BR112020015003A2

BR112020015003A2 - Métodos para o tratamento da doença de farber

Info

Publication number: BR112020015003A2
Application number: BR112020015003-7A
Authority: BR
Inventors: Eric Gaukel; Brante SAMPEY
Original assignee: Enzyvant Therapeutics Gmbh
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2020-12-29
Also published as: JP2021512853A; WO2019150192A1; AU2019214519A1; PH12020551146A1; EP3746115A1; MX2020007501A; CL2020001856A1; SG11202006506TA; JP2023113809A; US20190240298A1; IL276284A; IL312159A; CA3088225A1; US20230123505A1; CN112703010A; KR20200118011A; RU2020118032A

Abstract

a presente invenção divulga métodos de tratamento da doença de farber com o uso de doses particulares e perfis farmacocinéticos.

Description

“MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DE FARBER” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido Provisório de no US 62/625,763, depositado em 2 de fevereiro de 2018, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi entregue eletronicamente em formato ASCII e que é incorporada ao presente documento a título de referência na íntegra. A dita cópia ASCII, criada em 17 de janeiro de 2019, é denominada RVT-801-006WO_SL.txt e tem 11.363 bytes de tamanho.

ANTECEDENTES

[0003] A doença de Farber, um distúrbio de armazenamento lisossômico (LSD), é uma afecção que foi descrita pela primeira vez em 1952 em um bebê de 14 meses de idade com lesões granulomatosas em múltiplas articulações e evidência de armazenamento de lipídios. Durante a década seguinte, outros casos semelhantes foram descritos, todos demonstrando lesões semelhantes e frequentemente exibindo um choro ou voz "rouca" característica devido à presença de lesões na laringe. Também foi observado o envolvimento de outros sistemas orgânicos em alguns desses pacientes, incluindo pulmão, fígado, baço e sistema nervoso central (SNC).

[0004] Anteriormente, o tratamento para pacientes com doença de Farber era sintomático e tinha como objetivo principal reduzir a dor. O transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) foi realizado em um número limitado de pacientes, e, em geral, o resultado foi positivo, desde que o procedimento de transplante tenha sido bem-sucedido. Os pacientes transplantados com sucesso exibem redução significativa da dor, maior motilidade e mobilidade e, em alguns casos, encolhimento e resolução completa dos nódulos subcutâneos. No entanto, o transplante bem-sucedido requer células doadoras histocompatíveis e expõe os pacientes a regimes imunossupressores invasivos e potencialmente perigosos. Uma alternativa ao TCTH é a terapia gênica na qual as células doadoras autólogas são transduzidas com um vetor que expressa a proteína terapêutica, o que evita a necessidade de doadores histocompatíveis. Essa abordagem foi avaliada em um modelo de camundongo knockin da doença de Farber e resultou na redução de ceramidas teciduais e infiltração de macrófagos. No entanto, continua a haver uma necessidade de terapias intensificadas para o tratamento da doença de Farber.

[0005] Estudos anteriores em um modelo murino da doença de Farber grave estabeleceram uma ampla faixa de doses terapêuticas para a ceramidase ácida humana recombinante (“rhAC”), em que a eficácia foi caracterizada com base na redução da ceramida tecidual acumulada e na redução de citocinas pró-inflamatórias. As divulgações no Pedido Internacional No. PCT/US18/13509 depositado em 12 de janeiro de 2018 (publicado como WO 2018/132667 em 18 de julho de 2018) e em He et al., 2017 (fevereiro), “Enzyme replacement therapy for Farber disease: Proof-of-concept studies in cells and mice,” BBA Clin. 13 (7): 85 a 96, são incorporados a título de referência na sua totalidade.

[0006] No entanto, esses estudos não estabeleceram alvos de exposição. A previsão de uma dose equivalente humana (HED) a partir de uma dose terapêutica determinada durante estudos não clínicos no modelo murino da doença de Farber grave requer um entendimento da farmacocinética da enzima (“PK”) e distribuição do tecido (“TD”). O presente assunto atende a essas necessidades, conforme discutido aqui.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0007] Os camundongos CD-1 saudáveis e jovens são considerados a cepa parental do camundongo Farber (modelo de camundongo da doença Farber utilizado nesta descrição e exemplos). A Figura 3 mostra que o perfil farmacocinético da rhAC (RVT-801) do camundongo CD-1 jovem é semelhante ao perfil experimental da atividade da rhAC do camundongo

Farber em circulação. Isso indica que o camundongo CD-1 jovem fornece uma aproximação apropriada da PK do camundongo Farber e, como tal, os camundongos CD-1 foram usados para caracterizar a farmacocinética murina do RVT-801, já que os camundongos Farber são frágeis, difíceis de acasalar e não é numeroso o suficiente para realizar uma avaliação completa da farmacocinética.

[0008] Assim, com base em um pequeno número de camundongos Farber e com pontos de dados limitados sobrepostos entre as cepas, os dados relatados na descrição e nos Exemplos aqui sugerem que a exposição sistêmica à rhAC (por exemplo, RVT-801) em camundongos CD-1 se aproxima da do Farber e pode representar os níveis sistêmicos mínimos de rhAC em camundongos Farber após uma dose única de RVT-801 administrada por via intraperitoneal.

[0009] A AC humana recombinante (por exemplo, RVT-801) foi mostrada na descrição e nos Exemplos para distribuir extensivamente aos tecidos associados ao acúmulo de ceramida em um modelo murino da doença de Farber (por exemplo, fígado, baço e pulmão). A medição dos níveis sistêmicos da AC humana recombinante (por exemplo, RVT-801) poderia, portanto, potencialmente subestimar a exposição em tecidos relevantes de indivíduos humanos que sofrem da doença de Farber. Assim, confiar na alometria simples para dimensionar uma dose em espécies não clínicas para humanos pode não fornecer estimativas adequadas da exposição do tecido para conferir eficácia.

[0010] Uma estimativa da dose equivalente humana (HED), com base nas orientações da Agência de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos (“FDA”) para dosagem de escala entre espécies não clínicas e humanos, é baseada na área da superfície corporal (“BSA”) (Departamento de Saúde dos EUA e Serviços Humanos, Administração de Alimentos e Medicamentos, Centro de Avaliação e Pesquisa de Medicamentos (CDER), 2005, “Guidance for Industry. Estimating the Maximum Safe Starting Dose in

Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers.” 1 a 30), que é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. No entanto, as abordagens de estimativa de HED aqui descritas também consideram fatores fisiológicos, incluindo, mas não limitados a, principais mecanismos de depuração da vasculatura para os tecidos.

[0011] Os dados relatados neste relatório descritivo em camundongos indicam que o fígado e o baço são os principais tecidos alvo para a captação de RVT-801 após administração sistêmica.

[0012] Um HED pode ser derivado ao combinar a escala de BSA e as proporções de massa de tecido em relação ao peso corporal (“BW”) em camundongos e seres humanos. Dessa maneira, é possível derivar um fator de escala de dose que é responsável pelo tamanho relativo de cada compartimento da distribuição de AC humana recombinante (RVT-801) em cada espécie. As estimativas combinadas de HED com o uso de BSA e estratégias de tecido:BW são apresentadas na Tabela 1. TABELA 1: BSA E TECIDO COMBINADOS:

ESTIMATIVAS DE HED BASEADAS NO PESO CORPORAL ESCALONADO A PARTIR DE UMA DOSE DE 10 MG/KG DE CAMUNDONGO

[0013] De acordo com a descrição e os Exemplos, em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de um sujeito adulto humano com doença de Farber que compreende a administração ao sujeito humano de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) a uma dose de cerca de 0,8 mg/kg.

[0014] Também é fornecido em uma modalidade um método de tratamento de uma criança humana com doença de Farber, o método que compreende a administração de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) à criança a uma dose de cerca de 1,2 mg/kg.

[0015] Também é fornecido em uma modalidade um método de tratamento de uma criança humana com doença de Farber, o método que compreende a administração de ceramidase de ácido humano recombinante (rhAC) à criança a uma dose de cerca de 2 mg/kg.

[0016] Também é fornecido em uma modalidade um método de tratamento de uma criança humana com doença de Farber, o método que compreende a administração de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) à criança a uma dose de cerca de 5 mg/kg.

[0017] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito humano de uma dose terapeuticamente eficaz de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 que recebem uma dose única efetiva máxima (“MED”) de 10mg/kg de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um ou mais dos seguintes: Tmáx de cerca de 0,25 a 1,0 horas, Cmáx de cerca de 1,23 a cerca de 2,17 µg/ml, ou área sob a curva (AUC) de cerca de 1,37 h*µg/ml a cerca de 1,49 h*µg/ml (ou cerca de 1 h*µg/ml a cerca de 2 h*µg/ml), como divulgado abaixo neste relatório descritivo. A dose efetiva máxima (MED) em camundongos Farber foi determinada como sendo 10 mg/kg administrada por injeção IP em bolus. O valor para a AUCúltimo determinado pela após uma dose única de 10 mg/kg para camundongos CD-1 do tipo selvagem, pareados por idade, pode ser 1,37 μg.h/ml com uma Cmáx de 1,23 μg/ml.

[0018] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma único dose máxima eficaz (“MED”)

de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca proporções em camundongos CD-1 saudáveis maiores que 1 para AUCfígado:AUCsoro, AUCbaço:AUCsoro, AUCpulmão:AUCsoro, AUCrim:AUCsoro, AUCcoração:AUCsoro. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a distribuição da rhAC (RVT-801) nesses tecidos seja importante no que diz respeito à eficácia geral do tratamento com fármaco. É provável que a glicosilação do RVT-801 tenha um papel na absorção do fármaco nesses tecidos afetados pelo distúrbio, impactando positivamente a eficácia do tratamento com rhAC.

[0019] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC, que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (ou seja, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um ou mais dos seguintes: uma proporção AUCfígado:AUCsoro de cerca de 92,9, uma proporção AUCbaço:AUCsoro de cerca de 47,6, uma proporção AUCpulmão:AUCsoro de cerca de 5,64, uma proporção AUCrim:AUCsoro de cerca de 17,3, uma proporção AUCcoração:AUCsoro de cerca de 2,69, uma proporção AUCsanguetotal:AUCsoro de cerca de 0,575, uma proporção AUCcérebro:AUCsoro de aproximadamente 0,0281, ou uma proporção AUCLBAF:AUCsoro de cerca de 0,000165 em camundongos (em que LBAF é fluido do lavado broncoalveolar). Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca proporções em camundongos CD-1 saudáveis maiores que 1 para AUCfígado:AUCsoro,

AUCbaço:AUCsoro, AUCpulmão:AUCsoro, AUCrim:AUCsoro, AUCcoração:AUCsoro, AUCsangue total:AUCsoro, AUCcérebro:AUCsoro.

[0020] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a distribuição da rhAC (RVT-801) nesses tecidos seja importante no que diz respeito à eficácia geral do tratamento com fármaco.

[0021] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um Tmáx de cerca de 0,25 a 1,0 horas.

[0022] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx de cerca de 1,23 µg/ml a 2,17 µg/ml.

[0023] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC de cerca de 1,37 a 1,49 h*µg/ml.

[0024] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx, ou AUC0 ao último ou AUCtecido/AUCsoro em tecido ou matriz de acordo com os valores estabelecidos na Figura 7.

[0025] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um AUC0 ao último de cerca de 138 h*µg/ml no tecido do fígado.

[0026] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um Cmáx para o fármaco de cerca de 13 µg/ml no tecido hepático.

[0027] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED")

de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um AUC0 ao último de cerca de 70,9 h*µg/ml em tecido esplênico.

[0028] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um Cmáx para o fármaco de cerca de 7,58 µg/ml em esplênico.

[0029] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um AUC0 ao último de cerca de 25,8 h*µg/m no tecido do rim.

[0030] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx para o fármaco de cerca de 2,61 µg/ml no tecido renal.

[0031] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 4,01 h*µg/ml no tecido cardíaco.

[0032] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx para o fármaco de cerca de 0,362 µg/ml no tecido cardíaco.

[0033] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 0,0419 h*µg/ml no tecido do cérebro.

[0034] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx de cerca de 0,147 µg/ml no cérebro.

[0035] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável um AUC0 ao último cerca de 0,858 h*µg/ml no sangue.

[0036] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx para o fármaco de cerca de 1,23 µg/ml no sangue.

[0037] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito humano de uma dose terapeuticamente eficaz de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 que recebem uma única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT- 801) por via intraperitoneal, que fornece AUC0 ao último cerca de 0,000245 h*µg/ml em LBAF.

[0038] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem um única dose máxima eficaz (“MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx para o fármaco de cerca de 0,00196 µg/ml em LBAF.

[0039] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último cerca de 8,4 h*µg/ml no tecido pulmonar.

[0040] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um sujeito humano com doença de Farber pode compreender a administração ao sujeito de uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC que pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose máxima eficaz ("MED”) de 10 mg/kg de dose de rhAC (isto é, RVT-801) por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx para o fármaco de cerca de 1,42 µg/ml no tecido pulmonar.

[0041] Objetos e vantagens adicionais serão apresentados em parte na descrição a seguir e em parte serão evidentes a partir da descrição, ou podem ser aprendidos pela prática. Os objetos e vantagens serão realizados e alcançados por meio dos elementos e combinações particularmente apontados nas reivindicações anexas.

[0042] Deve ser entendido que tanto a descrição geral acima como a descrição detalhada a seguir são exemplificativas e explicativas e não são restritivas das reivindicações.

[0043] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram uma modalidade (ou diversas) e juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0044] A Figura 1 mostra um curso de tempo dos níveis de soro de RVT-801 em camundongos CD-1 jovens e saudáveis, pareados com a idade de camundongos da doença de Farber tratados com RVT- 801, após uma única injeção de RVT-801 em doses de 1, 3 e 10 mg/kg de acordo com o Exemplo 1.

[0045] A Figura 2 lista as métricas farmacocinéticas do soro RVT-801 em camundongos CD-1 jovens saudáveis após uma única injeção de RVT-801 em doses de 1, 3 e 10 mg/kg de acordo com o Exemplo 1.

[0046] A Figura 3 mostra as concentrações de RVT- 801 no soro de camundongo CD-1 saudável e com a atividade rhAC no plasma de camundongos com doença de Farber após uma única injeção de RVT-801 na dose de 10 mg/kg, de acordo com o Exemplo 1, mostrando comparabilidade entre os perfis farmacocinéticos dos camundongos Farber e camundongos de cepa CD-1 parental de mesma idade.

[0047] A Figura 4 mostra um curso de tempo das concentrações de RVT-801 no soro e em vários tecidos (fígado, baço, rim, coração, pulmão e cérebro) de camundongos CD-1 saudáveis e jovens após uma única injeção de soro RVT-801 em um dose de 10 mg/kg de acordo com o Exemplo 2.

[0048] A Figura 5A mostra um curso de tempo das concentrações de RVT-801 no tecido hepático de camundongos CD-1 jovens e saudáveis após uma única injeção de RVT-801 em doses de 1, 3 e 10 mg/kg, de acordo com o Exemplo 2.

[0049] A Figura 5B mostra um curso de tempo das concentrações de RVT-801 no tecido do baço de camundongos CD-1 jovens e saudáveis após uma única injeção de soro RVT-801 em doses de 1, 3 e 10 mg/kg, de acordo com o Exemplo 2.

[0050] A Figura 6A compara a AUC0-último no soro, sangue total, extrato de tecido hepático e tecidos do baço de camundongos CD-

1 saudáveis e jovens após uma única injeção de soro RVT-801 nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, de acordo com o Exemplo 2.

[0051] A Figura 6B mostra as razões de AUCtecido/AUCsoro calculadas a partir das concentrações de RVT-801 no soro, juntamente com tecidos hepático e de baço de camundongos CD-1 saudáveis e jovens, após uma única injeção de RVT-801 em doses de 1, 3 e 10 mg/kg de acordo com o Exemplo 2.

[0052] A Figura 7 mostra Cmáx, AUC 0-último e AUCtecido/AUCsoro calculados a partir das concentrações de RVT-801 no soro, sangue total e vários extratos de tecido (fígado, baço, rim, pulmão, coração, cérebro e fluido do lavado broncoalveolar (LBAF) de camundongos CD-1 jovens saudáveis após uma injeção única de RVT-801 a uma dose de 10 mg/kg de acordo com o Exemplo 2.

[0053] A Figura 8 mostra a distribuição do tecido e a comparação de AUCtecido/AUCsoro em vários tecidos de camundongos CD-1 saudáveis e jovens após uma única injeção de RVT-801 a uma dose de 10 mg/kg, de acordo com o Exemplo 2.

[0054] A Figura 9 mostra doses equivalentes humanas (HEDs) estimadas dimensionadas por área de superfície corporal (BSA), estimadas a partir do MED com relação à redução de ceramidas acumuladas no fígado e baço de 10 mg/kg em camundongos Farber, de acordo com o Exemplo 3.

[0055] A Figura 10 mostra HEDs específicos de tecido, escalonados pela proporção de peso de tecido para corpo, estimado a partir do MED de 10 mg/kg em camundongos Farber com relação à redução de ceramidas acumuladas no fígado e baço de acordo com o Exemplo 3.

[0056] A Figura 11 mostra os resultados de ambos os (1) cálculos de HED baseados em BSA e (2) cálculos de HED baseados na razão de peso de tecido para corpo de acordo com o Exemplo 3.

[0057] A Figura 12 mostra a comparação de uma modalidade de HED para RVT-801 no presente pedido com as doses de terapias de substituição enzimática aprovadas (ERTs).

[0058] A Figura 13 mostra os dados médios de tempo de concentração de rhAC no fígado, baço e rim de camundongos Farber após uma dose semanal única ou repetida de 10 mg/kg de RVT-801.

[0059] A Figura 14 mostra dados sobre as concentrações de soro de rhAC em camundongos CD-1 saudáveis e com atividade plasmática de ceramidase ácida em camundongos Farber após uma dose única de 10 mg/kg de RVT-801.

[0060] A Figura 15 mostra a razão final de tecido de rhAC:soro de AUC em camundongos CD-1 jovens saudáveis após uma dose única de 10 mg/kg de RVT-801.

[0061] A Figura 16 mostra rhAC em circulação após injeção única em bolus IP de 10 mg/kg IP de RVT-801 para camundongos CD-1 e Farber.

[0062] A Figura 17 mostra as concentrações de rhAC na circulação e nos tecidos principais após uma única injeção IP bolus de 10 mg/kg de RVT-801 para camundongos CD-1 e Farber.

[0063] As Figuras 18A-E apresentam dados de tempo de concentração de rhAC individuais no fígado (Figura 18A), baço (Figura 18B), rim (Figura 18C), pulmão (Figura 18D) e coração (Figura 18E) (Farber (símbolos abertos) e camundongos CD-1 de mesma idade (símbolos preenchidos)) após uma única injeção IP bolus de 10 mg/kg de RVT-801 (n = 3 por ponto de tempo).

[0064] As Figuras 19A-G apresentam as concentrações médias de rhAC em circulação (Figura 19A), fígado (Figura 19B), baço (Figura 19C), rim (Figura 19D), coração (Figura 19E), pulmão (Figura 19F) e tecido cerebral (Figura 19G) em camundongos Farber (símbolos abertos) e camundongos CD-1 com a mesma idade (símbolos preenchidos) após uma dose única de 10 mg/kg ou várias doses semanais a 10 mg/kg/dose de RVT-801 administrada via injeção IP em bolus, de acordo com o Exemplo 5.

[0065] As Figuras 20A e 20B mostram perfis médios de concentração no tempo de tecido rhAC após administração IP a camundongos CD-1 jovens em RVT-801-9013 Parte B (Figura Linear 20A e Figura 20B Log-Linear), respectivamente.

[0066] A Figura 21 apresenta proporções de tecido de RVT-801:exposição de soro em LBAF, sangue, cérebro, coração, rim, fígado, pulmão e baço com base na AUCúltimo após doses únicas de RVT-801 de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg para camundongos CD-1 jovens.

[0067] As Figuras 22A-D apresentam AUC normalizado por dose versus níveis de dose plotados para vários tecidos após a administração IP de RVT-801 em doses de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg em camundongos CD-1 jovens.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS TABELA 2: UMA LISTA DE CERTAS SEQUÊNCIAS AQUI REFERENCIADAS.

SEQ ID Descrição Sequência

NO

MPGRSCVALVLLAAAVSCAVAQHAPPWTEDCRKSTYPPSGPTYR Ácido de

GAVPWYTINLDLPPYKRWHELMLDKAPVLKVIVNSLKNMINTFVPS ceramidas

GKIMQVVDEKLPGLLGNFPGPFEEEMKGIAAVTDIPLGEIISFNIFYE e humana

LFTICTSIVAEDKKGHLIHGRNMDFGVFLGWNINNDTWVITEQLKPL recombin 1 TVNLDFQRNNKTVFKASSFAGYVGMLTGFKPGLFSLTLNERFSING ante

GYLGILEWILGKKDVMWIGFLTRTVLENSTSYEEAKNLLTKTKILAPA (rhAC)

YFILGGNQSGEGCVITRDRKESLDVYELDAKQGRWYVVQTNYDR (aminoáci

WKHPFFLDDRRTPAKMCLNRTSQENISFETMYDVLSTKPVLNKLTV do)

YTTLIDVTKGQFETYLRDCPDPCIGW GGCTCGGTCCGACTATTGCCCGCGGTGGGGGAGGGGGATGGA TCACGCCACGCGCCAAAGGCGATCGCGACTCTCCTTCTGCAGG TAGCCTGGAAGGCTCTCTCTCTTTCTCTACGCCACCCTTTTCGT GGCACTGAAAAGCCCCGTCCTCTCCTCCCAGTCCCGCCTCCTC CGAGCGTTCCCCCTACTGCCTGGAATGGTGCGGTCCCAGGTCG CGGGTCACGCGGCGGAGGGGGCGTGGCCTGCCCCCGGCCCA

GCCGGCTCTTCTTTGCCTCTGCTGGAGTCCGGGGAGTGGCGTT rhAC GGCTGCTAGAGCGATGCCGGGCCGGAGTTGCGTCGCCTTAGT 2 (DNA) CCTCCTGGCTGCCGCCGTCAGCTGTGCCGTCGCGCAGCACGC

GCCGCCGTGGACAGAGGACTGCAGAAAATCAACCTATCCTCCT TCAGGACCAACGTACAGAGGTGCAGTTCCATGGTACACCATAAA TCTTGACTTACCACCCTACAAAAGATGGCATGAATTGATGCTTG ACAAGGCACCAGTGCTAAAGGTTATAGTGAATTCTCTGAAGAAT ATGATAAATACATTCGTGCCAAGTGGAAAAATTATGCAGGTGGT GGATGAAAAATTGCCTGGCCTACTTGGCAACTTTCCTGGCCCTT TTGAAGAGGAAATGAAGGGTATTGCCGCTGTTACTGATATACCT TTAGGAGAGATTATTTCATTCAATATTTTTTATGAATTATTTACCA TTTGTACTTCAATAGTAGCAGAAGACAAAAAAGGTCATCTAATAC ATGGGAGAAACATGGATTTTGGAGTATTTCTTGGGTGGAACATA AATAATGATACCTGGGTCATAACTGAGCAACTAAAACCTTTAACA GTGAATTTGGATTTCCAAAGAAACAACAAAACTGTCTTCAAGGC TTCAAGCTTTGCTGGCTATGTGGGCATGTTAACAGGATTCAAAC CAGGACTGTTCAGTCTTACACTGAATGAACGTTTCAGTATAAAT GGTGGTTATCTGGGTATTCTAGAATGGATTCTGGGAAAGAAAGA TGTCATGTGGATAGGGTTCCTCACTAGAACAGTTCTGGAAAATA GCACAAGTTATGAAGAAGCCAAGAATTTATTGACCAAGACCAAG ATATTGGCCCCAGCCTACTTTATCCTGGGAGGCAACCAGTCTG GGGAAGGTTGTGTGATTACACGAGACAGAAAGGAATCATTGGA TGTATATGAACTCGATGCTAAGCAGGGTAGATGGTATGTGGTAC AAACAAATTATGACCGTTGGAAACATCCCTTCTTCCTTGATGATC GCAGAACGCCTGCAAAGATGTGTCTGAACCGCACCAGCCAAGA GAATATCTCATTTGAAACCATGTATGATGTCCTGTCAACAAAACC TGTCCTCAACAAGCTGACCGTATACACAACCTTGATAGATGTTA CCAAAGGTCAATTCGAAACTTACCTGCGGGACTGCCCTGACCC TTGTATAGGTTGGTGAGCACACGTCTGGCCTACAGAATGCGGC CTCTGAGACATGAAGACACCATCTCCATGTGACCGAACACTGCA GCTGTCTGACCTTCCAAAGACTAAGACTCGCGGCAGGTTCTCTT TGAGTCAATAGCTTGTCTTCGTCCATCTGTTGACAAATGACAGA TCTTTTTTTTTTCCCCCTATCAGTTGATTTTTCTTATTTACAGATA ACTTCTTTAGGGGAAGTAAAACAGTCATCTAGAATTCACTGAGTT TTGTTTCACTTTGACATTTGGGGATCTGGTGGGCAGTCGAACCA TGGTGAACTCCACCTCCGTGGAATAAATGGAGATTCAGCGTGG GTGTTGAATCCAGCACGTCTGTGTGAGTAACGGGACAGTAAAC ACTCCACATTCTTCAGTTTTTCACTTCTACCTACATATTTGTATGT TTTTCTGTATAACAGCCTTTTCCTTCTGGTTCTAACTGCTGTTAA AATTAATATATCATTATCTTTGCTGTTATTGACAGCGATATAATTT TATTACATATGATTAGAGGGATGAGACAGACATTCACCTGTATAT TTCTTTTAATGGGCACAAAATGGGCCCTTGCCTCTAAATAGCAC TTTTTGGGGTTCAAGAAGTAATCAGTATGCAAAGCAATCTTTTAT ACAATAATTGAAGTGTTCCCTTTTTCATAATTACTCTACTTCCCA GTAACCCTAAGGAAGTTGCTAACTTAAAAAACTGCATCCCACGT TCTGTTAATTTAGTAAATAAACAAGTCAAAGACTTGTGGAAAATA GGAAGTGAACCCATATTTTAAATTCTCATAAGTAGCATTCATGTA ATAAACAGGTTTTTAGTTTGTTCTTCAGATTGATAGGGAGTTTTA AAGAAATTTTAGTAGTTACTAAAATTATGTTACTGTATTTTTCAGA AATCAAACTGCTTATGAAAAGTACTAATAGAACTTGTTAACCTTT CTAACCTTCACGATTAACTGTGAAATGTACGTCATTTGTGCAAGA CCGTTTGTCCACTTCATTTTGTATAATCACAGTTGTGTTCCTGAC ACTCAATAAACAGTCACTGGAAAGAGTGCCAGTCAGCAGTCATG CACGCTGATTGGGTGTGT AAGCTTACCGCCACCATGAACTGCTGCATCGGCCTGGGTGAGA AGGCGCGTGGCTCGCACCGCGCCAGCTACCCCTCCCTGAGCG CCCTCTTCACCGAGGCGTCCATCCTCGGATTCGGGAGCTTCGC CGTCAAGGCACAGTGGACCGAGGATTGCCGCAAGAGTACGTAC CCCCCCAGTGGCCCGACGTACCGCGGCGCCGTCCCCTGGTAC

ACGATCAACCTGGACCTCCCCCCGTACAAGCGCTGGCACGAGT rhAC TGATGCTGGACAAGGCCCCCGTACTGAAGGTCATCGTGAACTC 3 (DNA) CCTGAAGAACATGATCAACACCTTCGTCCCCTCGGGCAAGATCA

TGCAGGTCGTGGACGAGAAGCTGCCCGGGCTCCTCGGCAACTT CCCCGGCCCGTTCGAAGAGGAGATGAAGGGCATCGCGGCCGT CACTGACATCCCCCTGGGCGAGATCATCAGCTTCAACATCTTCT ACGAGCTGTTCACCATCTGCACCTCCATCGTAGCCGAGGACAA GAAGGGCCACCTGATCCACGGTCGCAACATGGACTTCGGCGTC TTCCTGGGCTGGAACATCAACAACGACACCTGGGTCATCACCG AGCAGCTGAAGCCGCTCACCGTGAACCTCGATTTCCAGCGCAA CAACAAGACGGTGTTCAAGGCCAGCTCCTTCGCCGGGTACGTC GGGATGCTCACGGGCTTCAAGCCGGGACTGTTCTCGCTGACCC TCAACGAGCGGTTCTCCATCAACGGGGGCTACCTCGGCATCCT GGAGTGGATTCTCGGCAAGAAGGACGTGATGTGGATCGGCTTC CTCACACGGACCGTGCTGGAAAACTCCACTAGTTACGAGGAGG CCAAGAACCTGCTGACCAAGACGAAGATCCTGGCCCCGGCATA CTTCATCCTGGGCGGCAACCAGTCGGGCGAGGGGTGCGTCAT CACCCGCGACCGGAAGGAGTCCCTGGACGTCTATGAGCTGGA CGCCAAGCAGGGCCGCTGGTACGTCGTCCAGACGAACTACGA CCGATGGAAGCACCCCTTCTTCCTCGACGACCGGCGCACGCCC GCCAAGATGTGCCTGAACCGCACCAGCCAGGAGAACATCTCGT TCGAGACGATGTACGACGTGCTGTCGACCAAGCCCGTGCTCAA CAAGCTGACGGTCTACACCACGCTGATCGACGTGACGAAAGGC CAGTTCGAAACGTACCTGCGGGACTGCCCGGACCCTTGCATCG GCTGGTGATAATCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCC AAGCTTACCGCCACCATGAACTGCTGCATCGGGCTGGGAGAGA AAGCTCGCGGGTCCCACCGGGCCTCCTACCCAAGTCTCAGCGC GCTTTTCACCGAGGCCTCAATTCTGGGATTTGGCAGCTTTGCTG TGAAAGCCCAATGGACAGAGGACTGCAGAAAATCAACCTATCCT CCTTCAGGACCAACGTACAGAGGTGCAGTTCCATGGTACACCA

TAAATCTTGACTTACCACCCTACAAAAGATGGCATGAATTGATG rhAC 4 CTTGACAAGGCACCAGTGCTAAAGGTTATAGTGAATTCTCTGAA (DNA)

GAATATGATAAATACATTCGTGCCAAGTGGAAAAATTATGCAGG TGGTGGATGAAAAATTGCCTGGCCTACTTGGCAACTTTCCTGGC CCTTTTGAAGAGGAAATGAAGGGTATTGCCGCTGTTACTGATAT ACCTTTAGGAGAGATTATTTCATTCAATATTTTTTATGAATTATTT ACCATTTGTACTTCAATAGTAGCAGAAGACAAAAAAGGTCATCTA ATACATGGGAGAAACATGGATTTTGGAGTATTTCTTGGGTGGAA CATAAATAATGATACCTGGGTCATAACTGAGCAACTAAAACCTTT AACAGTGAATTTGGATTTCCAAAGAAACAACAAAACTGTCTTCAA GGCTTCCAGCTTTGCTGGCTATGTGGGCATGTTAACAGGATTCA AACCAGGACTGTTCAGTCTTACACTGAATGAACGTTTCAGTATA AATGGTGGTTATCTGGGTATTCTAGAATGGATTCTGGGAAAGAA AGATGTCATGTGGATAGGGTTCCTCACTAGAACAGTTCTGGAAA ATAGCACAAGTTATGAAGAAGCCAAGAATTTATTGACCAAGACC AAGATATTGGCCCCAGCCTACTTTATCCTGGGAGGCAACCAGTC TGGGGAAGGTTGTGTGATTACACGAGACAGAAAGGAATCATTG GATGTATATGAACTCGATGCTAAGCAGGGTAGATGGTATGTGGT ACAAACAAATTATGACCGTTGGAAACATCCCTTCTTCCTTGATGA TCGCAGAACGCCTGCAAAGATGTGTCTGAACCGCACCAGCCAA GAGAATATCTCATTTGAAACCATGTATGATGTCCTGTCAACAAAA CCTGTCCTCAACAAGCTGACCGTATACACAACCTTGATAGATGT TACCAAAGGTCAATTCGAAACTTACCTGCGGGACTGCCCTGACC CTTGTATAGGTTGGTGATAACCTAGGGTCGGGGCGGCCGGCC DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[0068] Conforme usado neste documento, os termos “um” ou “uma” significam “pelo menos um” ou “um ou mais”, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0069] Como usado aqui, o termo “cerca de” significa que o valor numérico é aproximado e pequenas variações não afetariam significativamente a prática das modalidades divulgadas.Onde uma limitação numérica é usada, a menos que indicado de outra forma pelo contexto, “cerca de” significa que o valor numérico pode variar em ±10% e permanecer dentro do escopo das modalidades divulgadas.

[0070] Como aqui utilizado, “atividade esfingomielinase ácida” ou “atividade ASM” refere-se a uma hidrolase lipídica relacionada que se liga firmemente à AC e copurifica com a mesma (Bernardo, K., R. Hurwitz, T. Zenk, R.J. Desnick, K. Ferlinz, E.H. Schuchman e K. Sandhoff,

1995, “Purification, characterization, and biosynthesis of human acid ceramidase,” J Biol Chem, 270: 11.098 a 11.102).

[0071] Conforme usado aqui, o termo “animal” inclui, mas não está limitado a, humanos e vertebrados não humanos, como animais selvagens, domésticos e de fazenda. O animal também pode ser chamado de “sujeito”.

[0072] Como usado aqui, o termo “carreador” significa um diluente, adjuvante ou excipiente com o qual um composto é administrado. Os carreadores farmacêuticos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo os de origem sintética, vegetal, animal, petróleo, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Os carreadores farmacêuticos também podem ser solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia e semelhantes. Além disso, podem ser utilizados agentes auxiliares, estabilizadores, espessantes, lubrificantes e corantes.

[0073] Como usado aqui, criança” refere-se a uma idade que vai do recém-nascido a 18 anos.

[0074] Conforme usado neste documento, os termos “compreendendo” (e qualquer forma de compreender, como “compreender”, “compreende” e “compreendido”), “tendo” (e qualquer forma de ter, como “ter” e “tem”), “incluindo” (e qualquer forma de inclusão, como “inclui” e “incluir”) ou “contendo” (e qualquer forma de conter, como “contém” e “conter”), são inclusivos ou de extremidade aberta e não exclui elementos adicionais não indicados ou etapas do método. Além disso, um termo que é usado em conjunto com o termo “compreendendo” também é entendido como capaz de ser usado em conjunto com o termo “consistindo em” ou “consistindo essencialmente em”.

[0075] Como aqui utilizado, o termo “contato” significa reunir dois elementos em um sistema in vitro ou em um sistema in vivo. Por exemplo, “contatar” com o polipeptídeo rhAC de um indivíduo, sujeito ou célula inclui a administração do polipeptídeo a um indivíduo ou paciente, como um ser humano, bem como, por exemplo, a introdução de um composto em uma amostra contendo uma preparação celular ou purificada que contém o polipeptídeo. Além disso, o contato pode se referir à transfecção ou infecção de uma célula com uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo.

[0076] Como usado aqui, “camundongo Farber”, “camundongos Farber”, “camundongos com doença de Farber” e “camundongo com doença de Farber” significa modelo de camundongo com doença de Farber grave (Asah1P361R/P31R6). O camundongo Farber é um modelo murino baseado em um genótipo grave de paciente com doença de Farber. Com base no genótipo do paciente com doença de Farber grave, camundongos knockin que são homozigotos para uma única mutação de nucleotídeo Asah1P361R/P361R foram derivados de uma colônia de fundo genético misto (W4/129Sv/CD-1) (“camundongos CD-1”) estabelecem um modelo murino de doença de Farber grave, como descrito anteriormente (Alayoubi, A.M., J.C. Wang, B.C. Au, S. Carpentier, V. Garcia, S. Dworski, S. El-Ghamrasni, K.N. Kirouac, M.J. Exertier, Z.J. Xiong, G.G. Prive, C.M. Simonaro, J. Casas, G. Fabrias, E.H. Schuchman, P.V. Turner, R. Hakem, T. Levade e J.A. Medin, 2013, Systemic ceramide accumulation leads to severe and varied pathological consequences, EMBO Mol Med, 5:827 a 842). Camundongos Farber foram estabelecidos em camundongos knockin homozigotos para uma mutação de nucleotídeo único no gene Asah1. Os camundongos Farber (Asah1P361R/P31R6) produzem uma AC alterada, incapaz de hidrolisar ceramidas em seus componentes esfingosina e ácidos graxos. Esses camundongos Farber exibem características da doença clínica de Farber, o que inclui interrupção da formação óssea e morfologia dos tecidos intra- articulares, presença de macrófagos carregados de lipídios e inflamação sistêmica, juntamente com uma taxa de crescimento significativamente atrofiada e vida útil reduzida em comparação com seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (Asah1PESO/PESO) ou heterozigotos (Asah1PESO/P361R).

[0077] Uma “quantidade eficaz” de uma enzima entregue a um sujeito é uma quantidade suficiente para melhorar o curso clínico de uma doença de Farber, em que a melhoria clínica é medida por qualquer uma das várias opções de parâmetros bem conhecidos pelo versado na técnica.

[0078] Conforme usado aqui, os termos “sujeito”, “indivíduo” ou “paciente”, usados de forma intercambiável, significam qualquer animal, incluindo mamíferos, como camundongos, ratos, outros roedores, coelhos, cachorros, gatos, suínos, gado, ovelha, cavalos ou primatas, como seres humanos.

[0079] Conforme usado neste documento, a frase “em necessidade do mesmo” significa que o sujeito foi identificado como tendo necessidade do método ou tratamento específico. Em algumas modalidades, a identificação pode ser por qualquer meio de diagnóstico. Em qualquer um dos métodos e tratamentos descritos neste documento, o sujeito pode precisar do mesmo.

[0080] Conforme usado aqui, a frase “número inteiro de X a Y” significa qualquer número inteiro que inclua os pontos finais. Por exemplo, a frase “número inteiro de 1 a 5” significa 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0081] Conforme usado aqui, o termo “isolado” significa que os compostos descritos aqui são separados de outros componentes de (a) uma fonte natural, como uma planta ou célula, ou (b) uma mistura de reação química orgânica sintética, como por técnicas convencionais.

[0082] Como usado aqui, o termo “mamífero” significa um roedor (isto é, um camundongo, um rato ou um porquinho-da-índia), um macaco, um gato, um cachorro, uma vaca, um cavalo, um porco ou um ser humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano.

[0083] Como aqui utilizada, a frase “farmaceuticamente aceitável” significa os compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento médico adequado, adequados para uso em contato com tecidos de humanos e animais. Em algumas modalidades, “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na

Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.

[0084] Conforme usado aqui, o termo “soro” significa qualquer matriz derivada de sangue, incluindo, sem limitação, “soro”, “plasma” ou “sangue total”.

[0085] Como aqui utilizada, a frase “substancialmente isolado” significa um composto que é pelo menos parcial ou substancialmente separado do ambiente em que é formado ou detectado.

[0086] Conforme usada aqui, a frase “quantidade terapeuticamente eficaz” significa a quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que provoca a resposta biológica ou medicinal que está sendo procurada em um tecido, sistema, animal, indivíduo ou humano por um pesquisador, veterinário, médico ou outro médico. O efeito terapêutico depende do distúrbio a ser tratado ou do efeito biológico desejado. Como tal, o efeito terapêutico pode ser uma diminuição na gravidade dos sintomas associados ao distúrbio e/ou inibição (parcial ou completa) da progressão do distúrbio, ou melhor tratamento, cura, prevenção ou eliminação de um distúrbio ou efeitos. A quantidade necessária para obter a resposta terapêutica pode ser determinada com base na idade, saúde, tamanho e sexo do sujeito. Quantidades ótimas também podem ser determinadas com base no monitoramento da resposta do paciente ao tratamento.

[0087] Qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica pode ser usado para monitorar o status da doença e a eficácia da terapia. Os monitores clínicos do status da doença podem incluir, entre outros, níveis de ceramida, peso, comprimento da articulação, inflamação ou qualquer outro fenótipo clínico conhecido por estar associado à doença de Farber.

[0088] Conforme usado neste documento, os termos “tratar”, “tratado” ou “tratar” significam tratamento terapêutico e medidas profiláticas em que o objetivo é desacelerar (diminuir) uma condição fisiológica indesejada, distúrbio ou doença, ou obter resultados clínicos desejados e benéficos. Por exemplo, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas; diminuição da extensão da condição, distúrbio ou doença; estado estabilizado (isto é, não piorando) de condição, distúrbio ou doença; atraso no início ou lentidão da condição, distúrbio ou progressão da doença; melhoria da condição, distúrbio ou estado ou remissão da doença (parcial ou total), detectável ou indetectável; melhoria de pelo menos um parâmetro físico mensurável, não necessariamente discernível pelo paciente; ou intensificação ou melhoria da condição, distúrbio ou doença. Assim, “tratamento da doença de Farber” ou “tratar a doença de Farber” significa uma atividade que alivia ou melhora qualquer um dos fenômenos primários ou sintomas secundários associados à doença de Farber ou a outra condição aqui descrita.

[0089] É ainda apreciado que certas características aqui descritas, que são, para maior clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. No entanto, várias características que são, por questões de brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

[0090] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento da doença de Farber. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo é diagnosticado com doença de Farber. Em algumas modalidades, o sujeito também é identificado como tendo: 1) nódulos subcutâneos; 2) um valor de atividade da ceramidase ácida em glóbulos brancos do sangue, fibroblastos de pele cultivados ou outras fontes biológicas (por exemplo, plasma) que são inferiores a 30% dos valores de controle; e/ou 3) alterações nucleotídicas nos dois alelos do gene de ceramidase ácida (ASAH1) que indicam, através de estudos bioinformáticos, de expressão gênica e/ou outros métodos, uma possível perda de função da proteína ácida ceramidase.

Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0091] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de redução de lipogranulomas em um sujeito com, ou suspeita de ter, doença de Farber. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg.

Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0092] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para reduzir o peso absoluto ou normalizado do baço em um sujeito com, ou com suspeita de ter, doença de Farber. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0093] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para reduzir os níveis de ceramida em um sujeito com, ou suspeito de ter, doença de Farber. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0094] Reduzir a ceramida também pode se referir à diminuição da ceramida ou ao aumento do metabolismo da ceramida, o que levaria a níveis reduzidos de ceramida.

[0095] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para aumentar os níveis de esfingosina em um sujeito com, ou suspeito de ter, doença de Farber. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0096] Diversas composições farmacêuticas são descritas aqui e podem ser usadas com base nas preferências do paciente e do médico. No entanto, em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma solução. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende meios condicionados a células que compreendem a rhAC. Como usado aqui, o termo “meio condicionado de célula” refere-se ao meio de cultura celular que foi usado para cultivar células que expressam rhAC e onde a proteína é secretada no meio e, em seguida, a proteína é isolada ou purificada do meio. Em algumas modalidades, o meio é usada para tratar o sujeito. O meio, por exemplo, pode ser aplicada à pele de um sujeito para tratar qualquer uma das condições, sintomas ou distúrbios aqui descritos.

[0097] Além das vias de administração descritas aqui, em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada que entra em contato com a pele do sujeito. Em algumas modalidades, a administração é administração parenteral. Em algumas modalidades, a administração compreende injetar a composição farmacêutica no sujeito. Em algumas modalidades, a administração é uma injeção intraperitoneal ou injeção intravenosa. Em algumas modalidades, a administração é administração oral.

[0098] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento da doença de Farber em um indivíduo em necessidade da mesma, em que o método compreende a expressão de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expressa isolada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0099] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para reduzir lipogranulomas em um sujeito com, ou suspeita de ter, doença de Farber, os métodos que compreendem expressar a ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expressa isolada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0100] Em algumas modalidades, o método compreende o tratamento de lipogranulomatose (no presente, doença de Farber) em um sujeito com, ou suspeita de ter, doença de Farber, são fornecidos, os métodos que compreendem expressar a ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expressa isolada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0101] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para reduzir o peso do baço (absoluto ou normalizado ao peso corporal) em um sujeito com, ou suspeito de ter, doença de Farber, os métodos que compreendem expressar a ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expressa isolada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0102] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para reduzir a ceramida em um sujeito com, ou suspeito de ter, doença de Farber, os métodos que compreende a expressão de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expresso isolado em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0103] Em algumas modalidades, métodos para aumentar a esfingosina em um sujeito com, ou suspeita de ter, doença de Farber, os métodos que compreende expressar ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) em uma célula; isolar a rhAC expressa da célula; e administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende a rhAC expressa isolada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a um adulto humano de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração a uma criança humana de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 1,2 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de

1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, os métodos que compreendem a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz de cerca de 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg.

[0104] Em algumas modalidades, a ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) de expressão em uma célula compreende transferir um vetor que codifica rhAC para a célula. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica rhAC. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é uma molécula como aqui descrita ou qualquer outra molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo rhAC ou seu homólogo, que é descrito em mais detalhes aqui. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Por exemplo, o vetor pode ser um vetor retroviral ou um vetor de vírus de DNA, como adenovírus, AAV e similares. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor compreende um promotor operacionalmente ligado à rhAC. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor SV40, o promotor CMV, o promotor EF1 alfa ou qualquer combinação dos mesmos, ou qualquer outro promotor que esteja ativo em uma célula de mamífero.

[0105] Em algumas modalidades, o vetor é transfectado ou infectado na célula. Os métodos de introdução do vetor na célula não são críticos e qualquer método pode ser utilizado para fornecer expressão suficiente do polipeptídeo rhAC na célula.

[0106] Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula não é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de hamster. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). Em algumas modalidades, a célula pode ser cultivada em um ambiente livre de soro ou substancialmente livre de soro. Em algumas modalidades, a célula é derivada de uma célula CHO-K1. Em algumas modalidades, a célula é uma célula murina. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mieloma murina. Em algumas modalidades, a célula é uma célula NS0. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz que é administrada é como aqui descrito, acima e abaixo.

[0107] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como descrito neste documento. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é administrada a um sujeito por via oral, por inalação, por instilação intranasal, por via tópica, transdérmica, parenteral, subcutânea, injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intramuscular, intraplural, intraperitoneal, intratecal ou por aplicação a uma membrana mucosa.

[0108] Como usado aqui, o termo “rhAC” ou “AC” refere-se à ceramidase ácida humana recombinante codificada pelo gene ASAH1 (NCBI UniGene GeneID No. 427). O AC hidrolisa a ligação de amido que liga as porções esfingosina e ácidos graxos da ceramida lipídica (Park, J.-H., Schuchman E. H., 2006, “Acid ceramidase and human disease,” Biochim. Biophys. Acta. 1758(12): 2.133 a 2.138; Nikolova-Karakashian et al., 2000, “Ceramidases,” Methods Enzymol. 311:194 a 201 (2000); Hassler et al., 1993, “Ceramidase: Enzymology and metabolic roles,” Adv. Lipid Res. 26:49 a 57). Mutações de ambos os alelos ASAH1 podem levar à doença de Farber.

[0109] Existem três tipos de ceramidases descritas até o momento (Nikolova-Karakashian, 2000). São classificadas como ceramidases ácidas, neutras e alcalinas, de acordo com seu pH ótimo de atividade enzimática. As ACs têm ótima atividade enzimática a pH <5. A AC humana foi a primeira ceramidase a ser clonada (Koch et al., 1996, “Molecular Cloning and Characterization of a Full-length Complementary DNA Encoding Human Acid Ceramidase: Identification Of The First Molecular Lesion Causing Farber Disease,” J. Biol. Chem. 271:33.110 a 33.115). Está localizado no lisossoma e é o principal responsável pelo catabolismo da ceramida. A disfunção dessa enzima devido a um defeito genético leva a uma doença de esfingolipidose chamada lipogranulomatose ou doença de Farber (Koch et al., 1996, “Molecular Cloning and Characterization of a Full-length Complementary DNA Encoding Human Acid Ceramidase: Identification Of The First Molecular Lesion Causing Farber Disease,” J. Biol. Chem. 271:33.110 a 33.115, Young et al., 2013, “Sphingolipids: regulators of crosstalk between apotosis and autophagy,” J. Lipid. Res. 54:5 a 19).

[0110] A proteína AC (N-acilsfingosina desacilase, enzima IUBMB nº EC 3.5.1.23) foi purificada de várias fontes, e os cDNAs e genes humanos e de camundongo foram obtidos. Consultar Bernardo et al., J. Biol. Chem. 270:11.098 a 11.102 (1995); Koch et al., J. Biol. Chem. 2711:33.110 a 33.115 (1996); Li et al., Genomics 50:267-74 (1998); Li et al., Genomics 62:223 a 231 (1999). É produzido através da clivagem da proteína precursora AC (consultar Ferlinz et al., J. Biol. Chem. 276(38):35.352 a 35.360 (2001)), que é o produto do gene ASAH1 (NCBI UniGene GeneID nº 427). A proteína AC [Homo sapiens] (Nº de acesso NCBI AAC50907) é mostrada na SEQ ID NO: 1.

[0111] A subunidade alfa da AC começa no aminoácido na posição 22 e continua até a posição 142 (como mostrado em negrito na SEQ ID NO: 1 na Tabela de Sequências), enquanto a subunidade beta da AC começa com o aminoácido na posição 143 e continua na posição 395 (como mostrado em itálico na SEQ ID NO: 1).

[0112] Conforme usado aqui, “ceramidase ácida ativa”, “AC ativa” ou “AC na forma ativada”, ou frases semelhantes, refere-se a proteínas precursoras de AC que foram submetidas à clivagem autoproteolítica na forma ativa (composta pelas subunidades α e β). O mecanismo de clivagem e ativação da AC humana é relatado em (Shtraizent, N., E. Eliyahu, J.H. Park, X. He, R. Shalgi e E.H. Schuchman, 2008, “Autoproteolytic cleavage and activation of human acid ceramidase,” J Biol Chem, 283(17):11.253 a 11.259). A ativação também é promovida pelo ambiente intracelular e, com base em sequências altamente conservadas no local da clivagem das proteínas precursoras da ceramidase entre as espécies, é esperado que ocorra na maioria dos tipos de células, se não em todos.

[0113] Conforme usado neste documento, “ceramidase ácida inativa”, “AC inativa” ou “precursor de ceramidase ácida inativa”, “precursor de AC inativa” ou (pré-proteína AC) se refere à proteína precursora de AC que não foi submetida à clivagem autoproteolítica na forma ativa. Precursores de AC inativas e ACs ativas adequadas para uso na ceramidase ácida recombinante desta e de todos os aspectos da presente invenção podem ser homólogos (isto é, derivados da mesma espécie) ou heterólogos (isto é, derivados de uma espécie diferente) ao tecido, células e/ou sujeito a ser tratado. As proteínas precursoras de ceramidase ácida (por exemplo, AC) sofrem clivagem autoproteolítica na forma ativa (composta pelas subunidades α e β). O mecanismo de clivagem e ativação da AC humana é relatado em (Shtraizent, 2008). Isso é promovido pelo ambiente intracelular e, com base em sequências altamente conservadas no local de clivagem das proteínas precursoras da ceramidase entre as espécies, espera-se que ocorra na maioria dos tipos de células, se não em todos. Assim, a ceramidase, como aqui utilizada, inclui proteínas ceramidases ativas e proteínas precursoras de ceramidase, em que as proteínas precursoras de ceramidase são convertidas em proteínas ceramidase ativas através de clivagem autoproteolítica. As modalidades nas quais a proteína precursora é absorvida pela célula de interesse e convertida em ceramidase ativa desse modo, bem como modalidades nas quais a proteína precursora é convertida em ceramidase ativa por uma célula ou agente diferente (presente, por exemplo, em um meio de cultura), são ambos contemplados.

[0114] As ACs ativas e proteínas precursoras de AC inativas que podem ser usadas neste e em todos os aspectos da presente invenção incluem, sem limitação, aquelas estabelecidas na Tabela 1 do documento US 2016/0038574, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

TABELA 1 DO DOCUMENTO US 2016/0038574 (AQUI INCORPORADA NA SUA TOTALIDADE A TÍTULO DE REFERÊNCIA)

[0115] Em algumas modalidades, a rhAC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0116] O “RVT-801” é uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) na forma ativada para o tratamento da doença de Farber. As subunidades alfa e beta da rhAC ativada são unidas por uma ligação dissulfeto. A molécula é uma ceramidase ácida humana recombinante (rhAC) derivada de células CHO-M transfectadas com um vetor plasmídeo de DNA que expressa rhAC. O RVT-801 é baseado no código UniProtKB: Q13510.

[0117] O efeito terapêutico do RVT-801rhAC foi estabelecido em um modelo murino de doença grave de Farber (He, et al, 2017) e foi caracterizado em vários estudos com parâmetros que descrevem impactos positivos nos resultados histopatológicos e imunológicos, juntamente com a redução concomitante da acumulação ceramidas.

[0118] Em algumas modalidades, a rhAC é uma proteína que é um homólogo da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a rhAC é codificada por uma molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a sequência é como definida no número de acesso do GenBank NM_177924.3 ou NM_177924.4, cada um dos quais é incorporado a título de referência na sua totalidade. A sequência nucleotídica que codifica a proteína pode ser a sequência completa mostrada nas SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou ser simplesmente a região de codificação da sequência. A região de codificação, por exemplo, pode ser nucleotídeos 313 a 1.500 da SEQ ID NO: 2 ou a região de codificação correspondente encontrada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. No entanto, como é bem conhecido dos versados na matéria, o código genético é degenerado e, portanto, outros códons podem ser usados para codificar a mesma proteína sem estar fora do que é divulgado. Uma vez que a sequência de aminoácidos é conhecida, qualquer sequência nucleotídica que codifique a sequência de aminoácidos é aceitável. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica compreende um peptídeo sinal. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos codificada pelos nucleotídeos 313 a 375 da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida compreende um peptídeo sinal dos resíduos de aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida não compreende um peptídeo sinal, como o peptídeo sinal dos resíduos de aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal é removido durante um processamento pós-tradução, em que a enzima é processada em suas diferentes subunidades. Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica é otimizada por códon para a célula da qual a proteína está sendo expressa. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma subunidade alfa, uma subunidade beta e semelhantes. Em algumas modalidades, a proteína que é produzida compreende um peptídeo dos resíduos de aminoácidos 22 a 142, 45 a 139, 134 a 379, 143 a 395 ou 1 a 395 da SEQ ID NO: 1. O peptídeo pode ser uma única proteína ou um polipeptídeo de diferentes sequências para formar a enzima. Em algumas modalidades, a proteína está livre de resíduos de aminoácidos 1 a 21. Estas regiões podem ser codificadas por uma única sequência nucleotídica ou sequências nucleotídicas separadas ou uma combinação de sequências nucleotídicas. Como discutido aqui, qualquer sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode ser usada e não está limitada à sequência aqui descrita como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

[0119] Em algumas modalidades, a rhAC tem atividade de ceramidase ácida (AC), mas não tem nenhuma atividade esfingomielinase ácida detectável, como a rhAC produzida nos Exemplos 1 e 2 abaixo. A atividade esfingomielinase ácida pode ser removida, por exemplo, por inativação por calor. A inativação por calor também pode remover outras proteínas contaminantes de uma preparação de rhAC. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente US Nº 20160038574, que é incorporada aqui na sua totalidade.

[0120] O termo “homólogo” refere-se a sequências de proteínas com entre 80% e 100% de identidade de sequência com uma sequência de referência. A identidade percentual entre duas cadeias peptídicas pode ser determinada por alinhamento em pares, com o uso de configurações padrão do módulo AlignX do Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carslbad, Califórnia). Em algumas modalidades, o homólogo tem pelo menos, ou cerca de 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade para uma sequência aqui descrito, como SEQ ID NO: 1.

[0121] Em algumas modalidades, a proteína entregue às substituições conservadoras do sujeito em comparação com uma sequência aqui descrita. As substituições conservativas exemplares não limitativas são mostradas na Tabela 3 e estão incluídas no escopo do objeto divulgado. Também podem ser feitas substituições para melhorar a função da enzima, por exemplo estabilidade ou atividade enzimática. As substituições conservadoras produzirão moléculas com características funcionais e químicas semelhantes às moléculas nas quais essas modificações são feitas. Exemplos de substituições de aminoácidos são mostrados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3: SUBSTITUIÇÕES CONSERVADORAS EXEMPLARES:

Resíduo Original Substituições Conservadoras Exemplares Ala Val, Leu, Ile Arg Lys, Gln, Asn Asn Gln Asp Glu Cys Ser, Ala Gln Asn Gly Pro, Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe Leu Ile, Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, Gln, Asn Met Leu, Phe, Ile Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Pro Ala Ser Thr, Ala, Cys Thr Ser Trp Tyr, Phe Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala

[0122] O termo “em combinação com”, conforme usado aqui, significa que os agentes descritos podem ser administrados a um indivíduo juntamente em uma mistura, simultaneamente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.

[0123] Como descrito aqui, em algumas modalidades, a proteína é produzida a partir de uma célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula do ovário de hamster chinês, “célula CHO”. Uma sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas aqui descritas pode ser DNA ou cDNA genômico ou RNA (por exemplo, mRNA) que codifica pelo menos uma das proteínas aqui descritas. O uso de cDNA requer que os elementos de expressão gênica apropriados para a célula hospedeira sejam combinados com o gene, a fim de alcançar a síntese da proteína desejada. O uso de sequências de cDNA pode ser vantajosa em relação às sequências genômicas (que contêm íntrons), em que as sequências de cDNA podem ser expressas em bactérias ou outros hospedeiros que não têm sistemas de splicing de RNA apropriados. Um versado na técnica pode determinar o melhor sistema para expressar a proteína.

[0124] Em algumas modalidades, a proteína é produzida de acordo com a Publicação de Pedido de Patente US Nº 20160038574, que é incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0125] Como o código genético é degenerado, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido específico. Com o uso do código genético, um ou mais oligonucleotídeos diferentes podem ser identificados, cada um dos quais seria capaz de codificar as sequências de aminoácidos aqui descritas.

[0126] A enzima que é administrada ao sujeito para tratar a doença de Farber ou uma condição associada a ela pode ser purificada. O termo “purificado” com referência a uma proteína refere-se a uma proteína que é substancialmente livre de outro material que se associa à molécula em seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína purificada está substancialmente livre do material celular ou de outras proteínas da célula ou tecido do qual é derivada. O termo refere-se a preparações em que a proteína isolada é suficientemente pura para ser analisada, ou pelo menos 70% a 80% (p/p) pura, pelo menos 80% a 90% (p/p) pura, 90 a 95% pura; e, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (p/p) puro. Em algumas modalidades, a proteína é purificada a partir de uma célula, como, mas sem limitação, uma célula CHO. ADMINISTRAÇÃO, COMPOSIÇÕES E KITS QUE

COMPREENDEM AS PROTEÍNAS

[0127] Como descrito aqui, as modalidades aqui fornecidas fornecem métodos de tratamento da doença de Farber. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma ou mais proteínas aqui descritas a um sujeito com doença de Farber ou suspeito de ter doença de Farber.

[0128] O tratamento de sujeitos pode compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas aqui descritas.

[0129] As proteínas podem ser fornecidas em um kit como aqui descrito.

[0130] As proteínas podem ser usadas ou administradas isoladamente ou em mistura com uma terapêutica adicional. Exemplos de terapêuticas adicionais incluem, entre outros, inibidores da esfingomielinase ácida (por exemplo, amitriptilina (Becker et al., 2010, “Acid Sphingomyelinase Inhibitors Normalize Pulmonary Ceramide and Inflammation in Cystic Fibrosis,” Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 42:716 a 724, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade) e inibidores das sintases de ceramida (por exemplo, Shiffmann, S., Hartmann, D., Birod, K., Ferreiròs, N., Schreiber, Y., Zivkovic, A., Geisslinger, G., Grösch, S. e Stark, H., 2012, “Inhibitors of Specific Ceramide Synthases,” Biochimie, 94(2):558 a 565, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade)). A terapêutica adicional também pode ser misturas de ceramidase descritas na Publicação de Pedido de Patente US Nº 20160038574, que é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0131] Embora as terapias de reposição enzimática (ERTs) possam ser eficazes, como mostrado em nosso estudo atual para a doença de Farber, onde foi demonstrada a redução do acúmulo de ceramida, os anticorpos podem se desenvolver contra o fármaco, ou seja, a enzima de reposição que pode reduzir sua eficácia. Nesse documento, é mostrado que doses repetidas são bem toleradas, o que suporta um regime de tratamento de administração repetida da enzima de reposição, resultando na redução dos sintomas da doença, particularmente a enzima produzida de acordo com os métodos descritos aqui e, por exemplo, na publicação do pedido de patente dos EUA n° 20160038574.

[0132] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento da doença de Farber em um sujeito em necessidade do mesmo compreendem administrar ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende uma ceramidase ácida humana recombinante em uma quantidade eficaz cerca de uma vez por semana, uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou uma vez um mês, por cerca de 10, cerca de 20 ou cerca de 30 semanas, 1, 5, 10 ou 25 anos, ou a duração da vida de um paciente.

[0133] Os veículos adequados e a sua formulação e embalagem são descritos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21ª ed., Troy, D. ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md. 2005) capítulos 40 e 41). Métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregados para controlar a duração da ação. As preparações de liberação controlada podem ser alcançadas através do uso de polímeros para complexar ou absorver os compostos. Outro método possível para controlar a duração da ação por preparações de liberação controlada é incorporar os compostos em partículas de um material polimérico, como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogéis, poli(ácido lático) ou copolímeros de acetato de vinila e etileno. Alternativamente, em vez de incorporar esses agentes em partículas poliméricas, é possível aprisionar esses materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, ou em sistemas de entrega de fármacos coloidais, por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas ou em macroemulsões.

[0134] Em geral, se administrar uma dose sistêmica da proteína, é desejável fornecer ao receptor uma dosagem de proteína que esteja na faixa de cerca de 1 ng/kg a 100 ng/kg, 100 ng/kg a 500 ng/kg, 500 ng/kg a 1 µg/kg, 1 µg/kg a 100 µg /kg, 100 µg/kg a 500 µg/kg, 500 µg /kg a 1 mg/kg a 50 mg/kg, 50 mg/kg a 100 mg/kg, 100 mg/kg a 500 mg/kg (peso corporal do destinatário), embora uma dose mais baixa ou mais alta possa ser administrada.

[0135] Em algumas modalidades, a dose humana de rhAC em adultos é de cerca de 0,8 mg/kg. Em algumas modalidades, a dose humana de rhAC em crianças é de cerca de ~1,2 mg/kg.

[0136] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de rhAC que é administrada é de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 10 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 10 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 20 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 30 mg/kg a cerca de 40 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 40 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg.

[0137] A dosagem pode ser administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês. Em algumas modalidades, a dose é administrada uma vez por semana. Em algumas modalidades, a dose é administrada uma vez a cada duas semanas. O tratamento também pode ser administrado em um esquema de doses únicas ou em um esquema de doses múltiplas, no qual um curso primário de tratamento pode ser de 1 a 10 doses separadas, seguido por outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes necessários para manter e reforçar a resposta, por exemplo, uma vez por semana, durante 1 a 4 meses, para uma segunda dose e, se necessário, uma dose subsequente (ou mais) após vários meses. Exemplos de cronogramas de tratamento adequados incluem: (i) 0, 1 mês e 6 meses, (ii) 0, 7 dias e 1 mês, (iii) 0 e 1 mês, (iv) 0 e 6 meses, ou outros cronogramas suficientes para desencadear as respostas desejadas esperadas para reduzir os sintomas da doença ou reduzir a gravidade da doença. Outros esquemas de tratamento, como, sem limitação, os descritos acima, também podem ser usados.

[0138] Em certos aspectos da divulgação, o tratamento é iniciado quando o indivíduo é recém-nascido, com menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos de idade ou entre 1 e 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 60, 70 ou 80 anos de idade (por exemplo, entre 1 e 2, entre 1 e 3, etc.). Em algumas modalidades, o sujeito está entre 16 e 61. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 16 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 12 e 69. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 12 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 19 e 74. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 19 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 4 e 62. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 4 anos de idade. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 7 e 42. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 7 anos. Em algumas modalidades, o sujeito é recém-nascido. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 1 e 6 meses. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento com a idade de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 6 e 43. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 6 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 5 e 31. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 5 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 5 e 57. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 5 e 29. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 1 e 3. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 1 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 10 e 70. Em algumas modalidades, o sujeito inicia o tratamento aos 10 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está entre 5 e 80, entre 10 e 70, entre 20 e 75, entre 5 e 60, ou entre 5 e 30 anos de idade.

[0139] Em algumas modalidades, um sujeito diagnosticado com doença de Farber é administrado rhAC a cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de rhAC ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de rhAC a cada duas semanas. Em uma modalidade, a dosagem aumenta de 1 mg/kg ou 2 mg/kg para 5 mg/kg na semana 4. Se um nível de dose não for tolerado por um sujeito indivíduo, a dose para esse indivíduo pode ser reduzida de 2 mg/kg para 1 mg/kg ou 5 mg/kg para 2 mg/kg, conforme apropriado. A rhAC pode ser administrada a cada 2 semanas por pelo menos 10, 20 ou 30 semanas ou pela duração da vida do sujeito. Em uma modalidade, um sujeito é diagnosticado com doença de Farber e é identificado como tendo: 1) nódulos subcutâneos; e/ou 2) um valor de atividade da ceramidase ácida em glóbulos brancos, fibroblastos de pele cultivados ou outras fontes biológicas (por exemplo, plasma) que seja inferior a 30% dos valores de controle; e/ou 3) alterações nucleotídicas nos dois alelos do gene de ceramidase ácida (ASAH1) que indicam, através de estudos bioinformáticos, de expressão gênica e/ou outros métodos, uma possível perda de função da proteína ácida ceramidase. Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com rhAC a cada duas semanas por 28 semanas. Em algumas modalidades, a entrega de rhAC é por infusão intravenosa (por exemplo, infusão de solução salina). Em algumas modalidades, começando em cerca de 1 mg/kg e elevando para cerca de 5 mg/kg de rhAC (por exemplo, para 5 mg/kg na semana 4).

[0140] Em algumas modalidades, a infusão intravenosa pode ser de 3 m/h ao longo do tempo (geralmente 3,5 a 4 horas). Em algumas modalidades, a dose é infundida a uma taxa de 3% do volume total na primeira hora e o restante da dose pode ser infundido nas 2,5 horas seguintes (isto é, a infusão na segunda hora pode ser de aproximadamente 40% do volume nominal por hora até a dose ser administrada). Não é estabelecido um tempo máximo de infusão para garantir que a tolerabilidade individual possa ser tratada caso a caso. A infusão é administrada através de um filtro de 0,2 mícron em linha, de baixa ligação às proteínas. A dose é normalizada para o peso em kg, que será determinado a cada intervalo de dosagem, com base no peso coletado na visita do estudo anterior.

[0141] Por exemplo, a administração específica do local pode ser no compartimento ou cavidade do corpo, como intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intramiocárdico, intraósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intraretinal, intraspinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, vaginal, retal, oral, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.

[0142] As composições terapêuticas aqui descritas podem ser preparadas para uso para administração parenteral (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou qualquer outra administração, particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas. A formulação também pode ser adequada para uma formulação injetável. Em algumas modalidades, a formulação injetável é estéril. Em algumas modalidades, a formulação injetável é livre de pirogênio. Em algumas modalidades, a formulação está livre de outros anticorpos que se ligam a outros antígenos que não sejam um antígeno aqui descrito.

[0143] Uma proteína de rhAC capaz de tratar a doença de Farber ou outra condição associada à atividade ou uso de rhAC para tratar uma patologia relacionada à rhAC deve ser fornecida aos sujeitos em uma quantidade suficiente para afetar uma redução, resolução ou melhoria no sintoma relacionado ou patologia. Essa patologia inclui os sintomas da doença de Farber, como aqui descrito em um sujeito. É dito que uma quantidade é suficiente ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz” para “afetar” a redução dos sintomas se a dosagem, via de administração e esquema de dosagem do agente forem suficientes para influenciar tal resposta. As respostas à proteína podem ser medidas por análise dos tecidos, órgãos ou células afetados pelo indivíduo, como por técnicas de imagem ou por análise ex vivo de amostras de tecido. Um agente é fisiologicamente significativo se sua presença resultar em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Em algumas modalidades, uma quantidade é uma quantidade terapeuticamente eficaz se for uma quantidade que pode ser usada para tratar, melhorar ou inibir sintomas da doença de Farber a que um sujeito está submetido. Exemplos não limitativos de tais quantidades são fornecidos neste documento, mas não se destinam a ser limitados a essa quantidade, se o contexto exigir outra quantidade.

[0144] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada por qualquer um dos seguintes meios: • Variação percentual da linha de base na contagem líquida de nódulos (≥5 mm) após tratamento com rhAC por 28 semanas; • Variação percentual da linha de base na contagem líquida de nódulos (≥10 mm) e comparação com o placebo após tratamento com rhAC por 28 semanas; • Variação percentual da linha de base na contagem total de nódulos (independentemente do tamanho) e comparação com o placebo após o tratamento com rhAC por 28 semanas; • Variação e variação percentual da linha de base da amplitude de movimento articular em articulações selecionadas e comparação com placebo após tratamento com rhAC por 28 semanas; • Variação e variação percentual da linha de base da distância de caminhada de 6 minutos e comparação com o placebo após o tratamento com rhAC por 28 semanas;

• Variação e variação percentual da linha de base dos testes de função pulmonar e comparação com placebo após tratamento com rhAC por 28 semanas; • Variação e variação percentual da linha de base do escore FDT e comparação com o placebo após o tratamento com rhAC por 28 semanas; • Variação e variação percentual em relação à linha de base no escore Z do peso corporal e altura para a idade durante o tratamento com rhAC ou placebo por 28 semanas.

[0145] Em algumas modalidades, a farmacocinética do RVT-801 após a administração em camundongos Farber ou camundongos saudáveis em doses diferentes é avaliada com base em métodos não compartimentados. Os métodos farmacocinéticos não compartimentais estimam a exposição a um fármaco estimando a área sob a curva de um gráfico de concentração-tempo, entre outros, com as seguintes métricas conhecidas na técnica:

TABELA 4 Características Descrição Dose (D) Quantidade de fármaco administrado Área sob a Curva A integral da curva concentração-tempo: (AUC) !"# AUC0-τ = ∫! # %& Meia-vida de O tempo necessário para a concentração do eliminação (t1/2) fármaco atingir metade do seu valor original: $%(') t1/2 = )! Cmáx Concentração máxima observada Tmáx Tempo de concentração máxima observada Túltimo Tempo da concentração final quantificável AUCúltimo Área sob a curva de concentração-tempo de 0 até o último ponto quantificável Vz/F Volume aparente de distribuição após administração extravascular CL/F Depuração aparente após administração extravascular

[0146] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento específico para o tecido é avaliada ao determinar a farmacocinética específica do tecido do RVT-801 com base nos métodos farmacocinéticos não compartimentais descritos acima.

[0147] Em algumas modalidades, a Dose Equivalente Humana (HED) de RVT-801 correspondente à dose eficaz para camundongos com doença de Farber é estimada. As avaliações não clínicas da HED aqui foram baseadas em dois métodos: 1) orientação de FDA para dimensionamento entre espécies não clínicas e humanos por área de superfície corporal (BSA) e 2) relações órgão:peso corporal entre espécies de fígado e baço como os principais tecidos para acumulação de ceramida e em que predominou a captação de RVT-

801.

[0148] Dimensionamento por área de superfície corporal: A HED, comparativa com o MED de camundongo Farber (dose máxima efetiva) e com base em BSA e no peso corporal de um adulto ou criança humana (em que HED = dose animal * (peso corporal animal/peso corporal humano)0,33 indica uma dose de ~0,81 mg/kg para um adulto de 60 kg e ~1,2 mg/kg para uma criança de 15 kg.

[0149] Dimensionamento por razões órgão:peso corporal: estudos de farmacocinética demonstraram que o mecanismo de liberação da vasculatura está associado à captação e/ou distribuição nos tecidos, portanto, a relação peso-para-peso corporal pode afetar a dose e o modelo de BSA pode não ser suficientemente preditivo isoladamente. Usando HED = MED * (Tecidohumano/BWhumano)/(Tecidohumano/BWcamundongo) a 10 mg/kg de dose de camundongo é equivalente a uma ~ 3-5 mg/kg de dose de um adulto humano ou um ~5/4 dose de mg/kg em uma criança de 15 kg com base no fígado e baço em adultos e crianças humanos.

[0150] Em algumas modalidades, a HED pode ser determinada combinando as duas abordagens de dimensionamento acima.

[0151] As proteínas podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que esses materiais, ou seus derivados funcionais, são combinados em mistura com um veículo carreador farmaceuticamente aceitável.

[0152] Também são fornecidos kits, que são descritos aqui e abaixo, que são úteis para a realização de modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, os kits compreendem um primeiro recipiente contendo ou embalado em associação com os polipeptídeos descritos acima. O kit também pode compreender outro recipiente contendo ou embalado em soluções de associação necessárias ou convenientes para a realização das modalidades. Os recipientes podem ser feitos de vidro, plástico ou papel alumínio e podem ser um frasco, garrafa, bolsa, tubo, bolsa etc. O kit também pode conter informações escritas, como procedimentos para realizar as modalidades ou informações analíticas, como a quantidade de reagente contida no primeiro recipiente significa. O recipiente pode estar em outro aparelho de recipiente, por exemplo, uma caixa ou um saco, juntamente com as informações escritas.

[0153] Ainda outro aspecto aqui previsto é um kit para o tratamento da doença de Farber. Em algumas modalidades, o kit compreende pelo menos um recipiente que compreende um polipeptídeo rhAC ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o mesmo. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente que compreende uma célula que está configurada para expressar rhAC. Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO. Em algumas modalidades, o kit compreende meios condicionados de uma célula que expressa rhAC. Em algumas modalidades, o meio condicionado é de uma célula CHO.

[0154] O assunto agora é descrito com referência aos seguintes exemplos. Esses exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e as reivindicações não devem, de forma alguma, ser interpretadas como limitadas a esses exemplos, mas devem ser interpretadas de modo a abranger toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado do ensino aqui fornecido. Aqueles versados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.

EXEMPLOS

[0155] Os presentes exemplos fornecem a disposição de rhAC nos principais compartimentos teciduais após a administração em uma variedade de doses eficazes para permitir a modelagem farmacocinética e de distribuição tecidual subsequente e, com base na dose eficaz e nas exposições teciduais, fornecem ainda predição de uma dose equivalente humana (HED),

dimensionado por área de superfície corporal ou proporção de órgão:peso corporal. EXEMPLO 1

[0156] O perfil farmacocinético de soro de rhAC (RVT- 801) após a administração de RVT-801 por injeção intraperitoneal (i.p.) em uma faixa de doses eficazes foi avaliado em camundongos CD-1 saudáveis, jovens e do tipo selvagem (cepa parental de camundongos Asah1P361R/P361R, (Consultar, He et al., 2017, aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). A produção e caracterização da rhAC (RVT-801) foram realizadas de acordo com o documento PCT/2018/052463 (ainda não publicado), depositado em 24 de setembro de 2018, que é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

PROTOCOLO DE VIDA

[0157] Camundongos CD-1 machos, com idade aproximada de 3,5 semanas (jovens), receberam RVT-801 como uma injeção IP única em bolus a 1, 3 ou 10 mg/kg. Amostras de sangue para análise farmacocinética foram coletadas de três (3) animais por ponto no tempo (pré- dose, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 pós-injeção) em cada grupo de doses por punção cardíaca ou outro meio aprovado para gerar o volume máximo de amostra de sangue de cada camundongo. Cada amostra de sangue foi processada na sua totalidade no soro imediatamente para análise da concentração de RVT-801 por ELISA. BIOANÁLISE RVT-801 DA ELISA

[0158] O ensaio imunossorvente sanduíche (ELISA) foi qualificado para a quantificação de RVT-801 no soro de camundongos. O método utiliza um anticorpo policlonal de coelho humano antirrecombinante AC (rhAC, RVT-801) de coelho purificado por afinidade para captura e um anticorpo policlonal de coelho anti-rhAC conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) purificado por afinidade para detecção. O RVT-801 é usado para estabelecer a curva padrão e os intervalos de controle. O sinal gerado é proporcional à concentração de RVT-801 na amostra dentro do intervalo definido do ensaio.

[0159] O procedimento detalhado do ensaio de 2 dias é o seguinte: No dia 1, uma placa de poliestireno transparente de 96 cavidades foi revestida com 100 μl de Reagente de Captura (1 μg/ml de coelho anti-rhAC em PBS) e incubada durante a noite a 2 a 8 °C. Todas as outras etapas foram realizadas no dia 2. Todas as incubações no dia 2 ocorreram à temperatura ambiente (TA), com agitação (~300 a 400 rpm). Em suma, a placa foi lavada 3 vezes com 300 ml de tampão de lavagem (1X PBS que contém 0,05% de Tween- 20, PBST) e rosqueado em toalhas de papel após a lavagem final. Em seguida, a placa foi bloqueada com 300 ml de tampão de ensaio (Caseína/TBS contendo 0,05% de Tween 20) por cavidade por pelo menos 1 hora e lavada como descrito acima. Após a lavagem, 100 μl dos padrões de calibração, controles e amostras, diluídos no MRD (50 vezes em Tampão de Ensaio), foram adicionados a cada cavidade, e a placa foi incubada por aproximadamente 2 horas e lavada como descrito acima. Em seguida, 100 µl de reagente de detecção (0,2 µg/ml de coelho anti-rhAC conjugado com HRP em tampão de ensaio) foram adicionados a cada cavidade e a placa foi incubada por aproximadamente 1 hora e lavada como descrito acima. Após a lavagem, 100 μl de solução de substrato fria foram adicionados a cada cavidade e a placa foi incubada no escuro por até 30 minutos. O desenvolvimento da cor foi monitorado medindo a absorvância a 650 nm (A650). A reação foi interrompida quando o A650 estava entre 0,9 a 1,2 para o padrão mais alto, ou conforme apropriado, com base no desenvolvimento da cor. Para interromper o desenvolvimento da cor, 100 μl de solução de parada foram adicionados a cada cavidade e a placa foi lida a 450 nm com a correção do comprimento de onda ajustada em 650 nm.

ANÁLISE FARMACOCINÉTICA NÃO COMPARTIMENTAL

[0160] A análise farmacocinética não compartimental foi realizada por meio do Certara WinNonlin Phoenix Versão 7.0. Proporções de exposições e gráficos foram gerados com Microsoft Excel e GraphPad Prism.

RESULTADOS

[0161] Para avaliar o perfil farmacocinético da enzima in vivo, camundongos CD-1 jovens saudáveis receberam uma única injeção de rhAC (RVT-801) nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, e as concentrações de RVT-801 foram determinadas no soro (Figura 1) às 0,5, 1, 2, 3, 4 e 6 horas após a injeção. Como mostrado na Figura 2, a exposição de soro (AUC, Cmáx) aumentou de maneira proporcional à dose após doses IP únicas de RVT-801 a 1, 3 e 10 mg/kg.

[0162] Os dados de PK de camundongo CD-1 jovem para RVT-801 são discutidos abaixo. Foram realizados dois estudos em camundongos CD-1 jovens dosados com RVT-801 a 10 mg/kg:

[0163] RVT-801-9013A - focado na caracterização de PK de soro.

[0164] Os seguintes parâmetros PK foram observados.

[0165] AUC 1,37 h*µg/ml

[0166] Cmáx 1,23 h*µg/ml

[0167] Tmáx 1,0 hora

[0168] RVT-801-9013B - focado na distribuição tecidual de RVT-801 e nas proporções de exposição de tecido:soro. Os seguintes parâmetros PK foram observados.

[0169] AUC 1,49 h*µg/ml

[0170] Cmáx 2,17 h*µg/ml

[0171] Tmáx 0,25 hora

[0172] Além disso, como mostrado na Figura 3, a duração da exposição ao RVT-801 (injeção i.p., 10 mg/kg) no soro de camundongos CD-1 do tipo selvagem correlacionou-se intimamente com a atividade da ceramidase ácida sistêmica (AC) em camundongos com doença de Farber (uma linha sólida com círculos pretos; reproduzida a partir do Pedido Internacional Nº PCT/US18/13509, cuja divulgação é incorporada a título de referência na sua totalidade). Com base nesta constatação, foram realizadas avaliações adicionais da farmacocinética do RVT-801 e distribuição específica do tecido com camundongos CD-1 do tipo selvagem pareados com a idade dos camundongos Farber jovens usados nos estudos de eficácia. EXEMPLO 2

[0173] Além disso, a farmacocinética e a distribuição específica de tecido de RVT-801 foram avaliadas em uma variedade de tecidos de órgãos de camundongos CD-1 de tipo selvagem.

PROCESSAMENTO DE TECIDOS ANTES DA ANÁLISE

[0174] Os homogenatos de tecido foram preparados em tampão CHAPS com a adição de um coquetel inibidor de protease, processando as amostras com um Qiagen TissueLyser II (3 ciclos de 3 minutos cada a uma frequência de 30 Hz). Os homogenatos de tecido foram diluídos para uma concentração total de proteína padrão de 1 mg/ml antes da detecção por ELISA. Devido ao baixo teor de proteínas, as amostras LBAF foram processadas para detecção com base no volume e não na concentração de proteínas. QUANTIFICAÇÃO DE RVT-801 NO EXTRATO DE

TECIDO POR ELISA MODIFICADO

[0175] O método ELISA qualificado para a quantificação do soro de camundongo RVT-801 foi adaptado para quantificação em tecidos de camundongos (sangue, fígado, baço, rim, coração, pulmão e cérebro).

[0176] O método modificado incluiu a preparação de lisados teciduais, quantificação da proteína total com o uso de um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) e preparação da curva padrão RVT-801 em tampão de lise. O método adaptado teve uma diluição mínima exigida (MRD) de 50 vezes apenas para amostras de controle de qualidade de soro de camundongo. Padrões e amostras de estudo não foram submetidos à MRD. O sinal gerado foi proporcional à concentração de RVT-801 na amostra. Os limites inferior e superior de quantificação do ensaio adaptado foram 0,400 ng/ml e 24,5 ng/ml, respectivamente. As concentrações medidas de RVT-801 foram corrigidas para homogeneização do tecido e diluição do lisado, conforme apropriado.

[0177] Antes da realização do ELISA, foi realizado um estudo de viabilidade. O estudo de viabilidade incluiu: 1) comparação das curvas padrão de RVT-801 preparadas em tampão RIPA (cloreto de sódio 150 mM, Tris- HCl 50 mM, pH 7,5, 0,25% (p/v) de ácido desoxicólico, 1% (v/v) NP-40), tampão CHAPS (cloreto de sódio 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CHAPS a 2% (p/v)) e soro de camundongo, 2) comparação de recuperações de amostras de controle de soro de camundongo contra curvas padrão de RVT-801 preparadas nos tampões RIPA e CHAPS, 3) comparação da ruptura do lisossoma com o uso de um kit de ensaio de fosfatase ácida (Sigma CS0740), seguindo diferentes métodos de homogeneização de tecidos (incubação em gelo, 3 ciclos de TissueLyser a 30 Hz, 5 ciclos de TissueLyser a 30 Hz e sonicação) com o uso de diferentes tampões de lise (PBS, RIPA e CHAPS), 4) confirmação de rompimento de lisossomos com o uso de um kit de β-galactosidase (Pierce 75705) após homogeneização em tampão CHAPS, e 5) análise de recuperações de lisados de tecidos cravados com RVT-801 em diferentes níveis de concentração contra uma curva padrão de CHAPS. Todas as amostras sólidas, exceto pelotas AM, foram pesadas em tubos antes da homogeneização. Um tubo vazio foi pesado no início de cada lote e esse peso foi usado para calcular o peso do tecido em cada tubo. Como a densidade hepática do camundongo era conhecida na literatura, esse valor (1,051 g/ml) foi usado no cálculo do fator de correção da lise para os tecidos do fígado; no entanto, todos os outros tecidos assumiram uma densidade de 1 g/ml (consultar Figura 7). As concentrações de fluido de revestimento epitelial (ELF) podem ser determinadas ao aplicar fatores de correção com base no conteúdo de ureia aos dados do fluido do lavado broncoalveolar (LBAF) para corrigir a diluição da amostra após a lavagem e a coleta.

ANÁLISE FARMACOCINÉTICA

[0178] Do mesmo modo que no Exemplo 1, a análise PK não compartimental foi realizada por meio do Certara WinNonlin Phoenix Versão 7.0.

RESULTADOS

[0179] O principal mecanismo para a remoção de RVT-801 da circulação é a captação em tecidos principais implicados nas acumulações de ceramida. Como mostrado na Figura 4, o RVT-801 alcança ampla distribuição em vários tecidos de órgãos (fígado, baço, rim, pulmão e coração). A exposição do RVT-801 nos tecidos principais é marcadamente maior que no soro e persiste por um período prolongado após o RVT-801 se tornar incomensurável na circulação sistêmica. Essa descoberta pode suportar doses menos frequentes do que as indicadas, com base na exposição de soro. A duração prolongada da exposição em tecidos de órgãos principais (fígado, baço) após tratamento agudo com RVT-801 correlaciona-se à redução máxima de ceramidas teciduais que ocorrem além da duração da exposição sistêmica.

[0180] O fígado e o baço são dois órgãos principais do acúmulo de ceramida em camundongos Farber e da captação de RVT-801, conforme discutido acima no Exemplo 1. As Figuras 5A e 5B mostram um curso de tempo da resposta à dose de RVT-801 nos extratos de fígado e baço, respectivamente, indicando que a exposição ao RVT-801 nos tecidos aumentou com a dose (1, 3 e 10 mg/kg). As maiores concentrações de RVT-801 foram alcançadas no fígado a ~4 horas após a dose e permaneceram elevadas após o último ponto de amostragem (24 horas), onde os níveis de soro eram indetectáveis. Foi observada variabilidade entre os momentos de amostragem, provavelmente devido à complexidade da dosagem de camundongos jovens (~16 g de peso corporal).

[0181] Além disso, a farmacocinética do RVT-801 foi avaliada nesses dois órgãos principais. Como mostrado na Figura 6A, em comparação com o RVT-801 no soro e no sangue total, a AUC0-último aumentou para o fígado e o baço em cada dose eficaz. Como mostrado na Figura 6B, a relação tecido:soro (AUCtecido:AUCsoro) demonstrou uma exposição significativamente maior por órgão em relação à exposição sistêmica em uma faixa de dose eficaz. As relações fígado:soro estão representadas na Figura 6B.

[0182] Além disso, a farmacocinética do RVT-801 nestes dois órgãos foi avaliada em comparação com as de vários outros órgãos. Como mostrado na Figura 7, o RVT-801 se distribui extensivamente aos tecidos associados com acúmulo de ceramida no camundongo Farber, como discutido acima no Exemplo 1. Em outros tecidos, 10 mg/kg de RVT-801 alcançaram proporções tecido:soro, como mostrado na Figura 8.

[0183] Discussão: Esses resultados estabelecem a meta de exposição de soro e tecido necessária para que a rhAC RVT-801 atinja os objetivos máximos de eficácia na redução de ceramidas teciduais em camundongos com doença de Farber. A exposição significativamente mais alta e prolongada alcançada em tecidos principais (fígado, baço) associada ao acúmulo de ceramida suporta uma duração prolongada de redução de ceramida nos tecidos pelo RVT-801 além dos níveis detectáveis de enzima no soro. EXEMPLO 3

[0184] Uma dose terapeuticamente significativa equivalente em humanos (HED: Dose Equivalente Humana) de RVT-801 foi avaliada aplicando as estratégias de dimensionamento discutidas acima, empregando a área da superfície corporal ou razões de peso de corpo:tecido do órgão.

[0185] Como mostrado na Figura 9, a dose de 10 mg/kg de RVT-801 foi dimensionada por área de superfície corporal (BSA) para explicar tendências fisiológicas gerais entre as espécies com base na seguinte fórmula: HED = dose do animal x (peso corporal do animal/peso corporal humano)0,33 (onde a dose do animal é 10 mg/kg). Com base na dose de 10 mg/kg de camundongo, o HED adulto foi de ~0,8 mg/kg e o HED infantil foi de ~1,2 mg/kg.

[0186] Como mostrado nas Figuras 10 e 11, a dose de 10 mg/kg de RVT-801 foi dimensionada por razões tecido:peso corporal para explicar o tamanho relativo de cada compartimento da distribuição de RVT-801 dentro de cada espécie, com o uso da seguinte fórmula: HED = dose animal x

(Massa de tecidohumano/BWhumano)/(Massa de tecidocamundongo/BWcamundongo) (onde a dose do animal é 10 mg/kg).

[0187] A combinação dos dois fatores de escala com base na área da superfície corporal e na proporcionalidade do órgão em relação ao peso corporal proporcionou uma faixa conservadora de dose equivalente humana (HED) de aproximadamente 1 a 5 mg/kg por administração, conforme mostrado na Figura 12. Essa faixa de HED é consistente com dosagens aprovadas de outras terapias de reposição enzimática comercializadas (ERTs). (Figura 12). Todas as informações de dosagem de outras ERTs resumidas na tabela da Figura 12 são das respectivas etiquetas dos produtos. EXEMPLO 4

[0188] O objetivo deste estudo foi determinar a farmacocinética de soro e de tecido do RVT-801 após um tratamento de dose única em camundongos CD-1 machos jovens de 1, 3 ou 10 mg/kg, administrados como uma injeção IP em bolus.

[0189] Após a administração IP em camundongos jovens, as concentrações de soro médias de RVT-801 foram mais altas entre 0,25 e 1 hora após a administração da dose para todos os grupos de doses e diminuíram rapidamente com uma meia-vida estimada de 1 hora. Soro RVT-801 aumentou com o aumento da dose, com o aumento de Cmáx e AUCúltimo maior do que proporcional em relação à dose. O Vz/F (volume aparente de distribuição após administração extravascular) excedeu a água corporal total e o CL/F (depuração aparente após administração extravascular) excedeu o fluxo sanguíneo hepático. Houve uma tendência de diminuição de Vz/F e CL/F à medida que a dose aumentou de 3 mg/kg para 10 mg/kg, sugerindo saturação na distribuição e depuração dos tecidos.

[0190] A dose máxima eficaz (MED) em camundongos Farber foi de 10 mg/kg administrada por injeção IP em bolus, consistente com o estudo atual. O valor para AUCúltimo, Cmáx e Tmáx determinados após uma dose única de 10 mg/kg para camundongos CD-1 do tipo selvagem e com idade correspondente foram os descritos acima:

[0191] RVT-801-9013A – focado na caracterização da PK de soro:

[0192] AUC 1,37 horas*µg/ml

[0193] Cmáx 1,23 h*µg/ml

[0194] Tmáx 1,0 hora

[0195] RVT-801-9013B – focado na distribuição de tecido de RVT-801 e taxas de exposição de tecido:soro

[0196] AUC 1,49 horas*µg/ml

[0197] Cmáx 2,17 h*µg/ml

[0198] Tmáx 0,25 h

[0199] Este estudo foi realizado em duas partes. O objetivo da parte A deste estudo foi determinar a farmacocinética de soro de RVT-801 após uma dose única em camundongos CD-1 machos jovens de 1, 3 ou 10 mg/kg, administrados como uma injeção intraperitoneal em bolus. O objetivo da parte B do estudo foi caracterizar a disposição do RVT-801 no tecido principal implicado no acúmulo de ceramida no modelo de camundongo Farber após uma dose única de 1, 3 ou 10 mg/kg administrada como uma injeção intraperitoneal em bolus para camundongos CD-1 machos jovens.

[0200] A fonte de substância de fármaco RVT-801 753-01-16-002 foi usada neste estudo. A formulação do veículo utilizada para administração de IP foi solução salina estéril.

[0201] O RVT-801 foi administrado via injeção intraperitoneal em bolus em camundongos CD-1 machos, com idade aproximada de 3,5 semanas. Um total de 108 camundongos foram utilizados na parte A do estudo e 102 camundongos foram utilizados na parte B do estudo. A NeoSome coordenou as datas de remessa e fornecimento de animais com seu fornecedor (Charles River Laboratories) para permitir aclimatação suficiente dos filhotes no viveiro antes da dosagem.

[0202] O material da dose foi preparado diluindo a solução estoque fornecida de RVT-801 com PBS estéril de acordo com a Tabela

5.

[0203] As doses individuais foram calculadas com base nos pesos corporais registrados no dia da administração da dose. Os animais foram administrados ao RVT-801 por injeção IP em bolus, conforme detalhado na Tabela 6. TABELA 5: PREPARAÇÃO DO MATERIAL DA DOSE TABELA 6: ADMINISTRAÇÃO DA DOSE

[0204] As amostras farmacocinéticas foram coletadas no esquema detalhado na Tabela 7, com coletas de sangue total de três animais por ponto de tempo por grupo de dose. Todo o volume de sangue total coletado de cada animal foi processado em soro.

TABELA 7: COLETA DE AMOSTRAS

FARMACOCINÉTICAS

[0205] †Coleta de sangue processada inteiramente no soro.

[0206] Na Parte B, o material da dose foi preparado diluindo a solução estoque fornecida de RVT-801 com PBS estéril de acordo com a Tabela 8. TABELA 8: ADMINISTRAÇÃO DA DOSE

[0207] As amostras farmacocinéticas foram coletadas no cronograma detalhado na Tabela 9. TABELA 9: COLETA DE AMOSTRAS

FARMACOCINÉTICAS

[0208] *LBAF- Fluido do Lavado Broncoalveolar

[0209] † MΦ – Pélete alveolar de macrófagos

[0210] As coletas de sangue foram divididas para fornecer amostras de sangue total e soro (onde indicado) para cada animal.

[0211] As amostras de PK no soro foram armazenadas a aproximadamente -70 °C e enviadas em gelo seco via correio noturno para a BioAgilytix (o fornecedor de bioanalíticos), onde a determinação das concentrações de RVT-801 foi realizada por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) em sanduíche.

[0212] O fígado e o baço foram coletados de todos os grupos de doses diretamente após a coleta de sangue no momento apropriado. Os tecidos foram secos cuidadosamente e colocados em frascos pré- etiquetados (pré-pesados). Os pesos de cada frasco contendo tecidos foram registrados e as amostras foram armazenadas a -70 °C até o envio. Não foram adicionados tampões, conservantes ou antibióticos aos tecidos, e não foram realizadas perfusões teciduais em nenhum estágio do estudo. Para o grupo de dose de 10 mg/kg, cérebro, rim, coração e pulmão foram coletados e processados como descrito para o fígado e o baço. Além disso, o fluido do lavado broncoalveolar (LBA) foi coletado do grupo da dose de 10 mg/kg diretamente após a coleta de sangue no momento apropriado, por meio de uma técnica de lavagem pulmonar, instilando os pulmões com 0,5 ml de solução salina tamponada com fosfato e subsequente coleta de aproximadamente 0,35 ml de LBA. As amostras de LBAF foram colocadas em um recipiente adequado e centrifugadas para gerar sobrenadante e um pélete de macrófagos alveolares. O sobrenadante foi removido e colocado em um frasco separado. O sobrenadante e o sedimento celular foram armazenados a -70 °C até o envio.

[0213] Três camundongos adicionais foram usados para fornecer matrizes sem fármaco. As amostras da matriz de controle foram usadas como amostras pré-dose para cada grupo de doses. A coleta, o processamento e o armazenamento das amostras foram realizados como descrito acima. As concentrações de RVT-801 no soro foram determinadas com o uso de um método ELISA sanduíche qualificado (BioAgilytix BAL-17-333-

036.01-REP). O LLOQ do ensaio de soro foi de 20 ng/ml e o ULOQ do ensaio foi de 1.224 ng/ml.

[0214] O método de soro foi adaptado para quantificação no sangue, fígado, baço, rim, coração, pulmão e cérebro. O método modificado incluiu a preparação de lisados de tecido, quantificação da proteína total usando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) e diluição para uma concentração total de proteína de 1 mg/ml em tampão de lise e preparação da curva padrão RVT-801 em tampão de lise. Devido ao baixo teor de proteínas, as amostras LBAF foram processadas em base volumétrica, e não com base em concentração de proteína padronizada. O método adaptado teve uma diluição mínima exigida (MRD) de 50 vezes apenas para amostras de controle de qualidade de soro de camundongo. Padrões e amostras de estudo não foram submetidos à MRD. O sinal gerado foi proporcional à concentração de RVT-801 na amostra. O LLOQ do ensaio adaptado foi de 0,400 ng/ml, e o ULOQ do ensaio foi de 24,5 ng/ml. As concentrações medidas de RVT-801 foram corrigidas para homogeneização do tecido e diluição do lisado. Uma descrição do método bioanalítico e resultados são fornecidos no relatório bioanalítico final.

[0215] Os parâmetros farmacocinéticos na Tabela 10 foram derivados com o uso de métodos não compartimentais empregando Phoenix WinNonlin® versão 7.0 (Certara, Princeton, NJ) com o uso de dados compostos de soro e tempo de concentração de tecido. A área sob a curva de concentração-tempo do tempo zero (pré-dose) até o último ponto de tempo diferente de zero foi calculada por uma combinação de métodos trapezoidais lineares e logarítmicos. O método trapezoidal linear foi empregado para todos os trapezoides incrementais decorrentes de concentrações crescentes e o método trapezoidal logarítmico foi utilizado para aqueles resultantes de concentrações decrescentes (método linear para cima/para baixo). Amostragem de sangue nominal e tempos de coleta de tecidos foram utilizados na análise. TABELA 10: DEFINIÇÕES DOS PARÂMETROS

FARMACOCINÉTICOS

[0216] Os valores de concentração do RVT-801 foram recebidos do laboratório bioanalítico em unidades de ng/ml e foram convertidos em unidades de μg/ml para análise e relatório de farmacocinética. Os dados de concentração e os parâmetros PK foram relatados para 3 algarismos significativos, exceto os valores de Tmáx e Túltimo que foram relatados com 2 casas decimais.

[0217] Todas as concentrações abaixo do limite de quantificação (BLQ) foram definidas como zero, e as concentrações médias em cada ponto do tempo para cada grupo de doses foram calculadas para o relato de estatísticas resumidas no tempo da concentração e valores médios no tempo da concentração. As concentrações médias que foram BLQ foram usadas na análise não compartimental sem ajuste.

[0218] Quaisquer concentrações médias iguais a 0 (todos os valores BLQ) foram consideradas BLQ e tratadas da seguinte forma para a ANC:

[0219] Se um valor BLQ ocorreu após uma concentração mensurável em um perfil e foi seguido por um valor quantificável, ele foi tratado como dados ausentes.

[0220] Se um valor BLQ ocorreu no final do intervalo de coleta (após a última concentração quantificável), ele foi tratado como dados ausentes.

[0221] Se dois valores de BLQ ocorreram sucessivamente após Cmáx, considerou-se que o perfil terminou no primeiro valor de BLQ e quaisquer concentrações subsequentes foram omitidas nos cálculos de PK.

RESULTADOS

[0222] Os dados individuais de tempo de concentração de tecido e soro de camundongo para RVT-801 usados na análise de PK da parte B são apresentados na Tabela 11. TABELA 11: DADOS DE TEMPO DE CONCENTRAÇÃO DO SORO ANIMAL INDIVIDUAL RVT-801 DA PARTE A Ponto ID do Concentração Grupo de Alíquota Nome Descrição sujeito (ng/ml) tempo Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 1 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 Pré Pré- <20,0 1 1 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 2 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 Pré Pré <20,0 1 2 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 3 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 Pré Pré <20,0 1 3 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 4 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 0,5 h 0,5 22,0 1 4 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 5 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 0,5 h 0,5 <20,0 1 5 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 6 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 0,5 h 0,5 61,7 1 6 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 7 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 1h 1h 34,4 1 7 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 8 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 1h 1h 49,3 1 8 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito 9 Grupo Sujeito Alíquota 0,25 1h 1h 42,5 1 9 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 2h 10 2 h <20,0 1 10 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 2h 11 2 h <20,0 1 11 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 2h 12 2 h <20,0 1 12 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 3h 13 3 h <20,0 1 13 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 3h 14 3 h <20,0 1 14 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 3h 15 3 h <20,0 1 15 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 4h 16 4 h <20,0 1 16 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 4h 17 4 h <20,0 1 17 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 4h 18 4 h <20,0 1 18 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 6h 19 6 h <20,0 1 19 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 6h 20 6 h <20,0 1 20 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 6h 21 6 h <20,0 1 21 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 8h 22 8 h <20,0 1 22 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 8h 23 8 h <20,0 1 23 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 8h 24 8 h <20,0 1 24 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 10 h 25 10 h <20,0 1 25 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 10 h 26 10 h <20,0 1 26 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 10 h 27 10 h <20,0 1 27 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 12 h 28 12 h <20,0 1 28 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 12 h 29 12 h <20,0 1 29 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 12 h 30 12 h <20,0 1 30 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 18 h 31 18 h <20,0 1 31 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 18 h 32 18 h <20,0 1 32 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 18 h 33 18 h <20,0 1 33 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 24 h 34 24 h <20,0 1 34 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 24 h 35 24 h <20,0 1 35 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 1 1 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,25 24 h 36 24 h <20,0 1 36 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 1 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 Pré Pré <20,0 2 1 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 2 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 Pré Pré <20,0 2 2 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 3 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 Pré Pré <20,0 2 3 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 4 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 0,5 h 0,5 493 2 4 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 5 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 0,5 h 0,5 <20,0 2 5 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 6 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 0,5 h 0,5 <20,0 2 6 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 7 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 1h 1h <20,0 2 7 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 8 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 1h 1h 140 2 8 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito 9 Grupo Sujeito Alíquota 0,75 1h 1h 233 2 9 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 2h 10 2 h 42,8 2 10 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 2h 11 2 h <20,0 2 11 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 2h 12 2 h <20,0 2 12 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 3h 13 3 h 41,7 2 13 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 3h 14 3 h <20,0 2 14 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 3h 15 3 h <20,0 2 15 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 4h 16 4 h <20,0 2 16 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 4h 17 4 h <20,0 2 17 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 4h 18 4 h <20,0 2 18 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 6h 19 6 h <20,0 2 19 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 6h 20 6 h <20,0 2 20 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 6h 21 6 h <20,0 2 21 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 8h 22 8 h <20,0 2 22 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 8h 23 8 h <20,0 2 23 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 8h 24 8 h <20,0 2 24 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 10 h 25 10 h <20,0 2 25 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 10 h 26 10 h <20,0 2 26 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 10 h 27 10 h <20,0 2 27 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 12 h 28 12 h <20,0 2 28 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 12 h 29 12 h <20,0 2 29 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 12 h 30 12 h <20,0 2 30 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 18 h 31 18 h <20,0 2 31 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 18 h 32 18 h <20,0 2 32 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 18 h 33 18 h <20,0 2 33 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 24 h 34 24 h <20,0 2 34 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 24 h 35 24 h <20,0 2 35 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 2 3 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 0,75 24 h 36 24 h <20,0 2 36 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 1 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 Pré Pré <20,0 3 1 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 2 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 Pré Pré <20,0 3 2 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 3 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 Pré Pré <20,0 3 3 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 4 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 0,5 h 0,5 1483 3 4 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 5 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 0,5 h 0,5 <20,0 3 5 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 6 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 0,5 h 0,5 1017 3 6 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 7 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 1h 1h 2459 3 7 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 8 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 1h 1h 727 3 8 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito 9 Grupo Sujeito Alíquota 2,5 1h 1h 502 3 9 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 2h 10 2 h <20,0 3 10 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 2h 11 2 h 292 3 11 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 2h 12 2 h <20,0 3 12 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 3h 13 3 h 249 3 13 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 3h 14 3 h <20,0 3 14 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 3h 15 3 h <20,0 3 15 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 4h 16 4 h <20,0 3 16 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 4h 17 4 h 87,5 3 17 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 4h 18 4 h 64,7 3 18 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 6h 19 6 h <20,0 3 19 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 6h 20 6 h 24,8 3 20 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 6h 21 6 h <20,0 3 21 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 8h 22 8 h <20,0 3 22 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 8h 23 8 h <20,0 3 23 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 8h 24 8 h <20,0 3 24 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 10 h 25 10 h <20,0 3 25 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 10 h 26 10 h <20,0 3 26 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 10 h 27 10 h <20,0 3 27 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 12 h 28 12 h <20,0 3 28 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 12 h 29 12 h <20,0 3 29 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 12 h 30 12 h <20,0 3 30 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 18 h 31 18 h <20,0 3 31 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 18 h 32 18 h <20,0 3 32 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 18 h 33 18 h <20,0 3 33 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 24 h 34 24 h <20,0 3 34 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 24 h 35 24 h <20,0 3 35 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A Grupo 3 10 mg/kg, Sujeito Grupo Sujeito Alíquota 2,5 24 h 36 24 h <20,0 3 36 A mg/ml, 4 Alíquota ml/kg

A

[0223] Os dados médios compostos de tempo de concentração do RVT-801 agrupados por tecido e dose são apresentados na Tabela 12. TABELA 12: DADOS DE TEMPO DE CONCENTRAÇÃO DO SORO ANIMAL INDIVIDUAL RVT-801 DA PARTE A RESUMIDOS POR PONTO DE TEMPO.

[0224] Os dados médios de tempo de concentração do RVT-801 para o grupo de doses de 10 mg/kg são exibidos com tecidos sobrepostos em eixos lineares na Figura 20.

[0225] As Figuras 20A e 20B mostram perfis médios de tempo de concentração de tecido RVT-801 após administração IP a camundongos jovens na parte B (linear e log-linear), respectivamente.

[0226] Após a administração IP em camundongos jovens, as concentrações de soro médias de RVT-801 foram mais altas em 0,25 horas após a administração da dose para todos os grupos de doses. As concentrações de soro de RVT-801 diminuíram rapidamente. A última concentração média diferente de zero ocorreu às 3 h para a dose de 1 mg/kg, 4 h após a dose para a dose de 3 mg/kg e 4 h após a dose para a dose de 10 mg/kg. A variabilidade nas concentrações de soro nos grupos de doses foi grande. As concentrações de soro na parte B do estudo foram geralmente consistentes com as concentrações de soro da parte A.

[0227] Após uma dose de 10 mg/kg, as concentrações de RVT-801 nos tecidos foram quantificáveis no primeiro momento pós-dose e foram maiores em 0,5 h após a dose para o pulmão e 1 h após a dose no fígado, baço, rim e coração. As concentrações de RVT-801 geralmente permaneceram quantificáveis nos tecidos até 18 h após a dose.

[0228] Os dados médios compostos do tempo de concentração de soro do RVT- 801 da Parte A e Parte B agrupados por dose estão tabulados nas Tabelas 13 e 14, respectivamente. TABELA 13: DADOS MÉDIOS COMPOSTOS DO TEMPO DE CONCENTRAÇÃO DO SORO RVT-801 POR NÍVEL DE DOSE NA PARTE

A

[0229] Limite de quantificação (<0,0200 ug/ml)

[0230] Média – média de 3 animais

[0231] SD – desvio padrão, TABELA 14: DADOS MÉDIOS COMPOSTOS DE TEMPO DE CONCENTRAÇÃO DO SORO RVT-801 POR NÍVEL DE DOSE NA PARTE B.

[0232] NS - nenhuma amostra coletada

[0233] Média - média de 3 animais

[0234] SD - Desvio padrão

[0235] Os parâmetros PK médios não compartimentais compostos para RVT-801 por matriz são apresentados na Tabela 15. TABELA 15: PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS NÃO COMPARTIMENTADOS MÉDIOS COMPOSTOS PARA RVT-801 EM TECIDOS E SORO APÓS ADMINISTRAÇÃO IP EM CAMUNDONGOS JOVENS CD-1 -

PARTE B

[0236] As razões de exposição de tecidos para soro são fornecidas na Tabela 16 e exibidas na Figura 21. A Figura 21 apresenta as razões de exposição do tecido RVT-801:soro com base no AUCúltimo.

[0237] LBAF, cérebro, coração, rim e pulmão foram coletados apenas para o grupo de dose de 10 mg/kg. TABELA 16: RAZÕES DE TECIDO RVT-801:EXPOSIÇÃO DE SORO (AUCÚLTIMO) APÓS ADMINISTRAÇÃO IP DE CAMUNDONGOS JOVENS - PARTE B

[0238] As razões tecido:soro são baseadas no AUCúltimo no tecido, dividido pelo AUCúltimo no soro.

[0239] * As concentrações de RVT-801 no LBAF representam níveis de fluido de revestimento epitelial (ELF) diluído em PBS.

[0240] É necessário um fator de correção para explicar a diluição para refletir as concentrações em ELF.

[0241] Os parâmetros de PK normalizados para a dose, representados pelos níveis de dose para vários tecidos, são apresentados nas Figuras 22A a D.

[0242] A Figura 22A representa a área normalizada da dose sob os dados da curva (DNAUC) no sangue após a administração de RVT- 801 a 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg.

[0243] A Figura 22B representa a área de dose normalizada sob os dados da curva (DNAUC) no soro após administração de RVT-801 a 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg.

[0244] A Figura 22C representa a área de dose normalizada sob os dados da curva (DNAUC) no tecido hepático após administração de RVT-801 a 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg.

[0245] A Figura 22D representa a área de dose normalizada sob os dados da curva (DNAUC) no baço após a administração de RVT-801 a 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg.

[0246] A exposição de soro sistêmica ao RVT-801 teve vida curta, com as concentrações de soro permanecendo quantificáveis por uma duração muito menor que as concentrações de tecido; 4 h no soro versus 18 a 24 h nos tecidos. Tmáx ocorreu dentro da primeira hora após a administração, consistente com a rápida distribuição do composto para os tecidos.

[0247] O RVT-801 foi amplamente distribuído para os tecidos, com razões de exposição de tecido para soro (AUCúltimo) variando de 0,000165 (LBAF:Soro) a 92,9 (Fígado:Soro). A maior exposição foi observada no fígado > baço > rim> pulmão > coração > sangue total > LBAF com Tmáx variando de 0,25 ha 2 h após a dose. As exposições no fígado, baço, rim, coração e pulmão foram quantificáveis 18 a 24 horas após a dose.

[0248] As amostras LBAF consistiram em ELF (fluido de revestimento epitelial) diluído no fluido de instilação de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A população celular alveolar não estava presente nas amostras analisadas, uma vez que as células foram removidas por centrifugação imediatamente após a coleta de LBAF. É necessário um fator de correção que reflita a diluição do líquido pulmonar nativo em PBS para converter as concentrações de RVT-801 no LBAF em níveis em ELF. A determinação do fator de diluição absoluta não foi realizada como parte deste estudo exploratório. O fator de correção pode ser determinado comparando o conteúdo de ureia no LBA com o conteúdo de ureia no plasma do mesmo animal que os níveis de ureia nativa no líquido epitelial são geralmente aceitos para refletir o conteúdo de ureia no plasma (Rennard SI, Basset G, Lecossier D, O'Donnell KM, Pinkston P, Martin PG, Crystal RG, 1986, “Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution,” J of Applied Physiology. 1986, 60(2): 532 a 538). Os fatores de correção determinados por Berkhout et al. com o uso de um método de coleta semelhante (Berkhout J, Melchers MJ, van Mil AC, Seyedmousavi S, Lagarde CM, Nichols WW, Mouton JW, 2015 “Pharmacokinetics and penetration of ceftazidime and avibactam into epithelial lining fluid in thigh- and lung-infected mice,”. Antimicrob Agents Chemother., 59(4): 2.299 a 2.304) foram altamente variáveis (média 11,6 vezes; variação de 4,3 a 144,2 vezes para um volume total de instilação de 2 ml) e indicam que a provável diluição no estudo atual (0,5 ml volume de instilação) pode ter até 36 vezes.

[0249] As concentrações de RVT-801 foram menores no sangue do que no soro com relação sangue:soro variando de 0,127 a 0,584, sugerindo que o RVT-801 não se associa preferencialmente aos eritrócitos. Consultar a Tabela 17. TABELA 17: RAZÕES DE EXPOSIÇÃO AO SANGUE:SORO RVT-801 (AUCÚLTIMO) APÓS A ADMINISTRAÇÃO POR IP DE CAMUNDONGOS JOVENS – PARTE B

[0250] O objetivo deste estudo foi determinar a farmacocinética de soro e de tecido do RVT-801 após um tratamento de dose única em camundongos CD-1 machos jovens de 1, 3 ou 10 mg/kg, administrados como uma injeção IP em bolus. Após a administração IP em camundongos jovens, as concentrações de soro médias de RVT-801 foram mais altas entre 0,25 e 1 hora após a administração da dose para todos os grupos de doses e diminuíram rapidamente com uma meia-vida estimada de 1 hora. O soro RVT- 801 aumentou com o aumento da dose, com o aumento de Cmáx e AUCúltimo maior do que proporcional em relação à dose. O Vz/F excedeu a água corporal total e o CL/F excedeu o fluxo sanguíneo hepático. Houve uma tendência de diminuição de Vz/F e CL/F à medida que a dose aumentou de 3 mg/kg para 10 mg/kg, sugerindo saturação na distribuição e depuração dos tecidos. A dose máxima eficaz (MED) em camundongos Farber foi de 10 mg/kg administrada por injeção IP em bolus, consistente com o estudo atual. O valor para o AUCúltimo determinado após uma dose única de 10 mg/kg para camundongos CD-1 do tipo selvagem e com idade correspondente foi de 1,37 µg.h/ml com um Cmáx de 1,23 µg/ml.

[0251] O RVT-801 foi submetido a uma rápida remoção da circulação sistêmica consistente com ampla distribuição do soro para outros tecidos. As maiores exposições ao RVT-801 foram observadas no fígado > baço> rim > pulmão> coração > sangue total > LBAF. As razões de exposição do tecido ao soro com base no AUCúltimo variaram de 0,000165 (LBAF:soro) a 92,9 (fígado:soro). A exposição ao tecido persistiu geralmente 18 a 24 horas após a dose. As concentrações de RVT-801 foram menores no sangue do que no soro com relação sangue:soro variando de 0,127 a 0,584, sugerindo que o RVT-801 não se associa preferencialmente aos eritrócitos. EXEMPLO 5

[0252] Foi realizado um estudo de distribuição de tecidos em camundongos Farber com idades entre 4 a 5 semanas na dosagem com o uso de um total de 12 camundongos Farber (Estudo RVT-801-9021; Parte

A). Seis animais foram administrados a uma dose única de RVT-801 a 10 mg/kg ou a três doses semanais de RVT-801 a 10 mg/kg/dose. Os grupos de doses foram constituídos por animais de ambos os sexos como o fornecimento de animais Asah1P361R/P361R foi limitado e nenhum efeito específico de gênero rhAC foi observado nesses animais. Um resumo da fase de dosagem do estudo é apresentado na Tabela 18. TABELA 18: ADMINISTRAÇÃO DA DOSE RVT-801-9021

[0253] Veículo 1: Diluição em PBS estéril. 1

[0254] Composto por animais machos e fêmeas.

[0255] Os camundongos Farber machos e fêmeas, com idades entre 4 a 5 semanas no momento do início da dose, foram administrados em doses únicas ou repetidas, uma vez por semana, de RVT-801 por injeção intraperitoneal (IP) em bolus. O material da dose foi preparado como indicado na Tabela 19. As doses individuais foram calculadas com base nos pesos corporais registrados no dia da administração da dose. O RVT-801 foi diluído em solução salina estéril e o material da dose foi preparado fresco em cada dia de administração. TABELA 19: PREPARAÇÃO DO MATERIAL DE DOSE RVT-801-9021

[0256] Nota: O material da dose é preparado fresco a cada dia da administração. 1

[0257] Fonte de substância medicamentosa EN753- 01-15-001 2

[0258] PBS: solução salina tamponada com fosfato.

[0259] O experimento foi projetado para determinar a concentração de rhAC na circulação e nos tecidos em momentos selecionados após a administração única ou repetida de RVT-801 a camundongos Farber e para avaliar a faixa e extensão da distribuição do RVT-801 nos tecidos principais em relação à farmacocinética estabelecida no camundongo CD-1. EXEMPLO 6

[0260] Foi realizado um estudo de imunotipagem em camundongos Farber não tratados e tratados. Os camundongos Farber não tratados e os camundongos do tipo selvagem (WT) foram administrados em 4, 6 e 8 semanas. Os camundongos Farber tratados foram administrados em aproximadamente 4 semanas. O estudo foi realizado com o uso de 11 camundongos Farber não tratados machos/fêmeas), 8 camundongos WT não tratados (machos/fêmeas) e 7 camundongos Farber tratados (machos/fêmeas). A dosagem foi administrada em doses semanais de RVT-801. Este ramo do estudo foi designado como RVT-801-9025 Parte B.

[0261] A rhAC administrado nos Exemplos 5 e 6 compreendeu uma solução de rhAC a 10 mg/ml (na verdade 9,91 mg/ml) com pH 7,4.

[0262] Após a administração do RVT-801, os camundongos foram submetidos a eutanásia de acordo com o procedimento operacional padrão e as amostras de PK foram coletadas em 6 e 24 horas após a administração (a coleta de amostras seguiu a terceira injeção semanal de RVT- 801 no grupo de doses repetidas). A coleta de amostras farmacocinéticas foi restrita a esses dois momentos devido à disponibilidade limitada de camundongos Farber. O sangue total foi coletado via cardiocentese em frascos de heparina de lítio e processado na sua totalidade para o plasma. Fígados intactos, baços, rins, pulmões, corações, cérebros e tecidos tímicos foram colhidos de cada animal, secos cuidadosamente e colocados em frascos individuais. Os tecidos não foram fixados nem perfundidos com tampão em nenhum estágio, e as amostras foram congeladas sem a adição de tampões, conservantes, inibidores de protease ou antibióticos. As amostras de plasma e tecido foram armazenadas a aproximadamente -70 °C e enviadas em gelo seco às instalações bioanalíticas para análise. A coleta de amostras de PK está detalhada na Tabela 20. TABELA 20: COLETA DE AMOSTRAS FARMACOCINÉTICAS RVT-801 1

[0263] Sangue total coletado em frascos de heparina de lítio e processado na sua totalidade para o plasma. Originalmente designado como coleta de soro no protocolo in vida.

[0264] Enquanto o tecido tímico foi coletado de cada animal, ele não foi analisado quanto ao conteúdo de rhAC devido às más condições do tecido do camundongo Farber.

ELISA À BASE DE TECIDO

[0265] A concentração de rhAC no tecido de camundongo Farber após a administração de RVT-801 foi medida por ELISA conduzido por BioAgilytix (Durham, NC).

[0266] As amostras de tecido foram executadas de acordo com os padrões de calibração preparados em tampão de homogeneização com amostras de soro ou controle de qualidade (CQ) baseado em tampão.

[0267] As amostras de tecido incorridas foram homogeneizadas em tampão (cloreto de sódio 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CHAPS a 2% (p/v), Thermo Scientific) contendo coquetel inibidor de protease (HALT, Thermo Scientific).

[0268] As amostras foram processadas com um único cordão de aço inoxidável de 5 mm a 30 Hz, utilizando um TissueLyser II (Qiagen) por três ciclos de três minutos cada. Os homogenatos foram colocados entre 2 a 8 °C entre os ciclos para controlar a temperatura da amostra. A concentração total de proteínas de cada homogenato de tecido foi determinada com um kit de quantificação de proteínas colorimétricas de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce), e as amostras foram diluídas a uma concentração total nominal de proteínas de 1 mg/ml com tampão antes da análise por ELISA.

[0269] O anticorpo de captura (coelho anti-rhAC) foi revestido em uma placa de microtitulação. A placa foi bloqueada com tampão proteico e lavada para remover o excesso de reagentes de captura e bloqueio. Os homogenatos de tecido diluído foram adicionados à placa juntamente com os padrões de calibração e QCs e incubados para permitir a conjugação de rhAC nas amostras e controles com o anticorpo que reveste a placa. A placa foi lavada para remover rhAC não conjugado e incubada com o anticorpo de detecção

(coelho anti-rhAC-HRP). A placa foi lavada para remover o anticorpo de detecção não ligado e incubada com a adição do substrato colorimétrico (3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina (TMB)) para visualizar rhAC conjugado com o anticorpo de detecção. A absorvância da amostra foi lida após a adição da solução de parada. O ensaio gerou um sinal proporcional à concentração de rhAC na amostra com o uso dos parâmetros descritos na Tabela 21. As concentrações de RVT-801 nos homogenatos de tecidos foram interpoladas a partir da curva padrão e corrigidas pela aplicação de fatores de diluição para calcular a concentração no tecido nativo. TABELA 21: RESUMO DO ELISA DE TECIDO RVT-801 1

[0270] MRD: diluição mínima necessária 2

[0271] LLOQ: Limite inferior de quantificação

[0272] ULOQ: Limite superior de quantificação 4

[0273] HRP: peroxidase de rábano silvestre 5

[0274] Homogenatos de tecido foram diluídos para uma concentração nominal de proteína; fator de diluição variado por tecido 6

[0275] BCC: concentração retrocalculada

[0276] O conteúdo de rhAC no plasma de camundongo Farber foi determinado por análise ELISA qualificada. Resumidamente, uma placa de microtitulação foi revestida com reagente de captura (coelho anti-rhAC), bloqueada, lavada e incubada com amostras de plasma incorridas e padrões de calibração e QCs correspondentes à matriz. Após a incubação, a placa foi lavada para remover rhAC não ligado e depois incubada com o reagente de detecção (coelho anti-rhAC-HRP). O excesso de reagente de detecção (não ligado) foi removido por lavagem adicional e o substrato colorimétrico (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB)) foi adicionado à placa. Finalmente, foi adicionada solução de parada para extinguir o desenvolvimento colorimétrico e a absorvância das amostras foi lida. A intensidade do sinal colorimétrico gerado no ensaio foi proporcional à concentração de rhAC nas amostras. Consulte a Tabela 22 para obter um resumo dos parâmetros do ensaio. A concentração de RVT-801 em amostras de plasma de camundongo Farber foi calculada novamente a partir da curva padrão.

TABELA 22: RESUMO DE ELISA NO PLASMA RVT-801

[0277] 1 MRD: diluição mínima necessária

[0278] 2 LLOQ: Limite inferior de quantificação

[0279] 3 ULOQ: Limite superior de quantificação

[0280] 4 HRP: peroxidase de rábano silvestre

[0281] 5 BCC: concentração retrocalculada

[0282] A área sob a curva de tempo-concentração RVT-801 não foi calculada para camundongos Farber devido à quantidade insuficiente e densidade temporal dos pontos de dados durante o período pós- administração; uma função do número limitado de animais Asah1P361R/P361R disponíveis. Por razões semelhantes, nem a meia-vida nem a depuração foram calculadas.

[0283] Os dados de concentração do RVT-801 foram reportados para três algarismos significativos e os valores de Tmáx foram reportados para duas casas decimais.

[0284] Todas as concentrações de amostras incorridas relatadas abaixo do limite de quantificação (BLQ) foram tratadas como tendo um valor igual a zero no cálculo dos dados médios de concentração- tempo.

RESULTADOS

[0285] Os dados médios de tempo de concentração de rhAC no plasma e tecidos selecionados de camundongos Farber que recebem doses semanais únicas ou repetidas de RVT-801 a 10 mg/kg/dose são apresentados na Tabela 6, enquanto os dados individuais são detalhados na Tabela 7.

[0286] Após uma dose única de RVT-801, a concentração máxima de rhAC foi medida 6 horas após a administração (o primeiro momento pós-dose) em todas as matrizes biológicas coletadas de camundongos Farber; no entanto, esses dados podem ser influenciados pelo número limitado de pontos de tempo de amostragem viáveis.

[0287] Após a administração repetida de RVT-801 a 10 mg/kg/dose, os níveis de rhAC na circulação e nos tecidos coletados 6 e 24 horas após a dose foram geralmente mais baixos do que aqueles após uma dose única de RVT-801 a 10 mg/kg nos camundongos CD-1 (RVT-801-9021), com várias amostras de doses repetidas de 24 horas abaixo do limite de quantificação. Essa tendência é facilmente aparente entre os três tecidos com o maior conteúdo geral de rhAC (fígado, baço e rim) após a administração do RVT- 801 em camundongos Farber, onde as concentrações médias de dose única de 24 horas são maiores do que aquelas após a administração repetida por um pedido de magnitude (Figura 13). A única exceção a essa tendência geral foi o cérebro, onde as únicas amostras com concentrações quantificáveis de rhAC foram de dois camundongos que receberam doses múltiplas de RVT-801.

[0288] A Figura 21 apresenta as taxas de exposição do tecido RVT-801:soro no LBAF, sangue, cérebro, coração, rim, fígado, pulmão e baço com base na AUCúltimo após doses únicas de RVT-801 de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg para camundongos CD-1 jovens. TABELA 23: DADOS MÉDIOS DO TEMPO DE CONCENTRAÇÃO DO PLASMA E DO TECIDO RVT-801 DO CAMUNDONGO

FARBER

[0289] Tabela 23: Concentrações médias de rhAC entre matrizes biológicas selecionadas para camundongos Farber (Asah1P361R/P361R) após receber uma dose única ou repetir doses uma vez por semana de RVT-801 a 10 mg/kg/dose por injeção bolus IP. Os animais da Parte B do RVT-801-9025 receberam quatro doses uma vez por semana do RVT-801, enquanto os camundongos que receberam doses múltiplas no RVT-801-9021 receberam três injeções uma vez por semana do RVT-801. Concentração da amostra RVT-801 determinada por ELISA sanduíche. Faixa calibrada ELISA: 20,0 a 1.224 ng/ml (soro), 0,400 a 24,5 ng/ml (tecido), 20,0 a 1.280 ng/ml (plasma).

[0290] BLQ: Abaixo do limite de quantificação

[0291] NC: Não coletado 1

[0292] Dados do estudo RVT-801-9021 2

[0293] Dados do estudo RVT-801-9025 Parte B

TABELA 24: DADOS INDIVIDUAIS DO TEMPO DE CONCENTRAÇÃO DO PLASMA E DO TECIDO RVT-801 DO CAMUNDONGO

FARBER

[0294] A Tabela 24 apresenta concentrações individuais de rhAC em matrizes biológicas selecionadas para camundongos Farber (Asah1P361R/P361R) após receber uma dose única ou repetir doses uma vez por semana de RVT-801 a 10 mg/kg/dose via injeção bolus IP. Os animais da Parte B do RVT-801-9025 receberam quatro doses uma vez por semana do RVT-801, enquanto os camundongos que receberam doses múltiplas no RVT- 801-9021 receberam três injeções uma vez por semana do RVT-801. Concentração da amostra RVT-801 determinada por ELISA sanduíche. Faixa calibrada ELISA: 20,0 a 1.224 ng/ml (soro), 0,400 a 24,5 ng/ml (tecido), 20,0 a

1.280 ng/ml (plasma).

[0295] BLQ: Abaixo do limite de quantificação

[0296] NC: Não coletado

RESULTADOS

[0297] A farmacocinética murina do RVT-801 foi previamente caracterizada em camundongos CD-1 machos jovens e saudáveis, com idade de 3,5 semanas (RVT-801-9013 Parte A). Os camundongos foram administrados logo após o desmame para aproximar o tamanho dos camundongos Farber e sua idade no início dos estudos de eficácia realizados no modelo Farber severo. A decisão de empregar o camundongo CD-1 para estudos gerais da ADME foi baseada no histórico genético comum (cepa parental do camundongo Farber), juntamente com a natureza cachexica e a fragilidade característica do camundongo Farber severo, influenciando sua adequação e disponibilidade para descrever um curso completo de tempo de concentração do RVT-801 administrado.

[0298] Quando administrada como uma injeção única de bolus IP em camundongos CD-1 machos jovens saudáveis, a 1, 3 ou 10 mg/kg, a exposição sistêmica do RVT-801 geralmente aumentava de maneira supraproporcional em relação à dose em termos de ambos Cmáx e AUC, com concentrações no pico de soro dentro de 1 hora após a administração. Embora tenha circulação relativamente curta (meia-vida <1 hora), o volume aparente de distribuição e a depuração aparente foram consistentes com a distribuição rápida e extensa de RVT-801 além da vasculatura, pois esses valores excederam a água corporal total e o fluxo sanguíneo hepático, respectivamente (Tabela 25). TABELA 25: FARMACOCINÉTICA DE SORO NÃO COMPARTIMENTAL DE RVT-801 EM CAMUNDONGOS CD-1 JOVENS

SAUDÁVEIS APÓS INJEÇÃO DE BOLUS IP ÚNICO

[0299] Farmacocinética de soro de RVT-801 após injeção de bolus IP único em camundongos CD-1 machos jovens e saudáveis; Amostras de PK coletadas até 24 horas após a administração, n = 3 por ponto no tempo.

[0300] Cmáx: concentração máxima observada

[0301] Tmáx: tempo de concentração máxima observada

[0302] Túltimo: tempo do ponto final quantificável

[0303] AUCúltimo: Área sob a curva de concentração- tempo de 0 até o último ponto de tempo quantificável

[0304] t1/2: Meia-vida da fase terminal

[0305] Vz/F: Volume aparente de distribuição após administração extravascular

[0306] CL/F: Depuração aparente após administração extravascular

[0307] A duração da exposição e a cinética geral de eliminação do RVT-801 em camundongos CD-1 correlacionaram-se intimamente com a duração e a meia-vida da atividade da ceramidase ácida medida em camundongos Farber após uma dose única de 10 mg/kg de rhAC para qualquer uma das linhagens (Figura 14). Esta observação deu crédito adicional à abordagem do uso de camundongos CD-1 para caracterizar a farmacocinética murina do RVT-801 e extrapolar as propriedades gerais da ADME para o modelo da doença.

[0308] A Figura 15 mostra a razão final de tecido rhAC:AUC de soro em camundongos CD-1 jovens saudáveis após uma dose única de 10 mg/kg de RVT-801.

[0309] Quando administrado como uma única injeção de bolus IP em camundongos CD-1 machos jovens a 1, 3 ou 10 mg/kg, o RVT- 801 alcançou ampla distribuição em uma variedade de tecidos e órgãos selecionados (RVT-801-9013 Parte B). A classificação dos tecidos em ordem de exposição indicou fígado > baço > rim > pulmão > coração > soro > sangue, com base na AUC (Figura 15, Tabela 9).

[0310] A análise da distribuição sanguínea in vivo sugeriu que o RVT-801 não se associou preferencialmente aos eritrócitos. Foram observadas durações de exposição significativamente prolongadas no tecido em relação ao soro; enquanto o RVT-801 era quantificável no soro por até 4 a 6 horas após a administração, a exposição tecidual geralmente persistia por pelo menos 18 a 24 horas após a administração.

[0311] Em uma dose de 10 mg/kg de RVT-801 para camundongos CD-1, que se correlacionou com a dose máxima efetiva (MED) no modelo de camundongo Farber com base na redução dos níveis acumulados de ceramida no fígado e baço, a maioria dos rhAC quantificáveis nos tecidos selecionados para análise foram distribuídos para fígado, baço e rim. TABELA 26: FARMACOCINÉTICA SISTÊMICA E TECIDUAL DE RVT-801 EM CAMUNDONGOS CD-1 JOVENS SAUDÁVEIS

APÓS INJEÇÃO DE BOLUS IP ÚNICO

[0312] Tabela 26. A farmacocinética sistêmica e tecidual do RVT-801 após injeção de bolus IP único em camundongos CD-1 machos jovens e saudáveis; Amostras de PK coletadas até 24 horas após a administração, n = 3 por ponto no tempo.

[0313] Cmáx: concentração máxima observada

[0314] Tmáx: tempo de concentração máxima observada

[0315] Túltimo: tempo do ponto final quantificável

[0316] AUCúltimo: Área sob a curva de concentração- tempo de 0 até o último ponto de tempo quantificável

[0317] Uma comparação da farmacocinética de dose única de RVT-801 em camundongos Farber (limitada a dois momentos pós- administração) com os perfis de exposição caracterizados em camundongos CD- 1 sugeriu que a exposição à rhAC era maior em camundongos Farber, com aumento sistêmico acentuado níveis de rhAC e exposições geralmente mais altas nos tecidos nos momentos analisados, após uma única injeção IP bolus de 10 mg/kg IP de RVT-801 para qualquer uma das linhagens (Tabela 26). TABELA 27: FARMACOCINÉTICA DO RVT-801 EM CAMUNDONGOS CD-1 E FARBER APÓS UMA DOSE ÚNICA DE 10 MG/KG

IP

[0318] Tabela 27. Parâmetros farmacocinéticos do RVT-801 em camundongos CD-1 machos saudáveis, com idade aproximada de

3,5 semanas, e camundongos Farber machos e fêmeas de 4 a 5 semanas de idade (Asah1P361R/P361R), após injeção única por bolus IP de 10 mg/kg de RVT- 801 em solução salina estéril. Foram utilizados 33 camundongos CD-1 totais e 6 camundongos Farber totais (n = 3 por ponto de tempo para cada estirpe); dados médios relatados. Concentração da amostra RVT-801 determinada por ELISA sanduíche. Faixa calibrada ELISA: 20,0 a 1.224 ng/ml (soro), 0,400 a 24,5 ng/ml (tecido), 20,0 a 1.280 ng/ml (plasma). A exposição cerebral ao RVT-801 foi limitada em camundongos CD-1 e não foi quantificável em camundongos Farber de dose única e, portanto, não é mostrada. 1

[0319] AUC não foi calculada para camundongos Farber devido a pontos de dados de tempo de concentração insuficientes no período pós-administração, uma função do número limitado de animais Asah1P361R/P361R disponíveis. 2

[0320] A concentração máxima de RVT-801 foi medida 6 horas após a administração (a avaliação pós-dose anterior) em todas as matrizes biológicas coletadas de camundongos Farber; esses dados podem ser influenciados pelo número limitado de pontos de tempo de amostragem viáveis. 3

[0321] Devido à disponibilidade limitada de camundongos Farber, a coleta de amostras farmacocinéticas foi restrita a 6 e 24 horas após a administração.

[0322] Os níveis sistêmicos de rhAC, medidos no plasma Farber e no soro CD-1, após uma dose única de 10 mg/kg IP de RVT- 801 sugerem que os camundongos Farber experimentaram maior exposição sistêmica ao rhAC do que os camundongos CD-1, conforme indicado por níveis mais altos em 6 horas pós-administração e presença sustentada em circulação com pontos de concentração quantificáveis de 24 horas no plasma de Farber, enquanto a rhAC não foi detectável/abaixo do limite de quantificação além de 6 horas no soro de camundongos CD-1. (Figura 16).

[0323] Em camundongos Farber, a concentração mais alta de RVT-801 em todas as matrizes biológicas analisadas ocorreu 6 horas após a dose. Embora os estudos de Farber não tenham sido projetados para definir explicitamente a Cmáx, uma comparação direta das concentrações de rhAC às 6 horas após a dose nos camundongos Farber e CD-1 não pôde ser feita à luz da escassez de dados de CD-1 naquele ponto no tempo específico; às 6 horas as concentrações de fígado, baço, pulmão e coração de Farber eram, no entanto, mais altas que a Cmáx observada nos tecidos CD-1 correspondentes. A exceção foi o rim, onde os camundongos CD-1 exibiram concentrações ligeiramente mais altas. Às 24 horas pós-administração, os níveis de rhAC nos tecidos CD-1 estavam abaixo do limite de quantificação ou caindo rapidamente, enquanto as concentrações no tecido de camundongo Farber permaneceram significativamente acima do LLOQ e altas em relação aos dados de soro de Túltimo nos camundongos CD-1.

[0324] Uma comparação de rhAC em circulação e nos principais tecidos de exposição após uma dose única de RVT-801 é ilustrada na Figura 17. Uma comparação da dispersão dos pontos de dados individuais é apresentada na Figura 18, onde a variabilidade da concentração de rhAC em um determinado ponto no tempo após uma dose única de RVT-801 pode ser apreciado nos tecidos analisados. Novamente, o aumento da exposição em Farber em relação aos camundongos CD-1 24 horas após a dose é facilmente aparente.

[0325] A Figura 17 mostra a concentração de rhAC em circulação e nos três principais tecidos de exposição em camundongos Farber (símbolos abertos) e CD-1 (símbolos preenchidos) após uma única injeção IP bolus de 10 mg/kg IP do RVT-801, n = 3 animais por ponto no tempo. As amostras foram coletadas e analisadas até 24 horas após a administração. As amostras de camundongos Farber foram coletadas apenas 6 e 24 horas após a dose. Os dados do baço CD-1 de 6 horas são conduzidos por um único valor quantificável.

[0326] A Figura 18 apresenta dados de tempo de concentração de rhAC individuais no fígado (Figura 18A), baço (Figura 18B), rim (Figura 18C), pulmão (Figura 18D) e coração (Figura 18E) Farber (símbolos abertos) e camundongos CD-1 (símbolos preenchidos) após uma única injeção IP bolus de 10 mg/kg de RVT-801, n = 3 por ponto de tempo. As amostras foram coletadas e analisadas até 24 horas após a administração.

[0327] Camundongos CD-1 saudáveis e jovens são considerados a cepa dos pais do modelo de camundongo da doença de Farber. A Figura 3 mostra que o perfil farmacocinético da rhAC (RVT-801) do camudongo CD-1 jovem é semelhante ao perfil experimental da atividade da rhAC do camundongo Farber no sangue. Isso indica que o camundongo CD-1 jovem fornece uma aproximação apropriada da PK do camundongo Farber, já que os camundongos Farber são frágeis, difíceis de acasalar e não é numeroso o suficiente para realizar uma avaliação completa da farmacocinética.

[0328] Embora com base em um pequeno número de camundongos Farber e com limitados pontos de dados sobrepostos entre as cepas, os dados sugerem que a exposição sistêmica à rhAC é significativamente maior em Farber em relação aos camundongos CD-1 após uma dose única de 10 mg/kg de RVT-801. As amostras sistêmicas de PK incorridas diferiram em várias maneiras potencialmente importantes; os camundongos Farber eram de sexo misto, significativamente menores que os CD-1 saudáveis e com a mesma idade e exibiam patologia profunda, produziam amostras de plasma, enquanto o soro era coletado dos camundongos CD-1 machos jovens.

[0329] As diferenças observadas na exposição ao RVT-801 provavelmente não são o resultado da análise de diferentes matrizes entre as cepas, já que o conteúdo de proteínas (além dos fatores de coagulação) do soro e do plasma é bastante semelhante. Além disso, o aumento na exposição plasmática medida de Farber não foi resultado do aumento da sensibilidade ao ELISA no plasma em relação à do soro e/ou da capacidade de relatar pontos de dados adicionais (ou seja, 24 horas após a dose) que seriam indetectáveis no soro CD-1 devido a diferenças na sensibilidade do método. Os dados de plasma de Farber relatados estavam bem acima do LLOQ e os métodos de plasma e soro tiveram desempenho semelhante (Tabela 27). TABELA 27: DESEMPENHO DE ELISA - SORO VERSUS

PLASMA

[0330] MRD: diluição mínima necessária

[0331] LLOQ: Limite inferior de quantificação

[0332] ULOQ: Limite superior de quantificação

[0333] A concentração de rhAC nos tecidos após a administração não pareceu ser dependente da razão tecido/peso corporal em camundongos Farbera. a

[0334] Com base na dose repetida de animais Farber de RVT-801-9025; sexo e pesos corporais não registrados para RVT-801-9021.

[0335] Embora tenham sido demonstradas diferenças imunológicas marcantes entre camundongos do tipo selvagem e Farber, seu impacto na farmacocinética do RVT-801 não é claro. Os anticorpos antifármacos (ADA) podem prolongar a circulação dos complexos fármaco-anticorpo, mas as diferenças de PK em discussão imediata foram observadas 24 horas após a administração de uma dose única de RVT-801, e nenhum ADA foi detectado nessas amostras.

[0336] É possível que a variação na exposição observada em camundongos Farber em relação aos camundongos CD-1 tenha sido consequência de alterações fisiológicas de múltiplos órgãos do modelo de camundongo da doença de Farber.

[0337] Diferenças na taxa de distribuição do RVT-801 da cavidade peritoneal para a vasculatura e/ou na captação de rhAC da circulação no tecido entre camundongos Farber e CD-1 poderiam explicar as variações de PK observadas entre as cepas. No entanto, essas tendências em potencial não podem ser avaliadas a partir dos estudos atuais sem uma interpretação exagerada dos dados disponíveis limitados

[0338] Ao comparar grupos de doses no RVT-801- 9021, não houve acúmulo aparente de rhAC após a administração semanal repetida do RVT-801. Em vez disso, os dados, embora limitados, sugerem que houve concentrações mais baixas de rhAC na circulação e nos tecidos analisados quando o RVT-801 foi administrado em várias doses uma vez por semana em comparação com uma única injeção no mesmo nível de dose (10 mg/kg/dose). Em todas as matrizes, com exceção do cérebro, os dados de tempo de concentração de dose única em 6 e 24 horas após a administração foram maiores após uma dose única de RVT-801 do que após três doses semanais Figuras 19A a 19G. Além disso, os dados são consistentes com um cenário de exposições mais baixas devido a menores concentrações absolutas de rhAC e a maiores taxas de depuração após doses múltiplas de RVT-801. Mais estudos seriam necessários para explorar essas tendências aparentes e estabelecer se os dados são consistentes com a farmacocinética geral de murinos do RVT-801 após administração repetida ou se os recursos da patologia inerente ao modelo de camundongo da doença de Farber influenciam a captação, disposição e depuração de rhAC.

[0339] As Figuras 19A a 19G apresentam a concentração média de rhAC em camundongos CD-1 após uma dose única de 10 mg/kg e camundongos Farber após uma dose única de 10 mg/kg ou várias doses uma vez por semana a 10 mg/kg/dose administrada via bolus Injeção IP, de acordo com o Exemplo 5 (RVT-801-9021).

[0340] As Figuras 20A e 20B mostram perfis médios de concentração no tempo de tecido rhAC após administração IP a camundongos CD-1 jovens em RVT-801-9013 Parte B (Figura Linear 20A e Figura 20B Log-Linear), respectivamente.

[0341] A Figura 21 apresenta as taxas de exposição do tecido RVT-801:soro no LBAF, sangue, cérebro, coração, rim, fígado, pulmão e baço com base na AUCúltimo com base em doses únicas de RVT-801 de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg em camundongos CD-1.

[0342] As Figuras 22A a 22D apresentam parâmetros de PK normalizados para dose, plotados em nível de dose para vários tecidos após a administração IP de RVT-801 em doses de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg em camundongos CD-1.

[0343] A Figura 19A apresenta um gráfico das concentrações sistêmicas de rhAC no soro após uma administração de dose única de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19A também apresenta concentrações plasmáticas em camundongos Farber após administração de dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. Além disso, a Figura 19A apresenta concentrações plasmáticas após uma administração de dose repetida da injeção de RVT-80. Também apresentaram concentrações séricas em camundongos CD-1 administrados a uma dose única de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801.

[0344] A Figura 19B apresenta concentrações de RVT-801 no tecido hepático em camundongos CD-1 após uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19B também apresenta concentrações de RVT-801 no tecido hepático em camundongos Farber tratados com uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19B apresenta adicionalmente concentrações de RVT-801 no tecido hepático em camundongos Farber tratados com 10 mg/kg/doses repetidas via injeção IP em bolus de RVT-801.

[0345] A Figura 19C apresenta concentrações de RVT-801 no tecido do baço em camundongos CD-1 após uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19C também apresenta concentrações de RVT-801 no tecido do baço em camundongos Farber tratados com uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19C apresenta adicionalmente concentrações de RVT- 801 no tecido hepático em camundongos Farber tratados com 10 mg/kg/doses repetidas via injeção IP em bolus de RVT-801.

[0346] A Figura 19D apresenta concentrações de RVT-801 no tecido renal em camundongos CD-1 após uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19D também apresenta concentrações de RVT-801 no tecido renal em camundongos Farber tratados com uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção bolus IP de RVT-

801. A Figura 19C apresenta adicionalmente concentrações de RVT-801 no tecido renal em camundongos Farber tratados com 10 mg/kg/doses repetidas via injeção IP em bolus de RVT-801.

[0347] A Figura 19E apresenta concentrações de RVT-801 no tecido cardíaco em camundongos CD-1 após uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19E também apresenta concentrações de RVT-801 no tecido cardíaco em camundongos Farber tratados com uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19E apresenta adicionalmente concentrações de RVT-801 no tecido cardíaco em camundongos Farber tratados com 10 mg/kg/doses repetidas via injeção IP em bolus de RVT-801.

[0348] A Figura 19F apresenta concentrações de RVT-801 no tecido pulmonar em camundongos CD-1 após uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19F também apresenta concentrações de RVT-801 no tecido pulmonar em camundongos Farber tratados com uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19F apresenta adicionalmente concentrações de RVT-801 no tecido pulmonar em camundongos Farber tratados com 10 mg/kg/doses repetidas via injeção IP em bolus de RVT-801.

[0349] A Figura 19G apresenta concentrações de RVT-801 no tecido cerebral em camundongos CD-1 após uma única dose de 10 mg/kg/dose via injeção IP em bolus de RVT-801. A Figura 19G apresenta adicionalmente concentrações de RVT-801 no tecido cerebral em camundongos Farber tratados com 10 mg/kg/doses repetidas via injeção IP em bolus de RVT-

801.

[0350] Abreviações.

[0351] ASAH1 = gene da ceramidase ácida.

[0352] AUC = área sob a curva de concentração- tempo.

[0353] AUC(0-∞) = área sob a curva de concentração- tempo no plasma desde o tempo zero extrapolado até o infinito no tempo.

[0354] AUC(0-t) = área sob a curva de concentração- tempo no plasma, do tempo zero ao último tempo da amostra.

[0355] IMC = índice de massa corporal.

[0356] BW = peso corporal.

[0357] cDNA = ácido desoxirribonucleico complementar.

[0358] CFR = Código de Regulamentos Federais.

[0359] IC = intervalo de confiança.

[0360] CL = folga.

[0361] Cmáx = concentração máxima.

[0362] SNC = sistema nervoso central.

[0363] FDA = Administração de Alimentos e Medicamentos.

[0364] HED = dose equivalente a humanos.

[0365] TCTH = transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[0366] IP = intraperitoneal.

[0367] IV = intravenoso.

[0368] MCP-1 = proteína quimioatraente de monócitos 1.

[0369] DP = farmacodinâmica(s).

[0370] PK = farmacocinética(s).

[0371] PRN = pro rata.

[0372] rhAC = ceramidase ácida humana recombinante.

[0373] DP = desvio padrão.

[0374] SMA-PME = Atrofia Muscular Espinhal com Epilepsia Mioclônica Progressiva.

[0375] tmáx = tempo até a concentração máxima.

[0376] Referências discutidas no presente pedido, que são incorporadas a título de referência em sua totalidade para a finalidade pretendida, o que é claro com base em seu contexto.

[0377] Alayoubi, A.M., J.C. Wang, B.C. Au, S. Carpentier, V. Garcia, S. Dworski, S. El-Ghamrasni, K.N. Kirouac, M.J. Exertier, Z.J. Xiong, G.G. Prive, C.M. Simonaro, J. Casas, G. Fabrias, E.H. Schuchman, P.V. Turner, R. Hakem, T. Levade e J.A. Medin, 2013, Systemic ceramide accumulation leads to severe and varied pathological consequences, EMBO Mol Med, 5:827 a 842.

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[0431] As divulgações de cada patente, pedido de patente, publicação e número de acesso aqui mencionados são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

[0432] Embora a presente divulgação tenha sido divulgada com referência a várias modalidades, é aparente que outras modalidades e variações delas podem ser desenvolvidas por outros versados na técnica sem se afastar do verdadeiro âmbito e escopo da divulgação. As reivindicações apensas devem ser interpretadas de modo a incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.

EQUIVALENTES

[0433] O relatório descritivo escrito anteriormente é considerado suficiente para permitir que um versado na técnica pratique as modalidades. A descrição e exemplos anteriores detalham certas modalidades e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa o quão detalhado o exposto possa aparecer no texto, a modalidade pode ser praticada de várias maneiras e deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.

[0434] Como aqui utilizado, o termo cerca de refere- se a um valor numérico, incluindo, por exemplo, números inteiros, frações e porcentagens, indicados ou não explicitamente. O termo sobre geralmente se refere a uma faixa de valores numéricos (por exemplo, +/- 5 a 10% da faixa recitada) que um versado na técnica consideraria equivalente ao valor recitado (por exemplo, tendo a mesma função ou resultado). Quando termos como pelo menos e cerca de precedem uma lista de valores ou intervalos numéricos, os termos modificam todos os valores ou intervalos fornecidos na lista. Em alguns casos, o termo cerca de pode incluir valores numéricos arredondados para a figura significativa mais próxima.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar a doença de Farber em um sujeito humano em necessidade do mesmo, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito humano a ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada a uma dose de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose é de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose é de cerca de 1 mg/kg.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose é de cerca de 2 mg/kg.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose é de cerca de 2,5 mg/kg.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose é de cerca de 5 mg/kg.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose é de cerca de 10 mg/kg.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é RVT-801, em que o RVT-801 compreende uma ceramidase ácida (rhAC) produzida de forma recombinante e purificada a uma pureza de pelo menos 95% de forma ativada por um processo que compreende as etapas de submeter a ceramidase ácida produzida de forma recombinante a pelo menos duas etapas de cromatografia selecionadas a partir de i) cromatografia de troca catiônica; ii) cromatografia de interação hidrofóbica (HIC); e iii) cromatografia de troca aniônica; e adicionalmente submeter a rhAC em solução a uma ou mais etapas de inativação viral, em que na uma ou mais etapas de inativação viral a solução de rhAC é titulada para um pH de 3,7 ou menos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a ceramidase ácida produzida de forma recombinante é submetida a três etapas de cromatografia que consistem essencialmente em i) cromatografia de troca catiônica; ii) cromatografia de interação hidrofóbica (HIC); e iii) cromatografia de troca aniônica.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais etapas de inativação viral são realizadas antes das etapas de cromatografia.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais etapas de inativação viral são realizadas antes de uma das pelo menos duas etapas de cromatografia.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais etapas de inativação viral são realizadas antes de pelo menos duas das pelo menos duas etapas de cromatografia.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a titulação para pH 3,7 é realizada com ácido cítrico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a titulação para pH 3,7 é realizada com ácido cítrico.

15. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a titulação para pH 3,7 é realizada com ácido cítrico.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pureza da ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é de pelo menos 95% em peso.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pureza da ceramidase ácida humano recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é de pelo menos 96% em peso.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pureza da ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é de pelo menos 97% em peso.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pureza da ceramidase de ácido humano recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é de pelo menos 98% em peso.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pureza da ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é de pelo menos 99% em peso.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pureza da ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é substancialmente 100% em peso.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose em um sujeito humano adulto é de cerca de 0,8 mg/kg.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dose em uma criança humana é de cerca de 1,2 mg/kg.

24. Método para tratar um sujeito humano com doença de Farber caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito humano de uma dose terapeuticamente eficaz de ceramidase ácida humana recombinante (rhAC), em que a dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada com base no perfil farmacocinético obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose eficaz e máxima de 10mg/kg de rhAC por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca nos camundongos CD- 1 saudáveis um ou mais dos seguintes: Tmáx de cerca de 0,25 a 1,0 horas, Cmáx de cerca de 1,23 a 2,17 µg/ml ou área sob a curva (AUC) de cerca de 1 h*µg/ml a cerca de 2 h*µg/ml.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a AUC é de cerca de 1,37 h*µg/ml a cerca de 1,49 h*µg/ml

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a AUC é de cerca de 1,37 h*µg/ml a cerca de 1,49 h*µg/ml e a Cmáx é de cerca de 1,23 a cerca de 2,17 µg/ml.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o Tmáx é de cerca de 0,25 a 1,0 horas.

28. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o Cmáx é de cerca de 1,23 µg/ml a 2,17 µg/ml.

29. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a AUC de cerca de 1,37 a 1,49 h*µg/ml.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que a ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é RVT-801.

31. Método para tratar um sujeito humano com doença de Farber caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma dose terapeuticamente eficaz de rhAC, em que a dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada com base no perfil farmacocinético, obtido em camundongos CD-1 saudáveis e jovens que recebem uma única dose eficaz e máxima ("MED") de 10 mg/kg de dose de rhAC por via intraperitoneal, em que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma Cmáx, AUC0-último ou AUCtecido /AUCsoro de acordo com os valores estabelecidos na Figura 7.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 138 h*µg/ml no tecido do fígado e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 13 µg/ml no tecido do fígado.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último cerca de 70,9 h*µg/ml no tecido esplênico e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 7,58 µg/ml em tecido esplênico.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último cerca de 25,8 h*µg/ml no tecido renal e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 2,61 µg/ml em tecido renal.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 4 h*µg/ml no tecido cardíaco e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 0,362 µg/ml em tecido cardíaco.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 0,0419 h*µg/ml no tecido do fígado e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 0,147 µg/ml no tecido do fígado.

37. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 0,858 h*µg/ml no sangue e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 1,23 µg/ml no tecido do fígado.

38. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 0,000245 h*µg/ml em LBAF e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 0,00196 µg/ml em LBAF.

39. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a rhAC provoca no camundongo CD-1 saudável uma AUC0 ao último de cerca de 8,4 h*µg/ml no tecido pulmonar e/ou uma Cmáx para o fármaco de cerca de 1,42 µg/ml no tecido do fígado.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 39, caracterizado pelo fato de que a ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é RVT-801.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ceramidase ácida produzida de forma recombinante purificada não tem atividade esfingomielinase ácida detectável.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito humano um antipirético, um anti-histamínico, um corticosteroide ou qualquer combinação dos mesmos anteriores, simultaneamente ou após a administração da ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ceramidase ácida humana recombinante purificada (rhAC) na forma ativada é administrada em uma composição terapêutica.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a composição terapêutica é administrada por via oral, por inalação, por instilação intranasal, por via tópica, transdérmica, parenteral, subcutânea, por injeção intravenosa, por injeção intra-arterial, por injeção intramuscular, por via intraplural, por via intraperitoneal, por via intratecal ou por aplicação a uma membrana mucosa.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais administrações repetidas da composição terapêutica.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de um ou mais agentes adicionais que reduzem os níveis de ceramida.