BR102012028235A2

BR102012028235A2 - Composição e formulação a base de óleo de arroz e usos

Info

Publication number: BR102012028235A2
Application number: BR102012028235-6A
Authority: BR
Inventors: Paulo Eduardo Neves Ferreira Velho; Bruno Grosselli Lania; Maria Leticia Cintra; Walter Szortika Tessmann
Original assignee: Unicamp; Helmut Tessmann Ind E Com De Oleos Vegetais Ltda
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2014-10-21
Also published as: BR102012028235B1; WO2014066968A1

Abstract

COMPOSIÇÃO E FORMULAÇÃO A BASE DE ÓLEO DE ARROZ E USOS A presente invenção descreve uma composição e sua formulação a base de óleo de arroz de uso tópico com alta capacidade de cicatrização cutânea. A composição é capaz de manter a área cicatricial com umidade ideal e as áreas periféricas secas e protegidas, além de apresentar uma ação sistêmica, fatores que aceleram o processo cicatricial.

Description

COMPOSIÇÃO E FORMULAÇÃO A BASE DE ÓLEO DE ARROZ E USOS

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma composição a base de óleo de arroz. Mais especificamente o presente invento trata de uma composição de uso tópico com alta capacidade de cicatrização cutânea. Além disso, são objetos adicionais seu uso e uma formulação compreendendo a referida composição.

Fundamentos da Invenção

As tentativas humanas de intervir no processo da cicatrização de

feridas, sejam elas acidentais ou intencionalmente promovidas durante procedimentos cirúrgicos, remontam à Antiguidade. A incidência e a prevalência de úlceras crônicas é extremamente alta, repercutindo em elevados custos financeiros. Embora no Brasil não se encontre dados precisos, 15 alguns trabalhos demonstram que há grande impacto psíquicossocial e econômico da cronificação de feridas. Elas são a segunda causa de afastamento do trabalho no Brasil (Ereno, 2003).

Muitas variáveis tanto de ordem geral como de ordem local influenciam esse longo e complexo processo. Dos fatores gerais, interferem a 20 idade, o estado nutricional do paciente, a existência de doenças de base, como diabetes, alterações cardiocirculatórias e de coagulação, aterosclerose, disfunção renal, quadros infecciosos sistêmicos e uso de drogas sistêmicas. Além deles, interferem também a localização anatômica da lesão, raça, técnica cirúrgica utilizada, etc (Mandelbaum, 2003).

Para que uma úlcera cutânea apresente cicatrização, ocorre, a

nível celular e molecular, uma cascata de eventos que trabalham em conjunto para a repavimentação e reconstituição do tecido lesado (Ortonne, 1994).

O processo de cicatrização pode ser dividido de forma mais simples em três fases: inflamatória, proliferativa e de remodelação (Pittman, 2007). Na fase inflamatória, depois de iniciada a coagulação hemostática, inúmeros mediadores químicos são liberados por células inflamatórias. Nos três primeiros dias, predomina a ação dos polimorfonucleares, responsáveis pela fagocitose de bactérias. O macrófago é a célula mais importante desta fase e permanecerá do terceiro ao décimo dia. Os linfócitos aparecem na lesão aproximadamente com uma semana. As Iinfocinas por eles liberadas têm 5 influência na ação dos macrófagos (Mandelbaum, 2003). Além destas, esta fase conta com a fibronectina. Sintetizada por fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais, ela adere simultaneamente à fibrina, ao colágeno e a outros tipos de células, funcionando assim como cola para consolidar o coágulo de fibrina, as células e os componentes de matriz (Mosher, 1981). io A fase de proliferação é responsável pelo fechamento

propriamente dito da lesão. Nela acontece a reepitelização pela migração dos queratinócitos a partir das bordas da ferida e dos anexos, se estes foram preservados (Dielgmann et al., 1981; Clark, 1985; Gentilhomme et al, 1999). As citocinas modulam o processo inflamatório que é necessário no processo 15 cicatricial, mas que pode ser prejudicial se excessivo. Elas também são responsáveis por uma cicatrização mais rápida e eficaz (Gentilhomme et al, 1999). A formação da matriz depende, além das células inflamatórias e endoteliais, do fibroblasto responsável pela produção de substâncias importantes tanto para o desbridamento como para a remodelação fisiológica 20 (Van Winkle, 1967). A proliferação de vasos que ocorre nesta fase é essencial para o suprimento de oxigênio e nutrientes para a cicatrização. Desta forma, pode-se dizer que a fase de proliferação é dividida em reepitelização, fibroplasia e angiogênese (Mandelbaum, 2003).

A remodelação é a última fase, dura meses e é responsável pelo 25 aumento da força de tensão e diminuição do tamanho da cicatriz. Reformulações dos colágenos, melhoria nos componentes das fibras colágenas, reabsorção de água são eventos que permitem uma conexão que aumenta a força da cicatriz e diminui sua espessura (Doillon et al., 1985). A neovasculatura local diminui, e a área cicatricial normal tem cerca de 80% da 30 força de tensão da pele normal, não é volumosa e é plana (Mandelbaum, 2003). Dentre as substâncias relacionadas com a inflamação que acredita-se interferirem no processo cicatricial, destacam-se as seguintes: adiponectina, leptina, interleucina (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-12, fator de necrose tumoral (TNF)-a, fator de crescimento relacionado à insulina (IGF)-I, interferon (IFN)-a e IFN-γ.

A adiponectina uma proteína que atua na homeostase de glicose e lipídeos. Os níveis de adiponectina circulante são altos, chegando a aproximadamente 0,01% das proteínas plasmáticas (Basu, 2009). É induzida durante a diferenciação do adipócito e sua secreção é estimulada por insulina. 10 A adiponectina é uma adipocina que influência o metabolismo sistêmico. Atua no metabolismo de glicose e ácidos graxos, sendo em algumas situações antagonista ao TNF-α (Yano, 2008). Induz uma diminuição nos níveis séricos de glicose e triglicérides, aumenta o nível de glucagon. No fígado promove a inibição insulina-dependente da gliconeogenese e tem ação antifibrosante; no 15 músculo esquelético promove o uso e oxidação de ácidos graxos, uso de glicose e produção de lactato. Age como anti-inflamatório e tem ação protetora contra a aterosclerose (Berg, 2001). Na pele de pacientes diabéticos, a adiponectina atua diretamente nos queratinócitos, regulando a expressão de substâncias imunomoduladoras produzidas por estas células; isso indica que a 20 adiponectina atua indiretamente sobre outras células, através dos produtos dos queratinócitos. Outra ação seria a supressão da proliferação e diferenciação dos queratinócitos, o que seria benéfico em casos de hiperqueratinização (Kaway, 2008). Estudo realizado no Brasil aponta que o sobrepeso tem a capacidade de aumentar o tempo de cicatrização (Nascimento, 2006).

A falta de leptina nos animais, assim como nos humanos, pode

levar a um aumento de peso e também ao aumento no tempo necessário para cicatrização. A administração direta de leptina leva a diminuição do tempo de cicatrização, com maior reepitelização, mas sem interferir na angiogênese. Outro fato observado em animais é do aumento da expressão de genes de receptores para leptina localmente, o que indica a importância da leptina para o processo cicatricial. A leptina leva a um aumento dos queratinócitos no local de aplicação, no início da cicatrização (Nascimento, 2006).

A IL-2 é uma citocina pleiotrópica (assim como a maioria das citocinas), isto é, têm múltiplos efeitos: uma única citocina pode interagir com mais de um tipo de célula, ter múltiplas atividades biológicas, interagir com outras citocinas, com as quais pode ter sobreposição de atividades (Arai, 1990). Produzida primariamente por linfócitos T ativados mitogênica ou antigenicamente. Possui papel chave na promoção da expansão clonal de células T antígeno-específicas. Além disso, a IL-2 é capaz de mediar múltiplas respostas imunes numa variedade de tipos celulares. A IL-2 estimula a proliferação dos timócitos, a proliferação e diferenciação de células B ativadas; promove o crescimento e diferenciação e a atividade citocida dos monócitos; induz o crescimento das células natural killere a produção nelas de citocinas e da ativida citolítica; aumenta a produção de células LAK (células Merativadas por linfócito) e induz a proliferação e diferenciação de oligodendrócitos (Goldsmith, 1994). Em situações de cicatriz hipertrófica e quelóides o IL-2 é encontrado em linfócitos locais, sugerindo ação pró-cicatricial (Armour, 2007).

A IL-4 também é uma citocina pleiotrópica que possui múltiplas atividades de modulação de resposta imune numa variedade de tipos celulares. É um fator de ativação/diferenciação das células B, que regula a troca de isótopo do Ig, particularmente IgGI e IgE. Ela suprime o desenvolvimento de células T CD4+ produtoras de IFN-γ e regula a diferenciação de células T helper naive no subconjunto Th2 que media a resposta alérgica e humoral imune. Junto com o TNF-α induz sinergicamente a expressão de VCAM-1 (molécula de adesão à célula vascular 1) em células endoteliais e musculares lisas, resultando no recrutamento seletivo de eosinófilos e linfócitos no sítio de inflamação. A IL-4 regula negativamente a produção de mediadores inflamatórios como a IL-1, TNF-α, e prostaglandina 2 (PGE2) em monócitos. Foi demonstrado atividade anti-tumoral tanto in vivo quanto in vitro. As células que secretam IL-4 são os basófilos, T CD8+, CD4+ de memória e Th2 naive, mastócitos, eosinófilos e células dendríticas ativadas por vírus. A IL-4 é a principal responsável por estimular a produção de tenascina (uma glicoproteína da matriz extracelular, presente como uma fina camada na derme papilar adulta, mas que é reexpressa no processo cicatricial) por fibroblastos, nas fases anteriores da deposição de colágeno e migração celular (Makhluf, 1996).

A IL-6 é uma citocina que desempenha papéis importantes na

defesa do hospedeiro, em reações de fase aguda, inflamação, hematopoiese, metabolismo ósseo, e progressão do câncer. A IL-6 é essencial para a transição de inflamação aguda. Ela é secretada por vários tipos de células e a produção é regulada por numerosos sinais como estímulos mitogênicos ou antigênicos, lipopolisacarídeos, cálcio, outras citocinas e vírus. As citocinas IL

4, IL-10 e IL-13 inibem a expressão de IL-6 nos monócitos (Hirano, 1996). Níveis sorológicos elevados de IL-6 foram observados em situações patológicas como infecções virais e bacterianas, trauma, doenças autoimunes e inflamação. A IL-6 aumenta no início do processo cicatricial e é importante, 15 pois possui propriedade mitogênicas nos queratinóctios, assim como quimiotático para neutrófilos e a infiltração destes até a área afetada, tem capacidade de aumentar a angiogênese local e aumenta a deposição de colágeno no local da ferida (Lin, 2003).

A IL-12 é uma glicoproteína heterodimérica, que aumenta a 20 atividade citotóxica e induz a produção de IFN-γ nas células natural killer, TeT dendríticas da epiderme. Também induz a produção de IFN-γ nos macrófagos. Esta citocina, em conjunto com outras da mesma família (IL-23 e IL-27), é capaz de promover o desenvolvimento de resposta imune através de células T CD4+ Th1; em resposta a infecções, a IL-12 promove a produção de células 25 Th1, após a IL-27 ter transformado o ThO em Th0/1; junto com a IL-18, a IL-12 cria células Th1 de memória a partir de células efetoras (Hamza, 2010). Em processos cicatriciais, a IL-12 tem sua expressão genética aumentada, fazendo com que os macrófagos produzam e secretem mais IFN-γ(Ishida, 2004).

O TNF-α desempenha papéis críticos na resistência normal do hospedeiro à infecção e ao crescimento de tumores malignos, servindo como imunoestimulantes e como mediadores da resposta inflamatória. Excesso de produção de TNF, no entanto, tem sido implicada como desempenhando um papel numa série de condições patológicas, incluindo caquexia, choque séptico, e doenças auto-imunes. O TNF-α é produzido por ativação dos macrófagos e outros tipos de células, incluindo células TeB, células NK, 5 células endoteliais, células musculares lisas e algumas células tumorais. Na cicatrização a ausência de receptores para esta citocina acelera o processo (Ware, 1996). Em feridas, o TNF- α é um dos responsáveis por iniciar a cascata pró-inflamatória, sendo responsável pela força e tensão cicatricial (Mast, 1996).

O IGF-I, também conhecido como somatomedina C, é um ío membro da superfamília insulina. Foi descoberto como um mediador de ações do hormônio no crescimento de células somáticas, mas também tem sido demonstrado ser um importante regulador do metabolismo celular, diferenciação e sobrevivência. IGF-I é sintetizado como uma pré-proteína que é proteoliticamente clivada para gerar a proteína madura (Humbel, 1990). O IGF15 1, juntamente com o fator de crescimento derivado de plaquetas 2 (PDGF-2) , pode aumentar a espessura da pele na cicatrização de feridas (Lynch, 1989), e esta substância está diretamente envolvida na regeneração de vários tipos de tecidos, não apenas o epitelial (Chen, 2010).

O IFN-α é uma glicoproteína pertencente à família das citocinas 20 que participa no controle e na replicação celular, na defesa do hospedeiro contra organismos estranhos, como vírus ou bactérias e é um dos principais interferons de tipo I. É produzido por fagócitos mononucleares em resposta à infecção viral. Tem papel na inibição da replicação viral e aumenta a expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade do tipo I (MHC tipo 25 I), seja por atuação autócrina ou parácrina (Krause, 2005). Outra forma de ação do IFN-α é proteger algumas células contra a entrada de vírus. Numerosas investigações mostraram que o IFN está envolvido na regulação do crescimento celular e no efeito imunomodulatório (Ferrantini, 2007).

O IFN-γ, também conhecido como interferon do tipo II, foi inicialmente identificado como produto com atividade anti-viral de linfócitos T ativados mitogenicamente. Possui papel chave na defesa do hospedeiro exercendo atividades imunoregulatórias, anti-proliferativas e pró-inflamatórias (Boehm, 1997). Algumas das funções mais importantes são a estimulação de funções efetoras dos macrófagos, aumento da diferenciação de Th1 induzido por IL-12, modulação da expressão das classes I e Il de moléculas do MHC, 5 regulação da troca de classe de imunoglobulinas (Ig) e regulação das interações entre leucócitos e endotélio. O IFN-γ também foi envolvido em papéis fisiológicos em neurônios sensores e na espermatogênese (Neumann, 1997; Kanzaki, 1998).

Ambos os interferons possuem ação anticicatricial, atuando na ío inibição da síntese de colágeno e proliferação celular e podem aumentar a produção de metaloproteinases. O IFN-α pode aumentar a produção da enzima colagenase, o que aumenta sua ação anticicatricial. Deste modo, ambas devem ter seus valores aumentados na fase final da cicatrização, impedindo que a mesma evolua para lesão hipertrófica (Tredget, 2000)

Estudos têm sido realizados avaliando o potencial do uso de

produtos naturais como princípio ativos de recursos para cicatrização. Entre estes, foram realizados estudos com dendezeiro (Sasidharan, 2012), água termal (Faga, 2011), babosa (Duansak, 2003), Jatyadi Taila (Shailajan, 2011), óleo de pinha (Tumen, 2011) e hortelã (Takayama, 2011).

Estudo realizado com óleo do farelo de arroz demonstra que este

possui capacidade de aumentar a resposta imune de camundongos, como a proliferação de linfócitos B e de citocinas como IL-2 e TNF-α, assim como a diminuição de IL-4 e IgE (Sierra, 2005). Um estudo com orizanol isolado de óleo de farelo de arroz indica que este fitoquímico tem capacidade de aumentar 25 a atividade imune celular e humoral, como a resposta hipersensitiva tardia, induz a produção de anticorpos por linfócitos BeT, aumenta a hematopoiese e a fagocitose induzida por macrófagos (Ghatak, 2012). Outro estudo mostra que o uso de compostos bioativos do óleo de farelo de arroz tem ação antiidade quando usado em formulações tópicas na pele de coelhos, onde o gel e 30 creme formulados com os bioativos não apresentaram eritema nem edema local, assim como melhorou a hidratação, elasticidade, espessura e rugosidade da pele de voluntários humanos (Manosroi, 2012). Em 2002, de Paepe e colaboradores descreveram que o uso de amido de arroz, tanto na água do banho quanto em formulações sem lipídeos ou loção de banho de “água em óleo” levou a um aumento de 20% na capacidade de cura de pacientes com 5 dermatite atópica, assim como melhorou as funções de barreira da pele (de Paepe, 2002). É relatado também que o óleo de farelo de arroz é fonte natural de esqualeno (um triterpeno intermediário na biossíntese do colesterol) que é o principal componente dos lipídeos poliinsaturados da superfície da pele e apresenta vantagens para a pele como emoliente e antioxidante, assim como ío para hidratação e atividades antitumorais, tendo potencial de desenvolvimente de dermocosméticos (Huang, 2009). Outro estudo indica que o consumo de cerca de 18 gramas de leite modificado de farelo de arroz, por 5 semanas, tem capacidade de diminuir a concentração sérica de colesterol e também de colesterol LDL em pacientes com diabetes do tipo 2 (Lai, 2011). Pesquisadores 15 da Coréia do Sul relataram que uma dieta com arroz integral (presente em muitas bebidas e chás e comercializado como um tipo de “arroz integral germinado”) suprime o ganho de peso e a acumulação de gordura no fígado e adipócitos epididimais e melhorou os perfis séricos de lipídeos, em parte por controlar a adipogênese através da redução de fatores transcricionais (Ho, 20 2012). Uma pesquisa, com óleo de farelo de arroz associado a diacilglicerol, conduzida em Calcutá, indicou que o consumo deste óleo diminui significantemente o peso dos ratos e a quantidade de colesterol e triglicérides circulantes no plasma, indicando um possível uso para prevenção de obesidade e incidência de hipercolesterolemia (Dhara, 2012). Porém, há estudo 25 que indica que lipídeos isolados de óleo de arroz refinado tem capacidade de causar úlcera duodenal em ratos (Jayaraj, 2000).

Dentre os documentos encontrados no Estado da Arte, destaca-se o de Paepe (Paepe et al., 2002) e colaboradores que descrevem o uso de fécula de arroz em duas formulações para o tratamento de doenças dérmicas. O uso da fécula do arroz suspenso em água foi utilizado para aumentar a função de barreira de uma pele danificada, porém não ulcerada. O documento não avalia o uso de óleo de arroz, nem tão pouco a ação sobre a cicatrização.

O documento US20020182260 de 11/03/2002 trata de um produto anti-inflamatório contendo pelo menos um óleo ou cera de origem animal, 5 mineral ou vegetal e dentre as opções de fonte vegetal eles citam o farelo de arroz. Neste pedido os inventores citam o uso de qualquer óleo de origem mineral, animal e vegetal, entre eles o óleo de arroz, que possam ter uma ação imunomoduladora utilizado em qualquer concentração e veiculados em qualquer formulação.

io Contudo, o trabalho inventivo restringe-se ao método para a

obtenção de composições que contenham um agente terapêutico que cause a inflamação e um concentrado de imunomoduladores. Os próprios inventores fazem menção a patentes anteriores que possuem substâncias antiinflamatórias na sua composição e não consideram que no processo cicatricial 15 o benefício do uso de determinado produto se dá, muitas vezes, pelo equilíbrio de ação pró e anti-cicatricial daquele produto, uma vez que a inflamação é necessária na cicatrização e a mesma pode ser prejudicial ao processo se demasiada. A ação do TNF-alpha no processo cicatricial torna clara esta realidade. Esta citocina pode ter ação pró ou anti-cicatricial dependendo da 20 concentração ou da fase do processo cicatricial em que é utilizada, como estudado por Mast já em 1996. A adiponectina, por exemplo, tem uma ação anti-cicatricial o que é desejável na fase de final do processo cicatricial chamada de remodelação, a fim de evitar-se a formação de quelóides.

Assim, um mesmo produto inflamatório pode ter ação antiinflamatória e é necessária a comparação e trabalho inventivo para obter-se um produto cuja ação in vivo se mostre benéfica no processo cicatricial como um todo.

Já o pedido US20070207222 de 28/02/2007 descreve uma composição que inclui uma cera para tratamento de doenças anti-inflamatórias, dentre as opções de cera eles citaram a de arroz. Nesta patente a substância terapêutica é o tar utilizado para tratamento tópico de doenças dermatológicas responsivas ao tar. Os inventores citam a cera do arroz como uma substância possível de ser adicionada à solução do tar e a fécula de arroz como um possível absorvente a ser adicionado ao tar.

O documento W02004093569 de 11/02/2004 descreve uma composição a base de mel e farinha de arroz, que no documento é destacado por absorver os fluidos da ferida, mantendo o mel por mais tempo no local. É mesmo como o citado, não havendo menção do uso do óleo como princípio ativo.

Diante das informações disponíveis no estado da técnica o ío processo de descrito na presente invenção apresenta vantagens sob vários aspectos. Primeiro, sobre as características de um produto eficaz para o tratamento de feridas devem incluir a facilidade de remoção do produto e o conforto do mesmo para o paciente, boa relação custo/benefício, manter a área cicatricial com umidade ideal e as áreas periféricas secas e protegidas, facilidade de aplicação e adaptabilidade (conformação às diversas partes do corpo). Outro diferencial do processo aqui descrito está relacionado com ação sistêmica que a tecnologia possui, onde os níveis séricos de algumas substâncias foram alterados, assim como é capaz de acelerar o processo cicatricial em relação ao tipo de colágeno depositado no local, sendo mais eficaz que outros produtos comumente utilizados para este fim.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção trata-se de uma composição a base de óleo de arroz de uso tópico com alta capacidade de cicatrização cutânea. Além disso, a presente invenção refere-se também ao uso e a formulação da referida composição.

Breve descrição das figuras

A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência às figuras em anexo e à seguinte descrição:

- A Figura 1 apresenta a área não cicatrizada dos ferimentos (%)

ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do grupo 1 (Controle). - A Figura 2 mostra a área não cicatrizada dos ferimentos (%) ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do Grupo 2 (AGE).

- A Figura 3 apresenta a área não cicatrizada dos ferimentos (%) ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do Grupo 3 (Óleo de arroz).

- A Figura 4 apresenta um gráfico referente à celularidade no lado controle dos 3 grupos.

- A Figura 5 apresenta um gráfico referente à celularidade no lado tratado nos três grupos.

Breve descrição dos anexos

- Anexo 1 mostra o aspecto dos ferimentos do lado submetido aos tratamentos durante quatro dias.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção descreve uma composição tópica a base de óleo de arroz para cicatrização.

Os principais exemplos de produtos que podem ser preparados partindo-se da composição, objeto da presente invenção, são:

- Loção;

- Creme;

- Pomada;

- Pós;

- Sprays;

- Pastas;

- Géis;

- Suspensões e

- Adesivos.

A composição da presente invenção compreende os seguintes componentes:

- Óleo de arroz;

- Veículo farmaceuticamente aceitável.

Além destes componentes, a composição da presente invenção ainda pode compreender componentes opcionais para proporcionar alguma característica desejável não alcançada com os componentes já citados, como emoliente, umectante, agente quelante, sistema espessante, componente antioxidante, sistema conservante, corantes e aromatizantes.

Serão descritos a seguir com maiores detalhes os componentes utilizados na composição da presente invenção, bem como outros componentes opcionalmente adicionados na formulação. Para cada produto preparado as concentrações e componentes podem variar.

Óleo de arroz

O óleo de arroz empregado é obtido pelo processo descrito no pedido de patente BR1020120087189, e adicionado em concentração variando entre 0,001% e 99,999%, preferencialmente 70%.

A dosagem do óleo de arroz, extraído através da patente BR 10 2012 0087189, a ser usada depende de muitos fatores, tais como o agente causador, a idade, peso e condições clínicas do paciente assim como a 15 experiência e julgamento do médico ou do profissional que administra a terapia. A quantidade efetiva do óleo de arroz é a que fornece melhora no paciente detectável por um profissional qualificado. O intervalo de dosagem varia com o composto usado, a via de administração e a potência do composto particular. Veículo farmaceuticamente aceitável:

A absorção local e a eficácia da presente invenção pode ser

melhorada utilizando-se como veículo uma quantidade apropriada de ácidos graxos essenciais de cadeia média ou outros compostos químicos conhecidos por facilitar a absorção e entrega dos compostos ativos da presente invenção usada como veículo para o óleo de arroz. Este será o veículo preferencial da 25 composição da presente invenção em um percentual adequado (q.s.p.) para atingir 100% da fórmula com base no peso total da composição. Ainda podem ser utilizados outros veículos farmaceuticamente aceitáveis como solução salina e tampões.

Além destes componentes, a composição da presente invenção ainda pode compreender componentes opcionais tais como: - Agente quelante como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) e

seus sais;

- Agente ajustador de pH como trietanolamina ou hidróxidos

inorgânicos;

- Agente conservante como parabenos, ácidos orgânicos,

imidazolidininas, diazolidinas, alcoóis fenólicos;

- Emoliente como álcoois e ácidos graxos, ésteres, éteres, mono-, di- ou triglicerídeos, hidrocarbonetos naturais ou sintéticos ou carbonatos orgânicos e suas combinações.

- Umectante como glicóis, preferencialmente glicerina,

propilenoglicol, butilenoglicol e suas combinações.

- Agente bacteriostático como hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propilo, clorocresol, cloreto de benzalcônio e similares.

- Ingredientes ativos como antibióticos, anestésicos, analgésicos e descamativos. Exemplos de drogas representativas dentro dessas classes

incluem gentamicina, peróxido de benzoíla, glicocorticoides, hidrocortisona, vitamina D3, metotrexate, ciclosporina, retinóides.

- Corantes;

- Aromatizantes.

A composição descrita no presente invento pode ser preparada

empregando qualquer processo conhecido do estado da técnica. O óleo de arroz extraído através da patente BR 10 2012 0087189 pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmacologicamente aceito, e com qualquer conservante, tampão ou propelente que seja necessário. Preparados tópicos 25 podem ser feitos combinando o óleo de arroz extraído através da patente BR 10 2012 0087189, com diluentes farmacêuticos convencionais e veículos usados comumente em formulações tópicas secas, líquidas, em creme e aerossol. Pomadas e cremes podem, por exemplo, ser formulados com base aquosa ou lipídica com a adição de agentes espessantes ou geleificantes 30 apropriados. As pomadas, cremes, pastas e géis podem conter também excipientes, tais como gorduras vegetais e animais, óleos, ceras, parafinas, amido, derivados de celulose, talco, óxido de zinco, silicones, polietilenoglicol, ácido silícico entre outros. Pós e sprays podem conter excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicato de cálcio e pó de poliamida, ou uma mistura destas substâncias. Adicionalmente, os sprays 5 podem conter propelentes, tais como clorofluorohidrocarbono, butano e propano.

Exemplo 1: Testes in vivo

Para os testes foram utilizadas fêmeas de ratos isogênicos da espécie Rattus norvegicus albinus IinhagemNTacUnibiSD (SpragueDawIey), com idade média de 7 semanas e massa entre 220 a 270g. O experimento foi autorizado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Campinas, de acordo com a Lei Federal 6.638.

Após o período de adaptação nas gaiolas os animais foram preparados para a realização dos ferimentos e passaram a receber os 15 tratamentos diários com os diferentes tipos de óleo, separados em "grupos" conforme indica a tabela 1 abaixo. Em cada grupo de animais foram subdivididos para serem sacrificados nos dias 2, 4 e 10 após a aplicação do primeiro tratamento.

A mudança dos períodos projetados para sacrifício de dois, sete e 14 dias, se deu porque observou-se clinicamente um processo de cicatrização mais rápido do que o previsto nos períodos menores de 4 e 10 dias as três fases da cicatrização poderiam ser avaliadas de modo mais adequado.

Respeitando-se o sentido da cabeça para a cauda, em todos os animais foram feitas quatro feridas do lado esquerdo, designadas como "A", "B", "C" e "D" e as do lado direito outras quatro designadas "E", "F", "G" e "H". O lado esquerdo recebeu sempre o produto de "Controle" ou "Testemunha" e o direito o "Tratamento".

A tabela 1 mostra esquematicamente a distribuição das feridas e dos tratamentos recebidos por cada grupo de animais.

30 Tabela 1. Tratamentos aplicadados em cada grupo de estudo.

Lado Esquerdo (Controle) Lado Direito (Tratamento) Grupo 1 Curativo oclusivo com gaze estéril Óleo mineral Grupo 2 Oleo mineral Acidos Graxos Essenciais Grupo 3 Oleo mineral Oleo de arroz Para receber o tratamento especificado e evitar estresse, cada

animal foi conduzido para sala separada dos demais onde foi anestesiado com uma dose específica para sua classe de massa com quetamina 50mg.kg'1, 5 xilazina 7,0 mg.kg'1 e diazepam 2,0 mg.kg'1 . Após estar completamente anestesiado as regiões paravertebrais e escapulares foram completamete tricotomizadas e foi feita desinfecção com uma solução de 2% de digliconato de clorexidina para assepsia da área onde seriam produzidas as feridas.

Na área tricotomizada foram feitas 4 feridas do lado direiro e ío outras 4 do lado esquerdo, cerda de 1 cm ao longo da coluna vertebral. Para uma melhor homogeniedade dos ferimentos tanto entre os 8 ferimentos de cada animal como entre todos os animais estudados, utilizou-se um bisturí circular descartável com 6mm de diâmetro para um corte na forma de disco em toda a profundidade da pele. O fragmento cutâneo em forma de disco era 15 levantado por pinça e excisado com tesoura.

Imediatamente após os ferimentos serem produzidos, o animal recebeu a primeira aplicação do produto específico para cada ferida como estipulado na tabela 1, que foi coberta com uma gaze para cada lado do animal a fim de se evitar contaminação dos diferentes óleos aplicados no mesmo 20 animal. A gaze foi presa por esparadrapo do tipo micropore e reforçada com esparadrapo externo. Diariamente os ferimentos foram limpos com soro fisiológico, os tratamentos repetidos com os respectivos óleos e os curativos substituídos até o dia determinado para o sacrifício. Para os curativos diários os animais não foram anestesiados para que não houvesse interferência no 25 metabolismo hepático, uma vez que todos os animais aceitaram todos os procedimentos sem agressividade e foram tolerantes à manipulação. O dorso e cada ferimento de cada animal foram fotografados com câmara e lupa digital, respectivamente, para avaliação posterior. Após sorteio para sacrifício nos dias 2, 4 ou 10 os animais em que haviam sido produzidos os ferimentos foram novamente anestesiados com tiopental (85,0 mg.kg'1), fotograficamente documentados e decaptados com guilhotina. Imediatamente após, o sangue foi coletado para as dosagens das substâncias relacionadas com inflamação pela técnica Elisa.

A pele das áreas tricotomizadas da região dorsal foram excisadas até a fáscia, separando-se as metades proximais, com duas feridas de cada lado para fixação em formal a 10% até o preparo das lâminas para avaliação histopatológica.

io Novas biopsias com lâminas circulares de mesmo diâmetro foram

feitas nos quatro pontos das biopsias anteriores na porção caudal da pele excisada. Cada um dos quatro fragmentos de derme ou pele retirados foram imediatamente identificados e colocados em recipiente contendo nitrogênio líquido sendo crioconservados a -80°C no final do período do experimento até o 15 preparo para as dosagens teciduais (PCR real time) das substâncias associadas à inflamação.

A avaliação visual feita durante a manipulação diária de cada um dos animais, para renovação do tratamento, registro fotográfico e troca de curativos, indicou que no grupo 1 houve cicatrização mais rápida no lado 20 tratado com óleo mineral quando comparado com o lado em que só foi usado soro fisiológico e uma melhora comparativamente significativa dos animais do grupo 3, tratados com óleo de arroz. A partir do segundo ou terceiro dia podiase observar uma cicatrização mais efetiva dos ferimentos neste grupo. No Anexo 1 pode-se observar um exemplo do aspecto dos ferimentos no quarto 25 dia de tratamento.

No dia de sacrifício de cada animal, os ferimentos animais foram fotografados com distância focal constante, de modo a manter a mesma escala em todas as imagens. As áreas não cicatrizadas foram quantificadas em número de “pixel”. As escalas das fotografias das peças excisadas foram 30 corrigidas para determinação da área, utilizando-se o programa uImageTooI v.3 UTHSCSA - The University of Texas Health Science Center in San Antonio". Determinou-se para cada ferimento tratado, do lado direito do animal, a redução relativa ao seu oposto topográfico, do lado esquerdo, não tratado. Desse modo pode-se quantificar proporcionalmente quanto do ferimento tratado permaneceu sem cicatrização após o início do experimento, em relação aos ferimentos, do mesmo animal e no mesmo plano transversal.

Nas Figuras 1, 2 e 3 são apresentadas as curvas da regressão polinomial de segundo grau, da porcentagem da área ferida não cicatrizada nos animais dos grupos 1, 2 e 3. No eixo X são indicados os números de dias de tratamento e o no eixo Y o percentual da área ferida, não cicatrizada, ío considerando-se que no dia zero todos os ferimentos estavam com a mesma área (100%). As barras verticais vermelhas representam quando a curva de cicatrização média atingiu 75% de ferimento e 25% cicatrizada e as barras negras quando 50% da área estava cicatrizada.

Houve evidente diferença clínica na cicatrização do lado em que 15 só foi realizada a limpeza com soro fisiológico e o lado tratado com óleo mineral nos animais do grupo 1. Esta observação reforça o conhecimento descrito desde 1945 de que a cicatrização é mais efetiva mantendo-se o ambiente úmido (Field & Kerstein, 1994). Os animais do grupo 3 (óleo de arroz) apresentaram melhor processo cicatricial clinicamente, do que os outros 20 grupos. Os ratos tratados com óleo de arroz apresentaram a melhor recuperação ao longo do período de 10 dias de tratamento, tendo sido possível observar melhora já a partir do terceiro dia.

Os resultados encontrados com a medida das áreas das úlceras mostraram maior velocidade de cicatrização de forma crescente com o óleo 25 mineral, AGE e óleo de arroz. A área cicatricial por vezes era difícil de ser medida pela presença de crostas que não se destacavam com a limpeza realizada de forma delicada. Este resultado pode ser observado nos gráficos apresentados nas figuras 1, 2 e 3, onde o grupo 3 apresenta resultados com variação muito grande no dia 10, devido à presença das crostas, o que 30 inviabilizou a medição mais correta da área cicatrizada. As crostas que persistiam à tentativa suave de remoção não eram retiradas porque fazê-lo insistentemente removeria também células a elas aderidas, interferindo no processo cicatricial natural. Portanto, a avaliação objetiva histológica foi o parâmetro considerado mais relevante.

Exemplo 2: Análise histológica Os ferimentos da porção proximal foram conservados inicialmente

em álcool 90° por 24 horas e posteriormente em formol 10% em frascos individuais devidamente identificados para a elaboração das lâminas para análise histológica. Após a extração de cada ferida de uma seção longitudinal abrangendo todo o ferimento ou cicatriz remanescente, a peça foi corada pelo ío método de hematoxilina e eosina (HE) e contida em bloco de parafina para o trabalho em micrótomo e montagem da lâmina.

As lâminas foram analisadas subjetivamente e objetivamente para estimativa da taxa de cicatrização dos ferimentos de forma cega, isto é, sem que os avaliadores soubessem a identificação da lâmina que examinavam.

1) Avaliação histológica subjetiva

A avaliação histológica subjetiva foi feita de maneira cega, isto é, a médica dermatopatologista que participou do projeto, fez a avaliação sem saber a identificação das lâminas que examinava.

No dia 2 (fase inflamatória) pode-se observar que a reepitelização já havia iniciado, ou seja, a epiderme começava a proliferar para cobrir a ferida (quanto mais acelerada a cicatrização, maior a extensão da ferida que já apresentava reepitelização), porém, nesta fase do processo, não se justificava avaliar a extensão da ferida que já se encontrava reepitelizada, porque todos os animais estavam começando este processo. Os vasos estavam muito congestos; quanto maior o número de vasos dilatados, nesta fase, melhor para que a cicatrização ocorra. Foi feita uma avaliação subjetiva: 0= leve; 1 = evidente. Na fase seguinte, eles já não estavam tão dilatados, mas as suas células começaram a proliferar e foram avaliadas no item “celularidade”. O tecido colágeno dérmico bem imaturo começou a ser observado, pouco celular, com muita substância fundamental basófila. Sabe-se que para esta fase, quanto mais tecido conjuntivo jovem mais adiantada está a cicatrização. As células deste tecido conjuntivo já podem começar a aparecer nesta fase da cicatrização e quanto mais presentes, melhor o processo cicatricial. A celularidade também foi estimada, de forma subjetiva: 0= muito baixa; 1= baixa; 2= evidente; a porcentagem de colágeno jovem presente na cavidade operatória também foi estimada de forma subjetiva.

Apesar de não haver avaliação histológica no dia 3, pode-se inferir avaliando os animais do dia 4 que nesta fase houve um significante aumento da celularidade. Estas eram células endoteliais (de vasos neoformados, que trazem nutrição para ajudar a cicatrizar) e células produtoras ío de colágeno (fibroblastos e miofibroblastos). O colágeno pode ser observado em maior quantidade no dia 4 naqueles com cicatrização mais adiantada.

No dia 4 a fase proliferativa, reepitelização, já estava bem avançada, com maior extensão da área de reepitelização. A cicatrização foi avaliada: (0= incipiente; 1= avançada; 2= completa ou quase completa). Nesta 15 fase ainda havia um significante número de células, mas, nos animais em fase mais adiantada de cicatrização, a celularidade que se iniciou no 3Q dia começa a diminuir já que, à medida que o colágeno vai sendo produzido, ele vai inibindo a produção de células (chamada inibição de contato) e, nos animais nestes animais com cicatrização mais adiantada já havia colágeno maduro. 20 Naqueles com cicatrização menos efetiva havia mais células e menos colágeno maduro (observado como fibras acidófilas mais espessas) e bastante colágeno imaturo, como no 2Q dia. A cavidade formada no experimento em parte já se encontrava preenchida; contudo, não a área central. Foi estimada de forma subjetiva a porcentagem de preenchimento relativa à pele normal adjacente 25 (em 5). Quanto ao tecido que preenchia a ferida e que continha células, fibrina, colágeno jovem e colágeno maduro; a quantidade de fibras colágenas maduras foi estimada, de forma subjetiva (0= nenhuma quantidade; 1= poucas fibras; 2= fibras mais evidente; 3= várias fibras; 4= numerosas fibras).

No dia 10 (fase de remodelação) muitos animais já tinham a reepitelização completa. Alguns ainda tinham resquícios do colágeno jovem (o mesmo do 2- dia) que ainda não foi substituído pelo maduro, de fibras espessas. Uma boa parte da cavidade formada no experimento já se encontra preenchida; contudo, a área central ainda estava deprimida, relativamente à pele normal adjacente. O preenchimento foi estimado em porcentagem. Com relação ao tecido que estava preenchendo a ferida operatória, nesta fase 5 observou-se áreas mais celulares e outras menos, em proporção inversa à do número de fibras colágenas maduras. Foi feita uma estimativa percentual da quantidade de fibras colágenas maduras que ocupavam o tecido que estava preenchendo a ferida.

Na análise subjetiva, no segundo dia do experimento, observou10 se maior celularidade e presença de colágeno jovem nos animais tratados com óleo de arroz. No dia 4 notou-se reepitelização mais acentuada no óleo de arroz, AGE e óleo mineral, respectivamente. A celularidade já era menor nos animais tratados com óleo de arroz e AGE, mas o preenchimento era maior nos animais do grupo controle. No dia 10, o preenchimento era consistentemente 15 maior nos animais tratados com óleo de arroz.

A avaliação subjetiva não evidenciou diferença estatística entre os grupos, porém sugeriu uma melhor cicatrização nos animais que utilizaram o óleo de arroz nos parâmetros observados no segundo dia. No quarto dia, os achados sugeriram menor celularidade nos dois grupos: AGE e óleo de arroz, 20 contudo o preenchimento aparentou ser maior nos animais do grupo sem tratamento. No dia 10 do experimento o preenchimento foi melhor no grupo tratado com o óleo de arroz.

2) Avaliação histológica objetiva

A avaliação objetiva foi realizada em microscópio com tela de ciclóide para contagem de células. Foi avaliado o número de células nos cortes, responsáveis pela cicatrização dos ferimentos. Para tanto quantificaram-se os núcleos celulares que tocavam os semi-círculos do ciclóide.

No ciclóide há 30 semi-círculos. Cada núcleo que toca um dos ciclóides ou semi-círculos foi contado. Este é um método comparativo, que mostra se a cicatrização está desenvolvida (adulta, composta de fibrócitos) ou se ainda é jovem (composta por fibroblastos). Na “fase adulta”, o número de núcleos é pequeno; na “fase jovem”, o número de núcleos é maior. Dessa forma, se uma amostra tem muitos núcleos, pode-se dizer que o tecido é jovem (ainda está no início do processo cicatricial).

Os resultados podem ser visualizados nas Figuras 4 e 5. A menor

celularidade foi observada nos lados tratados com óleo de arroz e com AGE, sugerindo uma melhor cicatrização nestes animais.

A avaliação objetiva mostrou uma menor celularidade nas úlceras tratadas com óleo de arroz quando comparadas com o lado contralateral em ío que as úlceras foram tratadas com óleo mineral o que documentou uma melhor cicatrização com este óleo. As úlceras tratadas com óleo de arroz e depois com AGE tiveram cicatrização melhor que quando foi usado apenas óleo mineral e soro fisiológico nas úlceras dos animais do grupo 1. Os resultados encontrados no tratamento com óleo de arroz sugerem uma possível ação sistêmica do 15 óleo, pois a contagem de células do lado controle dos animais do grupo do óleo de arroz foi menor do que o do grupo 1.

Não foi possível detectar diferenças estatísticas entre os grupos possivelmente pelo tamanho das amostras, pois observando as médias de cada grupo pode-se notar que o grupo 1 reduziu a quantidade de células quase 20 que a metade do que o grupo 3 conseguiu reduzir. Apesar dessa grande diferença as análises estatísticas não foram significativas. O mesmo poder ter acontecido com os testes dentro de cada grupo. Pode-se dizer que há diferença estatística entre a menor quantidade de células encontradas nos animais submetidos ao tratamento do grupo 3 e a quantidade de células 25 encontradas no lado sem tratamento do grupo 1.

3) Análise estatística da contagem de células

A análise foi feita para investigar a existência, ou não, de diferenças entre os três grupos em estudo (1, 2 e 3) e também dentro de cada grupo avaliando possíveis diferenças entre o tratamento e o controle dentro dos grupos.

• Estudo da Diferença Entre os Grupos Para este estudo foi considerada a diferença na quantidade de células entre o tratamento e o controle, ou seja, em cada um dos grupos foram computadas as diferenças, na quantidade de células contadas, entre controle e tratamento. Após a determinação desta diferença foi aplicada a análise de variância (ANAVA) nesses dados.

De acordo com a ANAVA pode-se dizer que não existe diferença significativa, na contagem de células, entre os três grupos em estudo, pois o pvalor encontrado foi de 0,8573, que é maior que o nível de significância de

0,05.

• Estudo da Diferença Dentro do Grupo 1

Para a avaliação dentro do grupo 1 foi aplicado o teste de médias “t de Student”, utilizando o nível de significância igual a 0,05.

De acordo com o teste t de Student não existe diferença significativa entre controle e tratamento do grupo 1.

• Estudo da Diferença Dentro do Grupo 2

Para a avaliação dentro do grupo 2 foi aplicado o teste de médias “t de Student”, utilizando o nível de significância igual a 0,05.

De acordo com o teste t de Student não existe diferença significativa entre controle e tratamento do grupo 2.

• Estudo da Diferença Dentro do Grupo 3

Para a avaliação dentro do grupo 3 foi aplicado o teste de médias “t de Student”, utilizando o nível de significância igual a 0,05.

De acordo com o teste t de Student não existe diferença significativa entre controle e tratamento do grupo 3.

• Estudo da Diferença Entre o Controle do Grupo 1 e o Tratamento do

Grupo 2

Para esta avaliação foi aplicado o teste de médias “t de Student”, utilizando o nível de significância igual a 0,05.

De acordo com o teste t de Student não existe diferença significativa entre o controle do grupo 1 e o tratamento do grupo 2, embora o pvalor esteja muito próximo de 0,05. • Estudo da Diferença Entre o Controle do Grupo 1 e o Tratamento do Grupo 3

De acordo com o teste t de Student existe diferença significativa

entre o controle do grupo 1 e o tratamento do grupo 3.

Exemplo 3: PCR quantitativo (qPCR) - PCR real time (análise de citocinas inflamatórias no tecido cicatricial)

Foi feita extração de RNA total das amostras de pele congeladas ío à -80°C, segundo método do reagente Qiazol (Qiagen, USA). Para a produção do cDNA, utilizou-se o kit High CapacitycDNA Reverse Transcription Kit (AppIiedBiosystems, Foster City, CA, USA), sendo a concentração final do cDNA de 3,0 pg. Este cDNA foi diluído segundo a concentração necessária para a amplificação eficiente de cada gene, sendo esta eficiência verificada 15 segundo método descrito abaixo.

As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqMan™(AppliedBiosystems) que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Foram utilizados kits TaqMan™assays (AppIiedBiosystems) para todos os genes, a saber: 20 adiponectina (Rn00595250_m1), Ieptina (Rn00565158_m1), IL-2 (Rn00587673_m1), IL-4 (Rn01456866_m1), IL-6 (Rn01410330_m1), IL-12 (Rn00575112_m1), IFN-α (Rn01400027_g1), IFN-y(Rn00594078_m1), IGF-1 (Rn00710306_m1) e TNF- a (Rn00562055_m1).

O gene GAPDRat (TaqMan™ - AppIiedBiosystems), Partnumber 4352338E, foi escolhido como controle endógeno da reação. Ele serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD está marcada com o fluoróforo VIC®, enquanto os primers para os alvos estão marcados com o fluoróforo FAM®.

Antes de se iniciarem os experimentos de quantificação relativa da expressão de qualquer gene, realizou-se a validação do sistema gene alvo, por exemplo, adiponectina e leptina, com o controle endógeno GAPD rat. Verificou-se que as eficiências de amplificação dos genes foram próximas a 100%. Esse passo é essencial para que o controle endógeno possa ser utilizado para normalizar os valores de expressão relativa do gene de interesse.

A validação da eficiência dos genes de interesse consistiu na amplificação, tanto com os primers dos genes de interesse quanto com o do controle endógeno, dos cDNAs de triplicatas de concentrações diferentes (diluições seriadas) de uma amostra escolhida aleatoriamente. Em seguida, foi construída uma curva padrão a partir do logaritmo da concentração das amostras pelo Ct [ThreshoIdCycIe: ciclo em que cada curva de amplificação ío atravessa o limiar de detecção (Threshold), o qual é definido arbitrariamente]. Nessa curva, foram obtidos os valores da inclinação (slope) da curva e da confiabilidade das réplicas (R2). Dessa forma, a eficiência do um sistema foi calculada através da fórmula: E = io('1/stope) -1. Para exemplificar, a placa de validação dos genes adiponectina, Ieptina e GAPD, foram feitas triplicatas de uma amostra de cDNA de hepatócito de rato em 7 concentrações diferentes (diluições seriadas de 5x).

Após o cálculo das eficiências de amplificação de cada gene de interesse e do controle endógeno, foi construído um gráfico de dispersão, o qual tem por finalidade definir qual é a amplitude de concentrações para as quais o sistema é eficiente. Para a construção do gráfico, foram utilizados os mesmos valores de logaritmo da concentração das amostras no eixo Xea diferença entre as médias dos Cts do controle endógeno e as médias dos Cts do gene de interesse para cada concentração no eixo Y. A seguir, obteve-se uma linha de tendência para estes valores, a qual possui uma equação de reta que permite verificar o valor da inclinação desta reta. Para que um sistema seja considerado eficiente, o valor da inclinação deve ser menor que 0,1 (quanto mais próximo de zero for este valor, menor é a inclinação da curva e, portanto, mais constante é a diferença entre as médias dos Cts do gene de interesse e do controle endógeno). Os pontos no gráfico, correspondentes às concentrações, que estiverem mais próximos à linha de tendência são considerados validados (o sistema tem 100% de eficiência nestas concentrações).

Também para exemplificar, a concentração de amostra validada como eficiente para os genes adiponectina, Ieptina e GAPD foi de 40,0 ng de cDNA.

Para a quantificação relativa dos genes em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 6,25μΙ_ de TaqMan Universal PCR Master Mix (AppIiedBiosystmes, Foster City, CA, USA) 2x, 0,625μΙ_ da solução de primers e sonda, 1,625μΙ_ de água e 4,OpL de cDNA 10 (40ng de cDNA), sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0 μΙ de água ao invés do cDNA. As condições de ciclagem utilizadas foram: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos e 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por

1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Todos os valores apresentados nas tabelas abaixo estão com os dados calculados de RQ, que é a quantificação relativa.

Os métodos para quantificação relativa da expressão gênica permitem quantificar diferenças no nível de expressão de um gene específico 20 (alvo) entre as diferentes amostras. A produção de dados é expressa como uma alteração ou diferença no número de vezes nos níveis de expressão. Para o estudo, foram feitas duas análises: em uma análise, uma amostra foi escolhida como calibradora e também foi escolhido um gene endógeno para normatizar os resultados. Os resultados normatizados obtidos são sempre 25 relativos ao dado do calibrador. A amostra calibradora utilizada para todos os grupos foi a que apresentou o valor mediano entre as três medições realizadas, para cada dia de tratamento (dois, quatro ou dez dias). Na outra, cada amostra de ferida com tratamento foi calibrada com uma amostra controle do próprio animal; assim, cada amostra tinha um calibrador diferente e específico.

As tabelas abaixo resumem estes resultados: Tabela 2: Resumos dos valores encontrados de RQ para as diferentes citocinas avaliadas nos grupos 1, 2 e 3, em relação ao grupo 1, através de PCR Real Time.

Adipo Resultados qPCR em relação ao grupo controle Leptina Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 1,00971 0,99784 0,293 Dia 2 1 N/D N/D Dia 4 1,61285 2,80048 0,314 Dia 4 0,68595 2,9599 N/D Dia 10 0,84471 2,63851 3,1362 Dia 10 1,30254 3,0155 15,894 IL-2 IL-4 Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 1,000 N/D 209,64 Dia 2 N/D N/D N/D Dia 4 1,58364 2,5122 17,1999 Dia 4 N/D N/D N/D Dia 10 0,98421 N/D 7,9337 Dia 10 N/D N/D N/D IL-6 IL-12 Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 29,5485 19,8944 0,02826 Dia 2 0,99209 2,78657 0,98608 Dia 4 1,74044 1,34772 0,00021 Dia 4 1,26476 7,87765 0,01848 Dia 10 3,11884 4,32348 0,06813 Dia 10 0,77279 0,79403 7,32084 TNF-a IGF-I Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 4,09404 35,7803 1,33 Dia 2 0,81582 2,56724 1,01068 Dia 4 0,71205 0,96728 0,00256 Dia 4 0,99639 6,40828 0,01019 Dia 10 0,89728 0,30012 0,06964 Dia 10 0,75066 2,65234 0,86222 IFN-a IFN-Y Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 2,29617 0,03855 2,11287 Dia 2 1 N/D 2,31363 Dia 4 1,02605 0,03206 2,66224 Dia 4 1,22638 22,77 N/D Dia 10 1,00148 0,10674 2,0163 Dia 10 1,72811 3,25803 0,36501 Observação: os valores relatados como N/D não foram detectados por esta técnica nas

amostras estudadas, pois os valores eram inferiores aos limites mínimos de detecção do aparelho. Tabela 3: resumos dos valores encontrados de RQ para as diferentes citocinas avaliadas nos grupos 1, 2 e 3, em relação ao lado controle do próprio animal, através de PCR Real Time.

Adipo Resultados qPCR em relação à ferida contralateral Leptina Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 6,902 65,716 0,455 Dia 2 0,88 4,268 N/D Dia 4 7,564 37,325 0,781 Dia 4 2,771 0 N/D Dia 10 2,346 1,338 0,928 Dia 10 0,551 N/D 13,11 IL-2 IL-4 Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 1,3186 N/D 118,401 Dia 2 N/D N/D N/D Dia 4 0,6148 10,9366 64,549 Dia 4 N/D N/D N/D Dia 10 0,6724 N/D 87,6928 Dia 10 N/D N/D N/D IL-6 IL-12 Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 12,3191 147,095 0,0094 Dia 2 0,12 1,2205 2,5071 Dia 4 87,02 2,9262 0,0152 Dia 4 1,324 21,0793 0,4904 Dia 10 24,3623 21,7462 0,461 Dia 10 2,202 11,4966 3,6853 TNF-a IGF-I Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 20,3023 2,9281 6,0588 Dia 2 1,077 28,925 14,352 Dia 4 220,658 4294,2 0,1521 Dia 4 20,973 38,007 0,124 Dia 10 18,6083 6,219 5297,51 Dia 10 2,075 247,286 0,034 IFN-a IFN-Y Controle AGE Arroz Controle AGE Arroz RQ RQ RQ RQ RQ RQ Dia 2 1,6018 0,3388 0,209 Dia 2 0,212 N/D 0,003 Dia 4 0,3781 0,0105 0,22 Dia 4 25,756 798,241 N/D Dia 10 0,3879 0,0279 9,9959 Dia 10 3,116 44,6627 0 1) Análise estatística de PCR real time

O objetivo deste experimento é avaliar a existência de diferenças entre os grupos em estudo e os dias, após a lesão, em que foram avaliados as animais. Foi utilizada a análise de variância (ANAVA) considerando um experimento com dois fatores e em seguida foi aplicado o teste de médias de Scott-Knott à 5% de significância.

PCR para adiponectina em relação ao grupo 1 Observando o conjunto de dados pode-se notar que existe um

valor muito diferente das demais. Retirando esta observação que pode ser considerada um outlier, as pressuposições foram atendidas e pode-se aplicar a ANAVA.

• Tabela de ANAVA: de acordo com a tabela de análise de variância se io pode observar que nenhum dos fatores em estudo apresentou

significância, nem mesmo a interação.

PCR para adiponectina em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.5454545. Após a transformação, as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

De acordo com a tabela de análise de variância se pode observar que nenhum dos fatores em estudo apresentou significância, nem mesmo a interação.

PCR para Ieptina em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox.

O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.7272727. Após a transformação as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

De acordo com a tabela de ANAVA do desdobramento, observa

se que as quantidades de Ieptina (em relação ao grupo 1) apresentam diferenças entre os grupos apenas nos dias 4 e 10. Para um melhor detalhamento aplicou-se o teste de médias de Scott-Knott, que está apresentado a seguir.

· Comportamento dos grupos quando o dia é 2: quando o dia é 2, os

grupos não tem comportamento diferentes entre si. • Comportamento dos grupos quando o dia é 4: quando o dia é 4, as quantidades de Ieptina (em relação ao grupo 1) são maiores no grupo

2. Nos demais grupos podemos considerar as quantidades de Ieptina iguais e inferiores ao grupo 2.

· Comportamento dos grupos quando o dia é 10: quando o dia é 10, as

quantidades de Ieptina (em relação ao grupo 1) são maiores no grupo

3. Nos demais grupos podemos considerar as quantidades de Ieptina iguais e inferiores ao grupo 3.

PCR para Ieptina em relação a ferida contralateral io Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi

aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.969697. Após a transformação as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

De acordo com a tabela de análise de variância é possível observar que nenhum dos fatores em estudo apresentou significância, nem mesmo a interação.

PCR para IL - 2 em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.4646465. Após a transformação, os pressupostos foram atendidos.

Apenas o fator grupo apresentou significância.

• Teste de médias para grupos: o grupo 3 é o que apresenta as maiores quantidades de IL-2, em relação ao grupo controle.

PCR para IL - 2 em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.9494949. Após a transformação, os pressupostos foram atendidos.

Em relação ao controle do próprio animal, não há diferenças

estatísticas. PCR para IL - 6 em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.8686869. Após a transformação foi possível realizar a ANAVA.

Apenas o fator grupo foi significativo; aplicou-se o teste de ScottKnott para identificar as diferenças existentes entre os grupos.

• Teste de médias para grupos: o grupo 3 apresenta as maiores quantidades de IL-6, em relação ao grupo controle.

ío PCR para IL - 6 em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.4242424. Após a transformação foi possível realizar a ANAVA.

Apenas o fator grupo foi significativo; aplicou-se o teste de Scott

Knott para identificar as diferenças existentes entre os grupos.

• Teste de médias para grupos: em relação ao animal como próprio controle, apenas o grupo 3 foi estatisticamente diferente e inferior aos demais grupos.

PCR para IL -12 em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.6666667. Após a transformação as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

De acordo com a tabela de análise de variância acima se pode

observar que a interação foi significativa, devendo-se desdobrar a interação.

• Comportamento dos grupos quando o dia é 2: quando o dia é 2, os 3

grupos não apresentam diferenças entre si.

• Comportamento dos grupos quando o dia é 4: a quantidade encontrada

BO no grupo 2 é maior entre todas e a menor é a do grupo 3. • Comportamento dos grupos quando o dia é 10: quando o dia é 10, os 3

grupos não apresentam diferenças entre si.

• Desdobramento de dias dentro de cada nível de grupo:

• Comportamento de dia quando o grupo é 1: quando o grupo é 1, as quantidades de IFN-γ (em relação ao grupo 1) não diferem em relação

aos dias.

• Comportamento de dia quando o grupo é 2: quando o grupo é 2, as

quantidades de INF-g (em relação ao grupo 1) não diferem em relação aos dias.

ío · Comportamento de dia quando o grupo é 3: quando o grupo é 3, os dias

2 e 4 apresentaram quantidades de IL-12 estatisticamente iguais e superiores que os animais avaliados no dia 10.

PCR para IL -12 em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.4848485. Após a transformação atendeu-se as pressuposições da ANAVA.

De acordo com a tabela de análise de variância acima se pode observar que a interação entre grupos e dias não foi significativa e que apenas a diferença entre grupos é significativa.

• Teste de médias para grupos: em relação à ferida, o grupo 2 apresenta

valores mais elevados de IL-12.

PCR para TNF - a em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.05050505. Após a transformação as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

Apenas o fator dia foi significativo; aplicou-se o teste de ScottKnott para identificar as diferenças existentes entre os grupos. • Teste de médias para dias: nos dias 2 e 10 as quantidades de TNF-a

foram superiores (e estatisticamente iguais) do que as encontradas no dia 4.

PCR para TNF - a em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.2727273. Após a transformação foi realizada a ANAVA.

• Teste de médias para grupos: as quantidades encontradas nos grupos 1

e 2 foram superiores (e estatisticamente iguais) às encontradas no grupo 3.

PCR para IGF -1 em relação ao grupo 1

Retirando um valor que pode ser considerada um outlier, realizouse novamente os testes das pressuposições da ANAVA e ainda assim os dados não normalizaram e as variâncias não homogeneizaram. Então se realizou também a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi 0.3434343. Após essa transformação os pressupostos para ANAVA foram atendidos.

De acordo com a tabela de análise de variância se pode observar que apenas o fator grupo foi significativo, ou seja, existem diferenças apenas entre os grupos e não entre os dias em que os animais foram avaliados. Aplicou-se o teste de Scott-Knott para identificar as diferenças existentes entre os grupos.

• Teste de médias para grupos: o teste indica que os grupos 1 e 3 são

estatisticamente iguais e inferiores em quantidade ao grupo 2.

PCR para IGF -1 em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.3838384. Após a transformação as pressuposições foram atendidas. De acordo com a tabela de análise de variância se pode observar que o fator grupo foi significativo. Aplicou-se o teste de Scott-Knott para identificar as diferenças existentes entre os grupos.

• Teste de médias para grupos: o teste de Scott-Knott indicou que os grupos 1 e 3 são estatisticamente iguais e as quantidades de IGF-1

(em relação a ferida) encontradas no sangue dos animais é menor que as quantidades encontradas no sangue dos animais do grupo 2.

PCR para IFN-α em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas foi ío aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.212121. Após a transformação foi realizada a ANAVA.

• Teste de médias para grupos: de acordo com o teste de Scott-Knott, o grupo 2 apresenta quantidades menores de IFN-α do que os grupos 1 e

3, estatisticamente iguais e com quantidades superiores.

PCR para IFN-α em relação à ferida contralateral

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -2.959596. Após a transformação as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

• Teste de médias para grupos: os três grupos apresentam diferenças nas quantidades de IFN-α onde a maior é a do grupo 3.

PCR para IFN-γ em relação ao grupo 1

Como as pressuposições da ANAVA não foram atendidas, foi aplicada a transformação de Box-Cox. O valor de λ utilizado para a transformação foi -0.1414141. Após a transformação as pressuposições da ANAVA foram atendidas. De acordo com a tabela de análise de variância acima se pode observar que a interação foi significativa ou seja, os efeitos provocados pelos grupos e pelos dias separadamente tem efeitos diferentes do que quando considerados os dois fatores ao mesmo tempo.

· Desdobramento de grupo dentro de cada nível de dias: de acordo com a

tabela de ANAVA do desdobramento, podemos observar que as quantidades de INF-γ (em relação ao grupo 1) apresentam diferenças entre os grupos em todos os dias.

• Comportamento dos grupos quando o dia é 2: os três grupos io apresentam diferença, sendo que as maiores quantidade são

encontradas, respectivamente, nos grupos 2, 3 e 1.

• Comportamento dos grupos quando o dia é 4: o grupo 3 apresenta maior

quantidade que os grupos 1 e 2.

• Comportamento dos grupos quando o dia é 10: o grupo 2 apresenta quantidade maior que os grupos 1 e 3.

• Desdobramento de dias dentro de cada nível de grupo: apenas os

grupos 2 e 3 apresentam quantidades diferentes de IFN-γ nos diferentes dias.

• Comportamento de dia quando o grupo é 2: as quantidades são maiores no dia 2 do que nos demais dias.

• Comportamento de dia quando o grupo é 3: as quantidades encontras

no dia 10 são inferiores aos demais dias, em relação ao grupo controle. PCR para IFN-γ em relação à ferida contralateral

• Teste t de Student para os grupos: pode-se dizer que não há diferença estatística entre os grupos analisados, nem para os diferentes dias de

tratamento.

Em relação à adiponectina, o óleo de arroz, na expressão local desta substância, é possível verificar que desde do dia 2 sua quantidade é menor do que o expresso nos grupos controle e AGE. Analisando os resultados de PCR, é possível verificar que os valores aumentam nos dias 4 e 10. Como a adiponectina é antiinflamatória, o ideal é que seus níveis estejam baixos no início da cicatrização e aumentem próximo ao final do processo (Berg, 2001), o que é verificado no óleo de arroz (os níveis de adiponectina, embora menores que os dos outros grupos, apresentam tendência de aumento ao longo do processo cicatricial). As análises estatísticas para PCR real time mostram que 5 em nenhum dos grupos e em nenhum dos dias os animais apresentaram quantidades diferentes de adiponectina, em relação ao grupo 1 e em relação ao próprio lado controle.

A leptina, quanto aos valores de expressão local, os animais tratados com AGE tiveram seu valor aumentado nos dias 4 e 10 em relação ío grupo controle. De acordo com a revisão bibliográfica, é interessante que a quantidade de leptina esteja aumentada no início da cicatrização, uma vez que ela favorece a proliferação dos queratinócitos (Nascimento, 2006), tendo sido encontrado um valor três vezes maior no grupo tratado com óleo de arroz em relação ao grupo controle. Quanto à expressão local do gene, quando o dia é 4, 15 as quantidades de leptina (em relação ao grupo 1) são maiores no grupo 2 e quando o dia é 10, as quantidades maiores encontradas foram no grupo 3. Quando foram comparados o lado tratamento e controle de cada animal, estatisticamente não foram encontradas diferenças.

A IL-2, produzida por neutrófilos e responsável por proliferação de queratinócitos e colágeno (Armour, 2007), é interessante que seja encontrada no início do processo cicatricial e que seu nível vá diminuindo, para evitar que seja formada cicatriz hipertrófica. Os níveis de IL-2 dos animais tratados com óleo de arroz foram os mais altos nos dia 2 e 4 comparando com os grupos controle e AGE, resultado visualizado tanto pelo método de Elisa quanto por PCR real time', localmente, a expressão gênica detectada no dia 4 foi maior que o grupo controle, porém menor que o grupo tratado com óleo de arroz. Na análise estatística dos dados de PCR real time, em relação ao grupo 1, apenas o grupo 3 apresentou quantidades maiores, uma vez que os grupos 1 e 2 são estatisticamente iguais. Nos dados relativos ao animal como seu próprio controle, a quantidade de IL-2, quando comparada com a ferida contralateral é maior no grupo 3 e o teste de Scott-Knott indicou que nos dias 2 e 4 as quantidades de IL-2 são estatisticamente iguais e superiores as quantidades encontradas no sangue dos animais avaliados no dia 10.

A IL-4 não foi detectável pelo PCR real time.

A IL-6, na análise local, apresenta diminuição do valor expresso no dia 2 e aumento no dia 10. Como foi explicitado na introdução, a IL-6 é uma citocina importante no início do processo cicatricial, onde os maiores níveis, tanto local quanto sistemicamente, deveriam ser encontrados. Em outros experimentos foi observado também que a ausência total de IL-6 em ratos com nocaute gênico o tempo de cicatrização chega a ficar três vezes maior (Lin, ío 2003). Na análise estatística dos resultados da PCR real time, quando a análise é feita levando em consideração o animal como seu próprio controle, o grupo apresentou a menor quantidade, comparando com os grupos 1 e 2 (estatisticamente iguais e com quantidade superiores de IL-6), o que indica maior ação sistêmica do grupo 3, uma vez que a diferença nas quantidades de IL-6 na ferida com tratamento e na ferida com controle foi a menor de todos os grupos. Quando os grupos foram comparados com o grupo controle, o grupo 3 foi o que apresentou as maiores quantidades de IL-6 dado aumento expressivo no D10. Observando os valores obtidos, nota-se que os níveis de IL-6 foram mais baixos que os valores encontrados no D2 e D4 e houve grande elevação já na fase de remodelação. Talvez, caso houvesse sido feita dosagem posterior teria havido elevação sistêmica dos níveis desta citocina, considerando que a elevação no local de aplicação deva ser prévia à sistêmica.

Quanto à IL-12, o óleo de arroz apresentou diminuição da expressão local nos dias 2 e 4 em relação ao grupo controle. Esta diminuição 25 da IL-12 é desejável também em outras doenças inflamatórias como a psoríase, por exemplo. O grupo AGE apresentou um aumento da expressão gênica local em todos os dias. O papel da IL-12 na cicatrização é de estimular a produção de interferons pelos macrófagos, sendo importante o seu aumento □ Ishida, 2004) que deve se dar nas fases finais da cicatrização. A análise 30 estatística da PCR real time em relação ao grupo controle permite dizer que há diferença estatística entre os grupos apenas no dia 4, onde as quantidades encontradas no grupo 2 são superiores às dos grupos 1 e 3 (estatisticamente iguais). Em relação ao próprio animal, apenas o grupo 2 apresentou quantidades estatisticamente superiores, comparando com os grupos 1 e 3.

Nas análises estatísticas dos dados de PCR real time, para o TNF-α, não é possível verificar diferença estatística tanto na análise em relação ao grupo controle quanto em relação à ferida contralateral. Isso se deve ao fato de haver grande variação entre os dados de cada dia e de cada grupo, onde as possíveis diferenças calculáveis seriam devido a esta variação e não a uma real diferença entre os tratamentos. A análise possivelmente poderia ser ío realizada se o número de amostras para o teste fosse maior. Contudo, ao se observar as médias dos valores desta substância obtidas no tecido em cada grupo (Quadro 3, página 34) nota-se que no grupo tratado com óleo de arroz houve menor quantidade de TNF-α nos três dias analisados. Isto pode sugerir uma ação anti-TNF-α tecidual e conseqüente elevação sistêmica observada nos dias 4 e 10. Várias drogas imunobiológicas, como as usadas em psoríase, tem ação anti-TNF-α o que aparentemente ocorreu no tecido.

O IGF-1 está elevado na fase inicial (dia 2) do processo cicatricial o que pode ser tanto quando tratado com óleo de arroz quanto com AGE, resultado observado no PCR real time. A partir do dia 4, o óleo de arroz apresenta queda na quantidade de IGF-1 até o dia 10 e o AGE continua aumentando no dia 4 e cai no dia 10. Como esta substância atua indiretamente na cicatrização (ela aumenta a função de outras substâncias, como o PDGF-2) e está relacionada com o aumento da espessura da pele, é esperado a quantidade circulante não seja alta na segunda e terceira etapas da cicatrização, pois uma alta quantidade desta substância pode levar ao desenvolvimento de cicatriz hipertrófica (Chen, 2010). Na análise estatística da PCR real time, é possível dizer que, quando comparados com o grupo controle, o dia não interfere nos resultados do grupo e que os grupos 1 e 3 são estatisticamente iguais e as quantidades de IGF-1 são maiores no grupo 2. Quanto à análise em relação à ferida contralateral, não é possível estabelecer diferença estatística, pois há alta variação entre as amostras de um mesmo dia e mesmo grupo. De modo semelhante ao TNF-α, as diferenças estatísticas não seriam relativas a uma real diferença entre os grupos, e sim devido a esta alta variação.

O IFN-α apresentou leve diminuição no dia 2 e aumento no dia 4 5 na expressão gênica local. Nas análises estatísticas da PCR real time, em relação ao grupo controle, o teste de Scott-Knott permite dizer que os grupos 1 e 3 apresentam as maiores quantidades médias de IFN-α, sendo estatisticamente iguais e superiores ao grupo 2. Nos resultados referentes ao animal como seu próprio controle, o teste de Scott-Knott mostra que todos os ío grupos apresentam diferença, sendo que as maiores quantidades são as apresentadas pelo grupo 3, 1 e 2, respectivamente.

O IFN-γ, em relação à expressão local, quando tratado com óleo de arroz apresentou um aumento no dia 2 e o tratado com AGE apresentou aumento nos dias 4 e 10, em relação ao grupo controle. Nas análises 15 estatísticas da PCR real time em relação ao grupo 1, quando o dia é 2 não há diferenças estatísticas. Quando o dia é 4 e 10, o grupo 2 é o que apresenta as maiores quantidades de IFN-γ. Na análise relacionando o lado tratado com o lado controle de cada animal, não foram encontradas diferenças estatísticas comparando-se os grupos e os dias de tratamento. Os resultados dos testes 20 foram todos não significativos devido à grande variabilidade ocasionada pela grande quantidade de valores não detectados. Observando o conjunto de dados, apenas para o grupo 1 existe maior número de dados e nos demais grupos poucas amostras detectaram a substância.

Exemplo 4: Elisa (análise de citocinas inflamatórias no soro)

Este ensaio emprega a técnica de imunoensaio sanduíche

quantitativo. Um anticorpo monoclonal específico para a substância alvo é préadicionado em uma microplaca ainda na fábrica. As amostras, controles e padrões são pipetados para os poços e se a substância em estudo estiver presente será ligada pelo anticorpo imobilizado. Depois de lavar as substâncias 30 não ligadas, um anticorpo policlonal com enzima ligada específica para a substância é adicionado aos poços. Após uma lavagem para remover qualquer reagente anticorpo-enzima não ligado, uma solução de substrato é adicionado aos poços. A enzima de reação produz um produto azul que fica amarelo quando a “solução de parada” é adicionada. A intensidade de medição de cor está em proporção com a quantidade de substância alvo ligado na etapa inicial.

Os valores da amostra são então lidos a partir da curva padrão.

Para as reações realizadas neste documento, foram usados kits comerciais de Elisa Quantikine, da R&D Systems (Minneapolis, EUA) para as substâncias IL-2, IL-4, IL-12, IL-6, IGF-1, IFN-a, IFN-γ e TNF-α; para as substâncias leptina e adiponectina foram usados kits comerciais fornecidos pela empresa Millipore (St. Charles, Missouri, EUA).

As placas dos 10 kits foram analisadas no leitor de microplaca BioRad 680, BioRadLaboratories (Hercules, CA, EUA), nos comprimentos de onda de 490 e 570nm, conforme recomendação dos fabricantes.

As medições e quantificações das citocinas inflamatórias dosadas por técnica Elisa estão sumarizados na Tabela 4 abaixo:

Tabela 4: Resumo dos valores encontrados nas dosagens das citocinas pelo método Elisa

Resultados ELISA para Adiponectina Resultados ELISA para Leptina CONTROLE AGE ARROZ CONTROLE AGE ARROZ DIA 2 8972,18 11116,1 8906,27 DIA 2 0,26 0,47 0,84 DIA 4 8337,17 8712,68 6242,34 DIA 4 0,74 0,43 0,59 DIA 10 16526,4 13466,2 9145,04 DIAlO 0,74 0,76 1,16 Resultados ELISA para IL 2 Resultados ELISA para IL 4 CONTROLE AGE ARROZ CONTROLE AGE ARROZ 15,671 DIA 2 41,0803 2 285,766 DIA 2 10,24 5,21 15,2 DIA 4 14,4842 -2,3757 62,4561 DIA 4 13,36 4,29 8,05 DIAlO 6,88647 93,3245 -19,948 DIA 10 6,67 6,03 9,6 Resultados ELISA para IL-6 Resultados ELISA para IL 12 CONTROLE AGE ARROZ CONTROLE AGE ARROZ DIA 2 280,107 255,535 106,935 DIA 2 5,91296 7,2662 2,47256 DIA 4 256,329 259,481 78,4776 DIA 4 -1,3491 10,403 -4,6988 DIA 10 276,947 222,988 96,0668 DIA 10 -2,1553 -7,009 -1,6031 Resultados ELISA para TNF-a Resultados ELISA para IGF-1 CONTROLE AGE ARROZ CONTROLE AGE ARROZ DIA 2 2,7634 -0,4749 <20729 DIA 2 594564 602213 623912 DIA 4 -8,5174 -12,129 10,3364 DIA 4 767184 884841 665231 DIA 10 -8,8164 -3,6932 11,4599 DIAlO 786540 647642 443059 Resultados ELISA para IFN-a Resultados ELISA para IFN-y CONTROLE AGE ARROZ CONTROLE AGE ARROZ DIA 2 21,1994 21,9283 18,717 DIA 2 42,5712 39,401 35,951 DIA 4 21,5645 17,2499 13,3764 DIA 4 196,445 42,1167 60,3296 DIA 10 25,6879 17,2483 26,082 DIAlO 141,806 35,5736 34,9849 1) Análise estatística de Elisa

O objetivo da análise estatística deste teste foi avaliar a existência de diferenças entre os grupos em estudo e os dias após a lesão em que foram avaliados as animais. Foi utilizada a análise de variância (ANAVA) considerando um experimento com dois fatores e em seguida foi aplicado o teste de médias de Scott-Knott à 5% de significância.

Teste ELISA para adiponectina

Aplicou-se o teste de Scott-Knott para identificar as diferenças existentes entre os grupos e os dias. ío De acordo com o teste de Scott-Knott, o grupo 3 apresenta

quantidades inferiores aos grupos 1 e 2 (superiores e iguais estatisticamente).

• Teste de médias para dias: de acordo com o teste acima, os valores de adiponectina encontrados no dia 10 foram superiores aos encontrados nos dias 2 e 4.

Teste ELISA para Leptina

De acordo com a análise estatística realizada, não há diferenças entre os grupos e dias analisados.

Teste ELISA para IL-2

Retirando a observação considerada um outlier, todas as pressuposições da ANAVA foram atendidas. De acordo com a tabela de Anava, os valores encontrados para IL-2 nenhum dos fatores em estudo apresentou significância, nem mesmo a interação.

Teste ELISA para IL-4

De acordo com a tabela de Anava, os valores encontrados para

IL-4 nenhum dos fatores em estudo apresentou significância, nem mesmo a interação.

Teste ELISA para IL-6

Aplicou-se o teste de Scott-Knott para identificar as diferenças existentes entre os grupos.

De acordo com o teste de Scott-Knott, os valores variaram nos três grupos, sendo que o maior valor foi encontrado no grupo 1, seguido pelos grupos 2 e 3, respectivamente.

Teste ELISApara IL-12 Em seguida, aplicou-se o teste de Scott-Knott para identificar as

diferenças existentes entre os grupos e os dias.

• Teste de médias para grupos: de acordo com o teste de Scott-Knott, o grupo 2 apresenta quantidades inferiores de IL-12 em relação aos grupos 1 e 3 (superiores e iguais estatisticamente).

· Teste de médias para dias: as quantidades de IL-12 são superiores no dia 2, enquanto os valores encontrados nos dias 4 e 10 são inferiores e iguais estatisticamente.

Teste ELISA para TNF-a

De acordo com a tabela de análise de variância é possível observar que a interação foi significativa. Quando a interação é significativa deve-se apenas desdobrar a interação, não sendo necessário o estudo dos fatores isoladamente.

s Desdobramento de grupo dentro de cada nível de dias:

• Comportamento dos grupos quando o dia é 2: quando o dia analisado é 2, não há diferenças entre os grupos. • Comportamento dos grupos quando o dia é 4: quando o dia analisado é

4, os valores encontrados no grupo 3 são superiores aos encontrados nos grupos 1 e 2, respectivamente.

• Comportamento dos grupos quando o dia é 10: quando o dia analisado é 10, os valores encontrados no grupo 3 são superiores aos encontrados

nos grupos 2 e 1, respectivamente.

S Desdobramento de dias dentro de cada nível de grupo:

• Comportamento de dia quando o grupo é 1 :quando analisado o grupo 1 isoladamente, o valor encontrado no dia 2 é superior aos encontrados

ío nos dias 4 e 10, respectivamente.

• Comportamento de dia quando o grupo é 2: não foram encontradas diferenças estatísticas no grupo 2, quando analisado em separado.

• Comportamento de dia quando o grupo é 3: quando analisado apenas o grupo 3, não são encontradas diferenças estatísticas, embora o valor

encontrado no dia 2 seja menor que nos outros dias analisados.

Teste ELISA para IGF-1

De acordo com a tabela de Anava, os valores encontrados para IGF-1 não apresentaram diferenças estatísticas.

Teste ELISA para IFN-a

De acordo com a análise estatística realizada, não há diferenças

estatísticas entre os grupos nem entre os dias analisados.

Teste ELISA para IFN-γ

Após a transformação por Box-Cox, as pressuposições da ANAVA foram atendidas.

Aplicou-se o teste de Scott-Knott para identificar as diferenças

existentes entre os grupos e os dias.

• Teste de médias para grupos: de acordo com o teste acima, é possível verificar que o grupo 1 apresentou quantidades superiores que os grupos 3 e 2, respectivamente. • Teste de médias para dias: segundo o teste de Scott-Knott para o dia analisado, os valores encontrados no dia 4 foram superiores aos demais dias.

Quanto à expressão de adiponectina, pode-se notar que, com o

óleo de arroz, houve diminuição sistêmica na quantidade presente no soro em relação ao grupo controle e AGE; a partir do dia 2 a diminuição é pequena, mas nos dias 4 e 10 há uma diminuição significativa. Quanto ao AGE, há um aumento sistêmico na quantidade circulante nos dias 2 e 4, diminuindo no dia 10. O teste de Scott-Knott indicou que os grupos 1 e 2 são estatisticamente ío iguais e as quantidades de adiponectina encontrada no sangue dos animais é maior que a quantidade encontrada nos sangue dos animais do grupo 3. Nesse grupo, apenas os animais que foram analisados no dia 10 apresentaram quantidade de adiponectina superior aos demais dias.

A leptina teve seu valor sistêmico aumentado em relação ao grupo 15 tanto no grupo tratado com AGE como no tratado com óleo de arroz nos dias 2 e 10 (em ambos os dias o aumento maior foi no grupo tratado com óleo de arroz) e diminuição dos valores medidos no dia 4 (diminuição maior no grupo tratado com AGE). Estatisticamente, contudo, pode-se dizer que em nenhum dos grupos e em nenhum dos dias os animais apresentaram quantidades de 20 leptina diferentes sistemicamente.

Quanto à IL-2 é possível visualizar uma diminuição sistêmica no dia 10. Este resultado é consoante com encontrado no trabalho realizado por Sierra e colaboradores (Sierra, 2005). Também pela técnica Elisa, os animais tratados com AGE apresentam diminuição nos dias 2 e 4 e aumento no dia 10. 25 Porém, de acordo com a tabela de análise de variância do teste de Elisa podese observar que em nenhum dos grupos e em nenhum dos dias os animais apresentaram quantidade de IL-2 diferentes estatisticamente no sangue.

A IL-4 teve seu nível aumentando sistemicamente no grupo tratado com óleo de arroz em relação ao grupo controle nos dias 2 e 10 e diminuído no dia 4. Já o grupo tratado com AGE teve seus valores sistêmicos diminuídos ao longo do todo o tratamento. Esta citocina tem sua função na fase inicial da cicatrização, pela deposição de tenascina no tecido lesado; é uma citocina pouco expressa no adulto, sendo reexpressa nos processos cicatriciais (Makhluf, 1996). Tendo isso em mente, o resultado apresentado pelo óleo de arroz é o melhor dentre os grupos, pois foi o que apresentou a maior 5 quantidade desta no dia 2 da cicatrização. Este resultado foi diferente do encontrado por Sierra, onde o orizanol diminuiu a quantidade de IL-4 (Sierra, 2005). De acordo com a tabela de análise de variância, contudo, pode-se dizer que em nenhum dos grupos e em nenhum dos dias os animais apresentaram quantidades sanguíneas de IL-4 diferentes estatisticamente. io A IL-6 apresenta seus menores valores no grupo tratado com óleo

de arroz ao longo de todo o processo cicatricial tanto local quanto sistemicamente. O grupo tratado com AGE apresenta queda sistêmica nos dias

2 e 10 em relação ao grupo controle e não há diferença no dia 4. De acordo com a tabela de análise de variância em relação aos dias para testes de Elisa podemos dizer que os animais apresentaram a mesma quantidade de IL-6 no sangue em todos os dias em que foram avaliados. Os 3 grupos apresentaram diferenças. Em primeiro lugar, o grupo que apresentou maior quantidade de IL

6 foi o grupo 1, em seguida foi o grupo 2 e por fim o grupo que apresentou menor quantidade de IL-6 foi o grupo 3.

Quanto à IL-12, o óleo de arroz apresentou diminuição da

expressão sistêmica desta citocina nos dias 2 e 4 em relação ao grupo controle. Esta diminuição da IL-12 é desejável também em outras doenças inflamatórias como a psoríase, por exemplo. No grupo AGE foi notada diminuição sistêmica ao longo de todo o tratamento. De acordo com a tabela de 25 análise de variância pode-se observar pela técnica de Elisa que a interação entre grupos e dias não foi significativa, indicando que o dia não interfere nos resultados dos grupos e vice-versa. Com isso foi avaliado cada fator em separado e neste caso os dois fatores foram significativos, ou seja, existem diferenças entre os grupos e entre os dias em que os animais foram avaliados. 30 O teste de Scott-Knott indicou que os grupos 1 e 3 são estatisticamente iguais e as quantidades de IL-12 encontradas são maiores que as quantidades encontradas no sangue dos animais do grupo 2. Apenas os animais que foram analisados no dia 2 apresentaram quantidade de IL-12 superior aos demais dias. Os animais dos dias 4 e 10 apresentaram quantidades de IL-12 estatisticamente iguais e inferiores aos animais do dia 2.

Já o TNF-α teve seu valor sistêmico aumentado ao longo de todo

o tratamento com o óleo de arroz em relação ao grupo controle. Como este fator é um dos responsáveis pelo início da cascata de eventos da cicatrização e atua também na tensão cicatricial, deve ser expresso ao longo de toda a cicatrização (Mast, 1996), o que pode ser visto sistemicamente com o óleo de 10 arroz. O aumento encontrado neste trabalho é consoante com o encontrado por Sierra e colaboradores no seu estudo sobre efeito imunológico do óleo de arroz (Sierra, 2005). De acordo com a tabela de ANAVA do desdobramento de dia de tratamento, pode-se observar que as quantidades de TNF-α, em relação aos grupos, foram significativas apenas nos dias 4 e 10. No segundo dia, os grupos 15 não tiveram comportamentos diferentes, ou seja, neste dia as quantidades de TNF-α não foram afetadas nos grupos. No D4 e D10 as quantidades de TNF-a dos grupos tiveram comportamentos diferentes entre si, ou seja, nesse dia as quantidades de TNF-α do grupo 3 foram superiores a dos demais grupos. Como foi mencionada, a ação do TNF-α pode variar de acordo com a 20 quantidade administrada no local de lesão, onde uma quantidade baixa acelera o processo e uma quantidade alta torna o processo mais lento (Mast, 1996). Neste sentido, a elevação sistêmica tardia pode estar relacionada à redução deste estímulo no período de remodelação.

O IGF-1 está elevado na fase inicial (dia 2) do processo cicatricial 25 o que pode ser tanto quando tratado com óleo de arroz quanto com AGE, resultado observado tanto no teste de Elisa quanto no PCR real time. A partir do dia 4, o óleo de arroz apresenta queda na quantidade de IGF-1 até o dia 10, tanto no PCR quanto no Elisa, e o AGE continua aumentando no dia 4 e cai no dia 10, em ambos os testes. Porém, de acordo com a tabela de análise de 30 variância para o teste de Elisa pode-se dizer que em nenhum dos grupos e em nenhum dos dias os animais apresentaram quantidade de IGF-1 diferentes. O IFN-α apresentou diminuição sistêmica nos dias 2 e 4, no grupo

3 em relação ao grupo controle. Mas, também de acordo com a tabela de análise de variância, pode-se dizer que estatisticamente em nenhum dos grupos e em nenhum dos dias os animais apresentaram quantidades de IFN-a diferentes sistemicamente.

O IFN-γ apresentou diminuição ao longo de todo o tratamento nos grupos tratados com óleo de arroz e AGE. O teste de Scott-Knott indicou que apenas o grupo 1 apresentou quantidade de IFN-γ superior aos demais grupos. A quantidade de IFN-γ encontrada no sangue dos animais dos grupos 3 e 2 10 podem ser considerados estatisticamente iguais e inferiores as quantidades encontradas no grupo 1. Apenas os animais que foram analisados no dia 4 apresentaram quantidade de IFN-γ superior aos demais dias. A redução sistêmica do IFN-γ é também desejável em certas doenças inflamatórias como a psoríase, por exemplo. Como ambos possuem ação anticicatricial, é 15 importante que seu valor seja diminuido, principalmente nas etapas iniciais da cicatrização, para que a deposição do colágeno possa ocorrer (Tredget, 2000), o que ocorreu no grupo tratado com óleo de arroz e pouco menos no tratado com AGE.

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Claims

1. Composição caracterizada por compreender os seguintes componentes: - Óleo de arroz; - Veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender óleo de arroz com concentração variando entre 0,001% e 99,999%, preferencialmente 70%.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo veículo farmaceuticamente aceitável ser selecionado dentre triglicérides de cadeia média (TCM), solução salina ou tampões, preferencialmente triglicérides de cadeia média (TCM) em um percentual adequado (q.s.p.) para atingir 100% da fórmula com base no peso total da composição.

4. Uso da composição, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de ter aplicação na cicatrização cutânea.

5. Uso do óleo de arroz caracterizado por ser aplicado na produção de formulações para cicatrização cutânea.

6. Formulação caracterizada pelo fato de compreender a composição de acordo com as reivindicações de 1 a 3 em um veículo farmacologicamente aceitável e componentes opcionais selecionados dentre agentes quelantes, agentes ajustadores de pH, agentes conservantes, emolientes, umectantes, agentes bacteriostático, ingredientes ativos, corantes e aromatizantes.

7. Uso da formulação, de acordo com a reivindicação de 6, caracterizada pelo fato de ter aplicação cicatrização cutânea.