BR112017008075B1

BR112017008075B1 - método para fermentar caules da família poaceae

Info

Publication number: BR112017008075B1
Application number: BR112017008075A
Authority: BR
Inventors: Brian Hamrick Edward
Original assignee: Brian Hamrick Edward
Priority date: 2016-06-14
Filing date: 2017-02-05
Publication date: 2019-12-24
Also published as: MX2017005160A; US9631209B1; CN107849585B; CN107849585A; BR112017008075A2; RU2650870C1; WO2017218053A1; MX363750B

Abstract

a presente invenção refere-se a um método para fermentar caules da família poaceae. isso inclui caules de cana-de-açúcar, sorgo e milho maís. esse método comprime caules entre rolos a entre 20% e 90% de seu diâmetro enquanto os caules estão submersos em uma solução aquosa de reagente. isso fratura os caules na direção axial sem perda significativa de suco durante extração simultânea da solução de reagente na rede resultante de rachaduras no tecido do parênquima. em algumas variantes, a solução aquosa de reagente contém organismos de fermentação, os açúcares se difundem das células do parênquima, entram em contato com os organismos de fermentação localizados nas rachaduras nos caules e produzem etanol e ácido láctico dentro dos caules. em algumas variantes, as combinações de enzimas, ácidos e reagente de fenton na solução aquosa de reagente se difundem na matriz lignocelulósica nos caules e degradam a mesma.

Description

MÉTODO PARA FERMENTAR CAULES DA FAMÍLIA POACEAE

DADOS DE PRIORIDADE [001] Este pedido de patente internacional reivindica a prioridade do Pedido de Patente nU.S.15/424.843, depositado em 4 de fevereiro de 2017, e do Pedido de Patete n- 62/349.674, depositado em 14 de junho de 2016, m que cada um é incorporado ao presente documento para referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção pertence a processos de fermentação para sintetizar um composto quimico desejado. Mais especificamente, a invenção pertence à preparação de compostos orgânicos que contêm oxigênios com múltiplos tipos de micro-organismos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] As culturas mais amplamente cultivadas da familia Poaceae são cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) , sorgo (Sorghum bicolor) e milho mais (Zea mays) . A palavra Poaceae é derivada da antiga grega (póa), que significa forrageira. Os caules de culturas na familia Poaceae têm sido usados como forrageira animal por milênios. Esses caules são comidos por ruminantes, que inclui gado, ovelha e cabras, devido ao fato de ruminantes poderem digerir celulose e hemicelulose. Esses caules também contêm açúcares nas células de parênquima de armazenamento, e, algumas vezes, contêm quantidades menores de grânulos de amido nas células de parênquima armazenadas.

[004] Os açúcares nesses caules têm sido usados para produzir açúcar de mesa e melaços, e têm sido fermentados em etanol para compor etanol bebivel (por

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2/57 exemplo, rum) e etanol combustível. Esses caules são frequentemente ensilados por salpicamento dos mesmos com bactérias formadoras de ácido láctico, um processo que preserva os caules por até um ano como ração animal, e que compõe os caules mais digestíveis por ruminantes.

[005] A ensilagem foi praticada por cerca de 200 anos, visto que foi constatado (na Alemanha), quando uma pessoa pica gramíneas e comprime as gramíneas picadas de modo que o ar seja mantido fora, que as gramas picadas (ensiladas) não se deterioram (isto é, têm cheiro semelhante a vinagre). Mesmo nos dias atuais, a ensilagem de gramíneas e outras culturas da família Poaceae envolve, primeiro, picar os caules em pedaços pequenos de cerca de 12 a 25 mm de comprimento, então, salpicar com micro-organismos (maior parte de bactérias formadoras de ácido láctico), então, comprimir os caules picados para manter o ar fora.

[006] Isso só funciona devido ao fato de que os açúcares podem se difundir para as superfícies de corte dos caules picados de modo que as bactérias formadoras de ácido láctico possam consumir os açúcares. A maior parte das leveduras e a maior parte das bactérias de ácido láctico não são moventes (não podem se mover por conta própria), de modo que o açúcar deve se difundir para as mesmas (esses microorganismos não podem nadar para onde os açúcares estão). Devido ao fato de as mesmas não serem moventes, e devido ao fato de os caules da família Poaceae não serem facilmente penetrados por micro-organismos, os caules devem ser picados ou esmagados para permitir que os açúcares se difundam para os micro-organismos.

[007] Salpicando-se micro-organismos e enzimas

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3/57 em caules picados ou esmagados apenas depositam microorganismos e enzimas nas superficies externas dos caules. As rachaduras que são formadas quando os caules são picados ou esmagados contém bolhas de ar que permanecem fixadas nas rachaduras, que impede que micro-organismos e enzimas sejam depositados dentro das rachaduras quando salpicados nos caules. Visto que a levedura e a bactérias formadoras de ácido láctico não são moventes, e visto que a difusão de enzimas e micro-organismos é extremamente lenta, a penetração dos caules pela levedura, bactérias formadoras de ácido láctico e enzimas é insatisfatória.

[008] Há uma necessidade na técnica por uma solução para esse problema de penetração incompleta dos caules por levedura, bactérias formadoras de ácido láctico e especialmente enzimas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO [009] A invenção, em algumas variações, fornece um método para fermentar caules da familia Poaceae, sendo que o método compreende as etapas de:

(a) fornecer caules da familia Poaceae, em que os caules têm um comprimento médio maior que 100 mm, e em que os caules têm um teor de umidade inicial médio entre 25% e 80%;

(b) comprimir os caules entre rolos enquanto os caules estão submersos em uma solução aquosa de reagente, em que os rolos comprimem o diâmetro médio dos caules entre 20% e 90%, e em que a dita solução aquosa de reagente contém um ou mais organismos de fermentação selecionados a partir do grupo que consiste em leveduras, bactérias formadoras de ácido láctico, bactérias formadoras de ácido acético e combinações dos mesmos;

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4/57 (c) remover os caules da solução aquosa de reagente, em que os caules retêm pelo menos uma porção do um ou mais organismos de fermentação; e (d) fermentar os caules por um tempo de fermentação para produzir produtos de fermentação dentro dos caules.

[010] Nas modalidades preferidas, os caules são selecionados a partir do grupo que consiste em caules de cana-de-açúcar, caules de sorgo e caules de milho mais.

[011] Em algumas modalidades, os caules têm folhas afixadas aos caules.

[012] Em algumas modalidades, os caules estão presentes como uma planta inteira.

[013] Nas modalidades preferidas, os rolos têm uma velocidade tangencial entre 0,1 m/s e 10 m/s.

[014] Nas modalidades preferidas, a solução aquosa de reagente contém enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em liase de pectina, amilase, celulase, oxidase de glicose, oxidase de hexose, xilanase e combinações dos mesmos.

[015] Em algumas modalidades, a solução aquosa de reagente contém ácidos selecionados a partir do grupo que consiste em ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico e combinações dos mesmos.

[016] Em algumas modalidades, a solução aquosa de reagente contém ions ferrosos, peroxide de hidrogênio ou uma combinação dos mesmos.

[017] Nas modalidades preferidas, o tempo de fermentação está entre 1 dia e 7 dias.

[018] Nas modalidades preferidas, a levedura é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae.

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5/57

[019] Em algumas modalidades, os caules são desidratados durante o tempo de atraso de fermentação da etapa (d). [020] Em algumas modalidades, as bactérias

formadoras de ácido láctico são selecionadas a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium freudenreichii e combinações dos mesmos.

[021] Em modalidades preferenciais, o método compreende, ainda, a solução aquosa de reagente com o uso de energia turbulenta de 0,15 W/kg a 5 W/kg.

[022] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, manter os caules em um ambiente anaeróbico por um tempo de ensilagem subsequente à conclusão do tempo de fermentação.

[023] Em algumas modalidades, o tempo de ensilagem está entre um dia e um ano.

[024] Em modalidades preferenciais, o método compreende, ainda, recuperar os produtos de fermentação esmagando-se os caules.

[025] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, recuperar os produtos de fermentação por evaporação dos produtos de fermentação a partir dos caules.

[026] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, alimentar os caules a ruminantes subsequentemente à etapa (d).

[027] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, usar os caules com digestão anaeróbica para produzir metano subsequentemente à etapa (d).

[028] Em algumas modalidades, o método

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6/57 compreende, ainda, usar os caules com hidrólise enzimática para produzir etanol a partir de celulose subsequentemente à etapa (d).

BREVES DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [029] A Figura 1 é um desenho esquemático de um aparelho experimental usado nas modalidades e exemplos da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [030] Os métodos, processos e sistemas da presente invenção serão descritos por referência a várias modalidades não limitantes e Figura (ou Figuras).

[031] Esta descrição possibilitará que um versado na técnica produza e use a invenção, e descreve diversas modalidades, adaptações, variações, alternativas e usos da invenção. Essas e outras modalidades, recursos e vantagens da presente invenção serão tornados mais aparentes para aqueles versados na técnica quando tomados com referência à descrição detalhada da invenção a seguir em conjunto com os desenhos anexos.

[032] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma, o e a incluem referentes no plural, a não ser que o contexto dite claramente de outra forma. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica a que esta invenção pertence.

[033] A não ser que indicado de outro modo, todos os números que expressam parâmetros, condições, resultados, e assim por diante, usados no relatório

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7/57 descritivo e nas reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo cerca de. Consequentemente, salvo caso indicado o contrário, os números estabelecidos na seguinte especificação e reivindicações afixadas são aproximações que podem variar dependendo dos algoritmos e cálculos específicos.

[034] O termo que compreende, que é sinônimo de que inclui, que contém ou caracterizado por é inclusive ou aberto e não exclui etapas de método ou elementos não citados adicionais. Que compreende é um termo da técnica usado na linguagem de reivindicação que significa que os elementos de reivindicação nomeados são essenciais, mas outros elementos de reivindicação podem ser adicionados e ainda formar um construto dentro do escopo da reivindicação.

[035] Conforme usado no presente documento, a frase que consiste em exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. Quando a frase consiste em (ou variações da mesma) aparece em uma cláusula do corpo de uma reivindicação, em vez de imediatamente após o preâmbulo, a mesma limita apenas o elemento apresentado nessa cláusula; outros elementos não são excluídos da cláusula como um todo. Conforme usado no presente documento, a frase que consiste essencialmente em limita o escopo de uma reivindicação aos elementos ou etapas de método especificados, mais aqueles que não afetam materialmente a base e a característica inovadora (ou características inovadoras) da matéria reivindicada.

[036] Em relação aos termos que compreende, que consiste em e que consiste essencialmente em, em que um desses três termos é usado no presente documento, a

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8/57 matéria reivindicada e presentemente revelada pode incluir o uso de qualquer um dos outros dois termos. Portanto, em algumas modalidades, não explicitamente citadas de outro modo, qualquer caso de que compreende pode ser substituído por que consiste em ou, alternativamente, por que consiste essencialmente em.

[037] Nenhuma modalidade descrita no presente documento deve ser limitada por qualquer teoria ou especulação relacionada aos mecanismos de reação, mecanismos de transferência de massa, ou descrições de matérias prima ou produtos.

[038] A presente invenção é pressuposta em uma solução técnica para o problema de que produzir produtos de fermentação a partir de tecido de parênquima de planta rica em açúcar é dispendioso devido à quantidade grande de energia e capital exigidos para esmagar eficazmente caules da família Poaceae para extrair açúcares. A presente invenção também é pressuposta em uma solução técnica para o problema de degradação de caules da família Poaceae após a colheita e antes do processamento ou consumo.

[039] Os termos comprimir, comprimido, que comprime e compressão são usados no presente documento para indicar que o diâmetro médio de caules é reduzido em 20% a 90%. Os termos esmagar, esmagado e que esmaga são usados no presente documento para indicar que o diâmetro médio de caules é reduzido em mais que 90%.

[040] Esta invenção usa a abordagem técnica de comprimir o diâmetro médio de caules em entre 20% e 90% enquanto os caules são submersos em uma solução reagente que contém um ou mais organismos de fermentação. Essa compressão

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9/57 fratura os caules sem perda significativa de açúcares, e a solução reagente é puxada para as rachaduras resultantes no tecido de parênquima. Os açúcares se difundem a partir das células de parênquima, entram em contato com os organismos de fermentação localizados nas rachaduras, e produzem etanol e/ou ácido láctico dentro dos caules. 0 etanol e/ou o ácido láctico preservam os caules para a extração subsequente de etanol e/ou consumo como forrageira para ruminantes. Em algumas variantes, as enzimas na solução reagente degradam e separam as paredes celulares de parênquima para esmagamento de energia inferior para extrair etanol ou açúcares.

[041] Os princípios da invenção são demonstrados nos Exemplos no presente documento.

[042] O pH baixo que resulta das bactérias formadoras de ácido láctico que fermentam açúcares nas culturas impede que outros organismos de deterioração cresçam. Manter a plantação anaeróbica impede que as bactérias formadoras de ácido acético consumam etanol e produzam ácido acético (vinagre). Visto que as bactérias formadoras de ácido acético são altamente moventes, as mesmas podem consumir todo o etanol nos caules ensilados, salvo caso o ambiente seja mantido anaeróbico (livre de oxigênio).

[043] Acredita-se agora que o pH baixo causado por bactérias formadoras de ácido láctico também resulte em um tipo de hidrólise de ácido diluído da hemicelulose nos caules, o que aprimora a capacidade para digerir dos caules. Normalmente, a hidrólise de ácido diluído é realizada em poucas horas em pH de 2,0 ou menor, porém, em pH de 4,0 em silagem, essa hidrólise de ácido diluído é realizada em semanas ou meses. Os dados que suportam hidrólise de ácido

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10/57 diluído em silagem são descritos no documento Henk, Linda L., e James C. Linden, Solid-state production of ethanol from sorghum. Applied biochemistry and biotechnology 57.1 (1996): páginas 489 a 501, o qual está incorporado ao presente documento para referência. Henk observa (na página 491; citações internas omitidas) que Nossos dados mostraram que a ensilagem é uma forma de hidrólise de ácido diluído. A ensilagem aprimorou a reatividade das fibras lignocelulósicas à hidrólise enzimática.

[044] Aqueles versados na técnica reconhecerão que muitos micro-organismos e enzimas são comumente usados para culturas de ensila, que incluem levedura, bactérias formadoras de ácido láctico, hemicelulase, celulase e oxidase de glicose. Isso é descrito no documento Kung, L, Silage fermentation and additives, Proceedings of Alltech's Seventeenth Annual Symposium. 2001, o qual está incorporado ao presente documento para referência. Isso também é descrito no documento Charley, Robert C., Pedido de Patente PCT n^£PCT/CA2010/001729, o qual está incorporado ao presente documento para referência.

[045] Aqueles versados na técnica, e aqueles familiarizados com cana-de-açúcar, sorgo e milho mais colhidos recentemente, reconhecerão que os caules colhidos recentemente dessas culturas são muito quebradiços. Se uma pessoa normal pisar com seu calcanhar em um caule colocado no chão, a mesma sentirá esse rachar, e ao olhar para o caule comprimido observará uma grande rachadura, algumas rachaduras pequenas, e um grande número de rachaduras menores, em que todas essas rachaduras estão na direção axial. A pessoa também observará que pouco suco é espremido para fora do

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11/57 caule ao simplesmente pisar em um caule com seu calcanhar. A pessoa também reconhecerá que um caule dobrado repentinamente quebrará com um estalo (falha quebradiça) — como na falha do tipo green snap bem conhecida em culturas de milho. Essa invenção faz uso da vantagem da natureza quebradiça de caules colhidos recentemente para propagar rachaduras nos caules com pouquíssima energia.

[046] As células de parênquima de armazenamento em caules na família Poaceae são células poliedrais com paredes finas de aproximadamente 360 microns de comprimento e 60 microns em diâmetro com uma espessura de parede de cerca de 2 microns. Isso é descrito em maiores detalhes no documento Dong, A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems (a new role for the apoplast), Plant Physiology 105.4 (1994) : páginas 1.139 a 1.147, o qual está incorporado ao presente documento para referência.

[047] Em particular, Dong mostra na Figura 2, imagens C e G, que as células de parênquima cana-de-açúcar são alinhadas na direção axial, porém, não são alinhadas na direção radial. Por essa razão a água flui através do apoplasto na direção axial (limitada pelo comprimento de internódio), porém, não flui através do apoplasto nas direções radial e lateral. As células de parênquima de outros caules na família Poaceae são alinhadas de modo semelhante. A cana-de-açúcar e outros caules na família Poaceae se fratura facilmente na direção axial devido ao fato de as paredes celulares de parênquima formarem planos de fratura na direção axial. Os caules na família Poaceae são difíceis de serem cortados na direção radial devido ao fato de as paredes celulares não serem alinhadas na direção radial, forçando o

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12/57 corte através das paredes celulares. Por outro lado, os caules na família Poaceae não exigem muita energia para serem partidos ou rachados na direção axial.

[048] Os caules na família Poaceae são facilmente rachados quando comprimidos radialmente. Os resultados da rachadura de caules de cana-de-açúcar, junto com um modelo de elemento finito de rachadura, estão contidos no documento Skantz, J., e S. A. Domanti, Experiments into the constitutive behaviour of sugarcane billets. PROCEEDINGS-AUSTRALIAN SOCIETY OF SUGAR CANE TECHNOLOGISTS. WATSON FERGUSON AND COMPANY, 1998, o qual está incorporado ao presente documento para referência. Sem desejar se vincular a qualquer teoria particular, acredita-se que a compressão radial inicial produza uma rachadura grande, a compressão subsequente produza duas rachaduras menores, a compressão subsequente produza quatro rachaduras ainda pequenas, etc.

[049] Os caules na família Poaceae que são rachados quando comprimidos rapidamente retornam para um formato redondo quando a força sobre o caule é removida. As fibras nos caules têm uma alta resistência à tração, e servem para puxar o caule de volta para um formato redondo quando a força sobre os caules é removida, ainda que com rachaduras no tecido de parênquima do caule.

[050] O suco nas células de parênquima de caules da família Poaceae, de modo geral, contém entre 2% e 20% de açúcares de hexose, que consistem primariamente em sacarose, glicose e frutose. O tecido de parênquima frequentemente também contém grânulos de amido. A matéria seca desses caules, após espremer o suco, é frequentemente chamada de bagaço. O bagaço compreende, de modo geral,

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13/57 aproximadamente 35% de celulose, 25% de hemicelulose e 22% de lignina. A hemicelulose consiste tipicamente em cerca de 85% de xilose, 13% de glicose e 2% de arabinose. A celulose, hemicelulose e lignina são frequentemente ligadas fortemente umas às outras, impedindo o acesso das enzimas para hidrolisar a celulose e hemicelulose. A ensilagem (converter açúcares livres em ácido láctico) é uma forma de hidrólise de ácido diluído que hidrolisa hemicelulose, tornando a celulose mais acessível por enzimas na digestão de ruminantes, digestão anaeróbica ou hidrólise enzimática.

[051] O teor de amido de milho de hastes de sorgo doce é descrito no documento Zhao, Ya Li, et al., Changes in stem composition and harvested produce of sweet sorghum during the period from maturity to a sequence of delayed harvest dates, Biomass and Bioenergy 39 (2012): páginas 261 a 273, o qual está incorporado ao presente documento para referência. Zhao mostra, na Tabela 2, que caules têm cerca de 10,1% do seu peso em açúcares e 3,6% do seu peso em amido. Se o amido fosse expresso no suco, o suco teria cerca de 4,3% do seu peso em amido, porém, estudos mostram que o suco apenas tem cerca de 0,1% de seu peso em amido (1.000 mg/1) . Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria particular, acredita-se que a maior parte do amido seja deixada nos caules quando o suco é espremido, devido à filtragem dos grânulos de amido quando os caules são sob pressão extrema.

[052] O teor de amido de suco de cana-de-açúcar e sorgo doce é descrito no documento Alves, Fernanda Viginotti, et al., Structural and physicochemical characteristics of starch from sugar cane and sweet sorghum

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14/57 stalks, Carbohydrate polymers 111 (2014): páginas 592 a 597, o qual está incorporado ao presente documento para referência. Alves mostra que o suco de cana-de-açúcar tem cerca de 356 mg/1 de amido e suco de sorgo doce tem cerca de 1.147 mg/1 de amido. Isso implica que caules de cana-deaçúcar têm cerca de um terço mais amido que caules de sorgo doce, e, portanto, cerca de 1% do peso de um caule de canade-açúcar é amido.

[053] O teor de açúcar de milho mais tropical híbridos é descrito no documento White, Wendy G., et al., The sugar, biomass and biofuel potential of temperate by tropical maize hybrids, GCB Bioenergy 4.5 (2012): páginas 496 a 508, o qual está incorporado ao presente documento para referência. White mostra que híbridos de milho temperado e tropical (Zea mays) produzem tanto grão quanto açúcares de caule fermentáveis.

[054] Muitos organismos de fermentação podem diretamente converter glicose, frutose, maltose (dímero de glicose) e sacarose (dímero de glicose-frutose) em etanol e ácido lático. No presente documento, monômeros de dímeros de glicose e frutose serão referidos como açúcares, os organismos de fermentação que convertem açúcares em etanol serão referidos como leveduras, e os organismos de fermentação que convertem açúcares em ácido lático serão referidos como bactérias formadoras de ácido lático. Os organismos de fermentação que convertem açúcares em etanol podem ser organismos unicelulares eucarióticos ou podem ser bactérias. Os organismos de fermentação que convertem açúcares em ácido lático podem ser organismos unicelulares eucarióticos ou podem ser bactérias.

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15/57 [055] Muitos organismos de fermentação convertem açúcares em etanol. A maioria dos organismos de fermentação amplamente usados que produzem etanol, leveduras de cerveja, são cepas de Saccharomyces cerevisiae. O etanol tem valor econômico significativo em bebidas, combustíveis de transporte e precursores para outros compostos orgânicos.

[056] Outros organismos de fermentação convertem açúcares em ácido lático. Esses são conhecidos como bactérias formadoras de ácido lático, e a cepa mais comum é Lactobacillus plantarum. O ácido láctico reduz o pH do que está sendo fermentado para cerca de 4,2 que inibe o crescimento da maioria das outras bactérias e fungos. Isso é comumente usado para preservar alimentos tais como iogurte e chucrute. Isso também é comumente usado para preservar culturas para uso posterior como alimentação animal (forragem), conhecida como ensilagem.

[057] Alguns organismos convertem etanol em ácido acético (vinagre) na presença de oxigênio (ambientes aeróbicos). A cepa mais comum é Acetobacter aceti.

[058] Uma solução a 0,5% de ácido fórmico é um inibidor seletivo de bactérias formadoras de ácido lático bem como outras bactérias de contaminação, mas não inibem a levedura. Isso é descrito no documento Schmidt, J., et al., Preservation of sugar content in ensiled sweet sorghum, Bioresource Technology 60.1 (1997) : 9 a 13, que é incorporado ao presente documento para referência. Uma grande porcentagem do ácido fórmico produzida em todo o mundo é usada para alimentação animal de ensilagem.

[059] A inibição de Saccharomyces cerevisiae por ácido lático e ácido acético é descrita no documento

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Narendranath, N. V., K. C. Thomas e W. M. Ingledew, Effects of acetic acid and lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae in a minimal medium. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 26.3 (2001): 171 a 177, que é incorporado ao presente documento para referência. Narendranath observa que Quando 0,5% em volume de ácido lático estiver presente nos meios, a presença de até mesmo 0,04% em volume de ácido acético (que não causou uma alteração significativa na taxa de crescimento de levedura que presente por si próprio) causou uma redução significativa na taxa de crescimento de S. cerevisiae.

[060] O ponto de ebulição de etanol é 78°C, o ponto de ebulição de ácido lático é 122°C e o ponto de ebulição de ácido acético é 118°C. Isso torna possível uma separação de baixo custo de etanol a partir de soluções que contêm ácido lático e ácido acético pelo uso de um destilador do tipo pot still (algumas vezes chamado de um alambique). No entanto, o ponto de ebulição de ácido fórmico é 100,8°C, o que torna mais difícil separar uma mistura de etanol e ácido fórmico com o uso de um destilador do tipo pot still. O metanol também é produzido em quantidades limitadas por organismos de fermentação e algumas enzimas, e tem um ponto de ebulição de 65°C. Visto que ferve em uma temperatura menor do que etanol, pode ser removido com o uso de um destilador do tipo pot still pelo descarte das poucas porcentagens iniciais do destilado (chamado de cabeças). Tanto o ácido fórmico quanto o metanol são tóxicos aos humanos, então, se as bebidas alcoólicas forem produzidas a partir de caules fermentados, o ácido fórmico não deve ser usado para ensilar

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17/57 os caules .

[061] Há técnicas bem conhecidas para fermentar os açúcares em caules da família Poaceae em etanol. Os caules são geralmente esmagados entre uma série de rolos para extrair o suco pelo impulso das células do parênquima, e, então, o suco é separado dos sólidos residuais e fermentado. Devido ao fato de que as células do parênquima são muito pequenas, é preciso muita energia para esmagar as mesmas. Quase 35% dos custos operacionais e capital de produção de açúcar dos caules é devido ao custo de esmagamento. A economia de esmagamento de cana-de-açúcar é descrita em mais detalhes no documento Gbaboa, Comparative study on cane cutter/juice expeller and roller model Sugarcane juice extraction systems, INT J CURR SCI 2013, 7: E 55 a 60, que é incorporado ao presente documento para referência.

[062] A fermentação de estado sólido é algumas vezes usada para fermentar caules da família Poaceae, cortando os caules em pequenos pedaços (ou fragmentando os caules), agitando os mesmos com levedura e os deixando fermentar. A levedura se adere ao tecido do parênquima recentemente exposto e os açúcares de dentro dos pedaços picados (ou caules fragmentados) difundem para a levedura, que fermenta os açúcares em etanol. Isso é o mesmo mecanismo da ensilagem, mas em que as bactérias formadoras de ácido lático são usadas em vez de levedura. A desvantagem desse tipo de fermentação de estado sólido é que a mesma exige muita energia para pasteurizar os caules antes da fermentação. Uma outra desvantagem dessa técnica é a grande quantidade de energia necessária para cortar ou fragmentar os caules. Uma outra desvantagem dessa técnica é que a mesma não

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18/57 permite a reação no interior dos caules com enzimas, devido à difusão muito lenta de enzimas. Uma outra desvantagem é que os caules fragmentados ou picados têm uma densidade aparente muito menor do que os caules ou fragmentos.

[063] Um exemplo disso é o processo de EX-FERM, descrito na Patente n- U.S. 4.560.659, expedida em 24 de dezembro de 1985 às Astúrias, que é incorporado ao presente documento para referência. O processo de EX-FERM envolve picar a cana-de-açúcar em pedaços com um diâmetro de tamanho de partícula médio entre 0,25 cm e 4,0 cm, misturar com levedura e água e fermentar. A solução fermentada é, então, reutilizada em fermentações subsequentes para aumentar a concentração de etanol antes destilação.

[064] Um outro tipo de fermentação de estado sólido é descrito no documento Bryan, William L., Solidstate fermentation of sugars in sweet sorghum, Enzyme and Microbial Technology 12.6 (1990) : 437 a 442, que é incorporado ao presente documento para referência. Essa técnica corta os caules em comprimentos de 0,6 cm ou fragmenta os caules. Quase 80% do açúcar nos caules é fermentado em etanol. No entanto, grandes quantidades de ácido lático e ácido acético são produzidas devido ao fato de que os caules não foram pasteurizados antes da fermentação.

[065] Um tipo similar de fermentação de estado sólido é descrito no documento Henk, Linda L., e James C. Linden, Solid-state production of etanol from sorghum, Applied biochemistry and biotechnology 57.1 (1996): 489 a 501, que é incorporado ao presente documento para referência. Essa técnica usa um picador de forragem para picar tanto os caules quanto as folhas no campo, agitar a forragem picada

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1S/5!

com levedura e enzimas, e, então, permitir a fermentação. Uma desvantagem é que a extração em contracorrente é necessária para extrair etanol, que é um método mais intensivo em capital do que o esmagamento dos caules. Henk observa (na página 500) que Ethanolic sorghum silage is stable over a period of at least 230 d, thus potentially producing a lowcost feedstock for continuous ethanol production on a yearly basis”.

[066] Uma outra técnica para fermentar os açúcares em caules da familia Poaceae em etanol é descrita na Patente n- U.S. 9.499.839, expedida em 22 de novembro de 2016 por Hamrick, que é incorporado ao presente documento para referência e que é comumente detido com o presente pedido. Essa técnica utiliza vácuo para infundir levedura e enzimas no apoplasto de culturas enriquecidas com carboidrato, que incluem cana-de-açúcar e sorgo sacarino, que drenam o líquido em torno das culturas, e, então, fermentando dentro do apoplasto.

[067] Os caules na família Poaceae podem ser digeridos por ruminantes após a ensilagem. Henk declara que essa digestibilidade aprimorada é causada pela hidrólise ácida diluída de hemicelulose. A digestibilidade de sorgo sacarino é descrita no documento Di Marco, O. N., et al., Digestibility of forage silages from grain, sweet and bmr sorghum types: Comparison of in vivo, in situ and in vitro data, Animal Feed Science and Technology 153.3 (2009): 161 a 168, que é incorporado ao presente documento para referência. A digestibilidade de cana-de-açúcar é descrita no documento Kawashima, T., et al., Feeding value of sugarcane stalk for cattle, ASIAN AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES 15.1

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2Q/51 (2002): 55 a 60, que é incorporado ao presente documento para referência. A digestibilidade de caules de palha de milho é descrita no documento Tolera, Adugna, e Frik Sundstpl, Morphological fractions of maize stover harvested at different stages of grain maturity and nutritive value of different fractions of the stover, Animal Feed Science and Technology 81.1 (1999) : 1 a 16, que é incorporado ao presente documento para referência.

[068] A digestibilidade e valor de nutriente de gramineas ensiladas é descrita no documento Jaakkola, Seija, Pekka Huhtanen, e K. Hissa, The effect of cell wall degrading enzymes or formic acid on fermentation quality and on digestion of grass silage by cattle, Grass and Forage Science 46.1 (1991) : 75 a 87, que é incorporado ao presente documento para referência. Jaakkola conclui que, quando a erva-dos-prados (Phleum pretense, na familia Poaceae) contém açúcares insuficientes para a ensilagem com bactérias formadoras de ácido lático, essa ensilagem com ácido fórmico funciona melhor do que a ensilagem com enzimas de celulase e hemicelulase.

[069] A maioria dos organismos de fermentação oxida os açúcares em dióxido de carbono e água em um ambiente aeróbico (com oxigênio). Um mol de glicose ou frutose (CgHizOg) (ou 0,5 mol de sacarose ou maltose) e seis mols de oxigênio (O2) são oxidados para seis mols de dióxido de carbono (CO2) e seis mols de água (H2O) . Esse mecanismo remove rapidamente o oxigênio do ambiente ao fermentar.

[070] As leveduras fermentam os açúcares em etanol em um ambiente anaeróbico (sem oxigênio) . Um mol de glicose ou frutose (ou 0,5 mol de sacarose ou maltose) é

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21/57 fermentado em 2 mols de etanol e 2 mols de dióxido de carbono e desprende 118 kJ de calor. Isso significa que a fermentação de uma solução de açúcar a 18% resultará em um aumento de temperatura de 34 °C, que significa que é necessário o resfriamento do meio de fermentação. A fermentação de 1 litro de uma solução de açúcar de 18% (1 mol de glicose) também produzirá 2 mols de dióxido de carbono, que tem um volume de cerca de 48 litros a 20°C e pressão atmosférica. Uma levedura típica fermenta de modo mais eficaz entre 20°C e 40°C, mas tem atividade de fermentação significativa até 5 °C (vinho branco é fermentado entre 7°C e 15°C) . As células de levedura morrem gradualmente em temperaturas acima de 42 °C. Saccharomyces cerevisiae é relativamente insensível ao pH e fermentará em uma faixa de pH de 2,9 a 7,2. Isso é descrito em mais detalhes no documento Arroyo-López, Effects of temperature, pH and sugar concentration on the growth parameters of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their interspecific hybrid, International journal of food microbiology 131.2 (2009) : 120 a 127, que é incorporado ao presente documento para referência.

[071] As bactérias de ácido lático fermentam açúcares em ácido lático tanto em ambientes anaeróbicos quanto ambientes aeróbicos, dependendo do tipo de bactérias formadoras de ácido lático. Em uma fermentação homolática, um mol de glicose ou frutose (CgHizOg) (ou 0,5 mol de sacarose ou maltose) é fermentado para dois mols de ácido lático (CaHgCb) . Em uma fermentação heterolática, um mol de glicose ou frutose (CgHizOg) (ou 0,5 mol de sacarose ou maltose) é fermentado para um mol de ácido lático (CaHgCb) , um mol de etanol (C2H₆O)

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22/51 e um mol de dióxido de carbono (CO2) . Lactobacillus plantarum cresce entre 15°C a 40°C tanto em ambientes aeróbicos quanto ambientes anaeróbicos. Em ambientes aeróbicos, Lactobacillus plantarum respira oxigênio, e esse oxigênio consumido produz peróxido de hidrogênio (H2O2) , que inibe o crescimento de outros organismos.

[072] A maioria das cepas de Saccharomyces cerevisiae tem um diâmetro de aproximadamente 10 microns. Uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com um tamanho de célula de aproximadamente 5 microns é Thermosacc® Dry, disponível junto à Lallemand Biofuels & Distilled Spirits, Duluth, Georgia, EUA. Isso produz concentrações de etanol até 20% em volume (16% em peso), assim, as culturas enriquecidas com açúcar com até 32% de açúcar em peso podem ser fermentadas por essa levedura. Isso significa que uma cultura ou suco extraído pode ser desidratado antes da fermentação de modo que a concentração de etanol resultante seja maior. A fermentação de levedura pode levar de 1 hora a 8 horas antes da produção significativa de etanol e dióxido de carbono. Isso é comumente chamado de tempo de atraso de fermentação. A desidratação durante o tempo de atraso de fermentação pode aumentar a concentração de etanol final.

[073] A maioria das cepas de lactobacillus plantarum tem formato de haste com um diâmetro de cerca de 0,5 a 1,2 micron e um comprimento de 1 a 10 microns. Uma fonte de Lactobacillus plantarum é BIOTAL® Silage Inoculant II, disponível junto à Lallemand Animal Nutrition, Milwaukee, Wisconsin, EUA. Frequentemente, lactobacillus plantarum é usado com outras bactérias e enzimas para tratar silagem. Isso é descrito na Patente n- U.S. 5.432.074, emitido em 11

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23/57 de julho de 1995 por Evans et al., que é incorporado ao presente documento para referência. Atualmente, as formulações de ensilagem disponíveis de Lallemand Animal Nutrition contêm misturas de Lactobacillus plantarum com Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Propionibacterium freudenreichii.

[074] Os organismos de fermentação são tão grandes que não se movem por difusão em sua vida útil. No entanto, os gases e açúcares difundem facilmente, e difundem facilmente através das paredes celulares de parênquima, e as enzimas se difundem através de líquidos externos às células do parênquima. O coeficiente de difusão de dióxido de carbono é 2,5 X 10^-9 m²/s, que significa que o mesmo difunde 1 mm em cerca de 7 minutos e 10 mm em cerca de 11 horas. O coeficiente de difusão de sacarose é 7,1 X IO^-10 m²/s, que significa que o mesmo difunde 1 mm em cerca de 17 minutos e 10 mm em cerca de 39 horas. O coeficiente de difusão de pectina liase é 8,0 X 10^-11 m²/s, que significa que o mesmo difunde 1 mm em cerca de 3,5 horas e 10 mm em cerca de 14 dias.

[075] A célula de levedura adere às superfícies (tais como células do parênquima) na presença de açúcares. Descreve-se Verstrepen e Klis, Flocculation, adhesion and biofilm formation in leveduras, Molecular microbiology 60.1 (2006): 5 a 15, que é incorporado ao presente documento para referência. De modo similar, as bactérias formadoras de ácido lático também aderem às superfícies tais como células do parênquima.

[076] Tanto a levedura quanto as bactérias formadoras de ácido lático são vendidas na forma seca por

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24/51 congelamento e são fáceis de manusear. Ambos são classificados como GRAS (Geralmente Reconhecido como Seguro), e são comumente consumidos na dieta média — por exemplo, o pão é feito com levedura Saccharomyces cerevisiae e o iogurte é feito com Lactobacillus plantarum (que também está presente em saliva) e Lactobacillus acidophilus. De modo similar, enzimas pectina liase, amilase, celulase, glicose oxidase, hexose oxidase e xilanase são disponíveis na forma de grau alimentar.

[077] O amido é um polímero de glicose. Antes que o amido possa ser convertido por levedura em etanol ou por bactérias formadoras de ácido lático em ácido lático, o mesmo deve ser primeiro convertido em glicose por enzimas amilase. O amido é insolúvel em água na faixa de temperatura para a qual a levedura ou bactérias formadoras de ácido lático são ativas.

[078] Há amilases disponíveis que convertem amido em glicose de modo eficaz na faixa de temperatura que a levedura opera de modo eficaz. Um exemplo é a formulação de enzima de STARGEN® 002, junto à DuPont Industrial Biosciences, EUA. Isso contém uma alfa-amilase Aspergillus kawachi expressa em Trichoderma reesei e uma glucoamilase junto a Trichoderma reesei que funcionem sinergeticamente para hidrolisar o substrato de amido granular em glicose. A endoatividade, alfa-amilase e exoatividade, glucoamilase catalisam a hidrólise completa de amido granular sob uma variedade de condições de fermentação de etanol. STARGEN® 002 tem atividade significativa entre 20°C e 40°C, e entre pH 3,5 e 4,5, então, é adequado para o pH e a temperatura de levedura.

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25/57 [079] O tecido de parênquima pode ser macerado (células separadas umas das outras) por enzimas. Quando o tecido do parênquima é macerado, a membrana celular também é rompida, tanto a partir da ação mecânica quanto a partir de enzimas que são liberadas da parede celular. Isso faz com que os teores dos vacúolos vazem para fora das células do parênquima e faz com que as enzimas difundam mais facilmente nos vacúolos. Isso também fornece uma ação de maceração, em que o liquido nas células do parênquima pode ser mais facilmente removido por aperto ou evaporação. A pectina liase e xilanase maceram células de parênquima em caules Poaceae. Isso é descrita no documento Ishii, Enzymes for the isolation of protoplasts, Plant Protoplasts and Genetic Engineering I. Springer Berlin Heidelberg, 1989, 23 a 33, que é incorporado ao presente documento para referência. Ishii também mostra que a celulose também resulta em degradação de parede celular.

[080] A pectina liase degrada pectina sem produzir metanol como bioproduto. Isso torna o suco fermentado mais útil como um produto de etanol com valor maior dessa invenção. Há pectinas liases disponíveis que operam no mesmo pH e faixa de temperatura como levedura, em particular, pectina liase a partir de Aspergillus niger, com um pH ideal de 5,5 e uma temperatura ideal de 35°C. No entanto, a pectina liase é incomum pelo fato de ter atividade significativa em temperaturas tão baixas quanto 5 °C. A pectina liase é descrita no documento Yadav et al., Pectin lyase: a review, Process Biochemistry 44.1 (2009): 1 a 10, que é incorporado ao presente documento para referência. Os dois exemplos de pectina liase que operam no mesmo pH e faixa

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26/57 de temperatura de levedura são Pectinex® XXL (Novozymes A/S, Dinamarca, DEN) e Rohapect 10L (AB Enzymes GmbH, Alemanha, GER).

[081] Ishii também mostra que xilanase macera células do parênquima de caules a partir de caules Poaceae e a celulase rompe as paredes celulares de células do parênquima desses caules. Um exemplo de um xilanase comercialmente disponível é HTec3 (Novozymes A/S, Dinamarca, DEN), que é uma mistura de endoxilanase e celulase. HTec3 tem cerca de 90% de atividade em temperaturas abaixo de 30°C e cerca de 70% de atividade em um pH de 4,0, assim, é adequado para o pH e temperatura de levedura.

[082] Glicose oxidase converte glicose e O2 em ácido glicônico e peróxido de hidrogênio. Uma combinação de glicose oxidase e celulase foi mostrada para impedir a degradação de silagem de forragem em condições aeróbicas. Isso é descrito no documento Rauramaa, A. L., J. J. Setãlã, e A. E. A. Tommila, The effect of glicose oxidase on the preservation of grass silage, Grass and Forage Science 46.4 (1991) : 359 a 364, que é incorporado ao presente documento para referência. Glicose oxidase está ativa em uma ampla faixa de pH e temperaturas, que é descrita no documento Biyela, Β. N. E., et al, The production of reduced-alcohol wines using Gluzyme Mono® 10.000 BG-treated grape juice, S. Afr. J. Enol. Vitic., Volume 30, Número 2, (2009): 124 a 132, que é incorporado ao presente documento para referência. Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria particular, acredita-se que a celulase libera glicose difícil de hidrolisar celulose, e essa liberação lenta de glicose resulta na lenta produção de ácido glucônico e peróxido de

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27/57 hidrogênio, em que o efeito combinado de pH inferior devido ao ácido glucônico e a toxicidade de peróxido de hidrogênio impede que a maioria dos organismos de contaminação produza ácido lático e ácido acético.

[083] Durante a fermentação, a levedura produz grandes quantidades de dióxido de carbono (CO2) . Ácido carbônico é formado pela dissolução de CO2 em água. Durante a fermentação, a pressão parcial de CO2 é 100 kPa (1 atm) , e o pH dessa solução é cerca de 3,92. A levedura fermenta bem nesse pH, as enzimas pectina liase de Aspergillus niger (tais como Pectinex® XXL e Rohapect 10L) têm atividade significativa nesse pH, e as enzimas de hidrolização de amido granular (tais como STARGEN) têm atividade significativa nesse pH. Similarmente, todas essas enzimas têm atividade

significativa na faixa de temperatura de levedura (25°C a 40°C). [084] A temperatura de colheita de cana-de- açúcar, sorgo e milho mais pode ser abaixo de 20 °C. Entretanto, o calor liberado pela fermentação de açúcares

difundidos do tecido de parênquima aumentará rapidamente a temperatura desse tecido à faixa de temperatura em que a enzimas têm atividade significativa.

[085] A densidade aparente do sorgo e cana-deaçúcar de caule inteiro está entre 300 e 400 kg/m³. A densidade aparente de fragmentos (seções cortadas) da canade-açúcar, sorgo e milho mais (isto é, caules) está entre 180 e 240 kg/m³. A densidade aparente dos caules picados a entre 10 mm e 25 mm de comprimento é cerca de 60 kg/m³. Em geral, a densidade aparente é inversamente relacionada ao comprimento picado dos caules.

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28/57 [086] Se caules inteiros, fragmentos ou caules picados forem fermentados em uma solução aquosa, o suco nos caules é diluído entre 2,5X e 10X. Já que o custo da separação do etanol das soluções diluídas é proibitivo, isso não é prático. Por exemplo, quando a densidade aparente dos caules é 200 kg/m³, 5 1 da solução aquosa circundam cada 0,5 1 do suco de caule. Se 1 1 do suco de caule tiver 10% de açúcar, o mesmo terá aproximadamente 5% de etanol após a fermentação. Se os caules forem fermentados em uma solução aquosa, a solução resultante terá 0,5% de etanol após a fermentação que não é comercialmente viável para extração. Isso pode ser solucionado fermentando-se caules inteiros e fragmentos em uma solução de etanol 5%, mas isso tem outros problemas de acúmulo de contaminantes ao longo do tempo.

[087] Já que os custos de transporte são primariamente uma função de volume (e não de peso), e já que as culturas são frequentemente colhidas a distância significativas de onde as mesmas são processadas, é bastante custoso transportar açúcares a tais baixas densidades aparentes já que apenas 2% a 5% do volume de um caminhão é ocupado pelo açúcar. Há uma necessidade na técnica de reduzir o custo da produção de etanol a partir de culturas ricas em açúcar produzindo-se o etanol no (ou próximo ao) sítio de colheita dessas culturas, reduzindo os custos de transporte.

[088] As células de parênquima nos caules são tecido vivo e, portanto, respiram (inspiram e expiram) após a colheita. A respiração envolve converter oxigênio e açúcar nas células de parênquima em dióxido de carbono e energia para manter a célula. A cana-de-açúcar, o sorgo e o milho mais perdem quantidades significativas de açúcar para

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29/57 respiração ao serem armazenados. Há uma necessidade na técnica de reduzir a perda de açúcar para a respiração convertendo-se mais rapidamente os açúcares em etanol do que os métodos atuais. Uma vez que os açúcares nas culturas são convertidos em etanol, os mesmos podem ser armazenados por longos períodos, permitindo a remoção contínua do etanol durante todo o ano. É desejado usar mais eficazmente o capital investido na extração com rolos, destilação e remoção de etanol com o uso desse equipamento durante todo o ano, não apenas durante a temporada de colheita.

[089] Se os caules de cana-de-açúcar, sorgo e milho mais forem armazenados em condições anaeróbicas (sem oxigênio), os micro-organismos no exterior dos caules colonização os e, após 21 dias, fermentarão completamente todo o açúcar nos caules, principalmente em ácido láctico e ácido acético. Já que a camada externa dos caules é frequentemente raspada e danificada pela colheita, os microorganismos podem penetrar mais facilmente as camadas externas dos caules, levando a perdas de açúcar devido à fermentação em ácido láctico e ácido acético. Salpicar os caules com levedura ou bactérias formadoras de ácido láctico sem picar ou triturar os caules primeiro é uma técnica de ensilagem ineficaz.

[090] A levedura produz grandes quantidades de dióxido de carbono durante a fermentação, e a infusão de leveduras em caules rachados forma uma espuma no exterior dos caules durante a fermentação e expele líquido dos caules pela ação de formação de bolhas dentro do tecido. Surpreendentemente, a levedura não é expelida por essas bolhas, e a levedura pode continuar a fermentação até todos

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30/57 os açúcares serem fermentados.

[091] Sem ater-se a qualquer teoria particular, acredita-se que a adesão de células de levedura a células de parênquima na presença de açúcares é mais forte do que as forças das bolhas de dióxido de carbono que atuam para expelir a levedura do tecido de parênquima.

[092] Esta invenção é também tem premissa no fato de que a taxa de difusão de açúcares através da membrana celular nas células de parênquima de caules da família Poaceae é suficiente para permitir que os organismos de fermentação nas rachaduras fermentem os açúcares dentro das células de parênquima a uma alta taxa. O etanol, então, se difunde nas células de parênquima. Em algumas variações, a pectina liase macera o tecido de parênquima, o que reduz a

energia necessária para esmagar os caules para recuperar o etanol ou açúcares não fermentados. [093] A invenção fornece um método para fermentar caules da família Poaceae, em que o método

compreende as etapas de:

(a) fornece caules da família Poaceae, em que os caules têm um comprimento médio maior do que 100 mm, e em que os caules têm um teor de umidade inicial médio entre 25% e 80% (base em peso) , tal como 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%;

(b) comprimir os caules entre rolos enquanto os caules estão submersos em uma solução aquosa de reagente, em que os rolos comprimem o diâmetro médio dos caules em entre 20% e 90%, e em que a solução aquosa de reagente contém um ou mais organismos de fermentação selecionados a partir do grupo que consiste em leveduras, bactérias formadoras de ácido

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31/57 láctico, bactérias formadoras de ácido acético e combinações dos mesmos;

(c) remover os caules da solução aquosa de reagente, em que os caules retêm pelo menos uma porção do um ou mais organismos de fermentação; e (d) fermentar os caules por um tempo de fermentação para produzir produtos de fermentação dentro dos caules.

[094] Os caules da família Poaceae são quebradiços quando os mesmos têm um teor de umidade entre 25% e 80%, então, comprimir os mesmos entre os rolos faz com que uma fina rede de rachaduras se forme na direção axial. As leveduras do tipo selvagem e bactérias formadoras de ácido láctico no exterior dos caules não são infundidas em números significativos na fina rede de rachaduras nos caules durante a etapa (b) porque a concentração de organismos de fermentação na solução aquosa de reagente é muito maior do que a concentração daqueles organismos de fermentação do tipo selvagem do exterior dos caules. Nem as leveduras nem as bactérias formadoras de ácido láctico são dotadas de mobilidade, então, os organismos de fermentação do exterior dos caules não colonizam o interior dos caules, e os açúcares que se difundem a partir do interior dos caules são consumidos dentro dos caules pelos organismos de fermentação infundidos com a solução aquosa de reagente. Portanto, muito pouco açúcar dos caules é consumido pelas leveduras do tipo selvagem e bactérias formadoras de ácido láctico no exterior dos caules.

[095] Os caules precisam ser longos o suficiente para serem puxados de uma calha de alimentação, propelidos através dos rolos (ou dois rolos ou três rolos em

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32/57 modalidades preferenciais) e ejetados através de uma calha de saida. A calha de saida precisa ter um diâmetro constante (ou crescente) para impedir a obstrução na emissão. Os testes mostraram que caules de 100 mm ou mais longos podem funcionar com rolos. Aqueles versados na técnica verão que os caules podem ser ou comprimidos um de cada vez entre os rolos ou múltiplos caules podem ser alimentados entre os rolos.

[096] A operação unitária chave nesse método é comprimir os caules enquanto submersos na solução aquosa de reagente, apenas o suficiente para formar uma rede de rachaduras microscópicas e não tanto que uma quantidade significativa de suco seja expressa. Surpreendentemente, os caules podem ser comprimidos enquanto submersos a uma alta velocidade dos caules, e a solução aquosa de reagente é puxada para a rede de rachaduras microscópicas nessa alta velocidade. Os testes a 1 m/s de velocidade de cana mostram que a distância submersa de cerca de 200 mm tem um tempo submerso de cerca de 200 ms para as enzimas e organismos de fermentação penetrarem o caule. Os exemplos mostram que esse tempo é suficiente para resultar na penetração completa do caule.

[097] Diferentes caules da familia Poaceae (ou diferentes híbridos) exigem diferentes quantidades de pressão entre os rolos. Diferentes diâmetros de rolo, diferentes resistências de mola, diferentes alturas de pá, diferentes números de rolos e diferentes velocidades tangenciais aplicarão diferentes forças de propagação de rachadura em diferentes tipos de caules. Entretanto, experimentação indevida não é exigida para determinar a força exigida entre os rolos, já que há simples procedimentos para determinar a

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33/57 resistência de mola ideal necessária.

[098] O teste de calibração mais simples envolve passar os caules entre os rolos na velocidade de produção (entre 0,1 e 10 m/s) sem nenhum líquido no aparelho, alterando as molas com diferentes constantes de mola até menos de 1% de perda de suco ser experimentado. Esses testes de perda de suco podem ser feitos em algumas horas. Os testes mostraram que apenas 0,5% de perda de suco ocorre a uma pressão suficiente entre os rolos para efetuar a infusão completa.

[099] Aqueles versados na técnica compreenderão que um teste de validação subsequente é medir o brix do suco no caule antes da infusão, infundir os caules com a solução aquosa de reagente e medir o resultado de fermentação após 3 dias de fermentação. A medição do teor de etanol e o amolecimento do tecido de parênquima validarão facilmente que a pressão escolhida entre os rolos é eficaz.

[0100] A modalidade preferencial desta invenção é comprimir caules inteiros entre rolos, já que isso pode ser feito com equipamento não custoso e movido por trabalho manual, pequenos motores de compressão interna ou pequenos motores elétricos. A energia exigida para comprimir é principalmente usada para propagação de rachaduras, o que é especialmente eficaz no consumo de energia. Aqueles versados na técnica podem ver como construir outras modalidades com rolos que têm a capacidade de infusão em escala industrial (mais do que 10 toneladas métricas por hora).

[0101] Quando os caules são comprimidos, a solução aquosa de reagente flui para a rede de rachaduras microscópicas, distribuindo os organismos de fermentação e as

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34/57 enzimas na solução aquosa de reagente por todo o tecido de parênquima dos caules.

[0102] Os caules da família Poaceae têm um diâmetro de cerca de duas vezes tão grande no fundo 1/3 do que o diâmetro no topo 1/3, e a pressão de compressão no fundo 1/3 é cerca de duas vezes essa no topo 1/3. Esse perfil de diâmetro (diâmetro como uma função de distância de uma extremidade do caule) é reduzido por rolos que comprimem os caules a entre 20% e 90% do diâmetro em cada ponto do caule, incluindo 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% e 90%, com a faixa mais preferencial dentre 40% e 60% do diâmetro em cada ponto do caule.

[0103] Os rolos da modalidade preferencial desta invenção precisam de uma força no vão entre os rolos proporcional à separação dos rolos. A modalidade preferencial desta invenção usa molas que empurram ou puxam os rolos em conjunto. As molas têm a característica de que a força suprida pela mola é linearmente proporcional ao deslocamento da mola (lei de Hooke).

[0104] Os caules não se dobram facilmente antes dos mesmos passarem através dos rolos e se dobram facilmente após os mesmos serem comprimidos enquanto passam através dos rolos. Em modalidades preferenciais desta invenção, os rolos são orientados de modo que a calha de alimentação de cima da solução aquosa de reagente para baixo da solução aquosa de reagente alimente diretamente aos rolos. Em modalidades preferenciais desta invenção, a calha que leva para fora da solução aquosa de reagente faz com que o caule seja dobrado em uma direção para cima após passar através dos rolos. A modalidade preferencial desta invenção usa dois rolos, mas

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35/57 aqueles versados na técnica também compreenderão que três rolos são uma modalidade viável.

[0105] Os rolos precisam agarrar os caules para alimentar os mesmos através dos rolos. Em modalidades preferenciais desta invenção, os rolos têm pás horizontais elevadas para ajudar a puxar os caules através dos rolos.

[0106] Em modalidades preferenciais desta invenção, um tanque contém a solução aquosa de reagente e tem uma válvula de alimentação que mantém o nivel da solução aquosa de reagente constante. Os caules que passam através da solução aquosa de reagente carregam alguma parte da solução aquosa de reagente, e testes mostraram que água na quantidade de cerca de 15% da massa do caule é carregada por absorção no caule, necessitando de reabastecimento do tanque que contém a solução aquosa de reagente. Isso significa que uma tonelada de caules absorverá cerca de 150 litros de solução aquosa de reagente. Uma modalidade desta invenção tem um par de rolos para comprimir caules em uma direção perpendicular aos rolos 107 e 108 na Figura 1 antes de os caules emergirem no tubo de saida 113, a fim de espremer a solução aquosa de reagente não necessária absorvida pelos caules.

[0107] A levedura é o organismo para produzir etanol a partir de açúcares no tecido de parênquima e a partir da glicose liberada pela hidrólise enzimática e hidrólise ácida diluída. Isso é usado para caules ricos em açúcar quando o propósito da fermentação é a recuperação de etanol. As bactérias formadoras de ácido láctico são usadas para reduzir o pH do interior dos caules a cerca de 4,2, o que impede outros organismos de colonizarem nos caules. Isso é usado ao ensilar os caules para o consumo subsequente por

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36/57 ruminantes. As coculturas de levedura e bactérias formadoras de ácido acético são usadas para converter açúcares em ácido acético, no caso em que os caules devem ser subsequentemente usados para digestão anaeróbica após a ensilagem. As coculturas de principalmente levedura com quantidades menores de bactérias formadoras de ácido láctico são usadas tanto para fermentar açúcares em etanol quanto para preservar os caules para o consumo subsequente por ruminantes.

[0108] Em modalidades preferenciais, os caules são selecionados a partir do grupo que consiste em caules de cana-de-açúcar, caules de sorgo e caules de milho mais.

[0109] Os mesmos são os caules mais amplamente cultivados da família Poaceae.

[0110] Em algumas modalidades, os caules têm folhas fixadas aos caules.

[0111] Durante a produção de silagem, as folhas são frequentemente mais facilmente digeridas do que os caules e contêm nutrição valiosa para ruminantes. A planta inteira, com folhas fixadas, pode ser esmagada entre os rolos para infundir a solução aquosa de reagente nos caules, enquanto se trata simultaneamente as folhas com a mesma solução aquosa de reagente. Durante a compressão com folhas fixadas, é preferencial alimentar o caule aos rolos do fundo do caule (a extremidade espessa) para o topo do caule (a extremidade fina), de modo que as folhas se dobrem contra o caule.

[0112] Em algumas modalidades, os caules estão presentes como uma planta inteira.

[0113] Durante a produção de silagem, é, algumas vezes, útil ensilar a planta inteira, incluindo folhas e quaisquer grãos fixados à planta inteira. A compressão abrirá

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37/57 também a bainha que envolve os grãos, tornando os grãos mais acessíveis a leveduras e enzimas, e tornando os grãos mais digeríveis.

[0114] Em modalidades preferenciais, os rolos têm uma velocidade tangencial entre 0,1 m/s e 10 m/s.

[0115] Testes mostraram que uma velocidade tangencial de 1 m/s pode infundir cerca de 1 tonelada métrica por hora de caules de sorgo sacarino, resultando em mais do que 90% dos açúcares nos caules sendo fermentados. Velocidades tangenciais mais lentas ou mais rápidas podem também fornecer uma infusão completa. Também, velocidades tangenciais mais rápidas produzem uma rede mais fina de rachaduras, conforme descrito no documento Skantz.

[0116] Em modalidades preferenciais, a solução aquosa de reagente contém enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectina liase, amilase, celulase, glicose oxidase, xilanase e combinações dos mesmos.

[0117] Testes mostraram que a pectina liase é útil para macerar o tecido de célula de parênquima em caules da família Poaceae, tornando mais eficaz extrair suco por esmagamento.

[0118] Amilase é usada em conjunto com pectina liase para hidrolisar grânulos de amido em células de parênquima em glicose. Pectina liase e/ou xilanase maceram as células de parênquima, e a celulase irrompe as células de parênquima, permitindo a difusão da amilase aos grânulos de amido.

[0119] A celulase é usada para hidrolisar celulose em caules em glicose, o que é um modo de liberar lentamente glicose. A glicose, por sua vez, pode ser

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38/57 fermentada em etanol ou ácido láctico, e a glicose oxidase pode ser usada para converter glicose e O2 em ácido glicônico e peroxide de hidrogênio.

[0120] Em algumas modalidades, a solução aquosa de reagente contém ácidos selecionados a partir do grupo que consiste em ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico e combinações dos mesmos.

[0121] Estudos mostraram que ácido fórmico é eficaz na ensilagem de caules da família Poaceae. Ácido acético e ácido láctico são úteis como um tampão de pH, e ambos impedem o crescimento de micro-organismos indesejados.

[0122] Em algumas modalidades, a solução aquosa de reagente contém ions ferrosos, peroxide de hidrogênio ou uma combinação dos mesmos.

[0123] Os ions ferros são usados com peróxido de hidrogênio na reação de Fenton. Os sais ferrosos são solúveis em água e podem ser seguramente alimentados a ruminantes nas concentrações necessárias para a reação de Fenton. Algumas bactérias formadoras de ácido láctico produzem peróxido de hidrogênio, hexose oxidases produzem peróxido de hidrogênio a partir de glicose, manose e galactose, e esse peróxido de hidrogênio juntamente com ions ferrosos catalisam a quebra da matriz lignocelulósica, tornando a mesma mais digestível e acessível às enzimas. Saccharomyces cerevisiae pode tolerar até cerca de 2 mM de peróxido de hidrogênio, mas as bactérias formadoras de ácido láctico e as bactérias formadoras de ácido acético não podem tolerar essa concentração de peróxido de hidrogênio. Isso é descrito no documento Jamieson, DEREK J., Saccharomyces cerevisiae has distinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione, Journal of

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39/57 bacteriology 174.20 (1992): 6.678 a 6.681 que é incorporado ao presente para referência.

[0124] Em modalidades preferenciais, o tempo de fermentação está entre 1 dia e 7 dias.

[0125] Os testes mostraram que a fermentação completa leva entre 1 dia e 7 dias, dependendo da temperatura e concentração dos organismos de fermentação.

[0126] Os experimentos mostraram que o tempo de fermentação com uma concentração de levedura de cerca de 2 células por célula de parênquima resulta em um tempo de fermentação de cerca de 48 horas a 96 horas, mas concentrações mais baixas de leveduras ou bactérias formadoras de ácido láctico podem levar mais tempo. Concentrações mais baixas resultam na fermentação mais lenta, o que resulta em menos aumento na temperatura, o que reduz a necessidade de mecanismos de resfriamento custosos.

[0127] Em modalidades preferenciais, a levedura é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae.

[0128] Saccharomyces cerevisiae é a levedura mais amplamente usada para fermentar açúcares em etanol. Esse organismo tem a maior tolerância a etanol de qualquer organismo de fermentação, e muitos híbridos estão disponíveis.

[0129] Em algumas modalidades, os caules são desidratados durante o tempo de atraso de fermentação da etapa (d).

[0130] A desidratação de caules durante o tempo de atraso de fermentação da etapa (d) evapora água dos caules, reduzindo a quantidade de água nos caules ao sinal da fermentação na etapa (d) . Quando o produto de fermentação é

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40/57 etanol, essa opção resulta em concentração de etanol mais alta no suco dos caules, que tem maior valor que uma concentração de etanol mais baixa. Quando o produto de fermentação é ácido láctico, essa opção resulta em uma concentração de ácido láctico mais alta, que resulta em um pH mais baixo e melhor ensilagem. A área de superfície interna exposta aumentada dos caules causada pela rede de pequenas rachaduras aumenta a taxa de desidratação, visto que a taxa de desidratação é proporcional à área de superfície exposta.

[0131] 0 tempo de atraso de fermentação pode ser prolongado diminuindo-se a concentração de organismos de fermentação na solução aquosa de reagente, aumentando, assim, a quantidade total de água removida durante o tempo de atraso de fermentação. Ar aquecido, aquecimento radiativo, aquecimento condutivo e combinações dos mesmos adicional energia térmica aos caules durante a desidratação, em que ar quente solar é uma modalidade preferencial. Aqueles versados na técnica perceberão que há inúmeras formas de manter a temperatura nos caules abaixo de 38°C durante a desidratação, especialmente controlando-se a taxa de circulação de ar quente através dos caules. Em algumas modalidades simples, os caules podem ser simplesmente deixados secar no sol durante o tempo de atraso de fermentação, e posteriormente armazenados em um ambiente anaeróbico pela maior parte do tempo de fermentação. O sucesso dessa modalidade simples depende da temperatura dos caules não ser elevada acima de 38°C durante a etapa (d) , o que poderia exterminar os organismos de fermentação infundidos na rede fina de rachaduras nos caules.

[0132] Durante o tempo de atraso de fermentação, pouco etanol é produzido e principalmente água dos caules é

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41/57 removida por desidratação. A quantidade ideal de desidratação é tal que a concentração de açúcar nos caules seja a máxima que os organismos de fermentação podem fermentar, tal como cerca de 32% de açúcar em peso com algumas cepas de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, as bactérias formadoras de ácido láctico são selecionadas a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium freudenreichii e combinações dos mesmos .

[0133] Essas bactérias formadoras de ácido láctico são usadas em formulações de ensilagem comercialmente disponíveis.

[0134] Em modalidades preferenciais, o método compreende, ainda, a solução aquosa de reagente com o uso de energia turbulenta de 0,15 W/kg a 5 W/kg.

[0135] A energia turbulenta suficiente é usada de modo que a escala de comprimento de Kolmogorov esteja na ordem de menos que o comprimento livre de apoplasto (por exemplo, cerca de 20 microns) . Com o uso da escapa de comprimento de Kolmogorov, e sabendo que a viscosidade cinemática da água a 20 °C é cerca de 10^-6 m²/s, a energia necessária para misturar os reagentes e processar a água até uma escala de 20 microns exige cerca de 5 W/kg, e misturar até uma escala de 50 microns exige cerca de 0,15 W/kg. Essas escalas são tais que a difusão de açúcares nessa escala dure segundos e a difusão de enzimas nessa escala dure minutos.

[0136] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, manter os caules em um ambiente anaeróbico por um tempo de ensilagem subsequente à conclusão do tempo de

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42/57 fermentação .

[0137] Quando o ambiente é anaeróbico e não há açúcares nos caules e/ou o pH está abaixo de 4,0, fungos e bactérias não podem se proliferar na pectina ou etanol nos caules.

[0138] Em algumas modalidades, o tempo de ensilagem está entre um dia e um ano.

[0139] Durante o tempo de colheita, há pouco tempo livre para processamento de culturas para remover açúcares ou etanol, e a ensilagem é um método para espalhar o processamento demorado de uma cultura ao longo de um ano inteiro. Adicionalmente, se as culturas forem para uso como ração para animal, as mesmas precisam ser ensiladas pelo período inteiro de modo que possam ser alimentadas aos ruminantes até a cultura seguinte ser colhida.

[0140] Em modalidades preferenciais, o método compreende, ainda, recuperar os produtos de fermentação esmagando-se os caules.

[0141] A pectina liase macera o tecido do parênquima em caules da família Poaceae. Isso fornece uma ação de maceração, em que o líquido nas células do parênquima pode ser mais facilmente removido por esmagamento do que por esmagamento convencional de caules não tratados.

[0142] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, recuperar os produtos de fermentação por evaporação dos produtos de fermentação a partir dos caules.

[0143] A taxa de evaporação é proporcional à área de superfície do líquido exposto, e a rede microscópica de rachaduras nos caules nesta invenção expõe uma área de superfície muito grande por volume unitário, tornando a

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43/57 evaporação de etanol eficaz. Adicionalmente, a concentração de etanol no vapor evaporado é mais alta que a concentração dentro dos caules. Isso torna prático produzir diretamente uma bebida alcoólica a partir do vapor evaporado dos caules.

[0144] Um exemplo de uma destilação solar que evaporará etanol dos caules fermentados é descrito na Patente n- US 4.966.655, expedida em 30 de outubro de 1990 por Wilkerson, que está incorporada ao presente documento para referência. O sol aquece os caules pelo brilho da luz através da cobertura plástica, e o ar frio à noite causa a condensação do vapor de etanol evaporado. Essa destilação solar é vedada e manterá um ambiente anaeróbico devido ao fato de que baixos niveis de dióxido de carbono continuarão a ser produzidos por fermentação, mantendo uma pressão positiva interna.

[0145] Esse tipo de destilação solar exige pouquíssimo capital para construção, e apenas a folha de cobertura plástica precisa ser substituída em alguns anos devido à luz ultravioleta que degrada o plástico.

[0146] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, alimentar os caules a ruminantes subsequentemente à etapa (d).

[0147] Os caules mecanicamente esmagados e enzimaticamente degradados são mais fáceis para os ruminantes diferirem que os caules não esmagados. Adicionalmente, a levedura nos caules aumenta o teor proteico. Ademais, o efeito de hidrólise com ácido diluído durante a ensilagem faz com que a hemicelulose e a celulose sejam mais digeríveis.

[0148] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, usar os caules com digestão anaeróbica

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44/51 para produzir metano subsequentemente à etapa (d).

[0149] Os caules mecanicamente esmagados e enzimaticamente degradados são mais eficazmente usados na digestão anaeróbica do que caules não esmagados. Adicionalmente, o efeito da hidrólise com ácido diluído durante a ensilagem faz com que a hemicelulose e a celulose sejam mais suscetíveis à digestão anaeróbica.

[0150] Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, usar os caules com hidrólise enzimática para produzir etanol a partir de celulose subsequentemente à etapa (d).

[0151] Os caules mecanicamente esmagados e enzimaticamente degradados liberam mais glicose durante a hidrólise enzimática do que os caules não esmagados. Adicionalmente, o efeito da hidrólise com ácido diluído durante a ensilagem faz com que a hemicelulose e a celulose sejam mais suscetíveis à hidrólise enzimática.

[0152] Uma pessoa de habilidade comum na técnica perceberá que a temperatura durante a fermentação pode ser limitada a cerca de 38°C com uma variedade de conjuntos de procedimentos de baixo custo, especialmente se a fermentação ocorrer durante 3 dias, e que uma temperatura inicial tão baixa quanto 5°C será suficiente para iniciar a fermentação. Essa fermentação em baixa temperatura elevará rapidamente a temperatura dos caules até acima de 38°C.

[0153] Uma pessoa de habilidade comum na técnica perceberá que aparelhos conhecidos podem ser empregados para os processos, sistemas e métodos revelados no presente documento. Os processos no presente documento podem ser a batelada, contínuos, semicontínuos ou pseudocontínuos.

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Qualquer referência a vaso ou reator no presente documento deve ser interpretada significando um ou uma pluralidade de tais aparelhos (tal como em série ou em paralelo). Vários padrões de fluxo podem ser desejados ou observados. Com reações químicas e processo de transferência de massa simultâneos que envolvem múltiplas fases, a dinâmica de fluidos pode ser bastante complexa. Dependendo do projeto específico, os padrões de fluxo podem abordar fluxo pistonado ou fluxo bem misturado.

[0154] O rendimento, ou capacidade de processo, pode variar amplamente de unidades de escala laboratorial pequena a biorrefinarias em escala comercial completa, incluindo qualquer piloto, demonstração ou escala semicomercial. Em várias modalidades, a capacidade de processo é pelo menos cerca de 1 kg/dia, 10 kg/dia, 100 kg/dia, 1 ton/dia (todas as toneladas são toneladas métricas), 10 ton/dia, 100 ton/dia, 500 ton/dia, 1.000 ton/dia, 2.000 ton/dia ou mais alta.

[0155] 0 sistema geral pode estar em uma localização fixa, ou pode ser mais portátil . 0 sistema pode ser construído com o uso de módulos que podem ser

simplesmente duplicados para aumento em escala prático.

[0156] Várias sondas podem permitir o monitoramento preciso do processo e controle através de vários estágios do processo, até, e potencialmente incluindo, todos os estágios do processo. Seria esperado que o monitoramento preciso do processo resultasse em aprimoramentos de rendimento e eficácia, tanto dinamicamente como durante um período de tempo em que o histórico operacional pode ser utilizado para ajustar as condições de

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46/57 processo (incluindo programas de rodízio de pressão). Em algumas modalidades, uma sonda de reação está disposta em comunicação operável com uma zona de processo. Tal sonda de reação pode ser útil para extrair amostras líquidas e analisar as mesmas, a fim de determinar a extensão da hidrólise, ou perfil de açúcar, etc. Os ajustes de processo podem ser baseados em medições, se consideradas necessárias ou desejáveis, com o uso de princípios bem conhecidos de controle de processo (retroalimentação, mecanismo antecipatório, lógica proporcional, integral e derivativa, etc.).

[0157] As correntes sólidas, líquidas e gasosas produzidas ou que saem de dentro do processo podem ser independentemente recicladas, passadas para as etapas subsequentes ou removidas/purgadas do processo em qualquer ponto.

[0158] Exemplos [0159] Os seguintes exemplos demonstram os princípios desta invenção. A infusão de levedura e enzimas por compressão durante submersão, conforme descrito acima, mostrou, por evidência experimental, ser útil para fermentar caules na família Poaceae.

[0160] O aparelho experimental da Figura 1 é projetado para reproduzir a funcionalidade de processo industrial da modalidade preferencial desta invenção quanto à temperatura, pressão e controle de fluxo de uma unidade industrial. O mesmo foi usado em uma colheita de sorgo sacarino na fazenda de sorgo sacarino Delta BioRenewables em Memphis, Tennessee, EUA em novembro de 2016 para testar a compressão de caules recém-colhidos. Alguns caules foram,

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47/57 então, congelados e transportados até Minneapolis, Minnesota, EUA, e foram descongelados e subsequentemente comprimidos com o uso desse aparelho experimental, conforme descrito nos Exemplos 2, 3 e 4 abaixo. A perda de massa causada pela compressão é descrita no Exemplo 2, e a fermentação e a eficácia enzimática são descritas no Exemplo 3 e 4.

[0161] A Figura 1 ilustra o dispositivo usado. Caules cortados com comprimento maior que 100 mm sem limite de comprimento máximo são alimentados através do tubo de alimentação 103. O vaso 101 contém a solução aquosa de reagente. O caule que é alimentado no dispositivo é primeiramente submerso na solução e, então, entra em contato com os rolos 108 e 107. O rolo 108 está girando livremente em torno do eixo 109, que, por sua vez, é deixado se mover verticalmente devido à mola 111. A compressão da mola e a quantidade de movimento do rolo podem ser ajustadas com o uso do tensionador 112, permitindo, assim, o tratamento ideal de caules de vários diâmetros e garantindo que a compressão dos caules seja limitada a entre 20% e 90%. O eixo 114 do rolo 107 não pode se mover verticalmente e é acionado por uma fonte externa de rotação. Essa fonte externa de rotação é mais tipicamente um motor elétrico, mas também pode ser uma manivela manual, manivela biciclica ou um motor de combustão interna. O rolo 107 fornece atrito e compressão aumentados dos caules. As pás metálicas 120 auxiliam a propelir os caules através do rolo 107 e do rolo 108. 0 rolo 107 direciona os caules entre os dois rolos e mediante conclusão de sua passagem através do sistema, os caules são expelidos através do tubo de saida 113. Conforme um caule deixa o espaço entre os rolos e, portanto, não é mais direcionado

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48/57 pelos mesmos, o mesmo é expelido pelo sistema sendo empurrado pelos caules seguintes que são comprimentos entre os rolos. 0 vaso 101 opera cheio de solução aquosa de reagente, e provisões são realizadas para que o vaso seja mentido cheio através do tampão de preenchimento 122 e drenadas através do tampão de drenagem 121.

[0162] O aparelho experimental usou um diâmetro de aproximadamente 90 mm para o rolo 107, um diâmetro de aproximadamente 100 mm para o rolo 108, uma espessura e uma altura de aproximadamente 6 mm para pás metálicas 120, uma distância mínima de 9,5 mm entre o rolo 107 e o rolo 108, uma velocidade tangencial de aproximadamente 1 m/s para o rolo 107, um diâmetro de 100 mm para o tubo de alimentação 103 e o tubo de saída 113, e um comprimento de 2 m para o tubo de alimentação 103 e o tubo de saída 113.

[0163] Os exemplos a seguir usam sorgo sacarino da fazenda de sorgo sacarino Delta BioRenewables em Memphis, Tennessee, EUA. 0 suco dos caules de sorgo sacarino foi espremido por aperto e o teor de açúcar em Brix foi medido com um refratômetro digital. Os caules de sorgo sacarino usados tinham um teor de umidade de 70%.

[0164] Observa-se que a medição de Brix de suco de sorgo sacarino foi ajustada multiplicando-se o Brix por cerca de 0,8 para obter a porcentagem em peso de açúcares totais. Isso se deve ao fato de que o suco de sorgo sacarino tem mais glicose e frutose que o suco de beterraba sacarina ou cana-de-açúcar, e o índice de refração de glicose e frutose defere daquele da sacarose. Isso é descrito no documento Liu, Ronghou, Jinxia Li e Fei Shen, Refining bioethanol from stalk juice of sweet sorghum by immobilized

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yeast fermentation, Renewable Energy 33.5 ao presente (2008): 1.130 a 1.135, que está incorporado documento para referência. [0165] Quatro exemplos desta invenção são mostrados abaixo. Exemplo 1 [0166] 0 Exemplo 1 mostra a diferença entre

comprimir um pedaço de caule de sorgo sacarino entre as garras de um torno enquanto submerso em uma solução aquosa de reagente e outro pedaço enquanto não submerso. A compressão durante submersão resulta em 30% mais fermentação que a compressão sem submersão e, então, subsequente submersão.

[0167] 0 sorgo sacarino foi fermentado tanto com compressão a 50% durante submersão em uma solução aquosa de reagente como com compressão ao ar e durante submersão em uma solução aquosa de reagente por 30 minutos.

[0168] Foi usado um caule de sorgo sacarino que foi colhido na fazenda de sorgo sacarino Delta BioRenewables em Memphis, Tennessee, EUA em outubro de 2015, transportado em gelo seco e armazenado em um congelador até ser testado em junho de 2016. Um caule de sorgo sacarino foi escolhido do congelador, com 200 mm de comprimento e 10 mm de diâmetro. 0 mesmo foi descongelado em um refrigerador por dois dias. 0 caule foi cortado em dois comprimentos de 100 mm, com a amostra esquerda pesando 7,1 g e a amostra direita pesando 9,4 g. Uma pequena quantidade de suco foi espremida e o Brix foi medido como 13%.

[0169] Um litro de solução aquosa de reagente foi preparado amornando-se 1 litro de água até 38 °C, então, adicionando-se 1 g de levedura Thermosacc da Lallemand

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Biofuels & Distilled Spirits e 1 g de nutrientes de levedura Fermax da BSG Corporation. Essa solução aquosa de reagente foi agitada com um agitador magnético por 30 minutos para reidratar a levedura seca por congelamento enquanto a temperatura da solução aquosa de reagente foi mantida em 38 °C.

[0170] A amostra esquerda foi colocada em uma bolsa plástica preenchida com a solução aquosa de reagente, espremida até um diâmetro de 5 mm e, então, imediatamente removida e deixada em drenagem. A massa da amostra esquerda aumentou de 7,1 g para 7,5 g, um aumento de cerca de 5,6%.

[0171] A amostra direita foi espremida até um diâmetro de 5 mm quando exposta ao ar, então, pesada. A massa da amostra direita reduziu de 9,4 g para 8,7 g, uma diminuição de cerca de 7,4%. A amostra direita foi, então, submersa na solução aquosa de reagente por 30 minutos. As bolhas do caule ficaram visíveis por 10 minutos. Após 30 minutos, a massa da amostra direita aumentou de 8,7 g para 9,3 g, um aumento de cerca de 6,9%.

[0172] As amostras esquerda e direita foram, então, colocadas em dois tubos de PVC vedados, cada um com cerca de 100 mm de comprimento e com um diâmetro interno de 20,9 mm. Esses tubos de PVC foram, então, submersos em um banho de água mantido a 38°C e conectados a um contador de gás.

[0173] O progresso da fermentação foi medido pelo gás produzido a partir de cada tubo de PVC com o uso de dois MilliGascounter, tipo MGC-1, da Dr.-Ing. Ritter Apparatebau GmbH & Co. KG em Bochum, Alemanha. A quantidade de gás produzido é medida na resolução de mililitros durante

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51/57 o periodo da fermentação. A fermentação de 3,35 g de açúcar (normalmente sacarose) gera 1 1 de gás (CO2) , de modo que a quantidade de açúcar fermentado, a taxa de fermentação e a quantidade total de açúcar fermentado possam ser inferidas pelo gráfico de gás produzido ao longo do tempo.

[0174]

A amostra esquerda produziu 0,0753 1 de gás em 897 minutos (14,95 horas). A amostra direita produziu

0,0767 1 de gás em 942 minutos (15,7 horas).

[0175]

Após a conclusão da fermentação, o suco foi espremido de cada amostra, e o Brix da amostra esquerda foi 2,6 e o Brix da amostra direita foi 4,2. O pH da amostra esquerda foi 3,98, e o pH da amostra direita foi 3,61.

[0176]

Para computar o teor de açúcar do suco de sorgo sacarino a partir da medição de Brix, multiplicou-se o Brix de 13% por 0,8, resultando em um teor de açúcar do suco de cerca de 10,4%. Isso se deve ao fato de que o suco de sorgo sacarino tem mais glicose e frutose que o suco de canade-açúcar, e o indice de refração de glicose e frutose defere daquele da sacarose. O mesmo está descrito no documento Liu et al., Refining bioethanol from stalk juice of sweet sorghum by immobilized yeast fermentation, Renewable Energy 33.5 (2008): 1.130 a 1.135, que está incorporado ao presente documento para referência.

[0177]

Para computar o teor de açúcar de cada caule, assumiu-se um teor de umidade de cerca de 70%, resultando em uma estimativa de 8,3% da massa de açúcar do caule. Dado que a amostra esquerda teve uma massa de 7,1 g antes da compressão, e assumindo-se uma perda de 7% de açúcares devido à compressão, o resultado é uma estimativa de 0,55 g de açúcar na amostra esquerda. Similarmente, a amostra

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52/57 direita teve uma massa de 9,4 g antes da compressão, resultando em uma estimativa de 0,73 g de açúcar na amostra direita.

[0178] A amostra esquerda produziu 0,55 g / 0,0753 1 = 7,3 g/1 (49% de eficácia), enquanto a amostra direita produziu 0,73 g / 0,0767 1 = 9,5 g/1 (35% de eficácia). Isso mostra que a eficácia desta invenção é significativamente mais alta que a abordagem alternativa de fratura do sorgo sacarino e subsequente submersão do mesmo. Adicionalmente, isso mostra que esta invenção infunde a solução aquosa de reagente no caule pelo menos 100 vezes mais rápido que a abordagem alternativa (alguns segundos em vez de 10 minutos), o que é essencial devido à necessidade de

infusão rápida de culturas conforme são colhidas. Exemplo 2 [0179] 0 Exemplo 2 mostra a perda de massa durante a compressão dos caules de sorgo sacarino com o uso do aparelho descrito na Figura 1 a 1 m/s entre os rolos

quando não submersos. Essa compressão usou uma pressão de mola alta (tensionador 112 girado para comprimir a mola 111 passando 5 mm da pressão de mola em repouso de zero) e uma baixa pressão de mola (tensionador 112 girado para comprimir a mola 111 até pressão de mola em repouso de zero) . Essa baixa pressão de mola foi usada no Exemplo 3 e essa alta pressão de mola foi usada no Exemplo 4.

[0180] O procedimento experimental foi:

(1) cortar oito seções de 600 mm de sorgo sacarino (2) registrar a massa e o diâmetro médio (3) ajustar o tensionador 112 em 5 mm passados da pressão de mola em repouso de zero

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53/57 (4) alimentar 4 seções de sorgo e registrar a massa (5) ajustar o tensionador 112 em pressão de mola em repouso de zero (6) alimentar 4 seções de sorgo e registrar a massa [0181] As molas usadas nesses experimentos tinham uma constante de mola de lei de Hooke de 17,4 kN/m, medida adicionando-se pesos em incrementos de 2 kg às molas e medindo-se o deslocamento da mola. A curva foi bastante linear, com 24 kg de peso (235,36 N) comprimindo a mola de 52,2 mm para 38,7 mm (compressão de 13,5 mm).

[0182] A redução de diâmetro medida e a força de esmagamento calculada em um caule de 2 0 mm são mostradas na Tabela 1. Isso mostra que sob alta pressão de mola (5 mm de compressão de mola) , um caule de 20 mm foi comprimido 75% entre as pás 120 e o rolo 108 e foi comprimido 45% entre o rolo 107 e o rolo 108.

[0183] Tabela 1: Redução de diâmetro e força de esmagamento

Pressão de mola Diâmetro sob as pás (mm) Diâmetro entre os rolos (mm) Redução de diâmetro sob as pás (%) Redução de diâmetro entre os rolos (%) Força de esmagamento sob as pás (MPa) Força de esmagamento entre os rolos (MPa) Alta 4,9 10,89 75,50% 45,55% 5, 84 0,79 Baixa 7,1 12,74 64,50% 36,30% 5,20 0,63

[0184] A Tabela 2 mostra que para uma alta pressão de mola (5 mm de compressão de mola), houve uma perda de massa de uma média de 0,35% e para uma baixa pressão de mola (0 mm de compressão de mola) , houve uma perda de massa de uma média de 0,24%. Essa baixa pressão de mola é usada no Exemplo 3 e essa alta pressão de mola é usada no Exemplo 4.

Nota-se que, no Exemplo 2, houve 7% de perda de suco com 50%

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54/51 de compressão do caule. Esse exemplo demonstra que a compressão entre os rolos a 1 m/s resulta em perda significativamente menor de suco que simplesmente compressão estática do caule.

[0185] Tabela 2: Perda de massa com compressão

Amostra Pressão de mola Massa inicial (g) Massa Após Esmagamento (g) Diâmetro Medio (mm) Perda de Massa (%) 1 Alta 127,4 127, 0 16 0,31% 2 Alta 127,3 126, 9 18 0,31% 3 Alta 174,5 174, 0 19 0,29% 4 Alta 193,1 192,2 21 0,47% 5 Baixa 137, 0 136, 8 17 0,15% 6 Baixa 183,2 182,7 24 0,27% 7 Baixa 150,3 150,2 20 0, 07% 8 Baixa 105,1 104, 6 15 0,48% Exempt .o 3

[0186] O Exemplo 3 mostra o resultado da fermentação após a compressão entre rolos com baixa pressão de mola com quatro combinações de enzimas diferentes (nenhuma, HTec3, Pectinex XXL e HTec3 e Pectinex XXL) . Isso demonstra que a fermentação é bem-sucedida com uma baixa pressão de mola, mas que a ação enzimática é ineficaz. Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria particular, se acredita que a baixa pressão de mola produziu uma rede de rachaduras menos extensiva que a alta pressão de mola, e distância de difusão média para as enzimas foi mais longa que o tempo de fermentação, enquanto a velocidade de difusão significativamente mais rápida de açúcares levou à completa difusão de açúcares às células de levedura, embora em

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55/57 distâncias mais longas.

[0187] A Tabela 3 mostra a composição de levedura e enzima das amostras 1 a 4 no Exemplo 3 e no Exemplo 4 • [0188] Tabela 3: Leveduras e enzimas usadas nos Exemplos 3 e 4

Amostra Levedura 5 g/1 Htec3 5 g/1 Pectinex 5 g/1 pH 1 X 5,15 2 X X 5,07 3 X X 5,16 4 X X X 5,12

0189] A Tabela 4 mostra os resultados da fermentação de caules com baixa pressão de mola. Não houve amaciamento visível de tecido do parênquima em qualquer uma dessas amostras após a fermentação ser concluída.

[0190] Tabela 4: Resultados da fermentação do

Exemplo 3

Amostra Massa Inicial (g) Massa Após Infusão (g) Massa Após Fermentação (g) Brlx (%) Gás (L) Eficácia (%) 1 122,0 137,3 126,7 20,0 3,839 94,11% 2 100,3 122,7 102,5 20,8 3,115 89,32% 3 117,1 136,7 126,3 19,8 3,843 99,15% 4 92,4 106, 6 97,3 20,4 2,944 93,44%

Exemplo 4 [0191] A Tabela 5 mostra os resultados da fermentação de caules com alta pressão de mola. Após a fermentação, o tecido do parênquima da amostra 1 não estava amaciado, a amostra 2 estava moderadamente amaciada, e o tecido do parênquima das amostras 3 e 4 estavam completamente

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56/57 dissolvidos. Isso demonstra que tanto a fermentação como a ação enzimática são eficazes com uma alta pressão de mola. Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria particular, se acredita que as eficácias acima 100% foram causadas por hidrólise enzimática de celulose nos caules pela celulase em HTec3.

[0192] O suco dessas quatro amostras foi espremido com um extrator de suco de cana-de-açúcar comercial e enviado para análise de teor de metanol para o Galbraith Laboratories, Inc. in Knoxville, Tennessee, EUA, com o use do procedimento GC-100H. A amostra 1 teve 42 ppm, a amostra 2 teve 35 ppm, a amostra 3 teve 64 ppm e a amostra 4 teve 7 0 ppm de metanol no suco espremido. Isso mostra que a produção de metanol durante a fermentação em caule é muito limitada que que Pectinex XXL produz quantidades muito modestas de metanol.

[0193] Tabela 5: Resultados da fermentação do

Exemplo 4

Amostra Massa Inicial (g) Massa Após Infusão (g) Massa Após Fermentação (g) Brlx (%) Gás (L) Eficiência (%) 1 135,5 162,4 148,7 21,5 4,3114 88,53% 2 125,5 147,9 133,9 16,8 3,9086 110,90% 3 209, 6 229, 9 217,0 17,9 6,4593 102,99% 4 157,5 183,5 169,7 15,6 4,2665 103,88%

[0194] Nessa descrição detalhada, foi feita referência a múltiplas modalidades e aos desenhos anexos em que são mostradas, a título de ilustração, as modalidades exemplificativas específicas da invenção. Essas modalidades são descritas para possibilitar que aqueles que são versados na técnica pratiquem a invenção, e se deve entender que

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57/57 modificações às várias modalidades reveladas podem ser realizadas pelo versado na técnica.

[0195] Nos casos em que os métodos e as etapas descritos acima indicam certos eventos ocorrendo em certa ordem, aqueles versados na técnica perceberão que a ordem de certas etapas pode ser modificada e que tais modificações estão em conformidade com as variações da invenção. Adicionalmente, certas etapas podem ser realizadas concorrentemente em um processo paralelo quando possível, assim como realizadas sequencialmente.

[0196] Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patente citados neste relatório descritivo estão incorporados ao presente a título para referência como se cada publicação, patente ou pedido de patente fosse apresentado específica e individualmente no presente documento.

[0197] As modalidades, as variações e as figuras descritas acima devem fornecer uma indicação da utilidade e da versatilidade da presente invenção. Outras modalidades que não fornecem todos os recursos e as vantagens apresentadas no presente documento podem ser também utilizadas, sem afastamento do espírito e do escopo da presente invenção. Tais modificações e variações são consideradas como parte do escopo da invenção definido pelas reivindicações. No caso de conflite em definições entre a presente revelação e um dicionário ou outra referência, a presente revelação prevalecerá.

Claims

1. MÉTODO PARA FERMENTAR CAULES DA FAMÍLIA POACEAE, caracterizado por compreender as etapas de:

(a) fornecer caules da família Poaceae, em que os ditos caules têm um comprimento médio maior que 100 mm, e em que os ditos caules têm um teor de umidade inicial médio entre 25% e 80%;

(b) comprimir os ditos caules entre rolos enquanto os ditos caules estão submersos em uma solução aquosa de reagente, em que os ditos rolos comprimem o diâmetro médio dos ditos caules em entre 20% e 90%, e em que a dita solução aquosa de reagente contém um ou mais organismos de fermentação selecionados a partir do grupo que consiste em leveduras, bactérias formadoras de ácido láctico, bactérias formadoras de ácido acético e combinações dos mesmos;

(c) remover os ditos caules da dita solução aquosa de reagente, em que os ditos caules retêm pelo menos uma porção dos ditos um ou mais organismos de fermentação; e (d) fermentar os ditos caules por um tempo de fermentação para produzir produtos de fermentação dentro dos ditos caules.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos ditos caules serem selecionados a partir do grupo que consiste em caules de cana-de-açúcar, caules de sorgo e caules de milho mais.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos ditos caules terem folhas fixadas aos ditos caules. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos caules estarem presentes como uma planta

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2/3 inteira.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos ditos rolos terem uma velocidade tangencial entre 0,1 m/s e 10 m/s.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita solução aquosa de reagente conter enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pectina liase, amilase, celulase, glicose oxidase, hexose oxidase, xilanase e combinações dos mesmos.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita solução aquosa de reagente conter ácidos selecionados a partir do grupo que consiste em ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico e combinações dos mesmos.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita solução aquosa de reagente conter íons ferrosos, peróxido de hidrogênio ou uma combinação dos mesmos.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelo dito tempo de fermentação estar entre 1 dia e 7 dias. 10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita levedura sei uma cepa de Saccharomyces cerevisiae. 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelos ditos caules serem desidratados durante um tempo de atraso de fermentação da etapa (d) . 12 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelas ditas bactérias formadoras de ácido láctico serem selecionadas a partir do grupo que consiste em

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3/3

Lactobacillus plantaram, Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium freudenreichii e combinações das mesmas.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, misturar a dita solução aquosa de reagente com o uso de energia turbulenta de 0,15 W/kg a 5 W/kg.