCSVTNTSMMTSEKITVTTSTG STLGNPGETSSVPVTGSLMPVTSAALVTVDPEGQSPATFSRTSTQDTTAFSKNHQT QSVETTRVSQINTLNTLTPVTTSTVLSSPSGFNPSGTVSQETFPSGETTISSPSSVSN TFLVTSKVFRMPISRDSTLGNTEETSLSVSGTISAITSKVSTIWWSDTLSTALSPSSLP PKISTAFHTQQSEGAETTGRPHERSSFSPGVSQEIFTLHETTTWPSSFSSKGHTTW SQTELPSTSTGAATRLVTGNPSTRAAGTIPRVPSKVSAIGEPGEPTTYSSHSTTLPK TTGAGAQTQWTQETGTTGEALLSSPSYSVIQMIKTATSPSSSPMLDRHTSQQITTAP STNHSTIFISTSTSPQESPAVSQRGHTRAPQTTQESQTTRSVSPMTDTKTVTTPGSS FTASGHSPSEIVPQDAPTISAATTFAPAPTGNGHTTQAPTTALQAAPSSHDATLGPS GGTSLSKTGALTLANSVVSTPGGPEGQWTSASASTSPDTAAAMTHTHQAESTEAS GQTQTSEPASSGSRTTSAGTATPSSSGASGTTPSGSEGISTSGETTRFSSNPSRDS HTTQSTTELLSASASHGAIPVSTGMASSIVPGTFHPTLSEASTAGRPTGQSSPTSPS ASPQETAAISRMAQTQRTGTSRGSDTISLASQATDTFSTVPPTPPSITSSGLTSPQT QTHTLSPSGSGKTFTTALISNATPLPVTSTSSASTGHATPLAVSSATSASTVSSDSPL KMETSGMTTPSLKTDGGRRTATSPPPTTSQTIISTIPSTAMHTRSTAAPIPILPERGV SLFPYGAGAGDLEFVRRTVDFTSPLFKPATGFPLGSSLRDSLYFTDNGQIIFPESDY QIFSYPNPLPTGFTGRDPVALVAPFWDDADFSTGRGTTFYQEYETFYGEHSLLVQQ AESWIRKMTNNGGYKARWALKVTWVNAHAYPAQWTLGSNTYQAILSTDGSRSYAL FLYQSGGMQWDVAQRSGNPVLMGFSSGDGYFENSPLMSQPVWERYRPDRFLNS NSGLQGLQFYRUIREERPNYRLECLQWLKSQPRWPSWGWNQVSCPCSWQQGRR DLRFQPVSIGRWGLGSRQLCSFTSWRGGVCCSYGPWGEFREGWHVQRPWQLAQ ELEPQSWCCRWNDKPYLCALYQQRRPHVGCATYRPPQPAWMFGDPHITTLDGVS YTFNGLGDFLLVGAQDGNSSFLLQGRTAQTGSAQATNFIAFAAQYRSSSLGPVTVQ WLLEPHDAIRVLLDNQTVTFQPDHEDGGGQETFNATGVLLSRNGSEVSASFDGWA TVSVIALSNILHASASLPPEYQNRTEGLLGVWNNNPEDDFRMPNGSTIPPGSPEEML FEIFGMTWQINGTGLLGKRNDQLPSNFTPVFYSQLQKNSSWAEHLISNCDGDSSCI YDTLALRNASIGLHTREVSKNYEQANATLNQYPPSINGGRVIEAYKGQTTLIQYTSNA EDANFTLRDSCTDLELFENGTLLWTPKSLEPFTLEILARSAKIGLASALQPRTVVCHC NAESQCLYNQTSRVGNSSLEVAGCKCDGGTFGRYCEGSEDACEEPCFPSVHCVP GKGCEACPPNLTGDGRHCAALGSSFLCQNQSCPVNYCYNQGHCYISQTLGCQPM CTCPPAFTDSRCFLAGNNFSPTVNLELPLRVIQLLLSEEENASMAEVNASVAYRLGT LDMRAFLRNSQVERIDSAAPASGSPIQHWMVISEFQYRPRGPVIDFLNNQLLAAVVE AFLYHVPRRSEEPRNDVVFQPISGEDVRDVTALNVSTLKAYFRCDGYKGYDLVYSP
QSGFTCVSPCSRGYCDHGGQCQHLPSGPRCSCVSFSIYTAWGEHCEHLSMKLDA FFGIFFGALGGLL LLGVGTFVVLRFWGCSGARFSYFLNSAEALP (SEQ ID NO: 191)
[0205]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno MCAM. A Tabela 7 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a MCAM. Tabela 7 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-MCAM (imaprelimabe) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCKAS
FSLTSNAVSWVRQPPGKALEWIAAIS QNIYNSLAWYQQKPGKAPKVLIFNAN SGGTTYYNSAFKSRLTISRD TSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR SLQTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
RYGYGWYFDFWGQGTLVTVSSA PEDFATYYCQQFYSGYTFGQGTKLEI (SEQ ID NO: 192) KR (SEQ ID NO: 196) CDR1 (SEQ ID NO: 193) - GFSLTSN CDR1 (SEQ ID NO: 197) - CDR2 (SEQ ID NO: 194) - SSGGT KASQNIYNSLA CDR3 (SEQ ID NO: 195) - CDR2 (SEQ ID NO: 198) - NANSLQT TYYCARRYG CDR3 (SEQ ID NO: 199) - QQFYSGYT anti-MCAM (ABX-MA1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSS
GSISSYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYY QSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPEIL TWTSNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFS LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFT LRLSSVTAADTAVYYCARDQGQWLL LKISRVEAEDVGVYYCMQAQQSPITF
PDAFDIWGQGTMVTVSS GQGTRLEIK (SEQ ID NO: 200) (SEQ ID NO: 204) CDR1 (SEQ ID NO: 201) - GGSISSY CDR1 (SEQ ID NO: 205) - CDR2 (SEQ ID NO: 202) - YYTWT RSSQSLLRSNGYNYLD CDR3 (SEQ ID NO: 203) - CDR2 (SEQ ID NO: 206) - LGSNRAS DQGQWLLPDAFDI CDR3 (SEQ ID NO: 207) -
MQAQQSPIT
[0206]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a MCAM podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 208 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 208
MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGL SQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQ VTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCV GRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDA QFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLA DGNPPPEIFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQGLDLDTMIS LLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETGQVL ERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVNVAIFGPPWMAFKERKVW VKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGV ECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEP ESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKSELVVEVKS DKLPEEMGLLQGSSGDKRAPGDQGEKYIDLRH
[0207]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno LRRC32. A Tabela 8 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a LRRC32. Tabela 8 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-LRRC32 (Publicação dos EUA No MAVLALLFCLVTFPSCILSQVQLKESG MKFPSQLLLFLLFRITGIICDIQVTQSS 2016/0272717) PGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGIN SYLSVSLGDRVTITCKASDHIKNWLA
WVRQPPGKGLEWLGMIWSDGSTDY WYQQKPGIAPRLLVSGATSLEAGVPS
NSVLTSRLRISKDNSNSQVFLKMNSL RFSGSGSGKNFTLSITSLQTEDVATY QVDDTARYYCARDRNYYDYDGAMD YCQQYWSTPWTFGGGTTLEIR (SEQ YWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 209) ID NO: 213) CDR1 (SEQ ID NO: 210) - CDR1 (SEQ ID NO: 214) -
GFSLTGYGIN KASDHIKNWLA CDR2 (SEQ ID NO: 211) - CDR2 (SEQ ID NO: 215) - GATSLEA MIWSDGSTDYNSVLTS CDR3 (SEQ ID NO: 216) - CDR3 (SEQ ID NO: 212) - QQYWSTPWT
DRNYYDYDGAMDY anti-LRRC32 (H198D-H3L4) VQLVESGGGLVKPSQTLSLTCTVSGF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQAS (Publicação Internacional No WO SLTSFHVSWVRQPPGKGLEWIATISS EDIYSGLAWYQQKPGKSPKLLIYGAG 2017/051888) GGGTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQVS SLQDGVPSRFSGSGSGTHYTLTISSL
LKLSSVTAADTAVYYCARISGWGHYY QPEDFATYFCQQGLKFPLTFGQGTK VMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: VEIKRT (SEQ ID NO: 221)
217) CDR1 (SEQ ID NO: 222) - CDR1 (SEQ ID NO: 218) - GFSLTSF QASEDIYSGLA CDR2 (SEQ ID NO: 219) - SSGGG CDR2 (SEQ ID NO: 223) - GAGSLQD CDR3 (SEQ ID NO: 220) - CDR3 (SEQ ID NO: 224) -
ISGWGHYYVMDV QQGLKFPLT
[0208]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a LRRC32 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 225 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
MRPQILLLLALLTLGLAAQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDT ETLDLSGNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNRL AMATALSAGGLGPLPRVTSLDLSGNSLYSGLLERLLGEAPSLHTLSLAENSLTRLTR HTFRDMPALEQLDLHSNVLMDIEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLRVL DLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKLLHFPDLAALPRLIYLNLSNNLIRLPT GPPQDSKGIHAPSEGWSALPLSAPSGNASGRPLSQLLNLDLSYNEIELIPDSFLEHL TSLCFLNLSRNCLRTFEARRLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRTLLLQG NALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPCGGPDEPGPSGCVAFSGITSLRSLSLV DNEIELLRAGAFLHTPLTELDLSSNPGLEVATGALGGLEASLEVLALQGNGLMVLQV DLPCFICLKRLNLAENRLSEILPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSAMGGLETSLR
RLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDATQDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCE KGGLKNINLIIILTFILVSAILLTTLAACCCVRRQKFNQQYKA (SEQ ID NO: 225)
[0209]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno sialil-Tn. A Tabela 9 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a sialil-Tn. Tabela 9 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-sialil-Tn (Bluebird) (Publicação QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS Internacional No WO 2017/040529) GYTFTDHAIHWVRQAPGQRLEWMG QSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPK
YFSPGNDDFKYSQKFQGRVTITADKS LLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF
ASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWI TLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTF MQYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: GQGTKVEIK (SEQ ID NO: 230) 226) CDR1 (SEQ ID NO: 231) - CDR1 (SEQ ID NO: 227) - KSSQSVLYSSNNKNYLA GYTFTDHAIH CDR2 (SEQ ID NO: 232) - WASTRES CDR2 (SEQ ID NO: 228) - CDR3 (SEQ ID NO: 233) -
YFSPGNDDFKYSQKFQG QQYYSYPLT CDR3 (SEQ ID NO: 229) - SWIMQY anti-sialil-Tn (Siamab Tx) (Publicação QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSG QIVLTQSPAVMSASPGEKVAITCSAS dos EUA No 2016/0311922) FSLTSYGWSWWRQPPGKGLEWLGV SSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTS
IWGDGSTNYHSALISRLSISKDNSKSQ NLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRM
VFLKLNSLQTDDTATYYCAKGGYFDY EAEDAATYYCQQRSSYPWTFGGGTK WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 234) LEIK (SEQ ID NO: 238) CDR1 (SEQ ID NO: 235) - GFSLTSYG CDR1 (SEQ ID NO: 239) - SSVSY CDR2 (SEQ ID NO: 236) - IWGDGST CDR2 (SEQ ID NO: 240) - STS CDR3 (SEQ ID NO: 237) - AKGGYFDY CDR3 (SEQ ID NO: 241) -
QQRSSYPWT
[0210]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a sialil-Tn podem ser identificados por triagem para ligação ao antígeno sialil-Tn ou um fragmento extracelular maduro do mesmo.
[0211]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno gpA33. A Tabela 10 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a gpA33. Tabela 10 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-gpA33 (KYOWA) (Publicação dos MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVL MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQS o EUA N 2009/0299039) SQLQVQESGPGLVKPSETLSLICTVS PATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYL
GGSIRTSGYYWGWFRQPPGKGLEWI AWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP GTSHNSGSTYYNPSLKSRVTISVDTS ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV
KNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARQG YYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKR YDFKVNIDVWGQGTTVTVSSAS (SEQ ID NO: 246) (SEQ ID NO: 242) CDR1 (SEQ ID NO: 247) - CDR1 (SEQ ID NO: 243) - RASQSVSSYLA GGSIRTSGY CDR2 (SEQ ID NO: 248) - DASNRAT CDR2 (SEQ ID NO: 244) - HNSGS CDR3 (SEQ ID NO: 249) - CDR3 (SEQ ID NO: 245) - QQRSNWPLT
QGYDFKVNIDV anti-gpA33 (DART-2w/Fc Versão 1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS DIQLTQSPSFLSASVGDRVICSARSSI (Publicação Internacional No WO GYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIG SFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLAS
2015/026894) RIYPGDGETNYNGKFKDRVIADKSSA GVPSRFSGSGSGTEFTLISSLEAEDA
YMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNVYF ATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 250) (SEQ ID NO: 254) CDR1 (SEQ ID NO: 251) - GSWMN CDR1 (SEQ ID NO: 255) - CDR2 (SEQ ID NO: 252) - SARSSISFMY RIYPGDGETNYNGKFKD CDR2 (SEQ ID NO: 256) - DTSNLAS CDR3 (SEQ ID NO: 253) - CDR3 (SEQ ID NO: 257) -
IYGNVYFDV QQWSSYPLT
[0212]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a gpA33 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 258 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 258
MVGKMWPVLWTLCAVRVTVDAISVETPQDVLRASQGKSVTLPCTYHTSTS SREGLIQWDKLLLTHTERVVIWPFSNKNYIEGELYKNRVSISNNAEQSDASITIDQLT MADNGTYECSVSLMSDLEGNTKSRVRLLVLVPPSKPECGIEGETIIGNNIQLTCQSK EGSPTPQYSWKRYNILNQEQPLAQPASGQPVSLKNISTDTSGYYICTSSNEEGTQF CNITVAVRSPSMNVALYVGIAVGVVAALIIIGIIIYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREA YEEPPEQLRELSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQ
[0213]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno GD3. A Tabela 11 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a GD3. Tabela 11 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-GD3 (KM871) (Publicação dos EVQLVESGGDFVQPGGSLRVSCAAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSAS o EUA N 2009/0226399) GFAFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVA QDISNYLNWYQQKPDKAPKLLIFYSS
YISSGGSGTYYSDSVKGRFTISRDNS NLHSGVPSRFSGGGSGTDYTLTISSL
KNTLYLQMRSLRAEDSAVYFCTRVKL QPEDIATYFCHQYSKLPWTFGQGTK GTYYFDSWGQGTLLTVSS (SEQ ID VEIKR (SEQ ID NO: 263) NO: 259) CDR1 (SEQ ID NO: 260) - HYAMS CDR1 (SEQ ID NO: 264) - CDR2 (SEQ ID NO: 261) - SASQDISNYLN YISSGGSGTYYSDSVKG CDR2 (SEQ ID NO: 265) - YSSNLHS
CDR3 (SEQ ID NO: 262) - CDR3 (SEQ ID NO: 266) -
VKLGTYYFDS HQYSKLPWT anti-GD3 (LD47) (Publicação dos EUA DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS No 2012/0276046) GFTFSNFGMHWVRQAPEKGLEWVA QDIGNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS
YISSGGSSINYADTVKGRFTISRDNPK RLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSL
NTLFLQMTSLRSEDTAIYYCTRGGTG QPEDFATYYCQQGKTLPYTFGGGTK TRSLYYFDWGQGATLIVSS (SEQ ID VEIK (SEQ ID NO: 271) NO: 267) CDR1 (SEQ ID NO: 272) - CDR1 (SEQ ID NO: 268) - NFGMH RASQDIGNFLN CDR2 (SEQ ID NO: 269) - CDR2 (SEQ ID NO: 273) - YTSRLQS YISSGGSSINYADTV CDR3 (SEQ ID NO: 274) - CDR3 (SEQ ID NO: 270) - QQGKTLPYT
GGTGTRSLYYFDY
[0214]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a GD3 podem ser identificados por triagem para ligação ao gangliosídeo GD3 ou um fragmento extracelular maduro do mesmo.
[0215]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno GM2. A Tabela 12 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a GM2. Tabela 12 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-GM2 (BIW-8962) (Publicação dos EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASG QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASS EUA No 2011/0236374) YTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGYI SVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSN
YPNNGGTGYNQKFKSKATLTVDKSS LASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRME
STAYMELHSLTSEDSAVYYCATYGHY AEDAATYYCQQRSSYPYTFGGGTKL YGYMFAWGQGTLVTVSA (SEQ ID EIKR (SEQ ID NO: 279) NO: 275) CDR1 (SEQ ID NO: 280) - CDR1 (SEQ ID NO: 276) - DYNMD SASSSVSYMH CDR2 (SEQ ID NO: 277) - CDR2 (SEQ ID NO: 281) - STSNLAS YIYPNNGGTGYNQKFK CDR3 (SEQ ID NO: 282) - CDR3 (SEQ ID NO: 278) - QQRSSYPYT
YGHYYGYMFAY anti-GM2 (Publicação Internacional No QVQLQQSGAELVKPGASVRLSCKTS DIVMTQSPSSLAVSAGDTVTINCRSS WO2004/083387) GYTFTTHYVSWVKQKPGQGLEWIGW QSLFSGNYNYLAWYQQKTGQTPKLLI
IFGGSARTNYNQKFQGKATLTVDTSS SYASTRHTGVPDRFVGSGSGTDFILTI
STAYMDLRSLTSDDSAVYFCVRQVG YNFQTEDLGDYYCQQHYSSPRTFGP WDDALDFWGQGTQVTVSS (SEQ ID GTKLKIK (SEQ ID NO: 287) NO: 283) CDR1 (SEQ ID NO: 288) - CDR1 (SEQ ID NO: 284) - QQHYSSPRT
QVGWDDALDF CDR2 (SEQ ID NO: 289) - YASTRHT CDR2 (SEQ ID NO: 285) - CDR3 (SEQ ID NO: 290) -
WIFGGSARTNYNQKFQG RSSQSLFSGNYNYLA CDR3 (SEQ ID NO: 286) - THYVS
[0216]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a GM2 podem ser identificados por triagem para ligação ao gangliosídeo GM2 ou um fragmento extracelular maduro do mesmo.
[0217]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno c-MET. A Tabela 13 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a c-MET. Tabela 13 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-c-MET(onartuzumabe) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSS
GYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVG QSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPK MIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSK LLIWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFT
NTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSY LTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTF VTPLDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID GQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 295) NO: 291) CDR1 (SEQ ID NO: 296) - CDR1 (SEQ ID NO: 292) - GYTFTSY QSLLYTSSQKNYLA ou Cotia CDR2 (SEQ ID NO: 293) – KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO: DPSNSDTRFNP ou Cotia DPSNSD 407) (SEQ ID NO: 406) CDR2 (SEQ ID NO: 297) - WASTRES CDR3 (SEQ ID NO: 294) - CDR3 (SEQ ID NO: 298) -
YRSYVTPLDY QQYYAYPWT Onartuzumabe-HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQ MNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 425) Onartuzumabe-LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL
QPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 426) anti-c-MET(emibetuzumabe) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVS
GYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMG SSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTS RVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDT NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL STSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARAN QPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTK
WLDYWGQGTTVTVSSA (SEQ ID NO: VEIKR (SEQ ID NO: 303) 299) CDR1 (SEQ ID NO: 304) - SSVSSIYLH CDR1 (SEQ ID NO: 300) - GYTFTDY ou Cotia SVSSSVSSIYLH (SEQ ID CDR2 (SEQ ID NO: 301) - NPNRRG NO: 410) CDR3 (SEQ ID NO: 302) - ANWLDY CDR2 (SEQ ID NO: 305) - STSNLAS CDR3 (SEQ ID NO: 306) -
QVYSGYPLT c-MET-Emibetuzumabe-HC (G.A)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTA YMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 427) c-MET-Emibetuzumabe-LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKWYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 428) ABT-700 (Abbvie) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSE
GYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMG SVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIY WIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDT RASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTI
SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEI SSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGG TTEFDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: GTKVEIK (SEQ ID NO: 417) 413) CDR1 (SEQ ID NO: 418) - CDR1 (SEQ ID NO: 414) - GYIFTAY KSSESVDSYANSFLH CDR2 (SEQ ID NO: 415) - KPNNGL CDR2 (SEQ ID NO: 419) - RASTRES CDR3 (SEQ ID NO: 416) - SEITTEFDY CDR3 (SEQ ID NO: 420) -
QQSKEDPLT c-MET-ABT700HC(G.A)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAY MELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 429) c-MET-ABT700LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
AEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 430)
[0218]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a c-MET podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 307 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPI QNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSG GVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQI EEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK DGFIVIFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRF CSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLN DDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNH EHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTI ANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKK ITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAI YKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNT LKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTG NYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYR EDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNS EIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNE NVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQ AISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYD ARVHTPEILDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQY PLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIG RGHFGCVYHGTLLDNDGKKIFICAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLL GICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKF VEIRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESL QTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDP
LYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSL LSSEDNADDEVDTRPASFWETS (SEQ ID NO: 307)
[0219]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno EPHA3. A Tabela 14 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a EPHA3. Tabela 14 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-EPHA3 (ifabotuzumabe) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS
GYTFTGYWMNWVRQAPGQGLEWM QGIISYLAWYQQKPEKAPKRLIYAASS GDIYPGSGNTNYDEKFQGRVTMTRD LQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQ
TSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARG PEDFATYYCGQYANYPYTFGQGTKL GYYEDFDSWGQGTTVTVSSA (SEQ EIKR (SEQ ID NO: 312) ID NO: 308) CDR1 (SEQ ID NO: 313) - QGIISYLA CDR1 (SEQ ID NO: 309) - GYTFTGY CDR2 (SEQ ID NO: 314) - AASSLQS CDR2 (SEQ ID NO: 310) - YPGSGN CDR3 (SEQ ID NO: 315) - CDR3 (SEQ ID NO: 311) - GQYANYPYT
GGYYEDFDS
[0220]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a EPHA3 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 316 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
MDCQLSILLLLSCSVLDSFGELIPQPSNEVNLLDSKTIQGELGWISYPSHGW EEISGVDEHYTPIRTYQVCNVMDHSQNNWLRTNWVPRNSAQKIYVELKFTLRDCNS IPLVLGTCKETFNLYYMESDDDHGVKFREHQFTKIDTIAADESFTQMDLGDRILKLNT EIREVGPVNKKGFYLAFQDVGACVALVSVRVYFKKCPFTVKNLAMFPDTVPMDSQS LVEVRGSCVNNSKEEDPPRMYCSTEGEWLVPIGKCSCNAGYEERGFMCQACRPG FYKALDGNMKCAKCPPHSSTQEDGSMNCRCENNYFRADKDPPSMACTRPPSSPR NVISNINETSVILDWSWPLDTGGRKDVTFNIICKKCGWNIKQCEPCSPNVRFLPRQF GLTNTTVTVTDLLAHTNYTFEIDAVNGVSELSSPPRQFAAVSITTNQAAPSPVLTIKK DRTSRNSISLSWQEPEHPNGIILDYEVKYYEKQEQETSYTILRARGTNVTISSLKPDTI YVFQIRARTAAGYGTNSRKFEFETSPDSFSISGESSQVVMIAISAAVAIILLTVVIYVLI GRFCGYKSKHGADEKRLHFGNGHLKLPGLRTYVDPHTYEDPTQAVHEFAKELDAT NISIDKVVGAGEFGEVCSGRLKLPSKKEISVAIKTLKVGYTEKQRRDFLGEASIMGQF DHPNIIRLEGVVTKSKPVMIVTEYMENGSLDSFLRKHDAQFTVIQLVGMLRGIASGM KYLSDMGYVHRDLAARNILINSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWT SPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVLWEVMSYGERPYWEMSNQDVIKAVDEGYRLPPP MDCPAALYQLMLDCWQKDRNNRPKFEQIVSILDKLIRNPGSLKIITSAAARPSNLLLD
QSNVDITTFRTTGDWLNGVWTAHCKEIFTGVEYSSCDTIAKISTDDMKKVGVTVVGP QKKIISSIKALETQSKNGPVPV (SEQ ID NO: 316)
[0221]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno TNFRSF10. A Tabela 15 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a TNFRSF10. Tabela 15 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve Anti-TNFRSF10 (T1014G03) EVQLVQSGAEVKMPGASVKLSCRVS SALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSS o (Publicação dos EUA N GDTFTAYFIHWVRQAPGQGLEWMG DIGAYKYVSWYQQHPGKAPKLVIYEV 2009/0226429) WFNPISGTAGSAEKFRGRVAMTRDT SNRPSGVSSRFSGSKSGQTASLTISG
SISTAYMELNRLTFDDTAVYYCARQH LQADDEADYYCNSYQGYNTWVFGG RGNTFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID GTKVTVLG (SEQ ID NO: 321) NO: 317) CDR1 (SEQ ID NO: 322) - CDR1 (SEQ ID NO: 318) - DTFTAYFIH TGTSSDIGAYKYVS CDR2 (SEQ ID NO: 319) - CDR2 (SEQ ID NO: 323) - EVSNRPS WFNPISGTAGSAEKFRG CDR3 (SEQ ID NO: 324) - CDR3 (SEQ ID NO: 320) - SYQGYNTWV
QHRGNTFDP anti-TNFRSF10 (m921) (Publicação QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISG QPVLTQPPSASATPGQRVTISCSGSS dos EUA No 2013/0156781) DSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLG SNIGSNTLDWFQQLPGTAPKLLIFDTN
RTYYRSKWYNDYAVSVKGRITINPDT RRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGL
SKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDL QAEDEAVYFCATWDNSLNGAVFGGG GVAAADSYYYYGMDVWGQGTTVTV TKLSVP (SEQ ID NO: 329) SS (SEQ ID NO: 325) CDR1 (SEQ ID NO: 330) - SSNIGSNT CDR1 (SEQ ID NO: 326) - CDR2 (SEQ ID NO: 331) - DTN GDSVSSNSAA CDR3 (SEQ ID NO: 332) - CDR2 (SEQ ID NO: 327) - ATWDNSLNGAVF
TYYRSKWYN CDR3 (SEQ ID NO: 328) -
ARDLGVAAADSYYYYGMDVW
[0222]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a TNFRSF10 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 333 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 333
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGG GRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVIIKTFKFVVVGVLLQVVP SSAATIKLEIDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSEIRSEHPGACNRCTEGVGYTNASN NLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSRGCPRG MVKVKDCTPWSDIECVEIKESGNGHNIWVILVVTLVVPLLLVAVLIVCCCIGSGCGGD PKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQQMESQEPADLTGV TVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRRRLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQ LMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEER HAREKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE
[0223]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno TNFSF11. A Tabela 16 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a TNFSF11. Tabela 16 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-TNFSF11 (denosumabe) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS
GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS QSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYG GITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISR
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDP LEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGT GTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS KVEIK (SEQ ID NO: 338) (SEQ ID NO: 334) CDR1 (SEQ ID NO: 339) - CDR1 (SEQ ID NO: 335) - GFTFSSY QSVRGRYLA CDR2 (SEQ ID NO: 336) - TGSGGS CDR2 (SEQ ID NO: 340) - GASSRAT CDR3 (SEQ ID NO: 337) - CDR3 (SEQ ID NO: 341) -
DPGTTVIMSWFDP QQYGSSPRT anti-TNFSF11 (H4H010P) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRAS o (Publicação dos EUA N GFTFSGYGMHWVRQAPGKGLDWVT QNISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKAS 2012/0114665) VISYDGSNKHYADSVKGRFTISRDNS SLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTVSSL
KNTLYLQMSSLGPEDTAVYYCAKSLS QPDDFATYYCQQYNRYSWTFGQGT GTYWGYGMDVWGQGTTVTVS (SEQ KVEIK (SEQ ID NO: 346) ID NO: 342) CDR1 (SEQ ID NO: 347) - QNISSW CDR1 (SEQ ID NO: 343) - GFTFSGYG CDR2 (SEQ ID NO: 348) - KAS
CDR2 (SEQ ID NO: 344) - ISYDGSNK CDR3 (SEQ ID NO: 349) - CDR3 (SEQ ID NO: 345) - QQYNRYSWT
CAKSLSGTYWGYGMDV
[0224]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a TNFSF11 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 350 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 350
MRRASRDYTKYLRGSEEMGGGPGAPHEGPLHAPPPPAPHQPPAASRSMF VALLGLGLGQVVCSVALFFYFRAQMDPNRISEDGTHCIYRILRLHENADFQDTTLES QDTKLIPDSCRRIKQAFQGAVQKELQHIVGSQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEA QPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTESNGKLIVNQDGFYYLYAN ICFREIHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKWSGNSEFEIFYSINV GGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID
[0225]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno CD74. A Tabela 17 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a CD74. Table 17 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-CD74 (milatuzumabe) QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKAS DIQLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQ
GYTFTNYGVNWIKQAPGQGLQWMG SLVEIRNGNTYLHWFQQRPGQSPRL WINPNTGEPTFDDDFKGRFAFSLDTS LIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT
VSTAYLQISSLKADDTAVYFCSRSRG LKISRVEAEDVGVYFCSQSSHVPPTF KNEAWFAYWGQGTLVTVSSA (SEQ GAGTRLEIKR (SEQ ID NO: 355) ID NO: 351) CDR1 (SEQ ID NO: 356) - CDR1 (SEQ ID NO: 352) - GYTFTNY QSLVHRNGNTYLH CDR2 (SEQ ID NO: 353) - CDR2 (SEQ ID NO: 357) - TVSNRFS NPNTGEPTFDD CDR3 (SEQ ID NO: 358) - CDR3 (SEQ ID NO: 354) - SQSSHVPPT
SRGKNEAWFAY anti-CD74 (1B11) (Publicação dos EUA EVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKAS LEIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRAS o N 2014/0170168) GYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMG QNIGSILAWYQHKPGQAPRLLIYGAS
WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDT TRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQ
STSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDI SDDFAVYYCQQYLYWPFTFGGGTKV RAYGSGSYSRYYYYGMDVWGQGTT EIK (SEQ ID NO: 363) VTVSS (SEQ ID NO: 359) CDR1 (SEQ ID NO: 364) - CDR1 (SEQ ID NO: 360) - RASQNIGSILA GYTFTSYGIS CDR2 (SEQ ID NO: 365) - GASTRAT CDR2 (SEQ ID NO: 361) - CDR3 (SEQ ID NO: 366) -
WISAYNGNTNYAQKLQ QQYLWPFT CDR3 (SEQ ID NO: 362) -
DIRAYGSGSYSRYYYYGMDV
[0226]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a CD74 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 367 ou SEQ ID NO: 368 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 367
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGAL YTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSK MRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMEILLQNADPLKVYPPLKG SFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMEIRWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKVLTKCQE EVSHIPAVHPGSFRPKCDENGNYLPLQCYGSIGYCWCVFPNGTEVPNTRSRGEIHN
CSESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM SEQ ID NO: 368
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGAL YTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSK MRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMEILLQSHWNWRTRLLG WV
[0227]Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 nas células matadoras naturais, e ao antígeno PMEL. A Tabela 18 lista algumas sequências exemplares de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a PMEL. Tabela 18 Clones Sequência de aminoácidos de domínio Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve anti-PMEL (17A9) (Publicação dos EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKSS DVQITQSPSYLAASPGETITINCRATK o EUA N 2017/0240645) GYSFTRYTMNWVKQSHGKNLEWIGV SISKYLAWYQEQPGKTNNLLIYSGSTL
INPYNGGTVYNQKFKGKATLTVDKSS QSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPE
STAYMELLSLTSEDSAVYYCARTDYD DFAMYYCQQHNEYPYTFGSGTKLEIK GYAMDYWGQGTSVTVSSAKT (SEQ (SEQ ID NO: 373) ID NO: 369) CDR1 (SEQ ID NO: 374) - CDR1 (SEQ ID NO: 370) - RATKSISKYLA GYSFTRYTMN CDR2 (SEQ ID NO: 375) - SGSTLQS CDR2 (SEQ ID NO: 371) - CDR3 (SEQ ID NO: 376) -
VINPYNGGTVYNQKFKG QQHNEYPYT CDR3 (SEQ ID NO: 372) -
TDYDGYAMDY anti-PMEL (8G3) (Publicação dos EUA EVQLQQSGPELVKPGASMRISCKAS DVQITQSPSYLDASPGETITINCRASK No 2017/0240645) GYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGV TISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTL
YNPYNGGTVYNQKFKGKATLTVDKS QSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPE
SSTTYMELLSLTSEDSAVYYCARTDS DFAMYYCQQHNEYPYTFGSGTKLEIK GGYAMDCWGQGTSVTVSSAKT (SEQ ID NO: 381) (SEQ ID NO: 377) CDR1 (SEQ ID NO: 382) - CDR1 (SEQ ID NO: 378) - RASKTISKYLA GYSFTGYTMN CDR2 (SEQ ID NO: 383) - SGSTLQS CDR2 (SEQ ID NO: 379) - CDR3 (SEQ ID NO: 384) -
VYNPYNGGTVYNQKFKG QQHNEYPYT CDR3 (SEQ ID NO: 380) -
TDSGGYAMDC
[0228]Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a PMEL podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 385 ou um fragmento extracelular maduro da mesma.
SEQ ID NO: 385
MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYP EWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWV NNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQW QVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFS VSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISR ALVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGEIRPTAEAPNTTAGQVP TTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEV MGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDA SSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQ AVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLH QILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQVPLIVGILLVLMAVVLAS LIYRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV
[0229]Dentro do domínio Fc, a ligação de CD16 é mediada pela região de dobradiça e o domínio CH2. Por exemplo, dentro da IgGl humana, a interação com CD16 é principalmente focada em resíduos de aminoácido Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239, e resíduo de carboidrato N-acetil- D-glicosamina no domínio CH2 (ver, Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273).
Com base nos domínios conhecidos, as mutações podem ser selecionadas para intensificar ou reduzir a afinidade de ligação a CD16, tal como usando-se bibliotecas exibidas em fagos ou bibliotecas de cDNA exibidas em superfície de levedura, ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.
[0230]A montagem de cadeias pesadas de anticorpo heterodimérico pode ser realizada expressando-se duas sequências de cadeia pesada de anticorpo diferentes na mesma célula, que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada de anticorpo, assim como montagem de heterodímeros. A promoção da montagem preferencial de heterodímeros pode ser realizada incorporando-se diferentes mutações no domínio CH3 de cada região constante de cadeia pesada de anticorpo como mostrado em US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 e US14/830336. Por exemplo, as mutações podem ser feitas no domínio CH3 com base em IgGl humana e incorporando pares distintos de substituições de aminoácido dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que permite essas duas cadeias se heterodimerizem seletivamente entre si. As posições de substituições de aminoácido ilustradas abaixo são todas numeradas de acordo com o índice da EU como em Kabat.
[0231]Em um cenário, uma substituição de aminoácido no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original com um aminoácido maior, selecionado de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W), e pelo menos uma substituição de aminoácido no segundo polipeptídeo substitui os aminoácidos originais com aminoácidos menores, escolhidos de alanina (A), serina (S), treonina (T) ou valina (V), tal que a substituição de aminoácido maior (um protuberância) se encaixa na superfície das substituições de aminoácido menor (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição de T366W, e o outro pode incorporar três substituições incluindo T366S, L368A e Y407V.
[0232]Um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo da invenção pode, opcionalmente, ser acoplado a uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica a uma região constante de anticorpo, tal como uma região constante de IgG incluindo dobradiça, domínios CH2 e CH3 com ou sem domínio CH1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90 % idêntica a uma região constante de anticorpo humano, tal como um região constante de IgG1 humana, uma região constante de IgG2, região constante de IgG3 ou região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90 % idêntica a uma região constante de anticorpo de um outro mamífero, tal como coelho, cão, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante em comparação com a região constante de IgG1 humana, por exemplo, em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e/ou K439. Substituições exemplares incluem, por exemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T3661, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V,
K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, K409R, T411D, T411E, K439D e K439E.
[0233]Em certas modalidades, as mutações que podem ser incorporadas na CH1 de uma região constante de IgG1 humana pode ser no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, as mutações que podem ser incorporadas na CK de uma região constante de IgG1 humana pode ser no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou T164.
[0234]Alternativamente, as substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela
19. Tabela 19 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S Conjunto 9 L368D/K370S S364K Conjunto 10 L368E/K370S S364K Conjunto 11 K360E/Q362E D401K Conjunto 12 L368D/K370S S364K/E357L Conjunto 13 K370S S364K/E357Q Conjunto 14 F405L K409R Conjunto 15 K409R F405L
[0235]Alternativamente, as substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela
20. Tabela 20 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 K409W D399V/F405T Conjunto 2 Y349S E357W Conjunto 3 K360E Q347R Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
[0236]Alternativamente, as substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir do seguinte conjunto de substituições mostrados na Tabela 21. Tabela 21 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D
[0237]Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido em cada cadeia de polipeptídeo pode ser selecionada de Tabela 22. Tabela 22 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y4071, T366V, T3661, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, Y407V K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E
[0238]Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido pode ser selecionada do seguinte conjunto de substituições na Tabela 23, onde as posições indicadas na primeira coluna de polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido negativamente carregado conhecido, e as posições indicadas na segunda coluna de polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido positivamente carregado conhecido. Tabela 23 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo K392, K370, K409 ou K439 D399, E356 ou E357
[0239]Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto na Tabela 24, onde as posições indicadas na primeira coluna de polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido positivamente carregado conhecido, e as posições indicadas na segunda coluna de polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido negativamente carregado conhecido. Tabela 24 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo
D399, E356 ou E357 K409, K439, K370 ou K392
[0240]Alternativamente, as substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir do seguinte conjunto na Tabela 25. Tabela 25 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo T350V, L351Y, F405A e Y407V T350V, T366L, K392L e T394W
[0241]Alternativamente, ou além disso, a estabilidade estrutural de uma proteína hetero-multimérica pode ser aumentada introduzindo-se S354C na primeira ou segunda cadeia de polipeptídeo, e Y349C na cadeia de polipeptídeo oposta, que forma uma ponte dissulfeto artificial dentro da interface dos dois polipeptídeos.
[0242]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl na posição T366, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, L368 e Y407.
[0243]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, L368 e Y407, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl na posição T366.
[0244]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349,
E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411.
[0245]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411.
[0246]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, D399, S400 e Y407 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, N390, K392, K409 e T411.
[0247]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, N390, K392, K409 e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, D399, S400 e Y407.
[0248]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, Y349, K360, e K409, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, E357, D399 e F405.
[0249]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, E357, D399 e F405, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, K360, Q347 e K409.
[0250]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em K370, K392, K409 e K439, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em D356, E357 e D399.
[0251]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em D356, E357 e D399, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em K370, K392, K409 e K439.
[0252]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, E356, T366 e D399, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, L351, L368, K392 e K409.
[0253]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, L351, L368, K392 e K409, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, E356, T366 e D399.
[0254]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de S354C e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de Y349C.
[0255]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de Y349C e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 por uma substituição de S354C.
[0256]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de K360E e K409W, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de Q347R, D399V e F405T.
[0257]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de Q347R, D399V e F405T e, em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de K360E e K409W.
[0258]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por uma substituição de T366W, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de T366S, T368A e Y407V.
[0259]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de T366S, T368A e Y407V, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por uma substituição de T366W.
[0260]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de T350V, L351Y, F405A e Y407V, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de T350V, T366L, K392L e T394W.
[0261]Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de T350V, T366L, K392L e T394W, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia de polipeptídeo da região constante de anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante de IgGl por substituições de T350V, L351Y, F405A e Y407V.
Proteínas de ligação multiespecíficas exemplares
[0262]Um TriNKET da presente divulgação é A49MI-Duobody-TriNKET- Onartuzumabe. A49MI-Duobody-TriNKET-Onartuzumabe compreende quatro cadeias de polipeptídeo: (a) Onartuzumabe-HC: a porção de cadeia pesada de anticorpo anti-c-MET onartuzumabe (SEQ ID NO: 425); (b) Onartuzumabe-LC: a porção de cadeia leve de anticorpo anti-c-MET onartuzumabe (SEQ ID NO: 426); (c) A49MI-HC: a porção de cadeia pesada de anticorpo anti-NKG2D A49MI (SEQ ID NO: 423); e (d) A49MI-LC: a porção de cadeia leve de anticorpo anti-NKG2D A49MI (SEQ ID NO: 424). O domínio Fc de SEQ ID NO: 425 compreende uma mutação F405L, e o domínio Fc de SEQ ID NO: 423 compreende uma mutação K409R, facilitando assim a heterodimerização de Fc. As sequências de A49MI-Duobody-TriNKET-Onartuzumabe são fornecidas abaixo. As CDRs sob numeração de Chothia destas sequências estão sublinhadas.
Onartuzumabe-HC (SEQ ID NO: 425)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSWLHWVRQAPGKGLEWVG MIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPL DWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPG A49MI-HC (SEQ ID NO: 423)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAA GWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPG A49MI-LC (SEQ ID NO: 424)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAA SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV
TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC Onartuzumabe-LC (SEQ ID NO: 426)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPK LLIWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0263]Um outro TriNKET da presente divulgação é A49MI-Duobody-TriNKET- Emibetuzumabe. A49MI-Duobody-TriNKET-Emibetuzumabe compreende quatro cadeias de polipeptídeo: (a) Emibetuzumabe-HC: a porção de cadeia pesada de anticorpo anti-c-MET emibetuzumabe (SEQ ID NO: 427); (b) Emibetuzumabe-LC: a porção de cadeia leve de anticorpo anti-c-MET emibetuzumabe (SEQ ID NO: 428); (c) A49MI-HC: a porção de cadeia pesada de anticorpo anti-NKG2D A49MI (SEQ ID NO:
423); e (d) A49MI-LC: a porção de cadeia leve de anticorpo anti-NKG2D A49MI (SEQ ID NO: 424). O domínio Fc de SEQ ID NO: 427 compreende uma mutação F405L, e o domínio Fc de SEQ ID NO: 423 compreende uma mutação K409R, facilitando assim a heterodimerização de Fc. As sequências de A49MI-Duobody-TriNKET- Emibetuzumabe são fornecidas abaixo. As CDRs sob numeração de Chothia destas sequências estão sublinhadas.
Emibetuzumabe-HC (SEQ ID NO: 427)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWM GRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLD WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPG A49MI-HC (SEQ ID NO: 423)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAA GWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPG A49MI-LC (SEQ ID NO: 424)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAA SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV
TEQDSKDSTY SLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC Emibetuzumabe-LC (SEQ ID NO: 428)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKWYSTS NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0264]Um outo TriNKET da presente divulgação é A49MI-Duobody-TriNKET- ABT-700. A49MI-Duobody-TriNKET-ABT-700 compreende quatro cadeias de polipeptídeo: (a) ABT-700-HC: a porção de cadeia pesada de anticorpo anti-c-MET ABT-700 (SEQ ID NO: 429); (b) ABT-700-LC: a porção de cadeia leve de anticorpo anti-c-MET ABT-700 (SEQ ID NO: 430); (c) A49MI-HC: a porção de cadeia pesada de anticorpo anti-NKG2D A49MI (SEQ ID NO: 423); e (d) A49MI-LC: a porção de cadeia leve de anticorpo anti-NKG2D A49MI (SEQ ID NO: 424). O domínio Fc de SEQ ID NO: 429 compreende uma mutação F405L, e o domínio Fc de SEQ ID NO: 423 compreende uma mutação K409R, facilitando assim a heterodimerização de Fc. As sequências de A49MI-Duobody-TriNKET-ABT-700 são fornecidas abaixo. As CDRs sob numeração de Chothia destas sequências estão sublinhadas.
ABT-700-HC (SEQ ID NO: 429)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMG WIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFD WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPG A49MI-HC (SEQ ID NO: 423)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVS SISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAA GWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPG A49MI-LC (SEQ ID NO: 424)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAA SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV
TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ABT-700-LC (SEQ ID NO: 430)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKW YRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0265]As proteínas multiespecíficas descritas acima podem ser fabricadas usando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida a um especialista na técnica.
Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; e o primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser estavelmente transfectados juntos em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas.
[0266]Para atingir o rendimento mais alto da proteína multiespecífica, diferentes razões do primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser exploradas para determinar a razão ideal para transfecção nas células hospedeiras.
Após a transfecção, os clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, tais como diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.
[0267]Os clones podem ser cultivados em condições adequadas para aumento de escala do biorreator e expressão mantida da proteína multiespecífica. As proteínas multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração profunda, lise celular, homogeneização, congelamento-descongelamento, purificação por afinidade, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca de interação hidrofóbica e cromatografia de modo misto.
II. CARACTERÍSTICAS DAS PROTEÍNAS MULTIESPECÍFICAS
[0268]As proteínas multiespecíficas aqui descritas incluem um sítio de ligação a NKG2D, um sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, e um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.
Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas contêm um sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, conforme exemplificado no formato F4-TriNKET.
[0269]Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas exibem estabilidade térmica semelhante ao anticorpo monoclonal correspondente, i.e., um anticorpo monoclonal contendo o mesmo sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor como aquele incorporado nas proteínas multiespecíficas (e.g., um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL).
[0270]Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas se ligam às células que expressam NKG2D e/ou CD16, tais como células NK, e células tumorais que expressam o antígeno associado ao tumor simultaneamente. A ligação das proteínas multiespecíficas às células NK podem intensificar a atividade das células NK para a destruição das células tumorais.
[0271]Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas se ligam ao antígeno associado ao tumor com uma afinidade semelhante ao antígeno associado ao tumor anticorpo monoclonal correspondente (i.e., um anticorpo monoclonal contendo o mesmo sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor como aquele incorporado nas proteínas multiespecíficas, por exemplo, um anticorpo monoclonal contendo o mesmo sítio de ligação a KIT como aquele incorporado nas proteínas multiespecíficas). Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas são mais eficazes na morte de células tumorais que expressam o antígeno associado ao tumor do que os anticorpos monoclonais de antígeno associado ao tumor correspondentes.
[0272]Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas aqui descritas, que incluem um sítio de ligação para um antígeno associado ao tumor selecionado de
KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, ativam células NK humanas primárias quando cocultivadas com células que expressam o antígeno associado ao tumor. A ativação de célula NK é marcada pelo aumento na desgranulação de CD107a e produção de citocina IFN-y. Além disso, comparadas a um anticorpo monoclonal de antígeno associado ao tumor correspondente, as proteínas multiespecíficas podem mostrar ativação superior de células NK humanas na presença de células que expressam o antígeno associado ao tumor.
[0273]Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas aqui descritas, que incluem um sítio de ligação para um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, intensificam a atividade de descanso e as células NK humanas ativadas por IL-2 quando cocultivadas com células que expressam o antígeno associado ao tumor selecionado.
[0274]Em algumas modalidades, comparadas ao anticorpo monoclonal correspondente que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL, as proteínas multiespecíficas oferecem uma vantagem no alvejamento de células tumorais que expressam níveis médios e baixos do antígeno associado ao tumor.
[0275]Em algumas modalidades, o formato F4bivalente de TriNKETs (i.e., TriNKETs incluem um sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL) melhora a avidez com que as TriNKETs se ligam a um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL,
que em efeito estabiliza a expressão e manutenção de altos níveis do antígeno associado ao tumor selecionado (e.g., KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 ou PMEL) na superfície de célula tumoral. Em algumas modalidades, as F4-TriNKETs medeiam a morte mais potente de células tumorais que expressam o antígeno associado ao tumor selecionado (e.g., KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 ou PMEL) do que as F3-TriNKETs ou F3’-TriNKETs correspondentes.
III. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
[0276]A invenção fornece métodos para tratar câncer usando uma proteína de ligação multiespecífica aqui descrita e/ou uma composição farmacêutica aqui descrita.
Os métodos podem ser usados para tratar uma variedade de cânceres que expressam um antígeno associado ao tumor selecionado de KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de KIT podem ser câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, tumor estromal gastrointestinal, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado e câncer testicular. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de F3 podem ser câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, sarcomas e câncer colorretal.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas de proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de IGF1R podem ser câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer de próstata, sarcoma, câncer da tireoide, câncer renal, câncer colorretal,
câncer pancreático, gliobastoma e câncer de fígado.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de Lewis Y podem ser câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo e leucemia mieloide aguda.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de MUC13 podem ser câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal,
câncer cervical e colangiocarcinoma.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de MUC4 podem ser câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, leucemia linfoblástica aguda, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de MCAM podem ser melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas, sarcoma, câncer colorretal, câncer pancreático e câncer renal.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de LRRC32 podem ser câncer renal,
câncer pancreático, sarcoma, câncer ovariano, câncer de pulmão, gliobastoma,
câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de mama e câncer cervical.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de sialil-Tn podem ser câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de mama.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de gpA33 podem ser câncer colorretal, câncer gástrico e câncer esofágico.
Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de GD3 podem ser câncer de pulmão,
glioma, câncer de mama, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático e neuroblastoma. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de GM2 podem ser câncer gástrico, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, câncer cervical, neuroblastoma, melanoma, câncer de pulmão, mesotelioma e câncer de fígado. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de c-MET podem ser câncer renal, câncer da tireoide, melanoma, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer colorretal e câncer de cabeça e pescoço. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de EPHA3 podem ser câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão, e sarcoma. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de TNFRSF10A podem ser câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de TNFSF11 podem ser câncer de mama, câncer de próstata e um câncer ósseo metastático. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de CD74 podem ser câncer difuso de grandes células B, uma malignidade de células B, câncer renal, câncer de pulmão, câncer ovariano, melanoma, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de bexiga, glioma, câncer de mama e leucemia. Cânceres exemplares a serem tratados pelas proteínas de ligação multiespecíficas de alvejamento de PMEL podem ser melanoma e sarcomas.
[0277]Em algumas outras modalidades, o câncer é câncer de mama, ovário, esôfago, bexiga ou gástrico, carcinoma do ducto salivar, carcinomas do ducto salivar, adenocarcinoma do pulmão ou formas agressivas de câncer uterino, tais como carcinoma endometrial seroso uterino. Em algumas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal,
câncer do endométrio, câncer esofágico, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de reto, câncer renal,
câncer de estômago, câncer testicular ou câncer uterino.
Em ainda outras modalidades, o câncer é um carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma,
carcinoma de células pequenas, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (e.g., um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer de laringe, câncer de parótida, câncer do trato biliar, câncer de tireoide, melanoma lentiginoso acral, ceratoses actínicas,
leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoide cístico,
adenomas, adenossarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer de canal anal,
câncer anal, câncer de anorreto, câncer astrocítico, carcinoma da glândula Bartholin,
carcinoma de células basais, câncer biliar, câncer ósseo, câncer da medula óssea,
câncer brônquico, carcinoma da glândula brônquica, carcinoide, colangiocarcinoma,
condossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coroide, leucemia linfocítica crônica,
leucemia mieloide crônica, carcinoma de células claras, câncer do tecido conjuntivo,
cistadenoma, câncer do sistema digestivo, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, câncer de células endoteliais, câncer ependimal, câncer de células epiteliais, sarcoma de Ewing, câncer de olho e órbita,
câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer de vesícula biliar, câncer antro gástrico, câncer de fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma,
câncer cardíaco, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular,
doença de Hodgkin, câncer de íleo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliais, câncer de ducto biliar intra-hepático, carcinoma de células escamosas invasivo, câncer de jejuno, câncer de articulações, sarcoma de
Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de células grandes, câncer de intestino grosso,
leiomiossarcoma, lentigo maligno melanomas, linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblasma, meduloepitelioma, câncer meníngeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer de boca, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, adenocarcinoma neuroepitelial melanoma nodular, linfoma de pele não epitelial, câncer de células não Hodgkin, carcinoma de células de aveia, câncer oligodendroglial, câncer de cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, câncer de pênis, câncer de faringe, tumores hipofisários, plasmocitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de pele, carcinoma seroso, câncer de seio, carcinoma de células pequenas, câncer de intestino delgado, câncer de músculo liso, câncer de tecido mole, tumor secretor de somatostatina, câncer de coluna, carcinoma de células escamosas, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma de disseminação superficial, leucemia de células T, câncer de língua, carcinoma indiferenciado, câncer de ureter, câncer de uretra, câncer de bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer de colo uterino, câncer de corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso, VIPoma, câncer de vulva, carcinoma bem diferenciado ou tumor de Wilms.
[0278]Em algumas outras modalidades, o câncer a ser tratado é o linfoma não-Hodgkin, como um linfoma de células B ou um linfoma de células T. Em certas modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células B, como um linfoma difuso de grandes células B, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células do manto, linfoma de células B de zona marginal, linfoma de células B de zona marginal extranodal, linfoma de células B de zona marginal nodal, linfoma de células B de zona marginal esplênica, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocitário, leucemia de células pilosas ou linfoma do sistema nervoso central (CNS) primário. Em certas outras modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células T, como um linfoma linfoblástico T precursor, linfoma de células T periférico, linfoma cutâneo de células T, linfoma angioimunoblástico de células T, linfoma de células matadoras naturais extranodais/T, linfoma de células T de tipo enteropático, linfoma de células T semelhante a paniculite subcutânea, linfoma anaplásico de células grandes ou linfoma de células T periférico.
[0279]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a KIT pode ser usada para tratar câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, tumor estromal gastrointestinal, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado ou câncer testicular.
[0280]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a F3 pode ser usada para tratar câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, sarcoma ou câncer colorretal.
[0281]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a IGF1R pode ser usada para tratar câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer de próstata, sarcoma, câncer da tireoide, câncer renal, câncer colorretal, câncer pancreático, gliobastoma ou câncer de fígado.
[0282]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a Lewis Y pode ser usada para tratar câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo ou leucemia mieloide aguda.
[0283]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a MUC13 pode ser usada para tratar câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal, câncer cervical ou colangiocarcinoma.
[0284]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a MUC4 pode ser usada para tratar câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, leucemia linfoblástica aguda, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de próstata.
[0285]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a MCAM pode ser usada para tratar melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas, sarcoma, câncer colorretal, câncer pancreático ou câncer renal.
[0286]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a LRRC32 pode ser usada para tratar. Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a pode ser usada para tratar câncer renal, câncer pancreático, sarcoma, câncer ovariano, câncer de pulmão, gliobastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de mama ou câncer cervical.
[0287]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a sialil-Tn pode ser usada para tratar câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer colorretal, ou câncer de mama.
[0288]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a gpA33 pode ser usada para tratar câncer colorretal, câncer gástrico ou câncer esofágico.
[0289]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a GD3 pode ser usada para tratar câncer de pulmão, glioma, câncer de mama, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático ou neuroblastoma.
[0290]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a GM2 pode ser usada para tratar câncer gástrico, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, câncer cervical, neuroblastoma, melanoma, câncer de pulmão, mesotelioma ou câncer de fígado.
[0291]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a c- MET pode ser usada para tratar câncer renal, câncer da tireoide, melanoma, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer colorretal ou câncer de cabeça e pescoço.
[0292]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a EPHA3 pode ser usada para tratar câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão ou sarcoma.
[0293]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a TNFRSF10A pode ser usada para tratar câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço.
[0294]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a TNFSF11 pode ser usada para tratar câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer ósseo metastático.
[0295]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD74 pode ser usada para tratar câncer difuso de grandes células B, uma malignidade de células B, câncer renal, câncer de pulmão, câncer ovariano, melanoma, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de bexiga, glioma, câncer de mama ou leucemia.
[0296]Em algumas modalidades, uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno que se liga a PMEL pode ser usada para tratar melanoma ou um sarcoma.
IV. TERAPIA DE COMBINAÇÃO
[0297]Um outro aspecto da invenção fornece terapia de combinação. Uma proteína de ligação multiespecífica aqui descrita pode ser usada em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar câncer.
[0298]Agentes terapêuticos exemplares que podem ser usados como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer, incluem, por exemplo, radiação, mitomicina, tretinoina, ribomustina, gencitabina, vincristina, etoposídeo, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carboquona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorrelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatina, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, ansacrina, proglumida, acetato de eliptínio, cetanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoina, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocina, carmofur, razoxano, sizofilano, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, teniposídeo, improsulfano, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferon- beta, interferon-gama (IFN-y), fator de estimulação de colônia-1, fator de estimulação de colônia-2, denileucina diftitox, interleucina-2, fator de liberação de hormônio luteinizante e variações dos agentes anteriormente mencionados que podem exibir ligação diferencial a seu receptor cognato, ou meia-vida aumentada ou diminuída do soro.
[0299]Uma classe adicional de agentes que pode ser usada como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer é inibidores de ponto de controle imunológico. Inibidores de ponto de controle imunológico exemplares incluem agentes que inibem um ou mais dentre (i) antígeno associado a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA4), (ii) proteína de morte celular programada 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 e (vii) TIM3. O inibidor CTLA4 ipilimumabe foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para tratar melanoma.
[0300]Ainda, outros agentes que podem ser usados como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer são agentes de anticorpo monoclonal que alvejam alvos que não ponto de controle (e.g., herceptina) e agentes não citotóxicos (e.g., inibidores de tirosina-cinase).
[0301]Ainda outras categorias de agentes anti-câncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado de um Inibidor de ALK, um Inibidor de ATR, um Antagonista A2A, um Inibidor de Reparo de Excisão de Base, um Inibidor de Tirosina Cinase Bcr- Abl, um Inibidor de Tirosina Cinase de Bruton, um Inibidor de CDC7, um Inibidor de CHK1, um Inibidor de Cinase Dependente de Ciclina, um Inibidor de DNA-PK, um Inibidor de DNA-PK e mTOR, um Inibidor de DNMT1, um Inibidor de DNMT1 mais 2- cloro-desoxiadenosina, um Inibidor de HDAC, um Inibidor da Via de Sinalização de Hedgehog, um Inibidor de IDO, um Inibidor de JAK, um Inibidor de mTOR, um Inibidor de MEK, um Inibidor de MELK, um Inibidor de MTH1, um Inibidor de PARP, um Inibidor de Fosfoinositídeo 3-Cinase, um Inibidor de PARP1 e DHODH, um Inibidor de Proteassoma, um Inibidor de Topoisomerase-II, um Inibidor de Tirosina Cinase, um Inibidor de VEGFR, e um Inibidor de WEE1; (ii) um agonista de OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada de IL-12, IL-15, GM-CSF e G-CSF.
[0302]Proteínas da invenção também podem ser usadas como um complemento para a remoção cirúrgica da lesão primária.
[0303]A quantidade de proteína de ligação multiespecífica e agente terapêutico adicional e o tempo relativo de administração podem ser selecionados de modo a obter um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, ao administrar uma terapia de combinação a um paciente em necessidade de tal administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição farmacêutica ou composições compreendendo os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem tal como, por exemplo, sequencialmente, concorrentemente, juntos, simultaneamente e semelhantes. Além disso, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo quando os agentes terapêuticos adicionais exercem seu efeito profilático ou terapêutico, ou vice-versa.
V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0304]A presente divulgação também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína aqui descrita.
A composição pode ser formulada para o uso em uma variedade de sistemas de liberação de fármaco. Um ou mais excipientes ou portadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação apropriada.
Formulações adequadas para o uso na presente divulgação são encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a ed., 1985. Para uma breve revisão de métodos para liberação de fármaco, ver, e.g., Langer (Science 249:1527-1533, 1990).
[0305]A formulação de liberação de fármaco intravenosa da presente divulgação pode ser contida em um saco, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, o saco pode ser conectado a um canal compreendendo um tube e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12 a 60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento e 45 mg da formulação seca por congelamento pode ser contida em um frasco. Em certas modalidades, cerca de 40 mg a cerca de 100 mg da formulação seca por congelamento pode ser contida em um frasco. Em certas modalidades, a formulação seca por congelamento de 12, 27, ou 45 frascos são combinadas para obter uma dose terapêutica da proteína na formulação de fármaco intravenoso. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco a cerca de 1.000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco.
[0306]A proteína pode existir em uma formulação farmacêutica aquosa líquida incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína em uma solução tamponada formando uma formulação.
[0307]Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser empacotadas para o uso tais como estão, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com um portador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações será, tipicamente, entre 3 e 11, mais preferivelmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e o mais preferivelmente entre 7 e 8, tal como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser empacotadas em múltiplas unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do agente acima mencionado ou agentes. A composição na forma sólida também pode ser empacotada em um recipiente para uma quantidade flexível.
[0308]Em certas modalidades, a presente divulgação fornece uma formulação com uma vida útil estendida, incluindo a proteína da presente divulgação, em combinação com manitol, ácido cítrico mono-hidratado, citrato de sódio, fosfato de dissódio di-hidratado, di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.
[0309]Em certas modalidades, uma formulação aquosa é preparada incluindo a proteína da presente divulgação em uma solução tamponada com pH. O tampão desta invenção pode ter um pH variando de cerca de 4 a cerca de 8, e.g., de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. As faixas intermediárias aos pH citados acima também se destinam a fazer parte desta divulgação. Por exemplo, as faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superiores e/ou inferiores se destinam a ser incluídas. Exemplos de tampões que irão controlar o pH dentro desta faixa incluem acetato (e.g., acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gliconato, histidina, citrato e outros tampões de ácido orgânico.
[0310]Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de 8.
Em certas modalidades, a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5, ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui ácido cítrico mono-hidratado, citrato de sódio, fosfato de dissódio di-hidratado, e/ou di-hidrogenofosfato de sódio di- hidratado. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui cerca de 1,3 mg/mL de ácido cítrico (e.g., 1,305 mg/mL), cerca de 0,3 mg/mL de citrato de sódio (e.g., 0,305 mg/mL), cerca de 1,5 mg/mL de fosfato de dissódio di-hidratado (e.g., 1,53 mg/mL), cerca de 0,9 mg/mL de di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (e.g., 0,86), e cerca de 6,2 mg/mL de cloreto de sódio (e.g., 6,165 mg/mL). Em certas modalidades, o sistema tampão inclui 1 a 1,5 mg/mL de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/mL de citrato de sódio, 1,25 a 1,75 mg/mL de fosfato de dissódio di-hidratado, 0,7 a 1,1 mg/mL de di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado e 6,0 a 6,4 mg/mL de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.
[0311]Um poliol, que atua como um tonicificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar com respeito à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionado também pode ser alterada com respeito ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade inferior de um monossacarídeo (e.g., manitol) pode ser adicionada, em comparação com um dissacarídeo (tal como trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 5 a cerca de 20 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 7,5 a 15 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 10 a 14 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 12 mg/mL. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.
[0312]Um detergente ou tensoativo também podem ser adicionados à formulação. Detergentes exemplares incluem detergentes não iônicos, tais como polissorbatos (e.g., polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (e.g., poloxâmero 188).
A quantidade de detergente adicionado é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de particulados na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polissorbato 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever sorbitanmono-oleato de polioxietileno (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4a ed., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1 % de polissorbato 80 pode ser adicionado na formulação.
[0313]Em modalidades, o produto de proteína da presente divulgação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada a uma concentração de 10 mg/mL em um frasco USP/Ph Eur tipo I 50R fechado com uma rolha de borracha e vedado com um fecho de alumínio crimpado. A rolha pode ser feita de elastômero de acordo com USP e Ph Eur. Em certas modalidades, os frascos podem ser preenchidos com 61,2 mL da solução de produto de proteína de modo a permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com solução salina a 0,9 %.
[0314]Em certas modalidades, a formulação líquida da divulgação pode ser preparada como uma solução de concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis estabilizantes. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um portador aquoso. Em certas modalidades, um estabilizador pode ser adicionado em uma quantidade não maior do que aquela que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarídeos, e.g., sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente tamponante, um tensoativo e um preservante.
[0315]Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser ajustado pela adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.
[0316]Além de agregação, a desamidação é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que pode ocorrer durante a fermentação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento de substância de fármaco/produto de fármaco e durante a análise de amostra. Desamidação é a perda de NH3 de uma proteína formando um intermediário succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário succinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 daltons do peptídeo precursor. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 daltons.
Isolamento do intermediário succinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. Como tal, a desamidação é tipicamente detectável como aumento de massa de 1 dalton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica de solvente, concentração iônica, sequência primária, conformação de polipeptídeo sítio e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácido adjacentes a Asn na cadeia de peptídeos, afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser seguindo um Asn em sequências de proteínas resultam em uma maior suscetibilidade à desamidação.
[0317]Em certas modalidades, a formulação líquida da presente divulgação pode ser preservada sob condições de pH e umidade para prevenir a desaminação do produto de proteína.
[0318]O portador aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Portadores ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada com pH (e.g., solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0319]Um preservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir ação bacteriana. A adição de um preservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multi-uso (múltiplas doses).
[0320]Formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferida em casos particulares, tais como quando um paciente está no hospital depois do transplante recebendo todos os fármacos através da via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9 % antes da administração. Em certas modalidades, o produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.
[0321]Em certas modalidades, um sal ou componentes tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas “formadores de base”. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser glicinato, carbonato, tampões de citrato, caso este em que, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.
[0322]Um preservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um preservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multi-uso (múltiplas doses).
[0323]O portador aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Portadores ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada com pH (e.g., solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0324]A proteína da presente divulgação pode existir em uma formulação liofilizada incluindo as proteínas e um lioprotectante. O lioprotectante pode ser açúcar, e.g., dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotectante pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente tamponante, um tensoativo, um agente de volume e/ou um preservante.
[0325]A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto de fármaco liofilizado pode estar em uma razão em peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a razão em peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.
[0326]Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser ajustado pela adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico.
Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.
[0327]Antes da liofilização, o pH da solução contendo a proteína da presente divulgação pode ser ajustado entre 6 a 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto de fármaco liofilizado pode ser de 7 a 8.
[0328]Em certas modalidades, um sal ou componentes tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas “formadores de base”. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser glicinato, carbonato, tampões de citrato, caso este em que, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íons.
[0329]Em certas modalidades, um “agente de volume” pode ser adicionado.
Um “agente de volume” é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui à estrutura física do bolo liofilizado (e.g., facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poros abertos).
Agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietilenoglicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.
[0330]Um preservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um preservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multi-uso (múltiplas doses).
[0331]Em certas modalidades, o produto de fármaco liofilizado pode ser constituído com um portador aquoso. O portador aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (e.g., seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, depois da liofilização. Diluentes ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada com pH (e.g., solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0332]Em certas modalidades, o produto de fármaco liofilizado da presente divulgação é reconstituído com água estéril para injeção, USP (SWFI) ou injeção de cloreto de sódio a 0,9 %, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado dissolve em uma solução.
[0333]Em certas modalidades, o produto de proteína liofilizado da presente divulgação é constituído a cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluído com solução salina a 0,9 % (solução de cloreto de sódio).
[0334]Os níveis reais de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxicos ao paciente.
[0335]A dose específica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50 a 5.000 mg de proteína. Alternativamente, uma dose do paciente pode ser sob medida ao peso corpóreo aproximado ou área de superfície do paciente.
Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou prevenida, a severidade da doença, a via de administração, e a idade, sexo e condição médica do paciente. Outra distinção dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para tratamento é rotineiramente feita por especialistas na técnica, especialmente em luz da informação de dosagem e ensaios aqui divulgados. A dosagem também pode ser determinada através do uso de ensaios conhecidos para determinar as dosagens usadas em conjunção com dados de dose-resposta apropriados. Uma dosagem de paciente individual pode ser ajustada conforme o progresso da doença é monitorado. Os níveis sanguíneos do construto ou complexo alvejável em um paciente podem ser medidos para ver se a dosagem precisa ser ajustada para atingir ou manter uma concentração eficaz. A farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construtos alvejáveis e/ou complexos, e dosagens dos mesmos, são mais prováveis de serem eficazes para um determinado indivíduo (Schmitz et al Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).
[0336]Em geral, as dosagens com base em peso corpóreo são de cerca de
0,01 µg a cerca de 100 mg por kg de peso corpóreo, tal como cerca de 0,01 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo,
cerca de 0,01 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 µg a cerca de
1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corpóreo,
cerca de 0,01 µg a cerca de 50 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 µg a cerca de
10 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 µg a cerca de 1 µg/kg de peso corpóreo,
cerca de 0,01 µg a cerca de 0,1 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 µg a cerca de
100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo,
cerca de 0,1 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corpóreo,
cerca de 0,1 µg a cerca de 10 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 µg a cerca de 1 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 50 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 µg a cerca de 10 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corpóreo,
cerca de 10 µg a cerca de 50 µg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 µg a cerca de 100 µg/kg de peso corpóreo, cerca de
100 µg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 100 µg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 100 µg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de
100 µg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo.
[0337]As doses podem ser administradas uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos.
Os especialistas na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição para dosagem com base em tempos de permanência medidos e concentrações do construto ou complexo alvejável em fluidos ou tecidos corporais. A administração da presente invenção pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através um cateter ou por injeção intralesional direta. Isso pode ser administrado uma ou mais vezes diariamente, uma ou mais vezes semanalmente, uma ou mais vezes mensalmente e uma ou mais vezes anualmente.
[0338]A descrição acima descreve múltiplos aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente especificamente contempla todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.
EXEMPLOS
[0339]A invenção agora sendo geralmente descrita, será mais facilmente entendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluídos meramente para propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar a invenção.
Exemplo 1 - Domínios de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D Domínios de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D recombinante purificado
[0340]As sequências de ácido nucleico de ectodomínios de NKG2D de ser humano, camundongo ou cynomolgus foram fundidos com sequências de ácido nucleico que codificam domínios Fc de IgG1 humana e introduzidos em células de mamífero a serem expressadas. Depois da purificação, as proteínas de fusão NKG2D-
Fc foram adsorvidas aos poços de microplacas. Depois de bloquear os poços com albumina de soro bovino para evitar a ligação não específica, domínios de ligação a NKG2D foram titulados e adicionados aos poços pré-adsorvidos com proteínas de fusão NKG2D-Fc. O anticorpo de ligação primário foi detectado usando um anticorpo secundário que foi conjugado com peroxidase de raiz forte e especificamente reconhece uma cadeia leve kappa humana para evitar reatividade cruzada de Fc.
3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de raiz forte, foi adicionado aos poços para visualizar o sinal de ligação, cuja absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Um clone de domínio de ligação a NKG2D, um controle de isotipo ou um controle positivo (compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados de SEQ ID NOs: 101 a 104, ou clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) foi adicionado a cada poço.
[0341]O controle de isotipo mostrou ligação mínima às proteínas NKG2D-Fc recombinantes, enquanto o controle positivo se ligou mais fortemente aos antígenos recombinantes. Os domínios de ligação a NKG2D produzidos por todos os clones demonstraram ligação através de proteínas NKG2D-Fc recombinantes de ser humano, camundongo e cynomolgus, embora com afinidades variáveis de clone para clone. Geralmente, cada clone anti-NKG2D ligado a NKG2D-Fc recombinante de ser humano (FIG. 3) e cynomolgus (FIG. 4) recombinante com afinidade semelhante, mas com menor afinidade para NKG2D-Fc recombinante de camundongo (FIG. 5).
Domínios de ligação a NKG2D se liga às células que expressam NKG2D
[0342]As linhagens celulares de linfoma de camundongo EL4 foram projetadas para expressar receptores de antígeno quimérico do domínio de sinalização NKG2D-CD3 zeta humano ou de camundongo. Um clone de ligação a NKG2D, um controle de isotipo ou um controle positivo foi usado a uma concentração de 100 nM para corar NKG2D extracelular expresso nas células EL4. A ligação do anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e a multiplicação pela anterior (FOB) foi calculada usando a intensidade média de fluorescência (MFI) de células que expressam NKG2D em comparação com células EL4 parentais.
[0343]Domínios de ligação a NKG2D produzidos por todos os clones ligados a células EL4 que expressam NKG2D humano e de camundongo. Os anticorpos de controle positivo (compreendendo os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve selecionados de SEQ ID NOs: 101 a 104, ou clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) deram o melhor sinal de ligação FOB. A afinidade de ligação a NKG2D para cada clone foi semelhante entre células que expressam NKG2D humano (FIG. 6) e NKG2D de camundongo (FIG. 7).
Exemplo 2 - Domínios de ligação a NKG2D bloqueiam a ligação de ligante natural a NKG2D Competição com ULBP-6
[0344]As proteínas NKG2D-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas aos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Uma concentração saturante de ULBP-6-His- biotina foi adicionada aos poços, seguida pela adição dos clones do domínio de ligação a NKG2D. Após uma incubação de 2 horas, os poços foram lavados e a ULBP- 6-His-biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com NKG2D-Fc foi detectada por estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano e substrato TMB.
A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de ULBP-6-His-biotina que foi bloqueada de ligação às proteínas NKG2D-Fc nos poços. O anticorpo de controle positivo (compreendendo os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve selecionados a partir de SEQ ID NOs: 101 a 104) e vários domínios de ligação a NKG2D bloquearam a ligação de
ULBP-6 a NKG2D, enquanto o controle de isotipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (FIG. 8).
[0345]Sequência de ULBP-6 é representada por SEQ ID NO: 108.
MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAV QGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDI QLENYTPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHP
GARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSS GTTQLRATATTLILCCLLIILPCFILPGI (SEQ ID NO: 108) Competição com MICA
[0346]As proteínas MICA-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas aos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fc-biotina foi adicionada aos poços seguido por domínios de ligação a NKG2D. Após incubação e lavagem, a NKG2D-Fc- biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com MICA-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação de NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D- Fc-biotina que foi bloqueada de ligação aos poços revestidos com MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve selecionados de SEQ ID NOs: 101 a 104) e vários domínios de ligação de NKG2D bloquearam a ligação de MICA a NKG2D, enquanto o controle de isotipo mostrou pouca competição com MICA (FIG. 9).
Competição com Rae-1 delta
[0347]Rae-ldelta-Fc de camundongo recombinante (adquirido de R&D Systems) foi adsorvido a poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fc-biotina de camundongo foi adicionada aos poços seguido pelos domínios de ligação a NKG2D.
Após incubação e lavagem, a NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com Rae-ldelta-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação de NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada de ligação aos poços revestidos de Rae-ldelta-Fc. O controle positivo (compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve selecionados a partir de SEQ ID NOs: 101 a 104, ou clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) e vários clones de domínio de ligação de NKG2D bloquearam a ligação de Rae-ldelta a NKG2D de camundongo, enquanto o anticorpo de controle de isotipo mostrou pouca competição com Rae-ldelta (FIG. 10).
Exemplo 3 - Clones de domínio de ligação a NKG2D ativam NKG2D
[0348]Sequências de ácido nucleico de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas com sequências de ácido nucleico que codificam um domínio de sinalização zeta de CD3 para obter construtos de receptor de antígeno quimérico (CAR). Os construtos NKG2D-CAR foram então clonados em um vetor de retrovírus usando a montagem Gibson e transfectados em células expi293 para a produção de retrovírus. As células EL4 foram infectadas com vírus contendo NKG2D-CAR juntamente com polibreno 8 gg/mL. 24 horas após a infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células EL4 foram analisados por citometria de fluxo, e clones que expressam altos níveis de NKG2D-CAR na superfície celular foram selecionados.
[0349]Para determinar se os domínios de ligação a NKG2D ativam NKG2D, eles foram adsorvidos aos poços de uma microplaca e as células EL4 de NKG2D- CAR foram cultivadas nos poços revestidos com fragmentos de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldina-A e monensina. A produção intracelular de TNF-a, um indicador da ativação de NKG2D, foi avaliada por citometria de fluxo. A porcentagem de células positivas para TNF-a foi normalizada para as células tratadas com o controle positivo. Todos os domínios de ligação a NKG2D ativaram NKG2D humano (FIG. 11) e NKG2D de camundongo (FIG. 12).
Exemplo 4 - Domínios de ligação a NKG2D ativam células NK Células NK humanas primárias
[0350]Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de leucócitos de sangue periférico humano usando centrifugação de gradiente de densidade. As células NK (CD3- CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com esferas magnéticas de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >95 %. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24 a 48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca para a qual os domínios de ligação de NKG2D foram adsorvidos e cultivadas em meio contendo conjugado com fluoróforo anticorpo anti-CD107a, brefeldin-A e monensina. Após a cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-y. A coloração de CD107a e IFN-y foi analisada em células CD3- CD56+ para avaliar a ativação de células NK. O aumento nas células duplamente positivas CD107a/IFN-y é indicativo de uma melhor ativação das células NK por meio do engajamento de dois receptores ativadores em vez de um receptor. Domínios de ligação a NKG2D e o controle positivo (por exemplo, domínio variável de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 101 ou SEQ ID NO: 103, e domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 104) mostraram uma maior porcentagem de células NK se tornando CD107a+ e IFN-y+ do que o controle de isotipo (FIG. 13 e FIG.
14 representam dados de dois experimentos independentes, cada um usando um PBMC de doador diferente para a preparação de células NK).
Células NK primárias de camundongo
[0351]Os baços foram obtidos de camundongos C57B1/6 e triturados através de um filtro de células de 70 µm para obter uma suspensão de célula única. As células foram sedimentadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido na Thermo Fisher Scientific #A1049201; cloreto de amônio 155 mM, bicarbonato de potássio 10 mM, EDTA 0,01 mM) para remover glóbulos vermelhos. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem colhidas e preparadas para o isolamento de células NK. As células NK (CD3-NK1.1+) foram então isoladas das células do baço usando uma técnica de depleção negativa com esferas magnéticas com pureza tipicamente >90 %. As células NK purificadas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de mIL-15 por 48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca para a qual os domínios de ligação a NKG2D foram adsorvidos e cultivadas em meio contendo anti-CD107a conjugado com anticorpo fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após a cultura em poços revestidos com domínio de ligação a NKG2D, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-y. A coloração de CD107a e IFN-y foi analisada em células CD3-NK1.1+ para avaliar a ativação de células NK. O aumento nas células duplamente positivas CD107a/IFN-y é indicativo de uma melhor ativação das células NK por meio do engajamento de dois receptores ativadores em vez de um receptor. Os domínios de ligação a NKG2D e o controle positivo (selecionado a partir dos clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX- 5 disponíveis na eBioscience) mostraram uma porcentagem maior de células NK se tornando CD107a+ e IFN-y+ do que o controle de isotipo (FIG. 15 e FIG. 16 representam dados de dois experimentos independentes, cada um usando um camundongo diferente para a preparação de células NK).
Exemplo 5 - Domínios de ligação a NKG2D permitem a citotoxicidade de células tumorais alvo
[0352]Os ensaios de ativação de células NK primárias em humanos e camundongos demonstraram marcadores de citotoxicidade aumentados em células NK após incubação com domínios de ligação a NKG2D. Para avaliar se isso se traduz em aumento da lise de células tumorais, um ensaio baseado em células foi utilizado, em que cada domínio de ligação a NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região Fc foi usada como um braço de direcionamento, enquanto a região do fragmento Fab (domínio de ligação a NKG2D) agiu como outro braço de direcionamento para ativar as células NK. Células THP-1, que são de origem humana e expressam altos níveis de receptores Fc, foram usadas como um alvo de tumor e um kit Perkin Elmer DELFIA Cytotoxicity foi usado. As células THP-1 foram marcadas com reagente BATDA e ressuspensas a 105 µg/mL em meio de cultura. As células THP-1 marcadas foram então combinadas com anticorpos NKG2D e células NK de camundongo isoladas em poços de uma placa de microtitulação a 37 °C durante 3 horas. Após a incubação, 20 µL do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 tit de solução de Európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por um leitor de placas PheraStar equipado com um módulo de fluorescência resolvido no tempo (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit.
[0353]O controle positivo, ULBP-6 - um ligante natural para NKG2D, mostrou aumento da lise específica de células alvo THP-1 por células NK de camundongo. Os anticorpos NKG2D também aumentaram a lise específica de células alvo THP-1, enquanto o anticorpo de controle de isotipo mostrou redução da lise específica. A linha pontilhada indica lise específica de células THP-1 por células NK de camundongo sem anticorpo adicionado (FIG. 17).
Exemplo 6 - Anticorpos NKG2D mostram alta termoestabilidade
[0354]As temperaturas de fusão dos domínios de ligação a NKG2D foram avaliadas usando fluorimetria de varredura diferencial. As temperaturas de fusão aparente extrapoladas são altas em relação aos anticorpos IgGl típicos (FIG. 18).
Exemplo 7 - Ativação sinérgica de células NK humanas por reticulação de
NKG2D e CD16 Ensaio de ativação de células NK humanas primárias
[0355]Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de leucócitos de sangue humano periférico usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK foram purificadas de PBMCs usando esferas magnéticas negativas (StemCell #17955). As células NK eram >90 % CD3- CD56+ conforme determinado por citometria de fluxo. As células foram então expandidas 48 horas em meio contendo 100 ng/mL de hIL-2 (Peprotech #200-02) antes do uso em ensaios de ativação. Os anticorpos foram revestidos em uma placa de fundo plano de 96 poços a uma concentração de 2 gg/mL (anti-CD16, Biolegend #302013) e 5 gg/mL (anti- NKG2D, R&D #MAB139) em PBS 100 i.tL estéril durante a noite a 4 °C seguido de lavagem dos poços completamente para remover o excesso de anticorpo. Para a avaliação da desgranulação, as células NK ativadas por IL-2 foram ressuspensas a 5 x 105 células/mL em meio de cultura suplementado com 100 ng/mL de IL-2 humana (hIL2) e 1 gg/mL de mAb anti-CD107a conjugado com APC (Biolegend #328619). 1 x 105 células/poço foram então adicionadas a placas revestidas com anticorpo. Os inibidores de transporte de proteína Brefeldin A (BFA, Biolegend #420601) e Monensin (Biolegend #420701) foram adicionados em uma diluição final de 1:1000 e 1:270, respectivamente. As células em placas foram incubadas durante 4 horas a 37 °C em 5 % de CO2. Para a coloração intracelular de IFN-y, as células NK foram marcadas com anti-CD3 (Biolegend #300452) e mAb anti-CD56 (Biolegend #318328) e, subsequentemente, fixadas, permeabilizadas e marcadas com mAb anti-IFN-y (Biolegend #506507). As células NK foram analisadas quanto à expressão de CD107a e IFN-y por citometria de fluxo após o bloqueio em células CD56+CD3- vivas.
[0356]Para investigar a potência relativa da combinação de receptores, foi realizada a reticulação de NKG2D ou CD16 e a correticulação de ambos os receptores por estimulação ligada à placa. Como mostrado na Figura 19 (FIGs. 19A a 19C), a estimulação combinada de CD16 e NKG2D resultou em níveis altamente elevados de CD107a (desgranulação) (FIG. 19A) e/ou produção de IFN-y (FIG. 19B). As linhagens pontilhadas representam um efeito aditivo de estímulos individuais de cada receptor.
[0357]Os níveis de CD107a e a produção intracelular de IFN-y de células NK ativadas por IL-2 foram analisados após 4 horas de estimulação ligada à placa com anti-CD16, anti-NKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. A FIG. 19A demonstra os níveis de CD107a; a FIG. 19B demonstra níveis de IFN-y; a FIG. 19C demonstra os níveis de CD107a e IFN-y. Os dados mostrados nas FIGs. 19A a 19C são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes.
Exemplo 8 - TriNKETs c-MET se ligam a c-MET em células tumorais
[0358]Linhagens celulares de câncer de cólon humano HT29 e HCT-116 foram usadas para avaliar a ligação de TriNKET a c-MET de superfície celular. A49MI- Duobody-TriNKETs foram diluídos e incubados com células HT29 e HCT-116. Os padrões de ligação de TriNKETs e anticorpos monoclonais parentais foram detectados usando um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e foi relatado MFI de dobra em relação aos controles apenas com anticorpo secundário. A FIG. 35 e a FIG. 36 mostram ligação dependente da dose de anticorpos monoclonais anti-c-MET e TriNKETs correspondentes incorporando os mesmos Fabs de ligação anti-c-MET às linhas celulares de câncer de cólon HT29 e HCT-116, respectivamente. Os TriNKETs ligaram-se a cada linhagem celular com um nível máximo de ligação mais alto, mas uma concentração de ligação meio-máxima ligeiramente aumentada (isto é, afinidade ligeiramente reduzida) em comparação com os anticorpos monoclonais correspondentes, embora essas diferenças fossem mais pronunciadas com HT29.
Exemplo 9 - Citotoxicidade de NK de curto prazo mediada por TriNKET
[0359]A capacidade de TriNKETs direcionados a c-MET de induzir citotoxicidade de células NK primárias contra células cancerosas c-MET positivas foi avaliada usando o ensaio de citotoxicidade DELFIA. Resumidamente, PBMCs foram isolados de leucócitos de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. Os PBMCs isolados foram lavados e as células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com esferas magnéticas. A pureza das células NK isoladas era tipicamente >90 % CD3-CD56+. As células NK isoladas foram colocadas em repouso sem citocina durante a noite.
[0360]No dia seguinte, as linhagens de células de câncer humano positivas para c-MET HT29 e HCT-116 foram colhidas da cultura. As células cancerosas foram lavadas com HBS e ressuspensas em meio de crescimento a 106 células/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116) seguindo as instruções do fabricante. Após a marcação, as células cancerosas foram lavadas três vezes com HBS e foram ressuspensas a 0,5 - 1,0 x 105 células/mL em meio de cultura. 100 µl de células marcadas com BATDA foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços.
[0361]O TriNKET ou mAb testado foi diluído em meio de cultura e 50 µl de TriNKET ou mAb diluído foram adicionados a cada poço. As células NK em repouso foram colhidas da cultura, lavadas e ressuspensas a 105 - 2,0 x 106 células/mL em meio de cultura para atingir uma razão E:T desejada de 5:1. 50 µL de células NK foram adicionados a cada poço da placa para perfazer um total de 200 gl de volume de cultura em cada poço. A placa foi incubada a 37 °C com 5 % de CO2 durante 2 a 3 horas.
[0362]Após a cultura, a placa foi removida da incubadora e as células foram sedimentadas por centrifugação a 200x g por 5 minutos. 20 µl do sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante. O sobrenadante das células marcadas incubadas sozinho foi usado para medir a liberação espontânea de TDA. O sobrenadante das células marcadas incubadas com
Triton-X a 1 % foi usado para medir a lise máxima das células alvo. O sobrenadante das células marcadas antes das 2 a 3 horas de incubação foi usado para medir o fundo e para fins de controle de qualidade.
[0363]200 µl de solução de európio à temperatura ambiente foram adicionados a cada poço contendo sobrenadante de cultura. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placa a 250 rpm por 15 minutos. A fluorescência foi medida usando um instrumento Victor 3 ou SpectraMax i3X.
[0364]Os níveis fluorescentes representaram a lise das células alvo. Os valores da % de lise específica foram calculados como: % de lise específica = ((Liberação experimental - Liberação espontânea) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) x 100 %.
[0365]As FIGs. 37A a 37C e 38 mostram a lise de células NK humanas de linhagens de células alvo positivas para c-MET na presença de TriNKETs anti-c-MET ou anticorpos monoclonais em 2 horas. Nas FIGs. 37A a 37C (FIG. 37A são gráficos de linha que mostram a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c- MET por células NK derivadas do doador 1; FIG. 37B são gráficos de linha que mostram a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c-MET por células NK derivadas do doador 2; e FIG. 37C são gráficos de linha que mostram a lise de células de câncer de cólon HT29 que expressam c-MET por células NK derivadas do doador 3), células HT29 foram usadas como células alvo com células efetoras NK derivadas de três diferentes doadores humanos saudáveis. A FIG. 38 mostra a lise de células alvo HCT-116 mediada por células NK de um único doador. Contra ambas as linhagens celulares e em vários doadores, os c-MET-TriNKETs tinham valores de EC50 subnanomolares. Em comparação com a atividade baixa ou ausente dos anticorpos monoclonais correspondentes, os TriNKETs forneceram maior lise e potência específica máxima.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0366]A divulgação completa de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos aqui referidos é incorporada por referência para todos os fins.
EQUIVALENTES
[0367]A invenção pode ser realizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou de suas características essenciais. As modalidades anteriores devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas em vez de limitar a invenção aqui descrita. O escopo da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas em vez da descrição anterior, e todas as alterações que vêm dentro do significado e intervalo de equivalência das reivindicações se destinam a ser abrangidas aqui.

Claims (90)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno c-MET associado ao tumor; e (c) um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.
2. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor selecionado do grupo que consiste em KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL; e (c) um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.
3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor como o segundo sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor.
4. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um fragmento variável de cadeia única (scFv), e o segundo e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor é um fragmento Fab.
5. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um scFv, e o segundo e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional que se liga a um antígeno associado ao tumor é um scFv.
6. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um fragmento Fab, e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor é um scFv.
7. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D é um scFv, e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor é um fragmento Fab.
8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D em seres humanos.
9. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro, o segundo, e/ou o sítio de ligação ao antígeno adicional compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
10. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o scFv que se liga ao antígeno associado ao tumor e/ou o scFv que se liga a NKG2D é ligado a um domínio constante de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, através de uma dobradiça compreendendo Ala-Ser, em que o scFv compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
11. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável de cadeia leve.
12. Proteína, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a ponte dissulfeto é formada entre C44 a partir do domínio variável de cadeia pesada e C100 a partir do domínio variável de cadeia leve.
13. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o scFv o domínio variável de cadeia pesada é ligado ao domínio variável de cadeia leve através de um conector flexível.
14. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que dentro do scFv, o conector flexível compreende (G4S)4.
15. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADA pelo fato de que dentro do scFv, o domínio variável de cadeia pesada é posicionado no terminal N ou no terminal C do domínio variável de cadeia leve.
16. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, CARACTERIZADA pelo fato de que dentro do scFv, a dobradiça compreende ainda sequência de aminoácidos Thr-Lys-Gly.
17. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende: (1) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 387, 88 e 390, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente; (2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências de região determinante de complementaridade 1 (CDR1), região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e região determinante de complementaridade 3 (CDR3) representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 387, 88 e 412, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
(3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 435,
64 e 436, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 66, 67 e 68, respectivamente;
(4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 437,
72 e 408, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente;
(5) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 409,
80 e 411, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 82, 83 e 84, respectivamente;
(6) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 421,
96 e 422, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 98, 99 e 100, respectivamente;
(7) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 87,
88 e 89, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
(8) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 387,
88 e 393, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
(9) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1,
CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 387,
88 e 396, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
(10) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências
CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 387, 88 e 399, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
(11) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências
CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 387, 88 e 402, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
(12) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências
CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 387, 88 e 405, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente; ou
(13) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo sequências
CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 87, 88 e 389, respectivamente; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 representadas pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91 e 92, respectivamente;
18. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende: (1) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 388 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86; (2) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86; (3) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 61 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 62; (4) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 70; (5) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 78; (6) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 93 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 94; (7) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 391 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86; (8) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 394 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86; (9) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 397 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86; (10) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 400 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86; ou (11) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 403 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 86.
19. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 e SEQ
ID NO: 93.
20. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 42.
21. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 49 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 50.
22. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 57 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 58.
23. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 59 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 60.
24. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 61 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 62.
25. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18,
CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 70.
26. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 78.
27. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 86.
28. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 93 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 94.
29. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 101 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 102.
30. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 %
idêntico à SEQ ID NO: 103 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 104.
31. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a c-MET compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de cadeia pesada (CDRH1), CDR2 de cadeia pesada (CDRH2) e CDR3 de cadeia pesada (CDRH3), e um domínio variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de cadeia leve (CDRL1), CDR2 de cadeia leve (CDRL2) e CDR3 de cadeia leve (CDRL3), em que as sequências de aminoácidos de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são apresentadas na SEQ ID NOs: 292, 406, 294, 296, 407 e 298; 300, 301, 302, 410, 305 e 306; ou 414, 415, 416, 418, 419 e 420, respectivamente.
32. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a c-MET compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 291 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 295; (b) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 299 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 303; ou (c) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 413 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 417.
33. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno KIT associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 109 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 113.
34. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno KIT associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 117 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 121.
35. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno F3 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 126 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 130.
36. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno F3 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 140 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 144.
37. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno IGF1R associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 149 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 153.
38. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno IGF1R associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 157 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 161.
39. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno Lewis Y associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 166 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 170.
40. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno Lewis Y associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 174 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 178.
41. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno MUC13 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 182 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 186.
42. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno MCAM associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 192 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 196.
43. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno MCAM associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 200 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 204.
44. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno LRRC32 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 213.
45. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno LRRC32 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 217 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 221.
46. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno sialil-Tn associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 226 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 230.
47. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno sialil-Tn associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 234 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 238.
48. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno gpA33 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 242 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 246.
49. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30,
CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno gpA33 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 250 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 254.
50. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno GD3 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 259 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 263.
51. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno GD3 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 267 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 271.
52. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno GM2 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 275 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 279.
53. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno GM2 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 283 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 287.
54. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno EPHA3 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 308 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 312.
55. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno TNFRSF10 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 317 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 321.
56. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno TNFRSF10 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 325 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 329.
57. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno TNFSF11 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 334 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 338.
58. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno TNFSF11 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 342 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 346.
59. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno CD74 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 351 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 355.
60. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno CD74 associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 359 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 363.
61. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno PMEL associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 369 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 373.
62. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga ao antígeno PMEL associado ao tumor, e em que a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 377 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntico à SEQ ID NO: 381.
63. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína compreende um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende uma dobradiça e um domínio CH2.
64. Proteína, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc de anticorpo compreende uma dobradiça e um domínio CH2 de um anticorpo IgG1 humano.
65. Proteína, de acordo com a reivindicação 63 ou 64, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
66. Proteína, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio Fc de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica ao domínio Fc de anticorpo de IgG1 humana e difere uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439.
67. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID NO: 423 e SEQ ID NO: 424.
68. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID NO: 425 e SEQ ID NO: 426; SEQ ID NO: 427 e SEQ ID NO: 428; ou SEQ ID NO: 429 e SEQ ID NO: 430.
69. Formulação, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes e um portador farmaceuticamente aceitável.
70. Célula, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais ácidos nucleicos que expressam uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68.
71. Método de intensificar morte celular tumoral, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende expor uma célula tumoral e uma célula matadora natural a uma quantidade eficaz da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, em que a célula tumoral expressa um antígeno associado ao tumor selecionado do grupo que consiste em KIT, F3, IGF1R, Lewis Y, MUC13, MUC4, MCAM, LRRC32, sialil-Tn, gpA33, GD3, GM2, c-MET, EPHA3, TNFRSF10A, TNFSF11, CD74 e PMEL.
72. Método de tratar câncer, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68 ou da formulação de acordo com reivindicação 69 a um paciente.
73. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a c-MET, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer renal, câncer da tireoide, melanoma, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer colorretal e câncer de cabeça e pescoço.
74. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a KIT, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, tumor estromal gastrointestinal, melanoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de fígado e câncer testicular.
75. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a F3, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, sarcomas e câncer colorretal.
76. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a IGF1R, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer de próstata, sarcoma, câncer da tireoide, câncer renal, câncer colorretal, câncer pancreático, gliobastoma e câncer de fígado.
77. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a Lewis Y, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, mieloma múltiplo e leucemia mieloide aguda.
78. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a MUC13, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal, câncer cervical e colangiocarcinoma.
79. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a MUC4, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de pulmão, leucemia linfoblástica aguda, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, e câncer de próstata.
80. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a MCAM, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de células pequenas, sarcoma, câncer colorretal, câncer pancreático e câncer renal.
81. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a LRRC32, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer renal, câncer pancreático, sarcoma, câncer ovariano, câncer de pulmão, gliobastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de mama e câncer cervical.
82. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a sialil-Tn, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de mama.
83. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a gpA33, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer gástrico e câncer esofágico.
84. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a GD3, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, glioma, câncer de mama, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático e neuroblastoma.
85. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a GM2, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, câncer cervical, neuroblastoma, melanoma, câncer de pulmão, mesotelioma e câncer de fígado.
86. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a EPHA3, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer colorretal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão e sarcoma.
87. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a TNFRSF10A, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço.
88. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a TNFSF11, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de próstata e um câncer ósseo metastático.
89. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a CD74, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em câncer difuso de grandes células B, uma malignidade de células B, câncer renal, câncer de pulmão, câncer ovariano, melanoma, sarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de bexiga, glioma, câncer de mama e leucemia.
90. Método, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga a PMEL, e o câncer a ser tratado é selecionado do grupo que consiste em melanoma e sarcoma.
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