BR112015023529B1 - Sistema indicador de esterilização e método de determinação da eficácia de um processo de esterilização - Google Patents
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Abstract
sistema indicador de esterilização e método de determinação da eficácia de um processo de esterilização a presente invenção refere-se a um sistema indicador de esterilização e a método de utilização do sistema para determinar a eficácia de um processo de esterilização. o sistema pode incluir um frasco possuindo um primeiro compartimento opcional e um segundo compartimento que compreende um meio de crescimento que compreende um ou mais de um dissacarídeo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo capaz de conversão a um monossacarídeo por esporos de germinação de uma ou mais espécies de microrganismo, o frasco sendo livre de monossacarídeo antes do uso; uma tira incluindo dois ou mais eletrodos para oxidar o monossacarídeo e para transportar um sinal elétrico resultante e um aparelho para detectar e medir o sinal elétrico resultante da oxidação. esporos de um indicador biológico adequado podem estar dispostos no primeiro compartimento e/ou sobre a tira.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a indicadores biológicos para testar a eficácia de processos de esterilização, mais especificamente, a métodos a base de nenhuma enzima para monitorar tais indicadores biológicos, em que tal monitoramento pode ser realizado eletronicamente.
[0002] Uma das classes mais importantes de indicadores é a dos indicadores biológicos (IB). Os indicadores biológicos fornecem o mais alto grau de certeza de que as condições de esterilização foram atendidas dentro do processador ou da própria carga processada. Este tipo de indicador é utilizado para representar o pior caso para o sistema de processamento fornecendo um número extremamente alto de organismos altamente resistentes ao processo particular no interior ou sobre o indicador. Normalmente, os esporos bacterianos são o organismo de escolha para monitorar sistemas de esterilização.
[0003] Os indicadores biológicos consistem tipicamente de microrganismos inoculados sobre um material de suporte. Os microrganismos são tipicamente esporos bacterianos que são conhecidos por serem muito resistentes ao meio de esterilização particular em que serão usados. O suporte é colocado em um ciclo de esterilização juntamente com a carga de dispositivo médico. Após a conclusão do ciclo o indicador biológico é incubado e monitorado para o crescimento por até sete dias. O crescimento de um indicador biológico indica que o processo de esterilização não foi adequado para atingir a esterilização completa e que a carga de dispositivo médico precisa ser reprocessada antes do uso. Nenhum crescimento de um indicador biológico confirma que as condições dentro do esterilizador foram adequadas para matar pelo menos o número de esporos bacterianos carregados no indicador (por exemplo, 106 de esporos bacterianos) e, portanto, fornece um nível de garantia de que a carga de dispositivo médico é estéril. Infelizmente, muitos dispositivos médicos são, na realidade, utilizados antes do usuário saber os resultados da incubação completa. Assim, existe uma necessidade no ambiente hospitalar para a detecção de esporos de indicadores biológicos viáveis no menor prazo possível.
[0004] Historicamente, a detecção de indicadores biológicos viáveis depende do meio visual de detecção. O crescimento e multiplicação de organismos viáveis podem ser vistos/detectados como evidenciado pela turbidez no meio de crescimento. Esta turbidez pode levar dias para se tornar perceptível. Outro meio visual e mais comum de detecção é com um indicador de pH colorimétrico. Conforme os organismos viáveis começam a metabolizar e utilizar as fontes de nutrientes, tais como os açúcares que são fornecidos no meio de crescimento, eles excretam produtos de resíduos ácidos. À medida que estes produtos de resíduos ácidos acumulam-se no meio de crescimento, o pH do sistema é reduzido, resultando em uma mudança de cor do meio de crescimento se um indicador de pH estiver presente. A detecção por este meio normalmente leva de 18 a 48 horas.
[0005] Mais recentemente, a fluorescência tem sido usada para detectar a atividade de enzimas que são produzidas pelos organismos de interesse através da adição de um substrato enzimático fluorogênico ao meio de crescimento. Esta metodologia mais recente diminui o tempo de incubação de dias para horas. No entanto, a principal limitação para a redução do tempo de incubação além do que é visto para a metodologia de fluorescência é a fluorescência de fundo inerente que ocorre naturalmente com muitos componentes do indicador biológico, incluindo recipientes de plástico e meios de crescimento. Sinais detectáveis autênticos devem ser altos o suficiente para ser distinguível sobre esta fluorescência de fundo nativa inerente. Logo, para aumentar a sensibilidade do sistema, é necessário reduzir a fluorescência de fundo (ruído) ou migrar para uma tecnologia diferente que tenha maior sensibilidade (sinal).
[0006] Assim, no estado da técnica e atual, indicadores biológicos dependem de meios colorimétricos ou fluorométricos para determinar a viabilidade. A detecção é limitada pela necessidade para os sinais gerados, seja colorimétrica ou fluorométrica, serem substancialmente acima dos níveis de fundo. Isto tem resultado em tempos de detecção para organismos viáveis na ordem de horas para dias, a fim de que sinal suficiente seja acumulado para ser detectável acima dos níveis de fundo. Seria benéfico para ambos os pacientes e hospitais que o tempo de detecção de organismos viáveis nos indicadores biológicos seja da ordem de minutos ou menos.
[0007] Tal método que permite o controle sobre a razão sinal-ruído é a detecção elétrica. O monitoramento das mudanças nas propriedades elétricas dos sistemas é um meio sensível para monitorar outras mudanças dentro desse sistema. As saídas elétricas resultantes podem então ser condicionadas por meios eletrônicos para fornecer sinais amplificados e filtrados que são diretamente proporcionais ao reagente que os gera.
[0008] A presente invenção fornece uma rápida detecção de microrganismos viáveis de um indicador biológico utilizando um método de detecção eletrônica a base de nenhuma enzima para detectar o acúmulo de açúcares simples, tal como a glicose, que resultam da degradação enzimática de açúcares complexos. O sistema a base de nenhuma enzima da presente invenção inclui uma combinação de pelo menos uma glicosidase de ocorrência natural presente em um esporo viável e eletrodos adaptados para oxidar um açúcar simples, tal como a glicose, produzido pela glicosidase no esporo viável. O meio de incubação ou de crescimento previsto para a pós-esterilização de esporos é fornecido livre do açúcar simples e com um açúcar complexo, tal como um dissacarídeo ou um polissacarídeo. A glicosidase reage com o complexo de açúcar adicionado aos meios de crescimento e quebra-os em açúcares simples incluindo, por exemplo, pelo menos uma glicose. O produto de açúcar simples é então exposto aos eletrodos sobre uma tira que é adaptada para seletivamente oxidar glicose que produz uma transferência de elétrons como parte de sua oxidação do açúcar simples. A quantidade de transferência de elétrons é proporcional à quantidade do açúcar simples produzido por esporos viáveis. A transferência de elétrons livres na oxidação pode ser monitorada e medida por eletronicamente. Se o monitoramento eletrônico detecta transferência de elétrons, isto significa que pelo menos alguns esporos são viáveis e sobreviveram ao processo de esterilização, mostrando assim que a esterilização não foi eficaz. Os eletrodos podem ser os utilizados em dispositivos de monitoramento de glicose sanguínea padrão do estado da técnica e, de fato, dispositivos de monitoramento de glicose sanguínea do estado da técnica conhecidos podem ser prontamente adaptados para uso na determinação da presença de qualquer glicose ou açúcar simples no meio combinado. Assim, a presente invenção permite a determinação da eficácia do processo de esterilização por meio de um método muito específico e muito sensível que pode ser realizado de maneira simples e medido eletronicamente. Em uma realização, o sistema e os processos utilizam dispositivos do estado da técnica padrão concebidos para uso no monitoramento os níveis de glicose sanguínea em pacientes diabéticos.
[0009] Assim, em uma realização, a presente invenção refere-se a um sistema indicador de esterilização incluindo:- esporos de uma ou mais espécies de microrganismos;- um frasco que compreende um primeiro compartimento opcional e um segundo compartimento contendo um meio de crescimento compreendendo um ou mais de um dissacarídeo ou um polissacarídeo capaz de conversão a um monossacarídeo por esporos de germinação de uma ou mais espécies de microrganismos, o frasco sendo adaptado para combinar conteúdos do segundo compartimento com os esporos para análise depois de o frasco ter sido exposto ao esterilizante;- uma tira que compreende dois ou mais eletrodos adaptados para oxidar o monossacarídeo e para transportar um sinal elétrico resultante da oxidação do monossacarídeo, em que os dois ou mais eletrodos são adaptados para proporcionar o contato com os conteúdos combinados do segundo compartimento e os esporos durante e/ou após a incubação; e- um aparelho ligado ou ligável a dois ou mais eletrodos e adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante de transferência de elétrons quando o monossacarídeo é oxidado pelos dois ou mais eletrodos,em que o sistema é livre do monossacarídeo antes da exposição a um esterilizante.
[00010] Em uma realização, o primeiro compartimento está ausente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira é inicialmente separada do segundo compartimento.
[00011] Em uma realização, o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira é inicialmente separada de ambos o primeiro compartimento e o segundo compartimento.
[00012] Em uma realização, o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira é inicialmente separada de ambos o primeiro compartimento e o segundo compartimento.
[00013] Em uma realização, o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira está inicialmente no primeiro compartimento.
[00014] Em uma realização, o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira está inicialmente no primeiro compartimento.
[00015] Em uma realização, o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira está inicialmente no segundo compartimento.
[00016] Em uma realização, o monossacarídeo é glicose.
[00017] Em uma realização, o um ou mais espécies de microrganismo compreende um ou ambos de Geobacillus stearothermophilus e Bacillus atrophaeus.
[00018] Em uma realização, o aparelho é um leitor de glicose.
[00019] Em uma realização, os dois ou mais eletrodos são passíveis de ligação a umleitor de glicose através de uma ligação sem fio.
[00020] Em uma realização, o dissacarídeo é a maltose que é convertida em glicose por uma glicosidase produzida por ou presente nos esporos de germinação.
[00021] Em uma realização, os pelo menos dois eletrodos compreendem grafite, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, ouro, platina, paládio, prata, níquel ou cobre ou uma combinação ou liga de quaisquer dois ou mais dos mesmos.
[00022] Assim, a presente invenção fornece uma solução simples e elegante para o problema de determinar rapidamente a eficácia de um processo de esterilização e fornece um aparelho especialmente adaptado para esse uso.
[00023] A presente invenção pode ser útil com uma variedade de aparelhos de esterilização. Os desenhos anexos destinam-se a fornecer uma descrição não limitativa e exemplar de um aparelho de esterilização adequado e para demonstrar o processo descrito, com a finalidade de fornecer uma melhor compreensão da presente invenção, e não se destinam a ser limitativos de qualquer forma. Nos desenhos anexos, peças e características similares podem ter referências similares.- A Fig. 1 é uma vista transversal esquemática de uma primeira realização de um indicador de esterilização apropriado para uso com as realizações da presente invenção, em uma configuração pré-ativada.- A Fig. 2 é uma vista transversal esquemática do indicador de esterilização da Fig. 1 em uma configuração ativada.- A Fig. 3 é uma vista transversal esquemática de uma segunda realização de um indicador de esterilização apropriado para uso com as realizações do presente invenção, na sua configuração pré-ativada, semelhante ao da Fig. 1.- A Fig. 4 é uma representação esquemática de uma tira eletro-condutora contendo três eletrodos adequados para uso em uma realização da presente invenção.- A Fig. 5 é uma representação esquemática de uma incubadora/leitora de teste para uso em uma realização da presente invenção.- A Fig. 6 é uma vista transversal esquemática de uma realização de um indicador de esterilização durante a incubação com uma tira eletro-condutora semelhante à da Fig. 4 inserida no meio de crescimento, em uma incubadora/leitora de teste, de acordo com uma realização da presente invenção.- A Fig. 7 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização com um frasco em que os esporos estão no primeiro compartimento e o meio de incubação e a tira estão no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção.- A Fig. 8 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização com um frasco em que os esporos e a tira estão no primeiro compartimento, mas estão separados um do outro e o meio de incubação está no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção.- A Fig. 9 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização com um frasco em que os esporos estão no primeiro compartimento e o meio de incubação está no segundo compartimento, e a tira está separada do frasco, de acordo com uma realização da presente invenção.- A Fig. 10 é uma representação esquemática de um sistema de indicador de esterilização com um frasco em que os esporos estão na tira e a tira está no primeiro compartimento, e o meio de incubação está no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção. - A Fig. 11 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização com um frasco em que os esporos estão na tira e a tira está separada do frasco, nada está no primeiro compartimento e o meio de incubação está no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção.- A Fig. 12 é uma representação esquemática de um dispositivo para receber o sinal produzido pelo eletrodo reativo, convertendo-o em um sinal digital e transferindo-o para um microcontrolador.
[00024] Deve ser entendido que para simplicidade e clareza de ilustração, os elementos mostrados nas Figuras não foram necessariamente desenhados à escala. Por exemplo, as dimensões de alguns dos elementos podem estar exageradas em relação à outra para maior clareza. Além disso, quando considerado adequado, números de referência foram repetidos ao longo das figuras para indicar elementos correspondentes.
[00025] Além disso, deve-se notar que as etapas do processo e estruturas descritas a seguir podem não formar um fluxo de processo completo para a produção de um indicador de esterilização final utilizável. A presente invenção pode ser praticada em conjunto com aparelhos e técnicas de processamento utilizados atualmente no estado da técnica e somente as etapas de processo comumente praticadas estão incluídas conforme são necessárias para uma compreensão da presente invenção.
[00026] Os indicadores biológicos descritos a seguir dependem de um novo mecanismo para detectar a viabilidade dos esporos. A invenção descrita no presente utiliza um sinal eletrônico que é gerado com base no acúmulo de um monossacarídeo, por exemplo, glicose, que resulta da capacidade de os organismos viáveis quebrarem açúcares complexos. Métodos de detecção eletrônicos baseados em glicose têm estado prontamente disponíveis há anos para monitorar os níveis de glicose no sangue de pacientes diabéticos. Até agora, no entanto, não tem havido uso nem sugestão para adaptar estes mecanismos de detecção eletrônica como um meio para detectar organismos viáveis após processos de esterilização.
[00027] A maioria dos organismos têm capacidades inerentes para quebrar açúcares complexos (tais como a maltose) em açúcares simples (tais como glicose), a fim de que a molécula de açúcar simples mais útil possa ser utilizada como fonte de energia pelo organismo. As mesmas reações básicas utilizadas no monitoramento dos níveis de glicose no sangue podem ser adaptadas para detectar organismos viáveis, tais como esporos, que podem sobreviver a um ciclo de esterilização. Em uma realização da presente invenção, os mesmos monitores de glicose eletrônicos podem ser adaptados para uso no monitoramento da eficácia de processos de esterilização. Ao contrário do monitoramento da glicose sanguínea, no entanto, onde a glicose é predominante e é medida diretamente, na presente invenção, inicialmente nenhuma glicose está presente e a glicose é apenas obtida a partir de uma molécula de carboidrato complexo não detectável que deve primeiro ser atuado por um organismo viável antes de a glicose ser liberada e capaz de ser detectada. Se nenhum organismo viável sobreviver às condições de esterilização, não há qualquer glicose presente glicose para ser detectada. Assim, na presente invenção, o açúcar simples, geralmente glicose, nunca está presente a menos que e até que um microrganismo viável tenha sobrevivido às condições de esterilização sendo monitorado quebre um carboidrato complexo para formar o açúcar simples. Se e quando esta quebra ocorrer, pode ser detectada e medida de acordo com a presente invenção.
[00028] Conforme os esporos viáveis começam a germinar (uma atividade da vida fundamental), produzem e liberam enzimas que os permitem quebrar os açúcares complexos em açúcares simples mais prontamente utilizáveis, tal como a glicose. Ao formular um meio que seja rico em açúcares complexos, tais como dissacarídeos, oligossacarídeos e/ou polissacarídeos (selecionados com base no fato de que podem ser quebrados pelas enzimas ativas de microrganismos de teste viáveis selecionados para o indicador de esterilização), um aumento no monossacarídeo, por exemplo, a glicose, seria esperado após a exposição de esporos viáveis a esta concentração aumentada do monossacarídeo no meio de crescimento pode ser detectada eletronicamente por eletrodos adaptados para oxidar os monossacarídeos. Sob as condições de esterilização, os esporos são mortos e quaisquer enzimas que os esporos possam ter possuído antes da esterilização serão destruídas. Portanto, um aumento do monossacarídeo detectado após a exposição destes esporos ao meio da presente invenção significa que os organismos são viáveis (prova de vida). A conversão mediada por esporos de açúcares complexos em glicose representa a primeira etapa na detecção de organismos viáveis de acordo com o processo da presente invenção. A segundo etapa é a oxidação de qualquer monossacarídeo assim produzido pelos dois ou mais eletrodos, e a terceira etapa é a detecção de qualquer sinal elétrico que acompanha a oxidação.
[00029] Os organismos de maior interesse para o monitoramento de processos de esterilização são Geobacillus stearothermophilus e Bacilus atrophaeus. Esporos de germinação de ambos os organismos produzem enzimas, incluindo, por exemplo, alfa- glicosidase, que pode quebrar o açúcar maltose complexo em duas moléculas de glicose. Isto exemplifica apenas um meio de atingir a primeira etapa na presente invenção. Outras enzimas produzidas de esporos também podem ser utilizadas para quebrar outros açúcares complexos, por exemplo, dissacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos, para produzir monossacarídeos como a glicose.
[00030] O monossacarídeo, por exemplo, glicose, pode então ser oxidada pelos eletrodos para atingir a segunda etapa na presente invenção. O monossacarídeo pode ser detectado por biosensores de glicose não enzimáticos utilizando, por exemplo, um potencial fixo, método cronoamperométrico para a determinação eletroquímica direta de moléculas de monossacarídeo recém-formadas. Métodos potenciais de varredura adequados são conhecidos para os técnicos no assunto. Por exemplo, C. Fang, C. Yi, Y. Wang, Y. Cao e X. Liu, em Biosens. Bioeletron. 24 (2009) 3164 revelam um polímero impresso de forma molecular que pode ser usado. Outros métodos de detecção de biosensores de glicose não enzimáticos também são bem conhecidos no estado da técnica.
[00031] Assim, o processo é dependente da primeira etapa do processo, em que quaisquer esporos de germinação produzem uma enzima capaz de quebrar os carboidratos complexos, por exemplo, maltose ou lactose, em mais simples açúcares, por exemplo, glicose. A falha em alcançar a produção do produto final da primeira etapa (como será o caso se os esporos são mortos) impede a detecção do açúcar simples na segunda etapa. Assim, na ausência de qualquer produto da primeira reação (por exemplo, glicose convertida a partir de maltose), nenhum sinal resultará ou será observado. Neste caso, a ausência de qualquer sinal derivado da oxidação de um monossacarídeo, tal como a glicose, significaria que a esterilização monitorada foi bem sucedida.
[00032] Exemplos de dissacarídeos adequados são maltose, lactose, sacarose, trealose, celobiose e isomaltose.
[00033] Exemplos de oligossacarídeos adequados são fruto-oligossacarídeos, galacto- oligossacarídeos, manano-oligossacarídeos, goma arábica, goma guar e hidrolisato de guar.
[00034] Exemplos de polissacarídeos adequados são o amido, dextrina, glicogênio, celulose e pectina. Outros polissacarídeos possivelmente adequados incluem gelano, goma ghatti, karaya, tragacanto, semente de psyllium, xantana, guar, porca marfim de manana, konjac, alfarroba, tamarindo, tara, carragenanas, alginatos, fucoidanos, laminarina, ágar, pululano, welano e escleroglucano.
[00035] Outros dissacarídeos, oligossacarídeos e/ou polissacarídeos adequados podem ser conhecidos dos técnicos no assunto e podem também ser úteis com a presente invenção.
[00036] A presente invenção utiliza um sinal eletrônico que se baseia na detecção do aparecimento de açúcares simples que são gerados a partir da quebra de açúcares complexos quando na presença de esporos de germinação de organismos indicadores.
[00037] Métodos de detecção eletrônicos baseados em açúcares têm estado prontamente disponíveis há anos para monitorar os níveis de glicose no sangue de pacientes diabéticos. Até agora, no entanto, esses mecanismos de detecção eletrônicos não foram utilizados ou sugeridos para uso como um meio para detectar organismos viáveis após processos de esterilização. É possibilitado no presente pela percepção de que as condições podem ser configuradas de modo que, na ausência de esporos viáveis, esporos sobreviventes nenhum monossacarídeo, por exemplo, glicose, está presente no sistema e nenhum será detectado, enquanto que, ao mesmo tempo, proporcionam uma medição muito sensível de qualquer do monossacarídeo que se torna presente devido à presença de esporos de germinação. A presente invenção, assim, toma vantagem do fato de que a maioria dos organismos vivos tem capacidades inerentes para quebrar açúcares complexos (tais como a maltose) em açúcares simples (tal como glicose), a fim de que a molécula de glicose mais útil possa ser utilizada como fonte de energia pelo organismo. O monitoramento da glicose através de métodos de detecção eletrônicos à base de enzimas (por exemplo, biosensores a base de glicose-oxidase) tem estado prontamente disponível por muitos anos para monitorar os níveis de glicose no sangue dos pacientes diabéticos. Estes mesmos métodos básicos para monitoramento dos níveis de glicose no sangue podem ser alterados e adaptados para detectar organismos viáveis, tais como esporos, que possam sobreviver a um ciclo de esterilização. Conforme os esporos viáveis começam a germinar, eles produzem enzimas que os permitem quebrar açúcares complexos em açúcares simples mais facilmente utilizáveis, tais como a glicose. Ao formular um meio que é rico em açúcares complexos (selecionados com base no fato de que podem ser quebrados pelas enzimas ativas dos organismos selecionados viáveis), um aumento na glicose seria esperado mediante exposição de esporos viáveis a este meio e incubação. Sob as condições de esterilização, os esporos são mortos e qualquer uma das enzimas derivadas de esporos que possa possuir será destruída.
[00038] Portanto, um aumento em glicose detectada após a exposição destesesporos a este meio confirma que os organismos são viáveis. A conversão mediada por esporos de germinação de açúcares complexos em açúcares simples é detectada diretamente no processo eletrocatalítico da presente invenção. Isto fornece um método até agora indisponível para a detecção de indicador de esporos viáveis sem os requisitos para a enzima adicionada exogenamente ou quaisquer produtos químicos adicionados gerando sinal.
[00039] Assim, em uma realização, a presente invenção refere-se a um sistema indicador de esterilização, incluindo esporos de uma ou mais espécies de microrganismo; um frasco compreendendo um primeiro compartimento opcional e um segundo compartimento contendo um meio de crescimento que compreende um ou mais de um dissacarídeo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo capaz de conversão a um monossacarídeo por esporos de germinação de uma ou mais espécies de microrganismos, o frasco sendo adaptado para combinar conteúdos do segundo compartimento com os esporos para análise depois de o frasco ter sido exposto a um esterilizante; uma tira compreendendo dois ou mais eletrodos adaptados para oxidar o monossacarídeo e para transportar um sinal elétrico resultante da oxidação do monossacarídeo, em que os dois ou mais eletrodos estão adaptados para proporcionar o contato com os conteúdos combinados do segundo compartimento e os esporos durante e/ou após a incubação; e um aparelho ligado ou ligável a dois ou mais eletrodos e adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante de transferência de elétrons quando o monossacarídeo é oxidado pelos dois ou mais eletrodos, em que o sistema está livre do monossacarídeo antes da exposição ao esterilizante. Uma vez que o sistema está livre do monossacarídeo antes da exposição ao esterilizante, qualquer sinal elétrico que é detectado e medido indicaria a presença de esporos de germinação viáveis e isso então indicaria que o processo de esterilização falhou para esterilizar totalmente a carga, uma vez o indicador continha esporos sobreviventes.
[00040] Os eletrodos adequados para uso com a presente invenção incluem uma variedade de tipos de eletrodos, sensibilidades, faixas lineares, limites de detecção e de aptidão para a deposição por jato de tinta, serigrafia ou métodos semelhantes. A composição e a forma física destes eletrodos definem-os como eletrocatalisadores e incluem, mas não estão limitados a: camadas porosas ou intercaladas (por exemplo, compreendendo um ou mais de cobre, níquel, prata, platina e ouro), grafite, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, nanopartículas, (por exemplo, compreendendo, por exemplo, nanotubos de cobre e de carbono, platina dopada e filmes de metal), metais não modificados, tais como cobre, níquel, prata, platina e ouro, os eletrodos quimicamente modificados, ligas (por exemplo, níquel-titânio, níquel-cobre e níquel-cromo-ferro), formas eletroquimicamente depositadas (tais como, por exemplo, óxidos de cobre e ouro/cobre bimetálicos) e polímeros e compósitos (por exemplo, níquel-óxido polimérico e ouro/Nafion®). Faixas de sensibilidades registradas de 2 x 10-4 a mais de 200 mA por mM (miliamperes por milimol) e os faixas lineares são tão elevadas quanto 4 a 5 ordens de magnitude. Os limites de detecção podem ser alcançados tão baixo quanto 2 x 10-8 mM. Embora muitas destas propriedades físico-elétrico estejam muito abaixo do que é necessário para a determinação de glicose no sangue, elas são idealmente adequadas para o monitoramento de geração de glicose na presença de um número pequeno de indicadores de esporos sobreviventes.
[00041] Sensores de glicose não enzimáticos podem ser operados usando, por exemplo, métodos de varredura potenciais, tais como varredura linear e voltametria de onda cíclica e quadrada. O processo de eletrocatálise não enzimática ocorre quando o analito (por exemplo, glicose recém-emergente) adsorve a superfície do eletrodo formando uma ligação que alternadamente adsorve e dessorve catalisando a oxidação de glicose e a induzindo de transferência de elétrons. É este fluxo de energia que é proporcional à quantidade de glicose no sistema e, portanto, é o meio pelo qual a presença de esporos viáveis pode ser detectada.
[00042] As seguintes reações de exemplos descrevem funções da enzima que ocorre naturalmente em quaisquer esporos de germinação que sobreviva ao processo de esterilização e de oxidação pelos eletrodos na tira adicionada ao meio de incubação/recuperação de acordo com uma realização da presente invenção, na qual a maltose é o açúcar complexo (dissacarídeo) e a glicose é o açúcar simples ou monossacarídeo:
[00043] Quando um diferencial de voltagem é aplicado através de um eletrodo de trabalho e um eletrodo de referência, o eletrodo de trabalho se torna polarizado e uma corrente de oxidação resultante da transferência de elétrons é produzida. Esta corrente oxidante pode ser medida e é proporcional à quantidade de açúcar simples presente e é o sistema após a esterilização e a incubação, quando nenhuma estava presente antes da esterilização e a incubação.
[00044] A presente invenção utiliza organismos que são resistentes ao processo de esterilização a ser monitorado em conjunto com um meio especializado que foi formulado com açúcares complexos, por exemplo, dissacarídeos, oligossacarídeos e/ou polissacarídeos que podem ser reduzidos por esporos viáveis a monossacarídeos, tal como o açúcar simples glicose. Os aumentos nos níveis de açúcar simples no sistema se esporos viáveis estão presentes podem, assim, ser monitorados eletronicamente.
[00045] Em uma realização, os pelo menos dois eletrodos compreendem grafite, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, ouro, platina, paládio, prata, níquel ou cobre ou uma combinação ou liga de quaisquer dois ou mais destes. Outros materiais de eletrodo adequados, como conhecido no estado da técnica de monitoramento de glicose sanguínea, podem ser utilizados, tal como será entendido pelo técnico no assunto.
[00046] Tal como usado no presente, as frases “um sinal elétrico resultante da oxidação do monossacarídeo” e “um sinal elétrico resultante da oxidação da glicose” significam que o sinal elétrico é aquele sinal que resulta da oxidação, em comparação com um sinal de fundo, tal como pode ser fornecido pelo uso de um eletrodo de referência. Assim, embora possa haver algum limiar de sinal elétrico entre os eletrodos, mesmo na ausência da oxidação, é o sinal resultante da oxidação que é de interesse e é medido na presente invenção.
[00047] Referindo-se agora aos desenhos, as Figuras 1 e 2 mostram um sistema indicador de esterilização (10) útil com uma primeira realização exemplar da presente invenção. As descrições a seguir são fornecidas para informar geralmente como um sistema de esterilização exemplar funciona, e não se destinam a limitar a presente invenção. O sistema indicador (10) compreende uma tampa (20) que é montável sobre um recipiente (30). O recipiente (30) inclui uma extremidade inferior fechada (31) e uma extremidade superior aberta e define um espaço interior (34). A tampa (20) tem uma parede exterior (22), uma extremidade inferior aberta e uma extremidade superior fechada (23). A tampa também inclui uma parede interior (ou as paredes) (24) interior disposta no interior da parede exterior da tampa, formando uma parede separada, e que define uma câmara interior (26). A câmara interior (26) inclui um orifício (25) adjacente à extremidade inferior da(s) parede(s) (24). A câmara (26) contém um fluido (50) e a tampa (20) inclui uma barreira quebrável (40) disposta em torno do orifício (25) da câmara (26) para encapsular o fluido (50) dentro da câmara (26).
[00048] Na realização ilustrada nas Figuras 1 e 2, o sistema indicador é configurado para a tampa (20) para ser montado no recipiente (30) em uma relação de encaixe sob pressão. Em outras realizações, não representadas, o sistema indicador pode ser configurado para que a tampa seja montada no recipiente em uma relação de rosca na qual a tampa esteja engatada com o recipiente por meio de fios e o sistema seja ativado por rotação da cápsula em relação ao recipiente, ou seja, ao enroscar a tampa ainda mais sobre o recipiente. Como mostrado nas Figuras 1 e 2, o recipiente (30) inclui uma projeção anelar (32) que forma uma saliência ou lábio adjacente ou próximo da extremidade superior do recipiente. A tampa (20) inclui uma projeção anelar (29) formando uma saliência ou lábio adjacente ao fundo da tampa. A tampa (20) pode ser montada sobre o recipiente (30) por deslizamento da saliência (29) da tampa sobre a saliência (32) do recipiente. A saliência (32) do recipiente (30) engata a saliência (29) na tampa (20) para evitar que a tampa (20) e o recipiente (30) se desacoplem. A tampa (20) e o recipiente (30) podem ser dimensionados de tal forma que a saliência (32) exerce uma quantidade suficiente de pressão contra a tampa (20) para evitar que a tampa (20) deslize para baixo sem a aplicação de uma força descendente externa à tampa (20). Desta forma, a barreira quebrável (40) pode ser mantida afastada das extremidades (38) dos membros de punção (36), de modo que a barreira quebrável (40) não entra em contato com e/ou não é quebrada pelos membros de punção até tal momento conforme desejado para ativar o indicador.
[00049] Como mostrado nas Figuras 1 e 2, o recipiente (30) está adaptado para quebrar a barreira quebrável (40). Os recipientes incluem uma ou mais projeções (36) (que também podem ser referidas no presente como “membros de punção”) que tem uma extremidade (38) adaptada para romper ou perfurar a barreira quebrável (40) quando a tampa (20) com a barreira quebrável (40) é movida para baixo e a barreira (40) entra em contato com a extremidade (38) da projeção (36). O membro de punção (36) é mostrado como sendo integral com e se prolongando para cima a partir da parede inferior (37) do recipiente. Em uma outra realização, não mostrada, os membros de punção (36) podem se estender tanto a partir da parede lateral (35) quanto da partir da parede inferior (37).
[00050] Para avaliar um processo de esterilização, uma concentração calibrada de microrganismos é disposta dentro do interior (34) do recipiente (30). Os microrganismos podem estar dispostos diretamente sobre as paredes (35) do recipiente ou podem ser fornecidos em um membro de suporte (por exemplo, membro de suporte (70)) que está disposto dentro do recipiente (30) ou sobre eletrodos que podem estar variavelmente situados, conforme descrito abaixo com relação às Figuras 6 a 11. O indicador de esterilização é então montado pela montagem da tampa preenchida com meio de recuperação (20) no recipiente (30). A tampa (20) pode ser montada por encaixe sob pressão da tampa (20) sobre o recipiente (30), como descrito acima, ou, por exemplo, por uma montagem roscada. Com referência à Fig. 1, tampa preenchida com meio de recuperação (20) é montada sobre o recipiente (30) em uma primeira posição não ativada (ou aberta), de tal modo que a barreira quebrável (40) permanece intacta e não é perfurada pelos membros de punção (36). Desejavelmente, na primeira posição não ativada, a barreira quebrável (40) é posicionada afastada e não entra em contato com as extremidades (38) dos membros de punção (36).
[00051] Com o indicador (10) montado, tal como mostrado na Fig. 1, o indicador de esterilização pode então ser submetido a um processo de esterilização. A tampa (20) é mostrada como tendo orifícios (28) através das quais um vapor esterilizante pode entrar e fluir para dentro do sistema de indicador. O esterilizante entra na tampa através dos orifícios (28) (no espaço entre a parede exterior (22) e a parede interior (24)) e flui para dentro do recipiente (30) através de um espaço (60) definido entre a superfície exterior da parede interior (24) na tampa (20) e a superfície interior da parede (35) do recipiente (30). O vapor esterilizante flui para dentro do recipiente (30) e atua sobre os microrganismos do indicador biológico, nesta realização.
[00052] Após o processo de esterilização ser completado, o indicador da esterilização pode ser ativado movendo a tampa (20) para baixo na direção do recipiente (30) para uma segunda posição (ou fechada ou ativada), a qual está ilustrada na Fig. 2. A tampa (20) é movida para baixo através da aplicação de uma força ou uma pressão descendente suficiente na tampa (20). Quando a tampa (20) é movida para baixo, a barreira quebrável (40) é colocada em contato com a extremidade (38) do membro de punção (36) e, eventualmente, movida para uma posição tal que a extremidade (38) do membro de punção (36) punciona ou penetra a barreira quebrável (40). Quando a barreira quebrável (40) é perfurada, o orifício (25) da câmara (26) é exposta e o meio de recuperação líquido (50) escoa para o interior da região (34) do recipiente (30) e em contato com os microrganismos, como mostrado na Fig. 2.
[00053] Como mostrado nas Figuras 1 e 2, nesta realização, a superfície interior da tampa (20) inclui uma segunda projeção anelar (27) e a tampa pode ser movida para baixo para uma posição tal que a parte superior da projeção (27) engata no fundo da saliência (32) no recipiente (30), e a tampa (20) é mantida na segunda posição fechada/ativada. A segunda posição fechada/ativada pode servir para manter a tampa (20) em uma relação selada com o recipiente (30), que pode impedir que microrganismos adicionais entrem no sistema. O uso das projeções (27) é opcional, em outras realizações do sistema de esterilização. A patente US 5.770.393 ilustra outras configurações adequadas e esta patente é incorporada ao presente por referência para os seus ensinamentos em relação à configurações de tampa e recipiente. Em uma outra realização alternativa, a superfície interior da tampa (20) e a superfície exterior do recipiente (30) podem ser roscadas e a tampa (20) pode ser movida para dentro e mantida em uma posição fechada por rosqueamento da tampa (20) sobre o recipiente (30), em que a tampa (20) pode ser roscada, como mostrado, por exemplo, na patente US 8.173.388 B2, que pode ser consultada para detalhes adicionais sobre esta realização do frasco, e que é por incorporada ao presente por referência para os seus ensinamentos em relação à configuração frasco e tampa deste e as realizações anteriores. Todas essas configurações alternativas estão dentro do escopo da presente invenção.
[00054] Como descrito acima, a tampa (20) na realização ilustrada nas Figuras 1 e 2 é mostrada como tendo o orifício (28) para permitir a penetração do vapor esterilizante no indicador. Será apreciado, no entanto, que a tampa não necessita ser fornecida com tal característica. O número, o tamanho, a forma e/ou a localização do(s) orifício(s) podem ser selecionados conforme desejado, tendo em consideração o esterilizante particular com o qual o indicador de esterilização deve ser utilizado. Por exemplo, a localização, a forma e o tamanho dos orifícios na tampa e/ou no recipiente podem ser selecionados para fornecer um caminho tortuoso para a entrada e a saída do vapor de esterilização entre os microrganismos e os ambientes circundantes. O caminho tortuoso pode também servir para inibir ou evitar a contaminação de agentes externos e para assegurar que uma quantidade adequada de esterilizante está disponível. Ao incluir o caminho tortuoso, é mais provável que toda a carga seja exposta ao esterilizante matando, assim, quaisquer microrganismos existentes antes do organismo de teste no indicador de esterilização ser morto.
[00055] Os orifícios podem ser fornecidos no recipiente em adição ou como uma alternativa ao fornecimento de orifícios na tampa. Se os orifícios não são fornecidos na tampa, a(s) parede(s) interior(es) não precisa(m) estar localizada(s) para fornecer um espaço entre a parede interior da tampa e a superfície interior do recipiente. Adicionalmente, se os orifícios forem fornecidos no recipiente, devem estar localizados de tal modo que o meio de crescimento não vaze ou derrame para fora através de tais orifícios quando o indicador for ativado e a barreira for quebrada.
[00056] A Figura 3 representa um indicador (10), em que um orifício (80) é formado na parede lateral (35) do recipiente (30) em uma posição adequada, além dos orifícios (28) na tampa (20). O orifício mostrado na Figura 3 está na parede lateral (35) do recipiente (30) perto do topo do recipiente (30), na vizinhança da extremidade (38) do membro de punção (36), para evitar vazamento ou derramamento após ativação. Como pode ser visto a partir da Figura 3, após a ativação, o orifício (80) nesta localização será coberto pela tampa (20) na posição ativada. Note-se que o indicador (10) mostrado na Fig. 3 inclui o orifício (28) na tampa (20), mas isso não é necessário. Em uma realização (não mostrada), o recipiente (30) inclui o orifício (80) e é usado com uma tampa semelhante à tampa (20), mas que não inclui um orifício tal como o orifício (28). Deste modo, um orifício pode ser fornecido quer sob a tampa ou no recipiente, ou em ambos a tampa e o recipiente.
[00057] Depois que o processo de esterilização foi concluído, a tampa (20) é pressionada ou torcida para baixo de tal forma que a extremidade (38) do membro de punção (36) penetre e rompa a barreira quebrável (40), liberando o meio de crescimento no espaço (26) para se misturar com e incubar com qualquer um dos microrganismos de indicadores biológicos que possam ter sobrevivido ao processo de esterilização. O meio de recuperação (50) pode compreender um meio aquoso ou uma solução aquosa que fornece germinação, metabolismo e subsequente crescimento de organismos, conforme necessário. O meio aquoso ou solução aquosa pode ser tamponado(a).
[00058] O indicador de esterilização (10) é então incubado durante um período de tempo suficiente para permitir que a viabilidade microrganismo seja determinada. Durante a incubação, quaisquer microrganismos viáveis começarão a metabolizar e germinar, e este metabolismo e germinação inclui atividade pelas enzimas para quebrar o dissacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo para produzir um monossacarídeo, por exemplo, para quebrar a maltose para produzir glicose. De acordo com a presente invenção, o “subproduto” de glicose está então disponível para ser oxidado pelos eletrodos que são fornecidos, cuja oxidação é detectada por meio de sinal elétrico produzido pelos dois ou mais eletrodos descritos no presente.
[00059] A Figura 4 é uma representação esquemática de uma tira eletro-condutora (400) que contém três eletrodos (402a), (402b) e (402c) adequados para serem utilizados em uma realização da presente invenção. A tira (400) inclui ainda eletrônicos (404) adaptados para proporcionar comunicação elétrica entre os eletrodos (402a), (402b) e (402c), e um aparelho ligado ou ligável a eletrodos que é adaptado para detectar e medir os sinais elétricos resultantes da transferência de elétrons quando qualquer glicose presente é oxidada pelos eletrodos. Como revelado e descrito, os eletrodos (402a), (402b) e (402c) são capazes de atuar sobre um monossacarídeo, tal como glicose, para oxidar o monossacarídeo e produzir uma transferência de elétrons detectável. Como descrito, os pelo menos dois eletrodos podem incluir dois eletrodos que participam da oxidação, enquanto o terceiro eletrodo pode funcionar como um eletrodo de referência. Outras realizações, não mostradas, podem incluir um número diferente de eletrodos. Por exemplo, o eletrodo de referência pode ser omitido ou pode ser adicionado um eletrodo adicional ou par de eletrodos. Os eletrônicos (404) podem incluir qualquer conexão elétrica adequada entre os eletrodos e um aparelho externo que detecta e mede quaisquer sinais elétricos gerados. Tais ligações podem incluir, mas não estão limitadas a, cabeamento, contatos elétricos físicos, por exemplo, acionados por molas ou tomadas, Ethernet, Bluetooth, 802.11, redes locais sem fios (WLAN), WiFi, WiMax e similares ou qualquer outro tipo de comunicação com fios ou sem fios conhecida no estado da técnica.
[00060] A Figura 5 é uma representação esquemática de uma incubadora/leitora de teste para uso em uma realização da presente invenção. A incubadora/leitora de teste pode incluir conexões elétricas adequadas para se conectar aos três eletrodos descritos em relação à Fig. 4 através de uma das ligações descritas. A incubadora/leitora de teste pode incluir controles de aquecimento e atmosféricos para proporcionar uma temperatura adequada e atmosfera para incubação dos conteúdos combinados do primeiro compartimento e do segundo compartimento do indicador de esterilização. A incubadora/leitora de teste pode ainda incluir um circuito eletrônico adaptado para detectar e medir qualquer sinal elétrico gerado quando a enzima fornecida nos eletrodos converte um monossacarídeo, por exemplo, glicose, a produtos de reação incluindo elétrons livres, de acordo com a presente invenção. A Fig. 6 fornece um exemplo de um arranjo adequado para a incubadora/leitora de teste representada na Fig. 5.
[00061] A Figura 6 é uma vista transversal altamente esquemática de um indicador de esterilização exemplar durante a incubação em uma incubadora/leitora de teste (600), com a tira contendo os eletrodos no lugar. A incubadora/leitora de teste representada na Fig. 6 inclui um recipiente inferior (602) e uma tampa ou capa (604). Como mostrado na Fig. 6, disposta na incubadora/leitora de teste (600) é um frasco de indicador de esterilização (606), em que o meio de recuperação/incubação (608) foi combinado com esporos de um organismo de teste selecionado, por exemplo, Geobacillus stearothermophilus, após um processo de esterilização que está sendo submetido para determinação da eficácia de acordo com uma realização da presente invenção. A incubadora/leitora de teste (600) está equipada com uma tira eletro-condutora (610), semelhante à da Fig. 4, que foi inserida nos conteúdos combinados dos primeiro e segundo compartimentos no recipiente (602), na incubadora/leitora de teste (600) de acordo com uma realização da presente invenção. A incubadora/leitora de teste (600) inclui ainda ligações elétricas de cabeamento (612) entre os três eletrodos na tira (610) e o circuito elétrico usado para detectar qualquer atividade elétrica gerada pela conversão enzimática de açúcares simples a seus produtos de reação. Conforme descrito em relação à Fig. 4, a incubadora/leitora de teste (600) pode se comunicar com a tira (610) através de qualquer método adequado.
[00062] A Figura 6 é representativa de uma realização de um frasco (606) em que há apenas um compartimento, por exemplo, em que o primeiro compartimento opcional está ausente, os esporos estão dispostos na tira (610) e a tira (610) inicialmente está separada do segundo compartimento. Como mostrado na Fig. 6, a tira separada inicialmente (610) foi colocada no meio de crescimento (608) que contém um ou mais de um dissacarídeo, um oligossacarídeo e um polissacarídeo capaz de conversão a um monossacarídeo por quaisquer esporos de germinação de um ou mais microrganismo, no caso de qualquer dos microrganismos sobreviverem ao processo de esterilização. Na realização em que o primeiro compartimento está ausente, o meio de crescimento (608) não é necessariamente submetido ao processo de esterilização: nesta realização, é necessário apenas que a tira (610), com os esporos dispostos nela, seja submetida às condições de esterilização. Naturalmente, etapas apropriadas devem ser tomadas para garantir que o meio de crescimento esteja livre de quaisquer microrganismos capazes de produzir açúcares simples a partir de açúcares mais complexos e, por conseguinte, também pode ser esterilizado ou submetido às mesmas condições de esterilização como a tira.
[00063] A Figura 7 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização incluindo um frasco de (700) em que os esporos estão no primeiro compartimento e o meio de incubação e a tira estão no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção. Como mostrado na Fig. 7, o frasco (700) inclui uma tampa (702) e um recipiente (704). O recipiente (704) forma um primeiro compartimento e a tampa (702) inclui um segundo compartimento contendo um meio de incubação ou de recuperação (706). Na realização da Fig. 7, esporos de um microrganismo adequado estão localizados dentro do primeiro compartimento e, nesta realização, os esporos são imobilizados sobre um suporte (708). O recipiente (704) inclui um membro de punção (710), o qual é colocado para perfurar uma barreira quebrável (712), quando o frasco (700) deve ser ativado por incubação após ter sido submetido a um processo de esterilização. O sistema indicador de esterilização inclui ainda uma fita eletro-condutora (714) que possui dois ou mais eletrodos, nesta realização, três eletrodos, que está inicialmente localizada no segundo compartimento, ou seja, na tampa (702). A tira (714) é substancialmente semelhante à tira descrita acima em relação à Fig. 4, mas não se limita a isso. Conforme descrito em relação à Fig. 4, a tira (714) inclui eletrônicos adequados para proporcionar uma ligação entre os eletrodos e um aparelho adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante da transferência de elétrons quando qualquer açúcar simples presente, por exemplo, glicose, é oxidado pelos eletrodos. A Fig. 7 é um exemplo de uma realização em que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira está inicialmente no segundo compartimento.
[00064] A Figura 8 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização com um frasco (800) em que os esporos e a tira estão no primeiro compartimento, mas estão separados uns dos outros, e o meio de incubação está no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente Invenção. Como mostrado na Fig. 8, o frasco (800) inclui uma tampa (802) e um recipiente (804). O recipiente (804) forma um primeiro compartimento e a tampa (802) inclui um segundo compartimento contendo um meio de incubação ou de recuperação (806). Os esporos de um microrganismo adequado estão localizados dentro do primeiro compartimento, em uma realização, os esporos estão imobilizados em um transportador (808). O recipiente (802) inclui um membro de punção (810), o qual é colocado para perfurar uma barreira quebrável (812), quando o frasco (800) deve ser ativado para incubação depois de ter sido submetido a um processo de esterilização. O sistema indicador de esterilização inclui ainda uma tira (814) que tem dois ou mais eletrodos, nesta realização, três eletrodos, que está localizada no primeiro compartimento. A tira (814) é substancialmente semelhante à tira acima descrita em relação à Fig. 4, mas não se limita a isso. Conforme descrito em relação à Fig. 4, a tira (814) inclui eletrônicos adequados para proporcionar uma ligação entre os eletrodos e um aparelho adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante da transferência de elétrons quando qualquer simples açúcar presente, por exemplo, glicose, é oxidado pelos eletrodos. A Figura 8 é um exemplo de uma realização em que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira é inicialmente no primeiro compartimento.
[00065] A Figura 9 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização que tem um frasco (900) em que os esporos estão no primeiro compartimento e o meio de incubação está no segundo compartimento e a tira está separada do frasco, de acordo com uma realização da presente invenção. Como mostrado na Fig. 9, o frasco (900) inclui uma tampa (902) e um recipiente (904). O recipiente (904) forma um primeiro compartimento e a tampa (902) inclui um segundo compartimento contendo um meio de incubação ou de recuperação (906). Os esporos de um microrganismo adequado estão localizados dentro do primeiro compartimento, em uma realização, os esporos estão imobilizados em um transportador (908). O recipiente (902) inclui um membro de punção (910), o qual é colocado para perfurar uma barreira quebrável (912), quando frasco (900) deve ser ativado para incubação depois de ter sido submetido a um processo de esterilização. O sistema indicador de esterilização inclui ainda uma tira (914) que tem dois ou mais eletrodos, nesta realização, três eletrodos, que está localizada separada do frasco (900). A tira (914) é substancialmente semelhante à tira acima descrita em relação à Fig. 4, mas não se limita a isso. Conforme descrito em relação à Fig. 4, a tira (914) inclui eletrônicos adequados para proporcionar uma ligação entre os eletrodos e um aparelho adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante da transferência de elétrons quando qualquer açúcar simples presente, por exemplo, glicose, é oxidado pelos eletrodos. A Figura 9 é um exemplo de uma realização em que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira está inicialmente separada tanto do primeiro compartimento quanto do segundo compartimento.
[00066] A Figura 10 é uma representação esquemática de um sistema de indicadores de esterilização possuindo um frasco (1000) em que os esporos estão na tira e a tira está no primeiro compartimento e o meio de incubação está no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção. Como mostrado na Fig. 10, o frasco (1000) inclui uma tampa (1002) e um recipiente (1004). O recipiente (1004) forma um primeiro compartimento e a tampa (1002) inclui um segundo compartimento contendo um meio de recuperação e de incubação (1006). Os esporos de um microrganismo adequado estão localizados dentro do primeiro compartimento sobre uma tira (1014), nesta realização. O recipiente (1002) inclui um membro de punção (1010) que é colocado para perfurar uma barreira quebrável (1012), quando o frasco (1000) deve ser ativado para incubação após ter sido submetido a um processo de esterilização. O sistema indicador de esterilização inclui ainda a tira (1014), que tem dois ou mais eletrodos, nesta realização, três eletrodos, que está localizada no primeiro compartimento. A tira (1014) é substancialmente semelhante à tira acima descrita em relação à Fig. 4, mas não está limitado a isso, exceto que, nesta realização, a tira (1014) também tem os esporos. Tal como descrito com respeito da Fig. 4, a tira (1014) inclui eletrônicos adequados para proporcionar uma ligação entre os eletrodos e um aparelho adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante da transferência de elétrons quando qualquer açúcar simples presente, por exemplo, a glicose, é oxidado pelos eletrodos. A Fig. 10 é um exemplo de uma realização na qual o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira está inicialmente no primeiro compartimento.
[00067] A Figura 11 é uma representação esquemática de um sistema indicador de esterilização possuindo um frasco (1100) em que os esporos estão na tira e a tira é separada do frasco, nada está no primeiro compartimento e o meio de incubação está no segundo compartimento, de acordo com uma realização da presente invenção. Como mostrado na Fig. 11, o frasco (1100) inclui uma tampa (102) e um recipiente (1104). O recipiente (1104) forma um primeiro compartimento e a tampa (102) inclui um segundo compartimento contendo um meio de incubação ou de recuperação (1106). O recipiente (1102) inclui um membro de punção (1110), que é colocado para perfurar uma barreira quebrável (1112), quando o frasco (1100) deve ser ativado para incubação após ter sido submetido a um processo de esterilização. O sistema indicador de esterilização inclui ainda uma tira de (1114) que tem dois ou mais eletrodos, nesta realização, três eletrodos, que está localizada separada do frasco (1100). Os esporos de um microrganismo adequado estão localizados sobre a tira (1114), nesta realização. A tira (1114) é substancialmente semelhante à tira acima descrita em relação à Fig. 4, mas não está limitado isso, exceto que, nesta realização, a tira (1114) também contém os esporos. Conforme descrito em relação à Fig. 4, a tira (1114) inclui eletrônicos adequados para proporcionar uma ligação entre os eletrodos e um aparelho adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante da transferência de elétrons quando qualquer açúcar simples presente, por exemplo, glicose, é oxidado pelos eletrodos. A Figura 11 é um exemplo de uma realização na qual o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira está inicialmente separada, tanto do primeiro compartimento quanto do segundo compartimento.
[00068] A Fig. 12 é uma representação esquemática de um dispositivo para receber o sinal produzido pelo eletrodo reativo, convertendo-o em um sinal digital e transferindo-o para um microcontrolador. Como será entendido pelo técnico no assunto, o sinal diferencial obtido a partir do eletrodo reativo na tira de teste, como modificado e medido pelo amplificador de transimpedância, é alimentado para um conversor analógico digital (CAD) e, em seguida, para a unidade microcontroladora/microprocessadora (UMC/UMP) que, por sua vez, emite os resultados para um visor através da qual o usuário pode determinar o resultado do teste e se a esterilização foi bem sucedida.
[00069] Leitores de glicose não enzimáticos adequados podem ser selecionados pelos técnicos no assunto para uso com a presente invenção. Tais leitores que estão comercialmente disponíveis incluem o Accu-Chek® da Roche Diagnostics, o FreeStyleLite® da Abbott Diabetes Care e o OneTouch Ultra® da Johnson & Johnson. Um sistema de teste de desenvolvimento do laboratório é a estação de trabalho eletroquímica épsilon CE (Bioanalytical Systems, Inc.). Vide também, a Enciclopédia Eletroquímica, “Tiras de Teste de Glicose Sanguínea Eletroquímica para Pessoas com Diabetes”, Bem Feldman, de outubro de 2009, para informação adicional sobre leitores de glicose sanguínea.
[00070] Assim, em uma realização, a presente invenção fornece ainda um método para a determinação da eficácia de um processo de esterilização. De acordo com esta realização, o método inclui as seguintes etapas:- expor o sistema indicador de esterilização de qualquer uma das reivindicações precedentes a um esterilizante em um processo de esterilização;- combinar o conteúdo do primeiro compartimento e do segundo compartimento e incubar os conteúdos combinados;- colocar a tira em contato com os conteúdos combinados antes e/ou durante a incubação e a oxidação de qualquer monossacarídeo com dois ou mais eletrodos;- conectar o aparelho aos dois ou mais eletrodos;- com o aparelho ligado aos dois ou mais eletrodos, detectar e medir qualquer sinal elétrico produzido pelos dois ou mais eletrodos do oxidante; e- determinar a eficácia do processo de esterilização com base na presença ou ausência do sinal elétrico.
[00071] O método acima pode ser realizado de acordo com os dados fornecidos na descrição escrita acima e em conjunto com o conhecimento dos técnicos no assunto. Embora uma pequena quantidade de testes e de experimentação possa ser necessária para otimizar a produção de um sistema indicador de esterilização adequado e a condução de um processo de esterilização adequado empregando o sistema indicador de esterilização descrito, qualquer teste ou experimentação será apenas mínimo.
[00072] Na presente invenção, a detecção de organismos viáveis é realizada através do monitoramento de um sinal eletrônico resultante do surgimento de um açúcar simples em uma população de esporos de germinação dos organismos. Somente esporos viáveis que sobreviveram às condições de esterilização podem expressar essa atividade e, assim, a aparência de um açúcar simples é um indicador positivo de esporos viáveis (uma condição REPROVAÇÃO quando da avaliação do desempenho esterilizante). Por outro lado, a ausência do açúcar simples sob estas condições de teste é uma indicação de que nenhum esporo no indicador biológico permanece viável (uma condição de APROVAÇÃO para o desempenho eficaz do esterilizador).
[00073] Em uma realização, a presente invenção utiliza ou se adapta para uso de um medidor de glicose, tal como o usado para a determinação não enzimática de concentrações de glicose sanguínea em pacientes com diabetes. Há, no entanto, uma diferença crucial entre a presente invenção e o uso conhecido de tais medidores de glicose e que se relaciona com a concentração do monossacarídeo, por exemplo, glicose, que é determinada. As concentrações de glicose no sangue variam geralmente de cerca de 2 mM (milimolar) a cerca de 30 mM. As concentrações do monossacarídeo, por exemplo, glicose, determinadas de acordo com a presente invenção são muito mais baixas, aproximando-se dos limites da instrumentação existente. Como é sabido, o limite de detecção quando se usa, por exemplo, eletrodos de nanofio de CuO modificados e um método cronoamperométrico potencial fixo é de cerca de 0,0005 mM ou 4 registros mais baixos do que as concentrações de glicose sanguínea padrão. Como é sabido, o limite de detecção quando se utiliza polímeros molecularmente impressos enxertados em eletrodos de ouro (“MI P Au”) é de cerca de 2 x 106 mM ou 6 registos mais baixos do que as concentrações de glicose sanguínea padrão, quando usando métodos de varredura potenciais de monitoramento eletrônico. Os limites acima de detecção são divulgados em Electrochemical Non-Enzymatic Glucose Sensors: A Perspective and an Evaluation, Kathryn E Toghill e Richard Compton; Int. J. Eletrochem Sci., 5 (2010) 1246-1301. Embora existam exemplos de maiores sensibilidades, o descrito acima demonstra claramente o afastamento significativo da presente invenção a partir de métodos comerciais existentes.
[00074] De acordo com realizações da presente invenção, os limites de detecção de concentrações do monossacarídeo, por exemplo, glicose, que indicariam a presença de esporos de germinação viáveis que sobreviveram ao processo de esterilização, são muito aprimorados em relação a indicadores de esterilização do estado da técnica e com relação às determinações de glicose sanguínea. Os limites de detecção aprimorados fornecem determinações muito mais rápidas de eficácia do processo de esterilização a ser testado. Isto porque, no caso de o processo de esterilização ter falhado e esporos sobreviverem, conforme os esporos começam a germinar, as concentrações iniciais do monossacarídeo serão muito baixas. Ao permitir a detecção de concentrações muito baixas do monossacarídeo, com a presente invenção, o tempo de atraso antes de qualquer monossacarídeo ser detectado pode ser reduzido a minutos ou mesmo segundos, em comparação com as horas a dias exigidos pelos indicadores de esterilização convencionais. Isto representa um aprimoramento importante e significativo em relação aos indicadores de esterilização convencionais.
[00075] Um fator que pode eventualmente limitar o nível mais baixo que pode ser detectado pela presente invenção é a pureza do dissacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo utilizado no meio de crescimento. Se estes sacarídeos superiores forem impuros e contiverem quantidades significativas do monossacarídeo associadas, pode ser necessário purificar ainda mais o dissacarídeo. Em alternativa ou, além disso, amostras em branco podem ser analisadas para determinar uma linha de base, utilizando o mesmo meio de crescimento, mas sem quaisquer esporos, mortos ou vivos. Em tal caso, o sinal elétrico resultante de transferência de elétrons quando o monossacarídeo é oxidado pelos eletrodos seria aquele sinal que excede qualquer que seja o sinal de linha de base obtido utilizando as amostras em branco.
[00076] A presente invenção, em uma realização, refere-se ao uso de esporos de Geobacilus stearothermophilos, que são o organismo indicador aceito para a avaliação de ciclos esterilizadores utilizando vapor e peróxido de hidrogénio vaporoso. A presente invenção, em outra realização, refere-se ao uso de esporos de Bacilus atrophaeus, que são o organismo indicador aceito para esterilizadores utilizando óxido de etileno e calor seco como esterilizante. A presente invenção é única no uso de um oligossacarídeo adicionado (por exemplo, maltose) conforme o substrato para glicosidase associada de esporo de ocorrência natural (por exemplo, alfa-glicosidase) para gerar níveis crescentes de açúcares simples, por exemplo, glicose, conforme o analito cuja possível surgimento a partir de esporos viáveis pós-esterilização é monitorado para avaliar a eficácia do processo de esterilização relevante. A ausência de níveis emergentes do açúcar simples é a indicação de que os esporos do indicador de esterilização não sejam mais viáveis e, assim, são evidencia de um processo de esterilização bem sucedido. Por outro lado, a presença de níveis emergentes do açúcar simples, que é o subproduto de esporos de germinação viáveis, é a indicação da falha do esterilizador para produzir as condições necessárias para a esterilização bem sucedida. Este mesmo processo pode ser usado com outras enzimas associadas a esporos (por exemplo, beta-galactosidase) para converter outro di-, oligo- ou polissacarídeos (por exemplo, lactose) para gerar o analito de açúcar simples, por exemplo, glicose. Uma vez que a presença de enzimas ativas associadas a esporos ou a sua produção após o evento de esterilização sob avaliação ocorre muito cedo no processo de germinação, os organismos indicadores ainda possuem todas as propriedades morfológicas e de membrana de esporos, embora no ponto em que o açúcar simples é detectado, os esporos estão apenas começando a germinar. Em uma realização preferida, o carboidrato suplementado é maltose, que tem benefícios particulares. Como primeiro benefício, o dissacarídeo não interage com o eletrodo para produzir um sinal sem interação esporos de germinação viáveis que expressam a enzima ativa, por exemplo, glicosidase. Como um outro benefício, a maltose fornece duas moléculas de glicose em vez de uma, que é o caso para muitos outros açúcares complexos potenciais como a lactose. Podem-se usar outras enzimas de ocorrência natural a partir da beta-galactosidase similar a esporo e uma lactose similar a substrato correspondente (produz uma molécula de glicose e uma molécula de galactose) para atingir o mesmo fim - aumentando a presença de glicose na solução de teste. Em ambos os casos, o produto da primeira etapa (por exemplo, glicose) interagiriam com o biosensor de eletrodo do exemplo citado para produzir o sinal detectável da presente invenção. Uma terceira vantagem é a capacidade de usar um biosensor de glicose retirada manual para a detecção e a avaliação de resultados que conduzem a uma designação de APROVAÇÃO OU REPROVAÇÃO no que diz respeito aos esporos indicadores viáveis restantes. O uso de um biosensor deste tipo permite tempos de leitura de segundos a minutos, o que também é novo para o campo de monitoramento do ciclo de esterilização.
[00077] Uma vantagem importante da presente invenção é o tempo mais rápido de leitura para indicadores biológicos. Além disso, uma vez que o sinal é medido eletronicamente, há a oportunidade para condicionamento de sinal e amplificação. Além disso, com um algoritmo simples correlacionando a relação direta de oxidação corrente a quantidade de açúcar simples, nenhuma interpretação de APROVAÇÃO e REPROVAÇÃO será exigida pelo usuário. Outra vantagem em relação a tecnologia similar é que é independente de quaisquer enzimas adicionadas que adicionam custo, reduzem a vida útil e sujeitam o desempenho do sensor biológico a limitação de taxa de difusão e influências de cinéticas enzimáticas.
[00078] A aplicação de detecção de glicose não enzimática em testes de sangue (para o qual existe uma grande quantidade de dados disponíveis) é influenciada pelos inibidores encontrados no sangue e no soro e deve ser utilizada em condições fisiológicas incluindo pH neutro. Uma vez que estes inibidores não estão presentes em preparações de esporos utilizados no sistema indicador de esterilização da presente invenção e uma vez que faixas muito mais amplas de temperatura, pH, força iônica e outras condições podem ser usadas com esporos, tais condições podem ser ajustadas para otimizar as necessidades eletrocatalíticas do sistema de eletrodos sem levar em conta as limitações da manutenção de condições fisiológicas. Por exemplo, sensibilidade muito maior pode ser alcançada a valores de pH que não seria possíveis em outros sistemas indicadores biológicos à base de enzima.
[00079] Embora os princípios da presente invenção tenham sido explicados em relação a certas realizações particulares, essas realizações são fornecidas para fins de ilustração. Deve ser entendido que várias modificações dos mesmos se tornarão evidentes para os técnicos no assunto após a leitura do relatório descritivo. Portanto, deve ser entendido que a presente invenção revelada no presente se destina a cobrir tais modificações que se enquadrem no escopo das reivindicações anexas. O escopo da presente invenção é limitado apenas pelo escopo das reivindicações.
Claims (14)
1. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, caracterizado pelo fato de que compreende:- esporos de uma ou mais espécies de microrganismos;- um frasco que compreende um primeiro compartimento opcional e um segundo compartimento contendo um meio de crescimento compreendendo um ou mais de um dissacarídeo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo capaz de conversão a um monossacarídeo por esporos de germinação de uma ou mais espécies de microrganismos, o frasco sendo adaptado para combinar conteúdos do segundo compartimento com os esporos para análise depois de o frasco ter sido exposto a um esterilizante;- uma tira que compreende dois ou mais eletrodos adaptados para oxidar o monossacarídeo e para transportar um sinal elétrico resultante da oxidação do monossacarídeo, em que os dois ou mais eletrodos são adaptados para proporcionar o contato com os conteúdos combinados do segundo compartimento e os esporos durante e/ou após a incubação; e- um aparelho ligado ou ligável a dois ou mais eletrodos e adaptado para detectar e medir o sinal elétrico resultante da transferência de elétrons quando o monossacarídeo é oxidado pelos dois ou mais eletrodos,em que o sistema é livre do monossacarídeo antes da exposição ao esterilizante.
2. SISTEMA I NDICADOR DE ESTERI LIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro compartimento está ausente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira está inicialmente separada do segundo compartimento.
3. SISTEMA I NDICADOR DE ESTERI LIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira está inicialmente separada tanto do primeiro compartimento quanto do segundo compartimento.
4. SISTEMA I NDICADOR DE ESTERI LIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira está inicialmente separada, tanto do primeiro compartimento quanto do segundo compartimento.
5. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira está inicialmente no primeiro compartimento.
6. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos sobre a tira e a tira está inicialmente no primeiro compartimento.
7. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro compartimento está presente, os esporos estão dispostos no primeiro compartimento e a tira é inicialmente no segundo compartimento.
8. SISTEMA I NDICADOR DE ESTERI LIZAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caract erizado pelo fato de que o monossacarídeo é glicose.
9. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais espécies de microrganismos compreendem um ou ambos de Geobacillus stearothermophilus e Bacilus atrophaeus.
10. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o aparelho é um leitor de glicose.
11. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caract erizado pelo fato de que os dois ou mais eletrodos são ligáveis a um leitor de glicose através de uma ligação sem fios.
12. SISTEMA I NDICADOR DE ESTERI LIZAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caract erizado pelo fato de que o dissacarídeo é maltose, que é convertido em glicose por uma glicosidase produzida por ou presente nos esporos de germinação.
13. SISTEMA INDICADOR DE ESTERILIZAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois eletrodos compreendem grafite, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, ouro, platina, paládio, prata, níquel ou cobre ou uma liga ou combinação de quaisquer dois ou mais destes.
14. MÉTODO DE DETERMI NAÇÃO DA EFICÁCIA DE UM PROCESSO DE ESTERI LIZAÇÃO, caracterizado pelo fato de que compreende:- expor o sistema indicador de esterilização conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 a um esterilizante em um processo de esterilização;- combinar os conteúdos do primeiro compartimento e do segundo compartimento e incubar os conteúdos combinados;- colocar a tira em contato com os conteúdos combinados antes e/ou durante a incubação e a oxidação de qualquer monossacarídeo com dois ou mais eletrodos;- conectar o aparelho aos dois ou mais eletrodos;- com o aparelho ligado aos dois ou mais eletrodos, detectar e medir qualquer sinal elétrico produzido pelos dois ou mais eletrodos do oxidante; e- determinar a eficácia do processo de esterilização com base na presença ou ausência do sinal elétrico.
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