BR102018016454A2

BR102018016454A2 - PROCESS OF OBTAINING BETA-GLUCANE EXOPOLISACARIDE EXTRACTED FROM THE MICROBIAL KEFIR CONSORTIUM

Info

Publication number: BR102018016454A2
Application number: BR102018016454-6A
Authority: BR
Inventors: Ricardo Yara; Cláudia Sampaio De Andrade Lima; Natália Almeida Onofre Cordeiro; Rafael Jorge Santos Aracati Padilha; Regina Silva Picasso; Ederson Akio Kido; Silene Carneiro Do Nascimento; Carlos André Dos Santos Silva; Yago Emídio De Oliveira Silva; Jeymesson Raphael Cardoso Vieira; Cristiane Moutinho Lagos De Melo; Aline Lima Do Nascimento; Paulo Antônio Galindo Soares; Paulo Antônio De Souza Mourão
Original assignee: Instituto Tecnológico Das Cadeias Biossustentáveis
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2020-03-10

Abstract

a presente invenção revela um processo para a extração de exopolissacarídeo tipo beta-glucana (ß-glucana) a partir de grãos do consórcio microbiano, originário de kefir cultivado em solução de açúcar mascavo e similares. a finalidade deste processo está na extração com rendimentos acima de 5% deste polissacarídeo.the present invention discloses a process for the extraction of exopolysaccharide type beta-glucan (ß-glucan) from grains of the microbial consortium, originating from kefir grown in brown sugar solution and the like. the purpose of this process is in the extraction with yields above 5% of this polysaccharide.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEO TIPO BETA-GLUCANA EXTRAÍDO DO CONSÓRCIO MICROBIANO DO KEFIRPROCESS OF OBTAINING BETA-GLUCANE EXOPOLISACARIDE EXTRACTED FROM THE MICROBIAL KEFIR CONSORTIUM

RELATÓRIO DESCRITIVODESCRIPTIVE REPORT

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

[001] A presente invenção revela um processo para a extração de exopolissacarídeo tipobeta-glucana (β-glucana) a partir de grãos do consórcio microbiano, originário dekefir cultivado em solução de açúcar mascavo e similares. A finalidade deste processo está naextração com rendimentos acima de 5% deste polissacarídeo.[001] The present invention discloses a process for the extraction of exopolysaccharide tipobeta-glucan (β-glucan) from grains of the microbial consortium, originating from dekefir cultivated in brown sugar solution and the like. The purpose of this process is in the extraction with yields above 5% of this polysaccharide.

ANTERIORIDADESPREVIOUS

[002] Polímeros de fontes naturais tem vantagem competitiva em relação a polímeros sintéticos, derivados do petróleo. Isso se deve ao uso de recursos renováveis para sua produção sustentável, sua biodegradabilidade e por serem, muitas vezes, biocompatível. Polissacarídeos são polímeros compostos por monossacarídeos, formados principalmente de carbono, oxigênio e hidrogênio, vastamente aplicados na indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética. Diversas fontes naturais produzem polissacarídeos, como bactérias, fungos, algas e plantas, entretanto, o mercado mundial é dominado por polissacarídeos vegetais e de algas. Exopolissacarídeos microbianos são polissacarídeos secretados por micro-organismos, com principal função de proteção contra estresse biótico e abiótico, incluindo adaptação a condições extremas e reserva de nutrientes. Eles podem ser homopolissacarídeos, contendo somente uma unidade monométrica, ou heteropolissacarídeo, com dois ou mais tipos de monômeros. Estes polímeros microbianos ainda são pouco explorados industrialmente (DONOT, F et al., Carbohydrate Polymers, v. 87: 951 - 962, 2012). Entre os polissacarídeos microbianos mais estudados na literatura estão xantana, gelana, dextrana e curdlana. A goma xantana é um polissacarídeo constituído de uma cadeia principal 1,4 β-D-glicose com ramificações a cada dois anéis, em posição 3,1 de 3 unidades de a-D-manose-6-acetilada, β-D -ácido glicurônico e β-D-ácido 4,6 manosil-pirúvico (Jansson, P; Kenne, L.; Lindberg, B. Carbohydrate Research, v. 45: 275 - 282, 1975). A gelana é formada por segmentos de 1,3 β-D-glicose, 1,4 β-D-ácido glicurônico, 1,4 β-D -glicose e 1,4 β-D-ramnose (MIYOSHI, E.; TAKAYA, T.; NISHINARI, K. Polymer Gels ans Networks, v. 6: 273-290, 1998). A goma dextrana tem cadeia semelhante à amilose, formada basicamente por um homopolímero linear com ramificações nos pontos α-1,2, α-1,3 ou α-1,4. Sua unidade principal é constituída de ligações do tipo α-1,6 glicosídicas (Khalikova, E.; Susi, P; Korpela, T. Microbiology and Molecular Biology Review, v. 69: 206-325, 2005). Curdlana é um homopolissacarídeo linear, formado principalmente de ligações 1,3 β-D-glicose (Kalyanasundaram, G. T.; Doble, M.; Gummadi, S. N., AMB Express, v. 2, 2012). Kefir de água é uma associação microbiana entre bactérias e leveduras, que se apresenta macroscopicamente como grãos gelatinosos, de forma irregular e tamanhos variados. Estes micro-organismos fermentam naturalmente a sacarose presente na solução de açúcar mascavo, sendo capaz de produzir exopolissacarídeos. O exopolisacarídeo extraído a partir de grãos de kefir de leite conhecido na literatura é a Kefirana, um glucogalactano ramificado, produzido por espécies de Lactobacilos, solúvel em água, que contem proporções quase que iguais de D-glicose e D-galactose (LaRivière, J. W. M. L. et al., Archiv Für Mikrobiologie, v. 59 : 269 - 278, 1967; Micheli, L. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, v. 53: 69 - 74, 1999; Vu, B. et al., Molecules, v. 14: 2535 - 2554, 2009). Nenhum destes trabalhos descreve β-glucanas extraídas de kefir de água. Os exopolissacarídeos do tipo glucanas são homopolissacarídeos de glicose, unidas por ligações glicosídicas (1^3 ; 1^6), (1^6), (1^3 ; 1^4), estas ligações apresentam duas configurações principais α e β na cadeia principal (Bohn, J. A., BeMiller, J. N. Carbohydrate Polymers, v. 29: 3-14, 1995; Silva, M. L. C. et al., Quimica Nova, v. 29: 85-92, 2006). As glucanas podem ser isoladas de micro-organismos como bactérias, leveduras ou fungos e até mesmo de plantas. As glucanas também diferem no tipo de ligação glicosídica, grau e tipo de ramificação, comprimento da cadeia, massa molecular e conformação do polímero (FREITAS, F et al. Trends in Biotechnology, v. 29: 388-398, 2011). Em relação as α-glucanas produzidas por micro-organismos, estas podem ser por várias lactobactérias dos gêneros Leuconostoc sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Lactobacillus sp., e Weissella sp. pela ação da enzima α -transglucosidases, que sintetiza as seguintes α-glucanas: dextrana (com mais de 50% de ligações α-1,6), mutana (com mais 50% de ligações α-1,3), alternana (que contem ligações alteradas de α-1,3 e α-1,6) e reuterana (com mais de 50% de ligações α-1,4) (MONSAN, P et al Current Opinion in Microbiology, v. 13:293-300, 2010) destes polímeros, a dextrana se destaca pela aplicação em diversos seguimentos da indústria, em contraste com a mutana, que não possui aplicações comerciais significativas no mercado (PATEL, S. et al. Indian Journal of Microbiology, v .52: 03-12, 2012). As β -glucanas são homopolissacarídeos de ocorrência natural, com glicose como componente estrutural, apresentando ligações β-glicosídicas. Na natureza as β -glucanas são amplamente encontrados na parede celular de muitas plantas (trigo, centeio, cevada e aveia) e leveduras (gênero Saccharomyces). Outras fontes de β-glucanas incluem algas como Laminaria sp., várias espécies de cogumelos como Shiitake (Lentinula edodes), Maitake (Grifola frondosa), Reishi (Ganoderma lucidum), Agaricus subrufesuns, e certos fungos Schizophyllum commune e Sclerotinia sclerotiorum que também produzem polímeros como esquizofilana e SSG (respectivamente), além de bactérias família Rhizobiaceae (MEENA, D.K., et al. Fish Physiology and Biochemistry v. 39: 431-457, 2013), Meena e colaboradores nesta revisão não citam o kefir de água como fonte de β-glucanas. Nas plantas, β-glucanas são predominantemente encontrados nas paredes internas da aleurona e subaleurona. Entre os cereais, os teores mais elevados de β-glucana são encontrados na cevada (2-20% m/m) e aveia (3-8% m/m) (EL KHOURY, D. et al. Journal of Nutrition and Metabolism Article ID 851362 v. 2011, 2012). Não existe na literatura nenhum processo descrito de obtenção de beta-glucana como exopolissacarídeo a partir de kefir.[002] Polymers from natural sources have a competitive advantage over synthetic polymers, derived from petroleum. This is due to the use of renewable resources for their sustainable production, their biodegradability and because they are often biocompatible. Polysaccharides are polymers composed of monosaccharides, formed mainly of carbon, oxygen and hydrogen, widely applied in the food, pharmaceutical and cosmetic industry. Several natural sources produce polysaccharides, such as bacteria, fungi, algae and plants, however, the world market is dominated by vegetable and algae polysaccharides. Microbial exopolysaccharides are polysaccharides secreted by microorganisms, with the main function of protection against biotic and abiotic stress, including adaptation to extreme conditions and nutrient reserve. They can be homopolysaccharides, containing only one monometric unit, or heteropolysaccharides, with two or more types of monomers. These microbial polymers are still little explored industrially (DONOT, F et al., Carbohydrate Polymers, v. 87: 951 - 962, 2012). Among the most studied microbial polysaccharides in the literature are xanthan, gelan, dextran and curdlan. Xanthan gum is a polysaccharide consisting of a 1,4 β-D-glucose main chain with ramifications every two rings, in position 3.1 of 3 units of aD-mannose-6-acetylated, β-D-glucuronic acid and β-D-4,6 mannosyl-pyruvic acid (Jansson, P; Kenne, L .; Lindberg, B. Carbohydrate Research, v. 45: 275 - 282, 1975). The gelan is formed by segments of 1,3 β-D-glucose, 1,4 β-D-glucuronic acid, 1,4 β-D-glucose and 1,4 β-D-rhamnose (MIYOSHI, E .; TAKAYA , T .; NISHINARI, K. Polymer Gels ans Networks, v. 6: 273-290, 1998). Dextran gum has a chain similar to amylose, formed basically by a linear homopolymer with branches at points α-1,2, α-1,3 or α-1,4. Its main unit consists of α-1,6 glycosidic bonds (Khalikova, E .; Susi, P; Korpela, T. Microbiology and Molecular Biology Review, v. 69: 206-325, 2005). Curdlana is a linear homopolysaccharide, formed mainly of 1,3 β-D-glucose bonds (Kalyanasundaram, G. T .; Doble, M .; Gummadi, S. N., AMB Express, v. 2, 2012). Water kefir is a microbial association between bacteria and yeasts, which appears macroscopically as gelatinous grains, of irregular shape and varying sizes. These microorganisms naturally ferment the sucrose present in the brown sugar solution, being able to produce exopolysaccharides. The exopolisacaride extracted from milk kefir grains known in the literature is Kefirana, a branched glucogalactan, produced by water-soluble Lactobacillus species, which contains almost equal proportions of D-glucose and D-galactose (LaRivière, JWML et al., Archiv Für Mikrobiologie, v. 59: 269 - 278, 1967; Micheli, L. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, v. 53: 69 - 74, 1999; Vu, B. et al., Molecules , v. 14: 2535 - 2554, 2009). None of these works describes β-glucans extracted from water kefir. Glucan-like exopolysaccharides are glucose homopolysaccharides, joined by glycosidic bonds (1 ^ 3; 1 ^ 6), (1 ^ 6), (1 ^ 3; 1 ^ 4), these bonds have two main configurations α and β in main chain (Bohn, JA, BeMiller, JN Carbohydrate Polymers, v. 29: 3-14, 1995; Silva, MLC et al., Quimica Nova, v. 29: 85-92, 2006). Glucans can be isolated from microorganisms such as bacteria, yeasts or fungi and even from plants. Glucans also differ in the type of glycosidic bond, degree and type of branching, chain length, molecular mass and polymer conformation (FREITAS, F et al. Trends in Biotechnology, v. 29: 388-398, 2011). Regarding α-glucans produced by microorganisms, these can be caused by several lactobacteria of the genera Leuconostoc sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Lactobacillus sp., And Weissella sp. by the action of the enzyme α-transglucosidases, which synthesizes the following α-glucans: dextran (with more than 50% of α-1,6 bonds), mutane (with more than 50% of α-1,3 bonds), alternan (which contains altered α-1,3 and α-1,6 bonds) and reuteran (with more than 50% α-1,4 bonds) (MONSAN, P et al Current Opinion in Microbiology, v. 13: 293-300 , 2010) of these polymers, dextran stands out for its application in different segments of the industry, in contrast to the mutane, which does not have significant commercial applications in the market (PATEL, S. et al. Indian Journal of Microbiology, v .52: 03 -12, 2012). Β-glucans are naturally occurring homopolysaccharides, with glucose as a structural component, presenting β-glycosidic bonds. In nature, β-glucans are widely found in the cell wall of many plants (wheat, rye, barley and oats) and yeasts (genus Saccharomyces). Other sources of β-glucans include algae such as Laminaria sp., Various species of mushrooms such as Shiitake (Lentinula edodes), Maitake (Leafy Grifola), Reishi (Ganoderma lucidum), Agaricus subrufesuns, and certain fungi Schizophyllum commune and Sclerotinia sclerotiorum that also produce polymers such as schizophilan and SSG (respectively), in addition to bacteria family Rhizobiaceae (MEENA, DK, et al. Fish Physiology and Biochemistry v. 39: 431-457, 2013), Meena and colleagues in this review do not cite water kefir as a source β-glucans. In plants, β-glucans are predominantly found on the inner walls of the aleurone and suballurone. Among cereals, the highest levels of β-glucan are found in barley (2-20% w / w) and oats (3-8% w / w) (EL KHOURY, D. et al. Journal of Nutrition and Metabolism Article ID 851362 v. 2011, 2012). There is no described process in the literature for obtaining beta-glucan as an exopolysaccharide from kefir.

[003] Os princípios do método de extração de β-glucanas de cevada e aveia foram desenvolvidos por Wood e colaboradores (WOOD, P J. et al., Cereal Chemistry v: 54, 524-533, 1977). Posteriormente, Wood e colaboradores desenvolveram em escala piloto os efeitos do tamanho de partícula, temperatura, pH e força iônica no rendimento de extração de β-glucanas, onde obtiveram um rendimento de até 78% (WOOD, P J. et al., Cereal Chemistry v. 66: 97-103, 1989). Entretanto, o custo é um fator limitante para a utilização industrial de β-glucana de origem vegetal como ingrediente de alimentos; este fator tem um peso significativo devido à presença dos contaminantes amido e proteínas que atualmente são retirados do produto por meio de tratamento enzimático associado à água quente (BRENNAN, C. S., CLEARY, L. J., Journal of Cereal Science v.42: 1-13, 2005) não existem relatos da presença do contaminantes amido e proteínas em kefir de água.[003] The principles of the method of extracting β-glucans from barley and oats were developed by Wood and collaborators (WOOD, P J. et al., Cereal Chemistry v: 54, 524-533, 1977). Later, Wood and collaborators developed on a pilot scale the effects of particle size, temperature, pH and ionic strength on the β-glucan extraction yield, where they obtained a yield of up to 78% (WOOD, P J. et al., Cereal Chemistry v. 66: 97-103, 1989). However, cost is a limiting factor for the industrial use of plant-derived β-glucan as a food ingredient; this factor has a significant weight due to the presence of contaminants starch and proteins that are currently removed from the product through enzymatic treatment associated with hot water (BRENNAN, CS, CLEARY, LJ, Journal of Cereal Science v.42: 1-13, 2005) there are no reports of the presence of contaminants starch and proteins in water kefir.

[004] O documento de patente US 0113821 A1 (Polysaccharide-basedhydrogel polymer and use thereof), publicado em 2014, descreve a manufatura deum sistema de liberação controlada de agentes ativos para plantas, animais ouseres humanos utilizando β-glucanas na forma de hidrogéis de cristais líquidos.Para tanto os autores utilizaram sistema de diálise contendo cloreto de cálcioaquoso, estes sistemas podem, inclusive, ordenar e cristalizar moléculas de DNAalterando as características mecânicas do gel. Em nenhum dos casos descritos napatente há citação do emprego de β-glucanas com ligações 1^6 extraídas de kefirde água.[004] US patent document 0113821 A1 (Polysaccharide-basedhydrogel polymer and use thereof), published in 2014, describes the manufacture of a controlled release system of active agents for plants, animals and humans using β-glucans in the form of hydrogels of liquid crystals. To this end, the authors used a dialysis system containing aqueous calcium chloride, these systems can even order and crystallize DNA molecules, changing the mechanical characteristics of the gel. In none of the cases described above, there is mention of the use of β-glucans with 1 ^ 6 bonds extracted from water kefir.

[005] O documento de patente US 8632798 B2 (Cereal β glucan compositions, methods of preparation and uses thereof), publicado em 2014, descreve a produção de β (1-3) β (1-4) glucana como agente de revestimento ou película de proteção que é caracterizado por ser clara, comestível, biodegradável, lubrificante e que pode liberar substâncias ao meio. Estas substâncias pode ser agentes farmacêuticos, médicos e terapêuticos, sabores, fragrâncias. O documento ainda descreve as aplicações para óleos essenciais e materiais não aquosos que são renderizados pelo β (1-3) β (1-4) glucana. Os filmes descritos de β (1-3) β (1-4) glucana, quando consumidos, desagregam na boca de maneira controlada e podem ser utilizados para a entrega de produtos farmacêuticos, médicos ou de confeitaria. Em nenhum dos exemplos citados na patente cita o emprego de β-glucanas extraídas de kefir de água.[005] Patent document US 8632798 B2 (Cereal β glucan compositions, methods of preparation and uses thereof), published in 2014, describes the production of β (1-3) β (1-4) glucan as a coating agent or protective film that is characterized by being clear, edible, biodegradable, lubricating and that can release substances in the middle. These substances can be pharmaceutical, medical and therapeutic agents, flavors, fragrances. The document also describes the applications for essential oils and non-aqueous materials that are rendered by β (1-3) β (1-4) glucan. The films described of β (1-3) β (1-4) glucan, when consumed, disintegrate in the mouth in a controlled manner and can be used for the delivery of pharmaceutical, medical or confectionery products. In none of the examples cited in the patent does it mention the use of β-glucans extracted from water kefir.

[006] Atualmente as tecnologias na área de obtenção de polissacarídeos microbianos para fins industriais envolvem o isolamento dos micro-organismos, fermentação, extração e purificação, gerando custos elevados com substratos, desenvolvimento de condições assépticas, infraestrutura necessária como uso de biorreatores, entre outros, a depender da técnica utilizada na extração e purificação. Existem diversas técnicas para extração, como uso de solventes orgânicos, digestores químicos, fluidos supercríticos, enzimas, métodos físicos ou combinação de técnicas. (DONOT, F et al., Carbohydrate Polymers, v. 87: 951- 962, 2012; QUINES, L. K. M. et al., Química Nova, v. 38: 1207-1218, 2015) nestas revisões não há citação de extração de β-glucanas de kefir por tratamento alcalino.[006] Currently technologies in the field of obtaining microbial polysaccharides for industrial purposes involve the isolation of microorganisms, fermentation, extraction and purification, generating high costs with substrates, development of aseptic conditions, necessary infrastructure such as the use of bioreactors, among others , depending on the technique used in the extraction and purification. There are several techniques for extraction, such as the use of organic solvents, chemical digesters, supercritical fluids, enzymes, physical methods or combination of techniques. (DONOT, F et al., Carbohydrate Polymers, v. 87: 951- 962, 2012; QUINES, LKM et al., Química Nova, v. 38: 1207-1218, 2015) in these reviews there is no mention of β extraction kefir glucans by alkaline treatment.

[007] O documento de patente CN 1884570 A (Method for preparing kefiran polysaccharide using microorganism fermentation), publicado em 2006, descreve o preparo de polissacarídeo utilizando bactérias da espécie Lactobacillus kefiranofaciens (JCM6985) obtidas de kefir. Para isso, as células bacterianas são inoculadas em um meio de fermentação e incubadas a 25 °C por 4 dias. O caldo de fermentação é centrifugado para remoção das células e ao sobrenadante é adicionado etanol gelado, formando um precipitado, recolhido por centrifugação. O precipitado é dissolvido em água destilada, centrifugado e novamente precipitado com etanol gelado. Com isso, foi obtido um polissacarídeo, com proporções de glicose e galactose 1:10 e ligações β -glicosídicas, nesta patente não descreve a obtenção de β-glucanas extraída de Lactobacillus kefiranofaciens.[007] Patent document CN 1884570 A (Method for preparing kefiran polysaccharide using microorganism fermentation), published in 2006, describes the preparation of polysaccharide using bacteria of the species Lactobacillus kefiranofaciens (JCM6985) obtained from kefir. For this, the bacterial cells are inoculated in a fermentation medium and incubated at 25 ° C for 4 days. The fermentation broth is centrifuged to remove the cells and to the supernatant is added chilled ethanol, forming a precipitate, collected by centrifugation. The precipitate is dissolved in distilled water, centrifuged and again precipitated with ice-cold ethanol. With that, a polysaccharide was obtained, with proportions of glucose and galactose 1:10 and β-glucosidic bonds, this patent does not describe the obtaining of β-glucans extracted from Lactobacillus kefiranofaciens.

[008] O documento de patente JPS 61257197 (Production of polysaccharide by capsular polysaccharide-producting bacterium separated from kefir particle) mostra que polissacarídeos podem ser obtidos a partir de Lactobacillus T-1, produtores de polissacarídeos capsulares, isolados do kefir, em meio contendo vinho. A colônia isolada é inoculada no caldo contendo soro de leite, vinho e carboidratos e incubada a 30 °C por uma semana. A solução de cultura resultante é centrifugada para remoção da matéria sólida e ao sobrenadante é adicionado etanol, para se obter um precipitado. O processo de precipitação é repetido 3 vezes e o precipitado é então dialisado e liofilizado. O polissacarídeo obtido tem monômeros de glicose e galactose em proporção 5:1. Nesta patente não descreve a obtenção de β-glucanas extraída de Lactobacillus T-1.[008] The patent document JPS 61257197 (Production of polysaccharide by capsular polysaccharide-producting bacterium separated from kefir particle) shows that polysaccharides can be obtained from Lactobacillus T-1, producers of capsular polysaccharides, isolated from kefir, in medium containing wine. The isolated colony is inoculated into the broth containing whey, wine and carbohydrates and incubated at 30 ° C for one week. The resulting culture solution is centrifuged to remove the solid matter and ethanol is added to the supernatant to obtain a precipitate. The precipitation process is repeated 3 times and the precipitate is then dialyzed and lyophilized. The polysaccharide obtained has glucose and galactose monomers in a 5: 1 ratio. This patent does not describe obtaining β-glucans extracted from Lactobacillus T-1.

[009] O documento de patente CN 102604851 (Lactococcus lactis capable of lowering cholesterol and producing extracellular polysaccharide), publicado em 2012, mostra que a espécie de Lactococcus latis isolada de kefir de leite, a partir da fermentação de soro de leite em repouso 30 °C por 24 horas em condições anaeróbicas, produzem exopolissacarídeo formado por monômeros de glicose e galactose. O documento de patente EP 0351370 A1 (Lactobacillus sp. KPB-167 and method of manufacturing viscose polysaccharides employing the same) apresenta uma nova cepa de Lactobacillus sp. isolada de grãos de kefir de leite, que cultivada em um meio com soro de leite ou meio com extrato de levedura e carboidratos, produz polissacarídeos capsulares com alto rendimento. Nestas patentes não descrevem a obtenção de β-glucanas extraída destes micro-organismos.[009] The patent document CN 102604851 (Lactococcus lactis capable of lowering cholesterol and producing extracellular polysaccharide), published in 2012, shows that the species of Lactococcus latis isolated from milk kefir, from whey fermentation at rest 30 ° C for 24 hours in anaerobic conditions, produce exopolysaccharide formed by glucose and galactose monomers. Patent document EP 0351370 A1 (Lactobacillus sp. KPB-167 and method of manufacturing viscose polysaccharides employing the same) discloses a new strain of Lactobacillus sp. isolated from grains of milk kefir, which is grown in a medium with whey or medium with yeast extract and carbohydrates, produces capsular polysaccharides with high yield. These patents do not describe obtaining β-glucans extracted from these microorganisms.

[010] Alguns polissacarídeos como as levanas, produzidos por bactérias como Zymomonas mobilis, que muitas vezes representam o principal grupo bacteriano presente em consórcios de kefir de água, são inteiramente produzidos no meio extracelular (DONOT, F et al., Carbohydrate Polymers, v. 87: 951- 962, 2012) sendo, em teoria, sensíveis ao microambiente de consórcios microbianos. Nesta revisão não descreve a obtenção de β-glucanas extraída de Zymomonas mobilis encontradas em kefir.[010] Some polysaccharides such as levans, produced by bacteria such as Zymomonas mobilis, which often represent the main bacterial group present in water kefir pools, are produced entirely in the extracellular medium (DONOT, F et al., Carbohydrate Polymers, v 87: 951- 962, 2012) being, in theory, sensitive to the microenvironment of microbial consortia. This review does not describe obtaining β-glucans extracted from Zymomonas mobilis found in kefir.

[011] As patentes descritas acima utilizam baterias isoladas dekefir para obtenção de exopolissacarídeos. Entretanto, consórcios microbianossão fontes de polissacarídeos, podendo ser inclusive obtidos em Estações deTratamento de Água (FREITAS, et al., Bioresource Technology v. 245: 1674-1683,2017). Neste sentido, foram observados que consórcios microbianos são capazesde gerar biomateriais na forma de grânulos e que estes grânulos não sãoresultantes de uma única população microbiana, nem que são compostos por umúnico exopolissacarídeo (SEVIOUR, LIN, Water Research v. 46: 48034813, 2012).Este trabalho não descreve a extração de β-glucana extraídos do consórciokefir.[011] The patents described above use isolated dekefir batteries to obtain exopolysaccharides. However, microbial consortia are sources of polysaccharides, and can even be obtained at Water Treatment Plants (FREITAS, et al., Bioresource Technology v. 245: 1674-1683,2017). In this sense, it was observed that microbial consortia are capable of generating biomaterials in the form of granules and that these granules are not the result of a single microbial population, nor that they are composed of a single exopolysaccharide (SEVIOUR, LIN, Water Research v. 46: 48034813, 2012) .This work does not describe the extraction of β-glucan extracted from the consortiumkefir.

[012] O documento de patente BR 102014020047-9 A2 (Extratocomposto por polissacarídeo e proteína com atividade moduladora angiogênica eatividade anti-inflamatória e produção à base de soro de leite com cultura dekefir), publicado no ano de 2016, apresenta a produção de extrato composto porpolissacarídeo e proteína obtido a partir do processo fermentativo utilizandocultura microbiana de kefir de soro de leite suplementado com nutrientes. Okefir é fermentado no soro de leite suplementado a 37 °C por 48 horas, arecuperação do extrato é feita a partir de tratamento com ácido tricloroacéticoe posterior precipitação dupla com etanol a 4 °C. A purificação é realizada commembrana de diálise, gerando um heteropolissacarídeo que contem monômeros degalactose, glicose, manose, arabinose e raminose, além de proteínas. Nestapatente não descreve a obtenção de β-glucanas extraída de kefir.[012] Patent document BR 102014020047-9 A2 (Extract composed of polysaccharide and protein with angiogenic modulating activity and anti-inflammatory activity and production based on whey with dekefir culture), published in 2016, presents the production of extract composed of polysaccharide and protein obtained from the fermentation process using microbial culture of whey kefir supplemented with nutrients. Okefir is fermented in the whey supplemented at 37 ° C for 48 hours, the recovery of the extract is made from treatment with trichloroacetic acid and subsequent double precipitation with ethanol at 4 ° C. Purification is carried out with a dialysis membrane, generating a heteropolysaccharide that contains degalactose, glucose, mannose, arabinose and raminose monomers, in addition to proteins. Nestapatente does not describe obtaining β-glucans extracted from kefir.

[013] No documento de patente JPH0265790 (Crude glycoproteinfraction having immunopotentiating action and production thereof), grãos dekefir de leite são cultivados em meio de cultura de leite desnatado, em seguidafiltrados para separação dos grãos, que são triturados com água e mantidos emagitação a 55 °C por 1 hora, seguido de centrifugação para recolher osobrenadante, e posterior precipitação com etanol, obtendo-se uma substânciapolissacarídica solúvel em água, com ação imunopotenciadora. Nesta patente nãodescreve a atividade da fração insolúvel em água extraída de kefir.[013] In patent document JPH0265790 (Crude glycoproteinfraction having immunopotentiating action and production thereof), milk kefir grains are grown in skimmed milk culture medium, then filtered to separate the grains, which are crushed with water and kept at 55 ° C for 1 hour, followed by centrifugation to collect the supernatant, and subsequent precipitation with ethanol, obtaining a water-soluble polysaccharide substance with immunopotentiating action. This patent does not describe the activity of the water-insoluble fraction extracted from kefir.

[014] O documento de patente US 4229440 (Pharmaceutical composition containing the polysaccharide KGF-C as active ingredient), publicado em 1980, trata da obtenção do polissacarídeo KGF-C a partir de grãos de kefir de leite. Os grãos são moídos, adicionados de água e aquecidos, centrifugados e o sobrenadante é coletado. Este é purificado através de troca iônica e então precipitado com etanol e liofilizado, gerando um pó solúvel em água, composto de glicose e galactose na proporção de 1:1, apresentando ação antitumoral. Esta patente não descreve o uso como antitumoral da fração insolúvel em água extraída de kefir.[014] US patent document 4229440 (Pharmaceutical composition containing the polysaccharide KGF-C as active ingredient), published in 1980, deals with obtaining the polysaccharide KGF-C from milk kefir grains. The beans are ground, added with water and heated, centrifuged and the supernatant is collected. This is purified by ion exchange and then precipitated with ethanol and lyophilized, generating a water-soluble powder, composed of glucose and galactose in the proportion of 1: 1, presenting anti-tumor action. This patent does not describe the use as an antitumor of the water-insoluble fraction extracted from kefir.

[015] Hidrogéis são compostos de redes poliméricas tridimensionaisinterligadas que não dissolvem em meio aquoso, mas intumescem consideravelmentenesse meio. Possuem extraordinária capacidade de absorver e armazenar água emsua estrutura reticulada, possuindo várias aplicações em tecnologias de ponta(exemplo engenharia tecidual e ambiental). Neste contexto hidrogéissuperabsorventes tem despertado a atenção pela capacidade de reterconsideráveis quantidades de água. Tipicamente materiais superabsorventes podemembeber entre 1.000 e 100.000% o seu peso seco, (10 a 1.000 g de água / g depolímero); como parâmetros um hidrogel normalmente não retém mais do que 100%(1 g de água / g de polímero) (VARAPRASADA, K., et al., Materials Science andEngineering: C, v. 79: 958971). Nesta revisão os autores não descrevem o usode β-glucana derivada de kefir como géis superabsoarventes.[015] Hydrogels are composed of interconnected three-dimensional polymeric networks that do not dissolve in an aqueous medium, but swell considerably in that medium. They have an extraordinary capacity to absorb and store water in their reticulated structure, having several applications in cutting-edge technologies (example tissue and environmental engineering). In this context, superabsorbent hydrogels have attracted attention due to the ability to retain considerable amounts of water. Typically superabsorbent materials can absorb between 1,000 and 100,000% of their dry weight, (10 to 1,000 g of water / g of polymer); as parameters a hydrogel normally does not retain more than 100% (1 g water / g polymer) (VARAPRASADA, K., et al., Materials Science and Engineering: C, v. 79: 958971). In this review, the authors do not describe the use of kefir-derived β-glucan as superabsoarvent gels.

[016] Varaprasada e colaboradores destacam ainda a pesquisa nodesenvolvimento de hidrogéis baseados em polímeros naturais que são muitasvezes nanoestruturados. As vantagens da utilização destes polímeros estão,sobretudo no que se refere a aplicações biomédicas devido a sua não-toxicidade(tanto dos polímeros como seus monômeros), solubilidade em água / capacidade deabsorção de água. Além dessas características os polissacarídeos possuem grandeinteração com meio aquoso, podendo apresentar biocompatibilidade,biodegradabilidade ou ao contrário, bioestabilidade dependendo do objetivo emanipulação do polímero. Por estas características estes biomateriais podem seprestar para liberação/entrega de fármacos ou ainda ser modificado química oupor enzimas dependendo da demanda. Podem ainda serem projetados para serempolímeros inteligentes (responsíveis a pH, ou ainda autocicatrizantes) e tambémserem bioativos, conduzindo e acelerando processos biológicos como por exemplode cicatrização (VARAPRASADA, K., et al., Materials Science and Engineering: C,v. 79: 958-971). Nesta revisão os autores não descrevem o uso de β -glucanaderivada de kefir como géis materiais bioativos.[016] Varaprasada and collaborators also highlight research on the development of hydrogels based on natural polymers that are often nanostructured. The advantages of using these polymers are, especially with regard to biomedical applications due to their non-toxicity (both of polymers and their monomers), water solubility / water absorption capacity. In addition to these characteristics, polysaccharides have great interaction with aqueous media, which may present biocompatibility, biodegradability or, on the contrary, biostability depending on the objective and handling of the polymer. Because of these characteristics, these biomaterials can be used for drug delivery / delivery or can be modified chemically or by enzymes depending on demand. They can also be designed to be intelligent polymers (responsible for pH, or even self-healing) and also to be bioactive, conducting and accelerating biological processes such as for example healing (VARAPRASADA, K., et al., Materials Science and Engineering: C, v. 79: 958-971). In this review, the authors do not describe the use of kefir-derived beta-glucan as bioactive material gels.

[017] Todas as patentes e revisões apresentadas acima utilizaram grãos de kefir de leite e obtiveram heteropolissacarídeo, formado principalmente de unidades monoméricas de glicose e galactose. Nenhuma das patentes utilizou tratamento alcalino na extração do exopolissacarídeo. Desta forma, nenhuma destas patentes extraiu polissacarídeos do consórcio microbiano do kefir com características de biopolímeros hidrofílicos insolúveis em pH neutro e solúveis em pH alcalino. As limitações encontradas no estado da técnica demandam a criação de uma nova técnica, conforme revelaremos abaixo.[017] All the patents and revisions presented above used grains of milk kefir and obtained heteropolysaccharide, formed mainly of monomeric units of glucose and galactose. None of the patents used alkaline treatment to extract the exopolysaccharide. Thus, none of these patents extracted polysaccharides from the microbial consortium of kefir with characteristics of hydrophilic biopolymers insoluble in neutral pH and soluble in alkaline pH. The limitations found in the state of the art require the creation of a new technique, as we will reveal below.

DESCRIÇÃO GERALGENERAL DESCRIPTION

[018] A presente invenção descreve a extração de um exopolissacarídeo deaplicações industriais de uma fonte de matéria-prima (grãos dekefir de água), através de processo de extração para este materialbiológico (extração em meio alcalino). O presente processo de obtenção de exopolissacarídeo degrãos de kefir cultivados em solução de açúcar mascavo como substrato e deconsórcios derivado deste, compreende as etapas de i) clareamento dos grãos ii)trituração dos grãos com água iii) adição de NaOH ou similares e aquecimento iv) eliminaçãodas impurezas v) precipitação do sobrenadante vi) recolhimento do precipitado vii) lavagem eneutralização viii) precipitação ix) remoção do sal formadox) secagem e trituração dopolímero. Os processos estão descritos na Figura 01.[018] The present invention describes the extraction of an exopolysaccharide from industrial applications from a source of raw material (water dekefir grains), through an extraction process for this biological material (extraction in alkaline medium). The present process of obtaining exopolysaccharide from kefir grains grown in brown sugar solution as a substrate and derived from it, comprises the steps of i) whitening the grains ii) grinding the grains with water iii) addition of NaOH or similar and heating iv) elimination of impurities v) precipitation of the supernatant vi) collection of the precipitate vii) washing and neutralization viii) precipitation ix) removal of the formed saltx) drying and grinding of the polymer. The processes are described in Figure 01.

[019] i) Clareamento dos grãos - Os grãos de kefir foram lavados sucessivamente com água tipo II ou similares.[019] i) Grain bleaching - The kefir grains were washed successively with water type II or similar.

[020] ii) Trituração dos grãos com água - Os grãos foram triturados até consistência gelatinosa [021] iii) Adição de NaOH ou similares e aquecimento e neutralização -Adiciona-se água purificada (qsp) e procede-se a neutralização até pH neutro utilizando-se soluções ácidas.[020] ii) Grinding the grains with water - The grains were crushed to gelatinous consistency [021] iii) Addition of NaOH or similar and heating and neutralization - Purified water (qsp) is added and neutralization is carried out until neutral pH using acidic solutions.

[022] iv) Eliminação das impurezas - Realiza-se filtragem, centrifugação ou métodos similares.[022] iv) Elimination of impurities - Filtration, centrifugation or similar methods are carried out.

[023] v) Precipitação do sobrenadante - realizado a partir da adição de etanol, isopropanol ou outros solventes similares.[023] v) Precipitation of the supernatant - carried out by adding ethanol, isopropanol or other similar solvents.

[024] vi) Recolhimento do precipitado - Realizado a partir de filtragem, centrifugação ou processos similares.[024] vi) Precipitate collection - Performed through filtration, centrifugation or similar processes.

[025] vii) Lavagem e neutralização - Utiliza-se soluções ácidas até pH neutro. [026] viii) Precipitação - realizado a partir da adição de etanol, isopropanol ou outros solventes similares.[025] vii) Washing and neutralization - Acid solutions are used until neutral pH. [026] viii) Precipitation - carried out by adding ethanol, isopropanol or other similar solvents.

[027] ix) Remoção do sal formado - O precipitado é lixiviado para remoção do sal formado, durante o processo de neutralização.[027] ix) Removal of the formed salt - The precipitate is leached to remove the formed salt, during the neutralization process.

[028] x) Secagem e trituração do polímero - Os grãos de polímero são secados e triturados até o padrão desejado.[028] x) Drying and grinding of the polymer - The polymer grains are dried and ground to the desired standard.

[029] Ao processo acima descrito pode-se incorporar etapas de reticularização e redução do tamanho das partículas poliméricas, em escala micro, nano ou picométricas.[029] The process described above can incorporate steps of reticularization and reduction of the size of the polymeric particles, on a micro, nano or picometric scale.

MODALIDADES PREFERIDASPREFERRED EMBODIMENTS

[030] O hidrogel de β-glucana, por ser obtido de fonte renovável e ser biodegradável é um produto ecologicamente amigável. Este hidrogel, por pertencer à classe das β-glucanas, tem aplicações biotecnológicas comerciais em diversos setores como: engenharia biomédica, como biomaterial (ex. substituto temporário de pele, fios de sutura e como parte de implantes reabsorvíveis, matriz de imobilização e cultivo de células viáveis, revestimento de dispositivos médicos etc); indústria farmacêutica, como bioativo per se, como matriz para imobilização e liberação controlada de drogas e veículo de fármacos como géis e participar de composição de cremes, pomadas, emulsões, filmes, entre outros; indústria alimentícia, como agente texturizante, espessante, emulsificante, gelificante e estabilizante; indústria cosmética, em hidratantes, loções e outros produtos; indústria química, como espessante; agroindústria, como matriz para retenção hídrica, imobilizadora de fertilizantes, pesticidas e nutrientes para plantas; indústria de papel; em engenharia de materiais como polímero biodegradável (ex embalagens biodegradáveis e película protetora de alimentos); e em sistemas de despoluição em engenharia ambiental.[030] The β-glucan hydrogel, being obtained from a renewable source and being biodegradable, is an ecologically friendly product. This hydrogel, because it belongs to the β-glucan class, has commercial biotechnological applications in several sectors such as: biomedical engineering, as biomaterial (eg temporary skin substitute, suture threads and as part of resorbable implants, immobilization matrix and culture of viable cells, coating of medical devices, etc.); pharmaceutical industry, as a bioactive per se, as a matrix for immobilization and controlled release of drugs and as a vehicle for drugs such as gels and to participate in the composition of creams, ointments, emulsions, films, among others; food industry, as a texturizing, thickening, emulsifying, gelling and stabilizing agent; cosmetic industry, in moisturizers, lotions and other products; chemical industry, as a thickener; agribusiness, as a matrix for water retention, immobilizer of fertilizers, pesticides and plant nutrients; paper industry; in engineering of materials such as biodegradable polymer (eg biodegradable packaging and protective food film); and in environmental engineering depollution systems.

[031] Processo de obtenção de exopolissacarídeo tipo beta-glucana extraído do consórcio microbiano do kefir caracterizado pelas etapas seguintes i) clareamento dos grãos ii) trituração dos grãos com água iii) adição de O polissacarídeo, β-glucana, produzido e extraído conforme descrito em 1 e caracterizado em 2 comporta-se como um hidrogel superabsorvente pois é capaz de hidratar-se até 1.000 vezes seu peso após 3 minutos.[031] Process for obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the kefir microbial consortium characterized by the following steps i) whitening the grains ii) grinding the grains with water iii) addition of The polysaccharide, β-glucan, produced and extracted as described in 1 and characterized in 2 it behaves like a superabsorbent hydrogel because it is capable of hydrating itself up to 1,000 times its weight after 3 minutes.

[032] O hidrogel de β-glucana, caracterizado em 3, produzido e extraído conforme descrito em 1 e caracterizado em 2 possui ação citotóxica contra linhagens neoplásicas K-562 (leucemia mielocítica crônica) e MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano), apresentando inibições de 70% e 58% respectivamente.[032] The β-glucan hydrogel, characterized in 3, produced and extracted as described in 1 and characterized in 2, has cytotoxic action against neoplastic strains K-562 (chronic myelocytic leukemia) and MCF-7 (human breast adenocarcinoma), showing inhibitions of 70% and 58% respectively.

[033] O hidrogel de β-glucana, caracterizado em 3, produzido e extraído conforme descrito em 1 e caracterizado em 2, possuindo as características citotóxica contra linhagens tumorais descrita em 4, e imunodulatória como estimulador do sistema imune e pró-cicatrizante descrita em 5, pode ser utilizado como matéria-prima a produção de filmes poliméricos do tipo elastômero voltados a aplicações biomédicas.[033] The β-glucan hydrogel, characterized in 3, produced and extracted as described in 1 and characterized in 2, having the cytotoxic characteristics against tumor lines described in 4, and immunodulatory as a stimulator of the immune and pro-healing system described in 5, the production of polymeric films of the elastomer type for biomedical applications can be used as raw material.

[034] O hidrogel de β-glucana, caracterizado em 3, produzido e extraído conforme descrito em 1 e caracterizado em 2, possuindo as características citotóxica contra linhagens tumorais descrita em 4, e imunodulatória como estimulador do sistema imune e pró-cicatrizante descrita em 5, pode ser utilizado como matéria-prima a produção de filmes poliméricos do tipo elastômero voltados a aplicações biomédicas.[034] The β-glucan hydrogel, characterized in 3, produced and extracted as described in 1 and characterized in 2, having the cytotoxic characteristics against tumor lines described in 4, and immunodulatory as a stimulator of the immune and pro-healing system described in 5, the production of polymeric films of the elastomer type for biomedical applications can be used as raw material.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Process of obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the kefir microbial consortium characterized by the following steps i) whitening the grains ii) grinding the grains with water iii) adding NaOH or similar and heating iv) eliminating impurities v) precipitation of the supernatant vi) precipitate collection vii) washing and neutralization viii) precipitation ix) removal of the formed salt x) drying and grinding of the polymer.

2. Process of obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir characterized by the alkaline extraction of beta-glucan as kefir exopolysaccharide.

3. Process of obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir according to claim 1 characterized by the addition of plasticizers resulting in a polymeric film.

4. Process of obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir according to claim 1, characterized by the graded reticularization process, in order to obtain a desired mechanical resistance.

5. Process of obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir according to claim 1, characterized by the reduction of particle size on a micro, nano or picometric scale, in order to obtain new functionalities.

6. Process for obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir according to claim 1 characterized by mixing with compatible polymers, in order to obtain new polymer blends combining characteristics of the polymers.

7. Process for obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir according to claim 1 characterized by the combination with metals, clays and similar nanostructured or not in order to obtain new composites.

8. Process for obtaining beta-glucan-type exopolysaccharide extracted from the microbial consortium of kefir according to claim 1, characterized by the covalent bonding of beta-glucan with other biomolecules in order to alter or add new functionalities to the material.