BR102013006007A2 - Compostos, uso, composição farmacêutica inibidora de redutase em microorganismos, ligante de inha, e, método para obtenção de ligantes de inha a partir de derivados de acetamida, ureia, fenol e carboxamida - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS, USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA INIBIDORA DE REDUTASE EM MICROORGANISMOS, LIGANTE DE INHA, E, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE LIGANTES DE INHA A PARTIR DE DERIVADOS DE ACETAMIDA, UREIA, FENOL E CARBOXAMIDA. A presente invenção apresenta novos e inventivos compostos inibidores enzimáticos em microorganismos. Em uma realização preferencial, os compostos da presente são utilizados para inibir a enzima 2-trans-enoil-ACP (CoA) redutase em microorganismos.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Compostos, Uso, Composição Farmacêutica Inibidora de Redutase em Microorganismos, Ligante de inhA, e, Método para OBTENÇÃO DE LIGANTES DE INHA A PARTIR DE DERIVADOS DE ACETAMIDA, UREIA, FENOL E CARBOXAMIDA

Campo da Invenção A presente invenção se situa no campo da biologia, da química e da farmácia. Mais especificamente, a presente invenção apresenta novos e inventivos compostos inibidores enzimáticos em microorganismos. Em uma realização preferencial, os compostos da presente invenção são úteis para inibir a enzima 2-frans-enoil-ACP (CoA) redutase em microorganismos.

Antecedentes da Invenção Mais de dois bilhões de pessoas estão infectadas com o agente causador da tuberculose, o Mycobacterium tuberculosis. Em 2010 houve 8,8 milhões (faixa: 8,5-9,2 milhões) de casos de TB no mundo. Desses, 1,1 milhão (faixa: 0,9-1,2 milhão) morreram de TB apenas e 0,35 milhão (faixa: 0,32-0,39 milhão) morreram de TB associada a HIV/AIDS. Surgem a cada ano 500 mil novos casos de TB multirresistente a fármacos (MDR). São 10 milhões de crianças órfãs devido à morte dos pais por TB (WHO, Global Report, 2011). No Brasil, 71 mil casos de TB foram notificados em 2010 com 4,6 mil mortes por ano. Tuberculose é a 4a causa de mortes no país por doenças infecciosas e a 1a causa de morte de pacientes com AIDS (Programa Nacional de Controle da Tuberculose, Secretária de Vigilância da Saúde, Ministério da Saúde).

Assim, novos compostos para o controle da tuberculose são necessários para o combate da doença. A invenção presente resolve o problema de se encontrar novos fármacos para o tratamento da tuberculose (TB), utilizando a enzima InhA, alvo do principal fármaco empregado no tratamento deste doença (isoniazida) (INH), como alvo terapêutico. Adicionalmente, é importante salientar que, por causa da clara relação evolutiva entre a InhA de Mycobacterium tuberculosis e suas homólogas em outros organismos, os compostos da presente invenção também possuem o potencial de inibir a enzima InhA destes organismos. Dentre esses, destacamos os gêneros: Mycobacterium·. causa tuberculose, lepra, úlceras, e outras infecções; Plasmodium: causa malária, em particular malária cerebral; Toxoplasma: causa toxoplasmose; Trypanosoma: causa doença de chagas; Klebsiella: causa infecções hospitalares,^pneumonia; C/?/a/nyc//af eausa-tracoma oü^clamidíase e infecções crônicas; Helycobacter. causa gastrite, úlcera e câncer estomacal; Pseudomonas: causa infecções hospitalares; Vibrio: causa cólera e outras infecções; Bacillus: intoxicação alimentar (cereus) e carbúnculo (anthracis)\ Yersinia: causa a peste negra; Staphylococcus\ causa infecção hospitalar; Salmonella: causa salmonelose; Neisseria: causa doença venérea (gonorrhoeae) e meningite (meningitidis). A busca na literatura científica e patentária apontou alguns documentos parcialmente relevantes para a presente invenção, os quais serão descritos a seguir. O artigo científico intitulado “High affinity InhA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis” de Sullivan et al (2006) descreve a necessidade de novos quimioterápicos serem utilizados contra cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes à fármacos utilizando design racional baseado em estrutura para desenvolvimento de uma série de éteres alquil difenil que são inibidores não-competitivos de InhA. O artigo científico intitulado “A slow, tight inhibitor of InhA, the enoyl-acyl carrier protein reductase from Mycobacterium tuberculosis” de Luckner et al (2010) descreve um novo inibidor, 2-(o-tolioxi-5-hexi!fenol) (PT70) como um inibidor ideal para enoil-ACP redutase de Mycobacterium tuberculosis. O documento US 2011/0092536 descreve novos derivados anti-infecciosos, método de produção dos mesmos, composições farmacêuticas contendo os compostos e o uso dos mesmos no tratamento antimicrobiano, sendo que os derivados compreendem uma fórmula geral contendo a combinação de i) estruturas piridina, piridínio ou dihidropiridina e estruturas relacionadas derivada dos metabólitos ativos de isoniazida; e ii) substituinte hidrofóbico cujo alvo é o sítio ativo do substrato. O documento US 5,614,551 descreve inibidores de ácido graxo como potenciais agentes antimicrobianos no qual uma etapa essencial de ação dos possíveis agentes antimicrobianos compreende ser administrado em uma célula microbiana a fim de permitir a inibição de uma enzima (sintase) relacionada à produção de ácidos graxos.

Os documentos acima referidos apresentam compostos potencialmente relevantes para a inibição de enzimas em microorganismos. Entretanto, nenhum dos documentos apontados descreve ou sugere os compostos da presente invenção e tampouco seu uso como inibidores enzimáticos, preferencialmente de enoil-ACP redutase em microorganismos, preferencialmente em Mycobacterium tuberculosis.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta, aos olhos dos inventores, possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção É um dos objetos da invenção proporcionar um processo ou método para obtenção de ligantes de inhA, referido método compreendendo as etapas de: - avaliação in silico de potenciais ligantes de inhA; - predição in silico de toxicidade e/ou dos referidos ligantes; e - testes in vitro dos referidos ligantes, notadamente estudos cinéticos e/ou de inibição de inhA.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona novos compostos inibidores de redutase de microorganismos, preferencialmente utilizados para inibir a enzima InhA (2-frans-enoil-ACP (CoA) redutase), mais preferencialmente InhA de Mycobacterium tuberculosis (EC: 1.3.1.9).

Entende-se como qualquer cadeia alquílica, uma cadeia linear ou ramificada, saturada ou insaturada, cíclica ou não. É, portanto, um objeto da presente invenção composto inibidor de redutase em microorganismo compreendendo a fórmula I: (fórmula I) onde R1 e R4, sendo os mesmos iguais ou distintos, compreendem qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O'. R2 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de oxigênio. R3 e R5 compreendem qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de hidrogênio.

Em uma realização preferencial, R1 e R5 são átomos de hidrogênio; R2 é -CH2; R3 são etilas, R4 é um átomo de cloro. É um outro objeto da presente invenção um composto inibidor de redutase em microorganismo compreendendo a fórmula II: (fórmula II) onde R1-R2, sendo os mesmos iguais ou distintos, compreendendo qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O'; R3 compreendendo qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de oxigênio.

Em uma realização preferencial, R1 são átomos de hidrogênio; R3 é um —CH2 e R2 é uma metila na posição orto. É um outro objeto da presente invenção composto inibidor de redutase em microorganismo compreendendo fórmula III: (fórmula III) onde R1 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O"; R2 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de oxigênio.

Em uma realização preferencial, R1 é um átomo de hidrogênio e R2 é um -CH2. É um outro objeto da presente invenção composto inibidor de redutase em microorganismo compreendendo fórmula IV: (fórmula IV) onde R1 e R3 podem, sendo os mesmos iguais ou distintos, compreender qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O'; R2 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de hidrogênio.

Em uma realização preferencial, R1 é um átomo de hidrogênio, R2 é - uma propila e R3 é uma metila na posição orto. É também um objeto adicional, da—presente inveTIçãõ composições ?fãrrrTãcêuticas compreendendo: a) compostos de fórmula I e/ou II e/ou III e/ou IV; e b) veículo farmaceuticamente aceitável. É um objeto adicional da presente invenção o uso dos compostos de fórmula I e/ou II e/ou III e/ou IV para fabricação de medicamento com ação antimicrobiana.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve descrição das figuras Figura 1. Análise das interações intermoleculares entre a enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis e N-(2-fenoxÍfenil)-2-[2-(2-piridil)tiazol-4-il] acetamida.

Figura 2. Análise das interações intermoleculares entre a enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis e 3-(o-tolil)-1-[5-(4-propoxifenil)-1,3,4-tiadiazol- 2- il]urea.

Figura 3. Análise das interações intermoleculares entre a enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis e 4-(7-cloro-4-quinolil)-2-(dietilaminometil)fenol.

Figura 4. Análise das interações intermoleculares entre a enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis e N-(4-{5-[(2-metilfenoxi)metil]-1,2,4-oxadiazol- 3- yl}phenyl)thiophene-2-carboxamide.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção tem como conceito inventivo comum o processo ou método para obtenção de ligantes de inhA. A partir do referido conceito inventivo comum, diferentes entidades moleculares são obtidas e resolvem o problema técnico de proporcionar novos ligantes de inhA. O processo ou método para obtenção de ligantes de inhA da presente invenção compreende ao menos três etapas: - avaliação in silico de potenciais ligantes^deJnhA;- -_predição-in-siliccHiê toxicidade e/ou dos referidos ligantes; e - testes in vitro dos referidos ligantes, notadamente estudos cinéticos e/ou de inibição de inhA.

Em uma concretização preferencial, o processo ou método para obtenção de ligantes de inhA da presente invenção compreende: - seleção da biblioteca de moléculas; - geração do modelo farmacofórico; - geração do farmacóforo 3-D e busca em bancos de dados; - modelagem molecular; - testes in silico de docagem molecular; - predição in silico de toxicidade; - medidas de inibição enzimática de MtlnhA in vitro; - seleção de moléculas para testes in vitro; e - estudo de inibição por cinética do estado estacionário.

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.

Veículo farmaceuticamente aceitável Na presente invenção entende-se por “veículo farmaceuticamente aceitável” qualquer veículo que proporcione a inserção em uma formulação, contendo excipientes e carreadores aceitáveis conhecidos por técnicos no assunto, assim como em doses e tratamentos convenientes para uso em composições particulares. O dito veículo pode ser descrito em uma série de regimentos de tratamento, incluindo oral, parenteral, intravenoso, intranasal, intravítreo e intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular e intraocular ou demais meios de administração e/ou formulação.

Uso A presente invenção proporciona o uso compostos de fórmula I e/ou II e/ou III e/ou IV para a fabricação de medicamento com ação antimicrobiana Exemplo 1. Realização Preferencial InhA ou 2-frans-enoil-ACP (CoA) redutase - de—Mycõbacteríum tubjsrculosis-tEC. 1T37Í.9) é uma enzima atrativa para realizar esforços de descoberta de fármacos devido a sua validação como alvo biológico efetivo para terapia de tuberculose. Na presente invenção, duas abordagens distintas de triagem in silico de ligantes foram utilizadas a fim de identificar novos inibidores InhA a partir de uma biblioteca de ligantes selecionada do banco de dados 2INC.

Inicialmente, um modelo farmacofórico tridimensional foi construído baseado em 36 estruturais de cristais MtlnhA disponíveis. Pela combinação de informação baseada em estrutura e baseada em ligantes, quatro pontos farmacofóricos foram desenhados para selecionar moléculas com habilidade para satisfazer as características de ligação da cavidade de ligação do substrato da MtlnhA. A segunda abordagem consiste em usar quatro programas bem estabelecidos de docagem molecular, com diferentes algoritmos de busca, para comparar o modo de ligação e escore das moléculas selecionadas na biblioteca acima mencionada. Depois de uma análise detalhada dos resultados, quatro ligantes foram selecionados para análise in vitro. Desses, três apresentaram resultados satisfatórios de atividade inibitória com IC5o de 20 ?? to 83 ??. O melhor composto apresentou inibição não competitiva aos substratos NADH e 2-frans-dodecenoil-CoA, com K, de 24 ?? e 20 ??, respectivamente. Esses resultados validaram o método desenvolvido. Material e métodos Seleção da biblioteca de moléculas Baseado na analise estrutural e físico química da MtlnhA, uma pré-seleção de compostos a serem selecionados foi realizada utilizando o Banco de Dados ZINC. Filtros moleculares 2D identificaram moléculas com características favoráveis para interagir com a cavidade de ligação da InhA: 4 < LogP < 7; ligações rotatórias < 6; aceptores de pontes de hidrogênio < 8; área de superfície polar < 40 Â2 ; e peso molecular entre 250 Da e 400 Da. O conjunto final de compostos compreendendo as características citadas compreendeu 999.853 compostos e foram utilizados em ambas abordagens descritas a seguir, ABORDAGEM 1: Geração de farmacóforo baseado em estrutura Abordagem computacional A busca pelo farmacóforo foi realizada utilizando-se o pacote de programas SYBL 8.0 (Tripos Inc., St Louis, MO) utilizado em estações Red Hat Enterprise Linux. As estruturas 3-D dos inibidores foram geradas usando parâmetros geométricos padrões do pacote de modelagem molecular do pacote de programas SYBL 8.0. Cada conformação otimizada de uma molécula do conjunto de dados foi energeticamente minimizada utilizando o campo de força Tripos e o algoritmo de gradiente conjugado Powell com um critério de convergência de 0,005 kcal/mol. À. Cargas atômicas parciais foram calculadas pelo método Gasteiger-Hückel. As análises, cálculos e visualizações foram realizadas utilizando os programas SYBYL 8.0 e PyMol.

Geração do modelo farmacofórico Atualmente, 36 estruturas cristalinas de MtlnhA estão disponíveis no banco de dados Protein Data Bank (PDB). Entre elas, encontramos o tipo selvagem de InhA e seus mutantes relacionados a resistência a drogas, na forma apo (sem ligante) e complexados com NADH (coenzima), análogos de substrato e diversos ligantes. As 36 estruturas cristais foram sobrepostas através de seus átomos Ca pelo método dos mínimos quadrados utilizando o programa TopMatch disponível em (http://topmatch.services.came.sbg.ac.at/). Os volumes das cavidades de ligação foram calculados com CASTp (http://sts.bioengr.uic.edu/castp/). Pontes de hidrogênio e contatos hidrofóbicos também foram analisados pelo LIGPLOT para obtenção de um perfil mais robusto de padrão de interação entre MtlnhA e seus ligantes cristalográficos. A análise estrutural de MtlnhA complexado com ligantes ligados a cavidade de ligação do substrato indicam diversos resíduos de aminoácido chaves, que podem estar envolvidos no processo de reconhecimento molecular. Com base nisso, um modelo farmacofórico 3-D de quatro pontos foi desenvolvido.

Geração do farmacóforo 3-D e busca em bancos de dados A biblioteca de moléculas de estruturas 3-D foi transferida pára um banco de dados UNITY noSYBYL 8.0. A busca 3-D com UNITY foi baseada no modeío farmacofórico gerado. A fim de aplicar o modelo farmacofórico com restrições 3-D, utilizamos coordenadas espaciais dos cristais do ligante 5-{[4-(9H-fluoreno-9-yl)piperazina-1-il]carbonil}-1H-indol (Genz-10850), ligado a MtlnhA (PDB ID:1P44). Os átomos doadores e receptores foram definidos pela conexão dos átomos doadores e receptores do ligante via correspondência parcial. A característica hidrofóbica foi parcialmente caracterizada baseada nos dois anéis presentes na estrutura do ligante. Os diâmetros das esferas foram ajustados de forma que uma amostra teste pode ser obtida, composta de ligantes cristalográficos MtlnhA. Para realizar a seleção na biblioteca de moléculas, foi realizada uma busca flexível UNITY 3-D.

Modelagem molecular O algoritmo UNITY assinala alta pontuação para moléculas que combinam com os pontos farmacofóricos em suas buscas flexíveis e, por conta disso, a geometria otimizada dos compostos sob analise podem ser afetados. Dessa forma, as estruturas moleculares do conjunto de compostos selecionados foram minimizadas a fim de evitar resultados falso positivos. A minimização energética das moléculas foi realizada utilizando o mesmo protocolo descrito na seção de Abordagem Computacional.

Subsequentemente, os candidatos a ligantes selecionados foram encaixados dentro da cavidade de ligação do substrato MtlnhA. O conjunto de programas GOLD foi utilizado para realizar as simulações de docagem molecular. A estrutura cristal MtlnhA usada como receptor (PDB ID, 1P44) foi escolhida dentre as 36 estruturas disponíveis devido a sua melhor relação entre o volume da cavidade de ligação (3,007.8 Â3) e a resolução da proteína (2,7 A). Para os cálculos, átomos de hidrogênio foram adicionados a proteína com geometria padrão utilizando o modulo Biopolymer implementado no SYBYL 8.0. O sitio ativo foi definido como incorporando todos os resíduos de aminoácidos com um raio de esfera de 8.0 Â centralizado no ligante cristalográfico ligado (Genz-10850). A coenzima NADH foi tratada como parte da proteína em todas as simulações de docagem. Estudos de modelagem molecular foram realizados utilizando os parâmetros padrões do GOLD. A função de alinhamento do GoldScore foi aplicada para selecionar uma configuração representativa para cada composto. As soluções foram visualmente checadas para checar se a configuração obtida por docagem ainda estava de acordo com a hipótese do farmacóforo original. A inspeção visual é uma prática comum e importante para evitar o teste de falsos positivos devido a suposições e deficiências dos métodos de docagem funções de pontuação. Na inspeção visual, nós criticamente acessamos a conformação de ligação sugerida, a superfície mutual de complementariedade do ligante e da proteína, e a possível presença de espaços não preenchidos ao longo da interface proteína-ligante. Somente essas moléculas que preencheram todos os quatro pontos farmacofóricos após as simulações de docagem foram selecionadas para o próximo teste (predição de toxicidade in silico). ABORDAGEM 2: Simulações exaustivas de docagem utilizando diferentes algoritmos Algoritmos de docagem molecular Em paralelo a abordagem baseada em estrutura do farmacóforo, simulações de docagem molecular foram realizadas utilizando quatro diferentes e bem estabelecidos programas: GOLD, AutoDock, FlexX e Surflex-Dock. GOLD (Generic Optimization for Ligand Docagem) é um programa que aplica um algoritmo genético para docagem de ligantes flexíveis em sítios de ligação de proteínas utilizando Algoritmo Genético. O programa dá algumas opções relacionadas à função de pontuação e, entre elas, elegemos o GoldScore para ser utilizado em nossas simulações.

AutoDock utiliza um campo de força semi-empírico de energia livre para avaliar conformações durante as simulações de docagem e proporciona muitos métodos para realização da busca conformacional. O Algoritmo Genético Lamarckiano, uma modificação do Algoritmo Genético tradicional, foi nossa escolha para este estudo. hlexX toi implementado como Algoritmo de Construção Incrementai, onde o fragmento base (o centro do ligante) é automaticamente selecionado e colocado dentro do sitio ativo usando uma abordagem algorítmica baseada em uma técnica de reconhecimento de padrão chamada de agrupamento de configurações (pose clustering). Após um bom conjunto de localizações ter sido obtido como base, as porções remanescentes do ligante são divididas em pequenos fragmentos e incrementalmente “crescem” dentro de bases alternativas. O algoritmo Surflex-Dock aplica a função de pontuação empírica Hammerhead e usa um ligante de sitio ativo idealizada, ou “protomol”, para gerar ligantes pela construção incrementai, e também usa um procedimento de cruzamento de informações que combina pedaços com configurações distintas. Protomols foram computadas usando a posição do ligante cognato para definir o sitio de ligação.

Receptor Proteico O receptor proteico escolhido das simulações com MtlnhA foi aquele com o código PDB 1P44 e a coenzima NADH foi tratada como parte do receptor. Em todas as simulações de docagem a estrutura do receptor foi mantida rígida, enquanto os ligantes foram tratados com total flexibilidade.

Conjunto de moléculas O conjunto de moléculas foi o mesmo utilizado para a abordagem baseada no farmacóforo.

Simulações de docagem Inicialmente, foi realizado docagem com todas as moléculas do conjunto de dados inicial dentro de MtlnhA usando GOLD. O sítio ativo foi definido como incorporando todos os resíduos de aminoácidos com uma esfera de raio 8.0 A centralizada no ligante cristalográfico ligado no 1P44 (Genz-10850). As 100 moléculas mais bem ranqueadas pelo GOLD foram selecionadas para serem submetidas a outros três programas, AutoDock, FlexX e Surflex-Dock, usando os mesmos parâmetros do GOLD, sendo somente djferente os algoritmos para busca e pontuação das melhores configurações do ligante, os quais são característicos de cada programa. Os ligantes que obtiveram uma conformação muito similar, em termos de posicionamento dos grupos funcionais, em pelo menos três dos quatro algoritmos, foram selecionados para o próximo passo (predição de toxicidade in silico).

Predição de toxicidade in silico Toxicidade não aceitável ainda é o maior gargalo no processo de descoberta de fármacos. A fim de superar esse problema, técnicas de predição de toxicidade in silico são rápidas são alternativas de baixo custo (ou suplementos) de ensaios biológicos para a identificação de efeitos tóxicos em um estágio inicial de desenvolvimento de produto. Portanto, como uma analise adicional in silico para todas as moléculas selecionadas pela primeira e pela segunda abordagem, nós utilizamos o sistema de informática de descoberta de fármacos OSIRIS para predizer as características de toxicidade. O OSIRIS Property Explorer (disponível em http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/) é parte integrante do sistema de registro de substâncias interno do Actelion. Ele calcula as propriedades relevantes para fármacos simultaneamente enquanto o usuário desenha a molécula. As moléculas selecionadas por ambas abordagens usadas na presente invenção foram submetidas ao OSIRIS e todas aquelas que apresentaram características desfavoráveis foram removidas do conjunto final de moléculas para serem testadas in vitro.

Análise de similaridades com fármacos e alvos existentes Para os ligantes que passaram nos testes de análise de toxicidade, foi realizada uma busca utilizando a ferramenta online SEA (Similarity Ensemble Approach - http://sea.bkslab.org/search/) para acessar as relações entre nossos escolhidos e moléculas que já possuem propriedades e alvos descritos.

Medidas de inibição enzimática de MtlnhA in vitro Para avaliar a potência relativa de cada ligante selecionado, medidas de velocidades em estado estacionário na presença de ligantes foram realizadas utilizando espectrofotômetro visível no UV UV-2550 (Shimadzu®), monitorando a oxidação de'NADH~em^340-nm-(ep:NADH-=-6,22._x.1.0l3__Mllçm'1) devido à redução do substrato 2-frar?s-dodecenoil-CoA. Experimentos foram realizados a 25°C, em 100 mM NahhPCU pH 7.5 e medidas das reações químicas de catálise enzimática começaram com a adição de MtlnhA à mistura. Resumidamente, diferentes concentrações (1 - 20 ??) de compostos selecionados foram adicionados à mistura reacional e a velocidade enzimática foi analisada como a % de inibição. A taxa máxima de reação enzimática (100% de atividade MtlnhA) foi determinada na ausência do inibidor, e na presença de concentrações fixas não saturantes de NADH (60 ?? s Km) e 2-trans-dodecenoil-CoA (45 ?? = Km).

Para determinar o modo de inibição e constante de inibição (Kj), taxas iniciais foram medidas como uma função da concentração de NADH em uma concentração fixa não saturante de 2-frans-dodecenoil-CoA (45 ??) e concentrações fixas variantes de inibidor (0, 1, 10 e 20 ??). Estudos de inibição foram também realizados na presença de concentração fixa não saturante de NADH (60 ??) e concentrações fixas variantes de inibidor (0, 6, 10 e 20 ??), e 2-trans-dodecenoil-CoA como substrato variável. Os valores de K\ para ambos substratos foram calculados ajustando os dados da equação descrevendo a inibição não competitiva (Eq. 1), na qual [I] é a concentração do inibidor, [S] é a concentração do substrato, Km é a constante de Michaelis-Menten, Vmax é a velocidade máxima e Ki é a constante de inibição total.

Eq. 1 Seleção de moléculas para testes in vitro -A-seleçãp final para moléculas testadas in vitro para verificação de sua atividade inibitória contra MtlnhA foi baseada'em- todas-análises descritas acima. Das 19 moléculas restantes, quatro foram escolhidas para serem testadas in vitro, a fim de abordar diferentes modos de interação com a cavidade de ligação com o substrato da MtlnhA. Para a primeira abordagem baseada em farmacóforo, foi escolhido ZINC22559057, o qual interage com a cavidade de ligação principalmente por meio de contatos hidrofóbicos. ZINC09137707 não está ligado pelo hidrogênio a NADH; entretanto, ele realiza duas pontes de hidrogênio com Tyr158 e diversas interações hidrofóbicas.

Tabela 1 - Informação sobre as moléculas selecionadas pela Abordagem 1 Tabela 2 - Informação sobre as moléculas selecionadas pela Abordagem 2 Estudo de inibição por cinética do estado estacionário Uma escolha inicial mostrou que três dos seis compostos selecionados apresentaram uma porcentagem satisfatória de inibição (%), de forma que foram realizadas outras analises complementares com abordagens diferentes. O composto ZINC02931014 com uma concentração final de 2 ?? mostrou 5,5% de inibição da atividade enzimática de MtlnhA, enquanto ZINC12509636 em uma concentração de 4 ?? mostrou 2,5% de inibição. O decaimento linear da atividade enzimática de MtlnhA em função do aumento das concentrações de ZINC02931014 e ZINC12509636 permitiram uma estimativa de valores de IC5o de cerca de 24 ?? e 83 ??, respectivamente. O composto ZINC09137707 com uma concentração final de 1 ?? mostrou 15% de inibição enzimática de MtlnhA. Dessa forma, o composto ZINC09137707 foi selecionado para estudos posteriores. O modo de inibição e os valores da constante de inibição (K,) foram derivados a partir de taxas iniciais medidas conforme descrito na seção Material e Métodos. Gráficos de dupla reciprocidade com concentrações diferentes de ZINC09137707 demonstram um padrão de linhas paralelas, sugerindo que esse composto age como inibidor não-competitivo de NADH e 2-trans-dodecenoil-CoA, no qual os valores de VVnax e Km foram simultaneamente reduzidos. A equação 1 se mostra adequada ao comportamento de inibidores não-competitivos, com valores de K, de 24 (± 3) ?? e 20 (± 2) ?? para, respectivamente, NADH e 2-fra/7S-dodecenoil-CoA.

Esse perfil de inibição indica que o inibidor se liga exclusivamente ao complexo enzima-substrato (ES), levando a inativação do complexo enzima-substrato-inibidor (ESI), e a afinidade do inibidor é máxima em concentrações saturantes de substrato.

De maneira interessante, para inibidores não competitivos, a inibição enzimática não pode ser superada por altas concentrações de substrato, o que é uma fraqueza dos inibidores competitivos. Esses estudos de inibição de bancada proporcionam suporte aos métodos de seleção in silico aqui descritos como ferramentas para mineração de compostos químicos com atividade inibitória da enzima MtlnhA e pode se mostrar útil para demais esforços de descoberta de fármacos.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Compostos, Uso, Composição Farmacêutica Inibidora de Redutase em Microorganismos, Ligante de inhA, e, Método para OBTENÇÃO DE LIGANTES DE INHA A PARTIR DE DERIVADOS DE ACETAMIDA, UREIA, FENOL E CARBOXAMIDA

Claims (13)

1. Composto inibidor de redutase em microorganismo-earacterizado por compreender a fórmula I: (fórmula I) onde R1 e R4, sendo os mesmos iguais ou distintos, compreendem qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O'; R2 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de oxigênio; e R3 e R5 compreendem qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de hidrogênio.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por R1 e R5 serem átomos de hidrogênio; R2 é -CH2; R3 serem etilas, R4 ser um átomo de cloro.

3. Composto inibidor de redutase em microorganismo caracterizado por compreender a fórmula II: (fórmula II) onde R1-R2, sendo os mesmos ou distintos, compreendendo qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O'; e R3 compreendendo qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de oxigênio.

4. Composto de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por R1 ser um átomo de hidrogênio; R3 ser um -CH2 e R2 ser uma metila na posição orto.

5. Composto inibidor de redutase em microorganismo caracterizado por compreender a fórmula III: (fórmula III) onde R1 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou 0;e R2 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de oxigênio.

6. Composto de acordo com reivindicação 5 caracterizado R1 ser um átomo de hidrogênio e R2 ser um -CH2.

7. Composto inibidor de redutase em microorganismo caracterizado por compreender a fórmula IV: (fórmula IV) onde R1 e R3 podem, sendo os mesmos iguais ou distintos, compreender qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos, um átomo de hidrogênio, um átomo do grupo dos halogênios, OH ou O"; e R2 compreende qualquer cadeia alquílica contendo de 1 a 10 carbonos ou um átomo de hidrogênio.

8. Composto de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por R1 serem átomos de hidrogênio, R2 ser uma propila e R3 ser uma metila na posição orto.

9. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreender: a) compostos de fórmula I e/ou li e/ou III e/ou IV; e b) veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uso dos compostos de fórmula I e/ou II e/ou III e/ou IV caracterizado por ser na fabricação de medicamento com ação antimicrobiana.

11. Ligante de inhA caracterizado por ser um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

12. Método para obtenção de ligantes de inhA caracterizado por compreender: - avaliação in silico de potenciais ligantes de inhA; - predição in silico de toxicidade e/ou dos referidos ligantes; e - testes in vitro dos referidos ligantes, notadamente estudos cinéticos e/ou de inibição de inhA.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender as etapas de: - seleção da biblioteca de moléculas; - geração do modelo farmacofórico; - geração do farmacóforo 3-D e busca em bancos de dados; - modelagem molecular; - testes in silico de docagem molecular; - predição in silico de toxicidade; - medidas de inibição enzimática de MtlnhA in vitro; - seleção de moléculas para testes in vitro; e - estudo de inibição por cinética do estado estacionário.