BG99999A

BG99999A - Азациклохексапептиди

Info

Publication number: BG99999A
Application number: BG99999A
Authority: BG
Inventors: James Balkovec; Frances Bouffard; Regina Black
Original assignee: Merck & Co. Inc.
Priority date: 1993-03-16
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 1996-04-30
Also published as: DE69421639T2; DE10299013I1; NO953648L; CN1119441A; KR960701092A; NO2005020I1; EP0620232A1; HRP940161A2; US5378804A; IL108892A0; CA2118757C; AU5783294A; RO113246B1; US5514650A; DK0620232T3; FI954327A; CN1098274C; IL108892A; KR100329693B1; DE69421639D1

Abstract

Съединенията проявяват превъзходни антибиотични свойства. Те имат обща формула@@в която заместителите имат посочените в описанието значения. Изобретението се отнася и до методи за получаване на посочените съединения.

Description

АЗАЦИКЛОХЕКСАПЕПТИДИ

Настоящото иозбретение се отнася до азациклохексапептиди и до метод за тяхното получаване.

Азациклохексапептидите съгласно настоящото изобретение, съединения с формула I (Послед.идент.№ 1-15) се характеризират с това, че има! циклохексапептиден пръстен при 5-ия въглероден атом на 4-хидроксиорнитиновия компонент (тук по-надолу означаван С-5-орн) и могат да се представят със следната формула

(0

- 2 в която | {

Rj е Н или ОН,

R2 е Н, СН₃ или ОН,

R₃ е НJ СН₃, CH₂CN, CH₂CH₂NH₂ или CH₂CONH₂, ! ' I

Rl е Cg-C₂j- алкил, Cg-C₂i- алкенил, Cj-Ciq алкоксифенил или СрС^ - алкоксинафтил,

R¹¹ е Н, СрСд - алкил, С3-С4 - алкенил, (СН2)2_4ОН, (СН2)2_4R^IVR^V, СО(СН2) i.₄NH₂,

R¹¹¹ е Н, С4-С4 - алкил, С₃-С4 - алкенил, (СН₂)₂_4ОН, (СН₂) ₂.₄NRI^vR^v или

RII и rIII взети заедно означават -(СН₂)4, -(СН₂)5-, -(СН₂)₂О(СН₂)₂- или (СН₂)₂-NH-(CH₂)₂-,

R^IV е Н или Cj-C4 - алкил,

R^v е Н или С1-С4 -алкил и техни присъединителни с кислина соли.

Когато се използва означението алкил, алкенил или алкокси, то включва радикали с разклонена или права верига.

Съединенията съгласно настоящото изобретение общо се получават като смес от стереоизомерни форми, в която обиконовено доминира едната форма. Условията могат да се нагласят така, че обикновен специалист в областта да получи главно единия желан изомер. Съединенията с предпочитана стереоизомерна форма, означена тук като нормална форма, могат да се видят в примерите с пунктирана линия под равнината при С-5-орн позиция. Означението епи се използва за тези съединения, при които групата при С-5-орн позиция е над равнината.

Фармацевтичноприемливите соли подходящи като ···· • ···· · · · • ·· · · ···· • · · · ··· · ··· · • · · · · · ·· ·· ·· ··· присъединителни с киселина соли са тези получени с киселини като солна, малеинова, лимонена, ябълчна, глутаминова бромоводородна, фосфорна, сярна, оцетна, винена, янтарна, оксалова, подобни и включват и други киселини свързани с фармацевтичноприемливите соли изброени в

Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977).

Съответните ядра за азапроизводните съгласно настоящото изобретение (Съединение с формула I) и идентифицираната последователност за тези съединения може да се види в следващата таблица. Тъй като пептидните ядра могат да бъдат същите без оглед на заместителя R¹, RH или Rill и тъй като идентификационният номер на последователността се определя за ядрените варианти, амините и солите имат същите идентификационни последователности.

Аза съед.	R1	Й2	^R3	Послед идент.
1-1	н	н	ch₂conh₂	1
1-2	н	н	ch₂cn	2
1-3	н	н	ch₂ch₂nh₂	3
1-4	ОН	н	ch₂conh₂	4
1-5	ОН	н	ch₂cn	5
1-6	ОН	н	ch₂ch₂nh₂	6
1-7	ОН	сн₃	ch₂conh₂	7
1-8	ОН	сн₃	ch₂cn	8
1-9	ОН	сн₃	ch₂ch₂nh₂	9
1-10	ОН	сн₃	ch₃	10
1-11	ОН	сн₃	H	11

·· ·· ····

	• · • • • ··· - 4	• · · · · ··· • · · · · · · ···
• · · · · ·· ·· ··	• · · * • · • · · · ·
1-12	ОН	ОН	СН₂С	onh₂	12
1-13	ОН	ОН	сн₂с	N	13
1-14	ОН	ОН	СН₂С	h₂nh₂	14
1-15	н	сн₃	сн₃		15

Едно от съединенията, което е особено изявено за контрол на микотични инфекции е съединението идентифицирно като съдинение 1-6, където R¹¹ е Н, е

CH2CH2NH2 и Rl е 9,11-диметилтридецил (DMTD) и което конкретно може да се назове съединение 1-6-1(Послед.идент. №6).

В горното означение 1-6-1 се отнася до първото съединение, в което подреждането на ядрата е 1-6. Тъй като при всички съединения от настоящото изобретение заместителят при С-5-орн е азот, заместителите при този азот могат да варират и всички съединения, които имат същите Rj, R2 и R3 могат да бъдат Послед.идент.№6.

Съединенията са разтворими в нисши алкохоли и полярни апротни разтворители като диметилформамид (ДМФ), диметилсулфоксид (ДМСО) и пиридин. Те разтворители като диетилов етер и ацетонитрил са неразтворими в

Съединенията съгласно настоящото изобретение са но като противогъбно полезни като антибиотици, по-специал средство или като антипротозойно средство. Противогъбните средства са полезни за контрол както на филаментозни фунги, така и за дрожди. Те по-специално са приспособими за прилагане за лечение на микотични инфекции у млекопитаещи, по-специално такива причинени от Candida species като С.albicans, С. tropicalis и C.pseudotropicalls,

Cryptococcus видове като С. neoformans и Aspergillus видове като A. fumigatus, A.flavus, A.niger. Те също така са полезни за лечение и/или предпазване от Pneumocystis carinii pneumonia, към когото имунокомпромисните пациенти са особено чувствителни както е описано тук по-долу.

Съединенията съгласно настоящото изобретение могат да се получат от циклопептиди с формула 'wпи

(Послед. идент. № 1-15) посредством редица взаимодействия, при които кислородният ···· ·· ·· • · · · ·· · • ♦ · · ·· ··· • · ··· · ··· •· · · ·· ·· ·· ··· ·· ···· атом npL С-5-орн (което може да се означи) още като хемиаминална позиция) в крайна сметка се замества с азот.

Изходните продукти могат да бъдат природни продукти или

- Т’ ......- модифицирани природни продукти както са описани по-долу.

Когато Rje водород вместо хидроксил, азасъединенията могат да се получат посредством алтернативна серия реакции. Методът приложим за получаване на съединенията, където Rj е или Н или ОН е описан най-напред.

Идентифицираните последователности на изходните продукти се виждат от следващата таблица:

Съеди- нение	R1	«2	Кз	Идент.послед на изходния продукт
А-1	н	н	ch₂conh₂	16
А-2	н	н	ch₂cn	17
А-3	н	н	ch₂ch₂nh₂	18
А-4	ОН	н	ch₂conh₂	19
А-5	ОН	н	ch₂cn	20
А-6	ОН	н	ch₂ch₂nh₂	21
А-7	ОН	сн₃	ch₂conh₂	22
А-8	ОН	сн₃	ch₂cn	23
А-9	ОН	сн₃	ch₂ch₂nh₂	24
А-10	ОН	сн₃	CH₃	25
А-11	ОН	сн₃	H	26
А-12	ОН	ОН	ch₂conh₂	27
А-13	ОН	ОН	ch₂cn	28
А-14	ОН	ОН	ch₂ch₂nh₂	29
А-15	н	сн₃	ch₃	30

- 7 ····

Съединенията A-4 и A-7 са идентифицирали в литературата като (J. Antibiotics 45, 1855-60 Dec.1992) пнеумокандин jBq и пнеумокандин Αθ, когато R¹ = DMTD. Когато в съединение А-1 R* и R² представляват един от двата варианта и R3 е -Н, СН3 или -CH2CONH2 (Послед.идент. №16, 19, 22, 25-27 и 30), те могат директно да се използват в първия метод. Когато R3 е -CH₂CN или

-CH2CH2NH2, групата -CH2CONH2 може първо да се превърне в -CH2CN или -CH2CH2NH2 както е описано по-долу и всички . ' модифицирани съединения (Послед.идент.№17-18, 20-21, 23-24,

28-29) да се използват при първия метод, или алтернативно, съединението, в което R3 е -CH2CONH2 може да с използва за получаване на съединение с N при хемиаминалната позиция и групата -CH2CONH2 в получения краен продукт се превръща в групата -CH₂CN или -CH2CH₂NH₂.

Първо, когато Rj, R₂ и R3 в изходния продукт са същите както и в крайния продукт, може да се използва следната последователност:

H₂NCH₂CH₂SH

Етап А

(В) (Послед. идент . № 31-45)

(D) (Послед. идент. № 1-15) an С

2,2 [0]

Етап В * Позицията на С-5-орн или хемиаминалната позиция

(1) (Послед. идент. № 1-15) ···· ··

В етап А, изходният продукт съединение А

I (Послед.идент.№ 16-30), алкилтиолът или арилтиолът и киселината взимодействуват в апротен раззтворител при безводни условия за време достатъчно да се осъществи взаимодействието като се получава съединение В (Послед.идент.№ 31-45), представени в следващата таблица.

Намерено е, че за този етап е полезен аминоетилтиолът.

	Съеди-	^R1	«2	«3
	нение

Идент.послед. на серния междинен продукт

В-1	Н	н	ch₂conh₂	31
В-2	Н	н	ch₂cn	32
В-З	Н	н	ch₂ch₂nh₂	33
В-4	ОН	н	ch₂conh₂	34
В-5	ОН	н	ch₂cn	35
В-6	ОН	н	ch₂ch₂nh₂	36
В-7	ОН	сн₃	ch₂conh₂	37
В-8	ОН	сн₃	ch₂cn	38
В-9	ОН	сн₃	ch₂ch₂nh₂	39
В-10	ОН	сн₃	CH₃	40
В-11	ОН	сн₃	H	41
В-12	ОН	ОН	CH₂CONH₂	42
В-13	ОН	ОН	ch₂cn	43
В-14	ОН	ОН	CH₂CH₂NH₂	44
В-15	Н	сн₃	CH₃	45

За етап А подходящи киселини са силни оргнични киселини и минерани киселини. Примери за силни органични ·· ·· ·· ····

- 10 I киселини са камфорсулфоновата Киселина, р-толуенсулфоновата киселина и метансулфоновата киселина. Минералните киселини са солна киселина и бромоводородна киселина. Камфорсулфоновата киселина е за предпочитане.

j

Подходящи разтворители са диметилформамид, диметилсулфоксид, 1-метил-2-пиролидинон и хексаметилфосфорен триамид. Предпочитат се диметиллформамид или диметилсулфоксид.

Взаимодействието най-общо се провежда при стайна температура в продължение на 1 до около 10 дни.

При провеждането на взаимодействието, циклохексапептидът, тиолът и киселината се разбъркват заедно в подходящ разтворител докато взаимодействието завърши. След това реакционната смес се разрежда с вода и се провежда флаш хроматография на смола като се използва 10 до 40% ацетонитрил/вода съдържаща 0,1% трифлуороцетна киселина като елуент. Фракциите съдържащи чистия продукт могат да се концентрират и лиофилизират и лиофилизираният продукт да се пречисти посредством високоефективна течна хроматография (HPLC).

Подходящи колони за HPLC са търговскидостъпните колони, продавани под наименование на търговска марка или търговско наименование като ZORBAX (DuPont), ’’Delta Рак (Waters), Bio-Rad (Bio-Rad), LICHROPREP” RP18(E.Merck). Специфичните колони са посочени в примерите за получаване.

В етап В, съединение С (Послед.идент.№ 31-45), сулфонът се получава чрез окисление на съединение В. Подходящи окисляващи средства или окислители са OXONE, (KHSO5.KHSO4.K2SO4 2:1:1, Aldrich Chemicals) ··

- 11 метахл<^ропероксибензоена киселина и пероксиоцетна киселина. Идентифицираната последователност на съединение

С е същата както на съединение В, тъй като атомът свързан с хемиаминалния въглероден атом е още сяра.

Идентифицираната последователност на сулфоните е както следва:

Идент.послед.

Съединение	^R1	«2	^R3	на сулфоновия продукт
С-1	Н	н	ch₂conh₂	31
С-2	Н	н	ch₂cn	32
С-3	Н	н	ch₂ch₂nh₂	33
С-4	ОН	н	ch₂conh₂	34
С-5	ОН	н	ch₂cn	35
С-6	ОН	н	ch₂ch₂nh₂	36
С-7	ОН	сн₃	ch₂conh₂	³⁷
С-8	ОН	сн₃	ch₂cn	38
С-9	ОН	сн₃	ch₂ch₂nh₂	39
С-10	ОН	сн₃	CH₃	40
С-11	ОН	сн₃	H	41
С-12	ОН	ОН	ch₂conh₂	42
С-13	ОН	ОН	ch₂cn	43
С-14	ОН	ОН	ch₂ch₂nh₂	44
С-15	н	сн₃	CH₃	45

Окисляването на тиоетера (съединение В) до сулфон (съединение С) се провежда с около две моларни количества окислител. Когато се използва едно моларно количество ···· с ·

- 12 окислител, продуктът е сулфоксид, който след тов!а може да се превърне в сулфон. Сулфоксидът може да се използва като междинно съединение за получаване на азасъединения, но сулфонът е за предпочитане. Използва се слаб излишък над двете моларни количества окисляващо средство.

Взаимодействието се извършва в безводна среда, за предпочитане смес от ацетонитрил и вода. Предпочитат се равни количества, макар че могат да се използват съотношения 1:9 до 9:1.

'Ч». При провеждането на взаимодействието окислителят се прибавя към разтвор на съединение В (Послед. идент.№ 3145) в 1:1 ацетонитрил/вода и сместа се оставя да стои при стайна температура за време достатъчно да завърши взаимодействието като се получаава съединение С, най-общо от около 30 минути до един час.

След завършване на взаимодействието, съединението се извлича от реакционната смес чрез разреждане с вода и хроматографиране. Подходяща е флаш колонна хроматография с обърната фаза (С18) при този етап на пречистване. Предпочитан елуент е 30-45% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) в 5 процентен степенен градиент. Подходящите фракции се лиофилизират, за да се извлече междинният сулфон, съединение С (Послед.идент.№ 31-45). Тези междинни съединения проявяват лабилност, така че изолирането трябва да се проведе колкото се може по-бързо.

Съединение С може да се превърне в съединение, което има азотен атом свързан с ”С-5-орн. Както се вижда от технологичната схема, взаимодействието на съединение С с алкалнометалния азид води до получаване на азид на това

място (съединение D),i докато взаимодействието с амин | (амоняк или амин) води до получаване на аминогрупа при С5-орн мястото, (съединение С). Съединение D е важно междинно съединение за повечето от съединенията съгласно настоящото изобретение. Макар че съединение D има азот при

С-5-орн, тъй като то не е краен продукт, за съединение D отделно е идентифицирана последователността.

Послед.идент.№ за съединение D могат да се намерят на следващата таблица:

Идент.послед.

Съединение	^R1	«2	«3	на азида
D-1	Н	н	ch₂conh₂	46
D-2	Н	н	ch₂cn	47
D-3	Н	н	ch₂ch₂nh₂	48
D-4	ОН	н	ch₂conh₂	49
D-5	ОН	н	ch₂cn	50
D-6	ОН	н	ch₂ch₂nh₂	51
D-7	ОН	сн₃	ch₂conh₂	52
D-8	ОН	сн₃	ch₂cn	53
D-9	ОН	сн₃	ch₂ch₂nh₂	54
D-10	ОН	сн₃	ch₃	55
D-11	ОН	сн₃	H	56
D-12	ОН	ОН	CH₂CONH₂	57
D-13	ОН	ОН	ch₂cn	58
D-14	ОН	ОН	ch₂ch₂nh₂	59
D-15	н	сн₃	CH₃	60

»· · ···· ··· • · ······ ··· • · · · · ···· ··· • · · · · · · »·· ·· ·· ·· ·· ···

Азидът може да се получи чрез прибавяне на алкалнометален азид при разбъркване при стайна температура към разтвор на сулфон (съединение С, Послед.идент.№ 31-45) в подходящ разтворител за време достатъчно да завърши взаимодейтвието с образуване на азида, определено посредством HPLC анализ. Реакционната смес след това може да се разреди с водна киселина като трифлуороцетна киселина и след това да се хроматографира, за да се отдели желааният азид (съединение D) от

F

реакционната смес. Колонна флаш хроматография с обърната фаза (С18) като се използва 10-25% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) в 5 процентен степенен градиент е подходяща за тази процедура. Азидът, (съединение D) след това може да се редуцира до съединение, което има три свободни аминогрупи, което е сред крайните продукти (съединение I, послед.идент. 115) съгласно настоящото изобретение. Взаимодействието може да се проведе чрез смесване на азида (съединение I) с Pd/C в разтворител като ледена оцетна киселина и хидрогениране при налягане от бутилка в продължение на 10 до 20 часа. След това продуктът може да се отдели като първо се отстранява катализаторът чрез филтриране и лиофилизиране на филтрата като се получава амин (Послед.идент.№ 1-15) като аминът е първичен амин. Така полученият амин може да се превърне в заместен амин както е описано по-долу. Съединение I, в което -NR^R¹¹¹ означава -NH(CH₂)₂NH₂ или общо -NH(CH₂)₂_₄NR^IVR^V може да се получи от сулфона по метод, при който диаминът

НзМСНз)2-4NR^1vR^ взаимодействува със сулфона (съединение С, послед.идент.№ 31-45).

Взаимодействието се провежда в апротен разтворител като тези назовани по

-горе стайна температура.

Използва се около десеткратен изл ишък от амина.

Взаимодействието може да се проведе за време от повече от един час до няколко часа.

При провеждане на взаимодействието подходящият амин се прибавя към разтвор на сулфона в безводен апротен разтворител и реакционната смес се разбърква при стайна температура до получаване на съединение I (Послед.идент.№ 1-15), при които заместителят при С-5-орн е -NrUrIH. Желаното съединение може след това да се отдели чрез разреждане с водна трифлуорооцетна киселина и след това хроматографиране. Подходяща е флаш колонна хроматография с обърната фаза (С18) при елуиране с 10 до 25% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) в 5 процентен степенен градиент. Подходящите фракции могат да се лиофилизират, за да се извлече продуктът като сол на трифлуороцетната киселина.

Трифлуороцетатната сол може да се превърне в друга сол чрез разтваряне във вода и пропускане през BioRad AG2-X8(C1') полипреп колона и извличане на продукта като хидрохлоридна сол.

Когато Rj във формула I е водород, съединение Г (Послед.идент.№ 1-3,15), азотът може да се вкара директно в хемиаминалната позиция чрез взаимодействие за образуване на азид, който след това се редуцира до амин, който в даден случай може да се алкилира или ацилира, за да се получи

Ш

- 16 крайният продукт. Взаимодействието

може да се проследи на

Макар че Rj е водород в някои природни циклохексапептиди, Rj обикновено е хидроксил. Така за някои от съединенията, съединение А' в реакционната схема се получава в първия етап от съответното съединение, в което R1 е ОН.

Получаването на редуцираното съединение може да се извърши чрез разбъркване на съответното хидроксилно съединение в ИСЮ^диетнлов етер при стайна температура, като се прибави трифлуороцетна киселина, след това триетилсилан и като се подложи сместа на бързо разбъркване в продължение на 4 до 10 часа или докато изходното хидрокси съединение повече не се открива с аналитична • · · ·

HPLC. Реакционната смес след това се излива в дестилирана вода като се получава редуциран продукт като утайка, която след това се обработва по общоприетите начини. Така полученият редуциран продукт може да се използва с или без пречистване за получаване на азида.

Продуктите, в които Rj е Н, могат да се получат чрез прибавяне на модифицирания циклохексапептид към получен разтвор на NH3. NH3 може да се получи от натриев азид и

трифлуороцетна киселина. Взаимодействието се осъществява при стайна температура като се получава азид, който може да се отдели по общоприети процедури и да се пречисти чрез HPLC.

Пречистеният азид може да се редуцира до амин чрез хидрогениране с паладий/въглен по подобен начин на

описания по-горе.

Амините получени както е описано по-горе и притежаващи първична аминогрупа -NH2 могат след това да се алкилират по обичайните начини като се получава заместена аминогрупа. Накратко, алкилирането може да се извърши чрез взаимодействие на подходящо заместен алкилхалид с амин (съединение I, NRHrIII « NH2r Послед.идент.№ 1-15) в апротен разтворител, в присъствие на основа като се получава монозаместен амин (съединение I, NR^IIR¹¹¹ “ NHR¹¹, където R¹¹ е СрС^алкил, Сз-С^алкенил, (СН2)г-4^{он и} (СН2)2-4^nrIVrV)· Последнота може да се отдели от реакционната смес по общоприетите процедури.

Амините получени както е описано по-горе и имащи първична аминогрупа -NH2 могат да се ацилират по общоприетите начини като се получава ацилирана

····

- 18 аминогрупа. Въпросната ацилна група е СО(СН₂) 1 _4ΝΗ₂· Тъй като тя е първична аминогрупа, аминът в ацилиращата киселина се защитава например с бензилоксикарбонилна група преди да се проведе ацилирането. Активираният естер като пентафлуорофенилов естер се предпочита. Ацилирането може да се извърши в апротен разтворител, в присъствие на основа като диизопропилетиламин при стайна температура за един до няколко часа като се получава ацилиран продукт. Продуктът може да се изолира чрез разреждане на реакционната смес с метанол и пречистване с HPLC. Защитната група може да се отстрани чрез обичайна хидрогенолиза (съединение I, -NRUrHI = -NHCO(CH₂) j_4NH₂).

Аминът, в който аминогрупата при хемиаминалната позиция е напълно заместена, т.е., когато или RII или RlH е

водород, за предпочитане се получава чрез взаимодействие на сулфон (съединение В Послед.идент.№ 31-45) с подходящо заместен амин rUrIUnh. Взаимодействието може да се извърши чрез прибавяне на амина към разбъркван разтвор на сулфона за време достатъчно, за да се извърши реакцията. Продуктът може да се извлече чрез пречистване посредством препаративна HPLC и лиофилизиране на подходящите компоненти.

Изобретението включва също така и

• ··· ·· ·· ·· ···· ·· · · · · · ··· • · · · · · · · ··· • · · · · ··· · ··· · ····· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

- 19 При нормалния начин на соли.

присъединителни с киселина !

изолиране съединенията се получават като присъединителна с киселина сол. Обикновено това е като сол с трифлуороцетната киселина. Така получената сол може да се разтвори във вода и да се пропусне през йонообменна колона пренасяйки желания анион. Елуатът съдържащ желаната сол може да се

концентрира, за да се извлече солта като твърд продукт.

Съединенията съгласно настоящото изобретение са активни спрямо фунги и по-специално срещу Candida видовете. Противогъбичните им свойства могат да се илюстрират при определяне на минималната фунгицидна концентрация (МФК) срещу Candida организми при опит с разредена микробиална хранителна среда проведен в Yeast Nitrogen Base (DIFCO) среда c 1% декстроза (YNBD) .

За такъв опит, съединенията се солубилизират в

100% диметилсулфоксид при начална концентрация от 5 mg/ml. След разтваряне, лекарствената биомаса се довежда до концентрация 512 pg/ml чрез разреждане с вода, така че крайната концентрация на диметилсулфоксида да бъде около 10%. След това разтворът се пропуска през многоканална пипета в първата колонка на микротитърна плочка с 96-ямки (всяка ямка съдържаща 0,075 ml YNBD), като се получава концентрация на лекарството от 256 pg/ml. Съединенията от първата колона се разреждат двукратно напречно на редиците, като се получава крайна концентрация на лекарството започваща от 256 pg/ml до 0,12 pg/ml.

Приготвят се четиричасови хранителни култури на организмите, които ще се изпитват като се използва спектрофотометър при 600 шп спрямо еднакъв 0,5 стандарт на

McFarland.Тази суспензия се разрежда 1: 100 в YNBD, за да се получи клетъчна концентрация от 1-5 образуващи колония единици (CFU/ml). Аликвотни части от суспензията (0,075 ml) се инокулират във всяка ямка от микротитърната плочка като се получава краен клетъчен инокулум от 5-25 х 10³ CFU/ml и крайна концентрация на лекарството в порядъка от 128pg/ml до 0,06pg/ml. Всеки опит включва една редица несъдържащи лекарството контролни ямки и една редица несъдържащи f клетки контролни ямки.

( След 24 часа инкубация, микротитърните плочки се разклащат внимателно на клатачна машина, за да се ресуспендират клетките. Инокулатор MIC-2000 се използува за прехвърляне на 1,5 микролитрова проба от всяка ямка на 96ямковата микротитърна плочка в еднорезервоарна плочка за инокулация съдържаща декстрозен arap по Sabouraud(SDA). Инокулираните SDA плочки се инкубират в продължение на 24 часа при 35°С.Резултатите са както следва:

-21 СЪЕДИНЕНИЕ f ОРГАНИЗЪМ

е cd ο • V>H £ *л

Q ο u-> ο· оо см о г-Н

S

U-) ш о m

Ρί см Ρί

Pi

*п	о	ο	ο
04	о	to	to
т—( «	1П	ο	ο
о	ό	ό	ο

ιη οι τ—1	ο ο ο	ο to ο	ο to ο
ό		ό	ό
		V	V

»л см т—< ό un CM wd ό in

CM ο

ο to Ο

in CM ч““< ό in

CM rH ο

Я

CM

X Ζ

Ο ο οι

X см я и см я и

I я я сп о to О о

V

см

I

Tt· <й Ή

Q

Н

Q

II —<

Pi слЗ ф

Рч

К

Л ч ф

А

Φ

Рч о ЕН ω * 4— • · · · • · · ··· · ··· ! Съединенията показват също in vivo} ефективност спрямо фунги. която може да бъде демонстрирана със същите съединения от опита in vivo.

Растежна SDA култура на Candida albicans MY 1055

от една нощ се суспендира в стерилен физиологичен разтвор и клетъчната концентрация се определя чрез изброяване на хемацитометър и клетъчната суспензия се довежда до 3,75х10⁵клетки/мл. След това по 0,2 милилитра от тази суспензия се вкарва венозно в опашната вена на мишки, крайният инокулум да бъде 7,5х10⁴ клетки/мишка.

След това опитът се извършва, като се прилагат водни разтвори на съединение I в различни концентрации интраперитонеално(1.Р.), два пъти дневно(Ь.1.й.), в продължение на четири последователни дни на 18 до 20 грамови женски DBA/2 мишки, които предварително са инфектирани с Candida albicans по начина описан по-горе. На контролни мишки заразени с Candida albicans се прилага интраперитонеално дестилирана вода. След седем дни,

мишките се умъртвяват с газ въглероден диоксид, отделят се двата бъбрека асептично и се преместват в стерилна полиетиленова торбичка съдържаща 5 милилитра физиологичен разтвор. Бъбреците се хомогенизират в торбичките, серийно се разреждат със стерилен физиологичен разтвор и повърхността на SDA плочките се напръсква с аликвотни части. Плочките се инкубират при 35°С в продължение на 48 часа и дрождевите колонии се изброяват за определяне на единиците образуващи колонията (CFU) на грам бъбреци. Съединенията (1) и (2), (3) и (4) дават >99 процента намаляване на извлечими Candida CFU при 0,09 и

···

0,375 mg/kg интраперитонеално два пъти дневно в продължение на четири последователни дни.

ията от настоящото изобретение са полезни също за инхибиране или облегчаване на инфекции причинени от Pneumocystis carini при пациенти с увредена имунна система. Ефективността на съединенията от настоящото изобретение за терапевтични или антиинфекциозни цели може да бъде демонстрирана в опити с имуносупресирани плъхове.

В такова изследване е определена ефективността на съединение 1-6-1 (Rj = OH, R₂ = Н, R3 = CH₂CH₂NH₂, R¹ = DMTD, R¹¹ = Н, R^{111 e} CH₂CH₂NH₂). Плъхове порода Sprague Dawley (с тегло приблизително 250 грама) се подлагат на имуносупресия с дексазон в питейната вода (2,0 mg/L) и се държат на нископротеинова диета в продължение на седем седмици, за да се индуцира развитието на Pneumocystis pneumonia от латентна инфекция. Преди третираане с лекарственото средство, два плъха се умъртвяват, за да се потвърди наличие на Pneumocystis carinli pneumonia (РСР), и двата плъха е намерено, че имат инфекцията. Пет плъха (тежащи приблизително 150 грама) се инжектират два пъти дневно в продължение на четири дни подкожно със съединение 1-6-1 в 0,25 ml носител (дестилирана вода). Прави се и контролна проба с носител. Всички животни продължават да получават дексазон в питейната вода и нископротеинова диета по време на периода на третирането. След завършване на третирането, всички животни се умъртвяват, белите дробове се отделят и обработват, а степента на заболяването се определя чрез микроскопичен анализ на оцветени препарати. Резултатите от това изследване показват, че (' • ···· • · · «

- 24 ί I съединение 1-6-1 намалява P.carinii cysts y 5 плъха c наймалко 90 процента, когато дозата е 0,075 mg/kg , като всички плъхове преживяват.

I ;

Изтъкнатите свойства са използваеми по-ефективно, когато съединението се приготви в нов фармацевтично приемлив състав с фармацевтичноприемлив носител по общите фармацевтични техники на смесване.

Новите състави съдържат терапевтично противогъбно количество или антипневмоцистно количество от активното съединение. Общо, съставът съдържа най-малко 1 тегловен % съединение I. Концентрираните състави подходящи за разреждане преди употреба могат да съдържат 90 тегловни % или повече. Съставите представляват състави за орално, локално, парентерално (включително интраперитонеално, подкожно, мускулно и венозно), назално, прилагане чрез супозитории или инсуфлация. Съставите могат да се приготвят чрез хомогенно смесване на съединение I с компонентите, които са подходящи за желаната среда.

Съставите приготвени за орално прилагане могат да бъдат течни форми или твърди форми. За течните форми, терапевтичното средство може да се смеси с течни носители като вода, гликоли, масла, алкохоли и подобни, а за твърдите форми като капсули и таблети, с твърди носители като нишестета, захари, каолин, етилцелулоза, калциев и натриев карбонат, калциев фосфат, талк, лактоза, най-общо със смазващи вещества като калциев стеарат, заедно със свързващи, дезинтегриращи средства и подобни. Заради лекотата на тяхното прилагане, таблетите и капсулите представляват най-предпочнтаната орална дозирана форма.

• -У «ЛйФЯйата ·· • · • · ·· • · · • · ··· ·· ·· ···· •и · •· ··· ♦ *·· •· ·· ···

Особено предимство е съставите да се приготвят във форма на дозирани единици (както е посочено по-долу) за лесно прилагане и еднаквост на дозирането. «Съставите във форма на i ' ί единична доза представляват аспект на настоящото изобретение.

Съставите могат да се приготвят за инжектиране и такива форми могат да бъдат суспензии, разтвори или емулсии в маслен или воден носител като 0,85%-ен натриев хлорид или 5%-на декстроза във вода и могат да съдържат средства за приготвяне на формите като суспендиращи, стабилизиращи и/или диспергиращи средства. Буфериращи средства както и добавки като физиологичен разтвор или глюкоза също могат да се добавят, за да стане разтоворът изотоничен. Съединението може също така да се солубилизира в алкохол/пропиленгликол или полиетиленгликол за венозно прилагане чрез изкапване. Съставите могат също така да се приготвят във форма на дозирана единица в ампули или в многодозни контейнери, за предпочитане с добавка на консервант. Алтернативно, активните компоненти могат да бъдат в прахообразна форма за приготвяне с подходящ носител преди прилагане.

Терминът във форма на дозирана единица” както е използван в описанието и претенциите се отнася до физически разделени единици, всяка единица съдържаща предварително определено количество активен компонент изчислено да води до желания терапевтичен ефект, заедно с фармацевтичен носител. Примери за такива дозирани единици са таблети, капсули, пилили, прахчета, нишестени капсули и подобни. Дозираните единици съгласно настоящото

• · · ···· · · · • · ···· ····· • · · · ····· ··· · ····· · · · ··· ·· ·· ♦· ·· ···

- 26 .изобретение могат да съдържат общо от 100 до 200 милиграма от едно от съединенията.

Когато съединението се използва като ι

противогъбично средство, може да се използва всякакъв метод за прилагането му. За третиране на микотични инфекции, се използва обикновено орално или интравенозно прилагане.

Когато съединението ще се използва за контрол на инфекции Pneumocystis, желателно е директно да се третира белият дроб или бронхите. За тези случаи се предпочитат инхалациите. За прилагане чрез инхалации, съединенията съгласно настоящото изобретение удобно се доставят под формата аерозолен спрей в опаковки под налягане или небулизатори. Предпочитана система за прилагане чрез инхалация е самоопределящ дозата на инхалация (MDI) аерозол, който може да се приготви като суспензия или разтвор на съединение I в подходящи пропеланти като флуоровъглероди или въглеводороди.

Макар че съединенията съгласно настоящото изобретение могат да се прилагат като таблети, капсули, състави за локално приложение, прахове за инхалиране, супозитории и подобни, разтворимостта на съединенията от настоящото изобретение във вода и водни среди ги прави приемливи за употреба в инжекционни форми, а също и за течни състави подходящи за аерозолни спрейове.

Следващите примери илюстрират изобретението, но те не са ограничаващи.

Примери 1-3 илюстрират получаването на продуктите по първия метод, именно като се преминава през сулфона. Методът може да се използва за получаване на което и да е

съединение, но трябва да се използва за получавайе на продукта, когато Rj е ОН, с добър добив.

Примери 4 и следващите илюстрират получаването на продуктите чрез директно заместване на кислород с азот в хемиаминалната позиция 5-орн. Този метод се предпочита, когато R| е Н и R4 и R¹¹¹ е Н .

Пример 3 илюстрира използването като изходен продукт съединение, в което R₃ вече е бил редуциран до CH₂CH₂NH₂ от природния продукт, където R₃ е CH₂CONH₂. Подобно, за съединенията, в които R₃ е -CH₂CN може да се използва вече частично модифицирано съединение.

Примери 9 и 10 илюстрират превръщането на хемиаминалния кислород в азот и след това превръщане на

CH₂CN или ch₂ch₂nh₂.

- 28 ! ПРИМЕР 1

2hci

но

Част А. Получаване на междинното съединение 1-[4хидрокси-5-(епи)-аминоетилтио-1Ч²-(10,12-диметмл-1оксотетра децил) орнитнн]-5-(3-хидрокси глута мин)-6-(3хидроксипролин)ехинокандин В (Послед.идент.№ 34)

Разтвор на 500 mg (0,47 mmol) пнеумокандин Bq (Послед.идент.№ 19), 5,34 g (47 mmol) 2-аминоетантиол хидрохлорид и 109 mg (0,47 mmol) (lS)-(+)- 10-камфорсулфонова киселина в 40 ml безводен диметилформамид се разбърква при 25°С в продължение на 6 дни. Реакционната смес се разрежда с 40 ml вода и се провежда флаш хроматография върху колона LICHROPREP RP18 (40-63 pm, 15,0 g) приготвена с 10% ацетонитрил/вода. Колоната се елуира с 10 до 40% ацетонитрил/вода, като се събират две фракции при всеки 10 процентен градиент. От двете фракции елуирани с 40% ацетонитрил/вода се получава 185 mg • · · · · · продукт, който се пречиства^ чрез HPLC ZORBAX С8 (21,2 х

250 mm), при елуиране с 40-45% ацетонитрил/вода (0,1% три флуороцетна киселина), при което се получава 128 mg 1-[4хидрокси-5-(епи)-аминоетилтио-М²-(10,!2-диметил-1I оксотетра децил)орнитин]-5-(3-хидроксиглутамин)-6-(3хндроксипролин)ехинокандин В трифлуороацетат като бяло аморфно твърдо вещество.

*НЯМР (400 MHz, CD3OD) 6 1,34 (d, J=6,3 Hz, ЗН),

2,89 (m, 2H), 4,72 (d, J=4,9 Hz, 1H).

FAB-MS (Li), m/e 1131 (MH+Li)⁺.

Част В. Получаване на междинен сулфон (Послед.идент. № 34)

Към разбъркван разтвор от тиосъединението (444 mg,

0,358 mmol) получено в част А, в 15 mL 1:1 ацетонитрил/вода се прибаβ«ΟΧΟΝΕ (324 mg еквивалентни на 1,06 mmol калиев хидрогенперсулфат). След около 45 минути разтворът се разрежда с равно количество вода и бързо се хроматографира като се използва колона за флаш хроматография с обърната фаза (С18) и се елуира с 35-43% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) при 2% степенни градиенти. Продуктът съдържащ фракциите се лиофилизира като се получава 357 mg (86% добив) от еписулфона.

*НЯМР (400 MHz, CD3OD) δ 3,48 (m, 2Н), 3,55 (m, 1Н),

3,71 (m, 1H), 3,91 (dd, 1H), 4,00 (m, 1H), 5,17 (dd, 1H), 6,76 (d,

2H), 7,16 (d, 2H).

Част C. Получаване на продукт c формула (1),

Съединение 1-4 (Послед.Идент. №4)

Към разбъркван разтвор от 1,2 g (0,945 mmol) епи• ···· ··· • · · · · ··*· • · · · ··· · ··· • · · · · • · ·· · · ·*· сулфон (получен кактр е описано в част В) в 20 mL безводен диметилформамид се прибавя етилендиамин (568 mg, 9,45 mmol). След 1 час, HPLC анализът (RP-C18, 40% CH3CN/H2O (0,1% трифлуороцетна киселина)) на реакционната смес показва пълно превръщане в два полярни продукта в съотношение 37:63. След флаш хроматогрфия на колона с обърната фаза (С18) и елуиране с 10-40% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) при 5%-ен степенен градиент се провежда лиофилизация на подходящите фракции като се получава 200 mg (21% добив) нормален продукт като (бис) трифлуорацетатна сол.

*НЯМР (400 MHz, CD3OD) δ 1,14 (d, J=6,2 Hz, 3H),

2,72 (dd,

3,8 Hz,

Hz, 1H),

5,09 (dd,

J=8,5 и

4,2 Hz, 1Н), 5,18 (широк s, 1H), 6,74

Hz, 2H),

7,12 (d,

J=8,6 Hz, 2H), 7,47 (d, J=8,6 Hz, 1H),

7,71 (d, J=10,0 Hz, 1H), 8,11 (d, J=8,7 Hz, 1H), 8,71 (d, J=8,7 Hz,

1H).

FAB-MS (Li), m/z 1113,5 (MLi)⁺.

(Бис)-трифлуорацетатната сол получена по-горе се рзтваря във вода и разтворът се пропуска през Bio-Rad AG2Х8 (С1~) полипреп колона като се промива с още вода.

Продуктът съдържащ елуата се лиофилизира като се получават горните съединения като (бис)-хидрохлорид.

След лиофилизиране на фракциите съдържащи главния продукт се получава епи-продукт.

*НЯМР (400 MHz, CD₃OD) S 3,02 (m, 1Н), 4,16 (m, 1H),

5,10 (dd, 1Н), 6,76 (d, 2H), 7,14 (d, 2H).

FAB-MS (LI), m/z 1113,9 (MLi)⁺.

ft • ·

- 31 ПРИМЕР 2

Част А. Получаване на междинен сулфон (Послед.идент. №36)

Изходното съединение А-6 R¹ = 9,11-диметилтридецил (Послед.идент. №21) се получва както е описано за такова съединение в раздела озаглавен Получаване на изходните продукти.

Съединение А-6 се превръща в епи-тиосъединението В-6 (Послед.идент. № 36) по подобен начин на описания в част А на пример 1.

Към разбъркван разтвор на 285 mg (0,241 mmol) съединение В-6 в 14 mL 1:1 ацетонитрил/вода се прибавя OXONE (162 mg еквивалентни на 0,530 mmol калиев хидрогенперсулфат). След период от 45 минути разтворът се разрежда с равно количество вода и се хроматографира. След флаш хроматогрфия на колона с обърната фаза (С18) и елуиране с 30-45% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) при 5%-ен степенен градиент се провежда ·· ·· ···· ♦ · · · ·

лиофилизация на съдържащите продукта фракции като се [

получава 212 mg епи-сулфон (съединение С-6, Послед.идент.№

36). Добив . 84%.

*НЯМР (400 MHz, CD₃OD) δ 3,08 (m, 2Н), 3,46 (t, J=6,6

Hz, 2H), 3,68 (m), 5,05 (m), 6,77 (d, J=8,5 Hz, 2H), 7,15 (d, J=8,5 Hz, 2H).

FAB-MS (LI), m/z 1039,0.

Част В. Получаване на продукт c формула (2) (Съединение 1-6, R^II=H, R^I1I=2- аминоетил). Послед.идент.№6

Към разбъркван разтвор на съединение С-6 (получено както е описано в част А,418 mg, 0,305 mmol) в 10 mL безводен диметилформамид се прибавя етилендиамин (183 mg, 3,05 mmol). След период от 1 час, HPLC анализът (RP-C18, 35% CH3CN/H2O (0,1% трифлуороцетна киселина)) на реакционнта смес показва пълно превръщане в два полярни продукта в съотношение 36:46. Реакционната смес се разрежда с водна трифлуороцетна киселина (190 mL Н2О, 0,4 mL CF3COOH) и се хроматографира. След флаш хроматогрфия на

колона с обърната фаза (С18) и елуиране с 10-25% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) при 5%-ен степенен градиент се провежда лиофилизация на съдържащите продукта фракции като се получава 111 mg от продукта като (трис)-трифлуорацетатна сол. Добив 25%.

1НЯМР (400 MHz, CD3OD) δ 1,17 (d, J=6,2 Hz), 2,44 (dd, J=7,0 и 13,2 Hz, 1H), 2,7-3,0 (m, 4H), 3,06 (t, J=7,0 Hz, 2H), 3,82 (m, 3H), 3,97 (dd, J=ll,2 и 3,2 Hz, 1H), 4,03 (m, 2H), 4,70 (d, J=2,3 Hz, 1H), 5,00 (d, J=3,3 Hz, 1H), 6,75 Hz (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,11 (d, J=8,6 Hz, 2H).

FAB-MS (Li), m/z 1099,9 (MLi)⁺, 1033,9.

• е«- · · · · · · · · · · ·♦ * ···· ··· • ^е · · · · ·· ··« • ♦ · · ····· ··· · • · · · · · · · ··« ·· ·· ·· ·· ·«·

- 33 I (Трис)-трифлуорацетатната сол получена по-горе се разтваря във вода и разтворът се пропуска през Bio-Rad AG2Х8 (СГ) полипреп колона като се промива с още вода.

Продуктът съдържащ елуата се лиофилизира като се получават 93 mg горното съединение като (трис)-хидрохлорид.

ПРИМЕР 3

НС!

Част А. Получаване на азид (Послед.идент.№40)

Към разбъркван разтвор от 297 mg, 0,257 mmol) еписулфон (пример 1, част В) в 10 милилитра безводен диметилформамид се прибавя литиев азид (126 mg, 257 mmol). След период от около 1 час, HPLC анализът (RP-C18, 40% СНзС1Ч/Н2О (0,1% трифлуороцетна киселина)) на реакционната смес показва пълно превръщане до един, по-малко полярния, продукт. След флаш хроматогрфия на колона с обърната фаза (С18) и елуиране с 30-65% ацетонитрил/вода (0,1% трифлуороцетна киселина) при 5%-ен степенен градиент се провежда лиофилизация на съдържащите продукта фракции като се получава суров азид. След препаративна HPLC (RP• ·· ·

С18, 40-45% CH3CN/H2O (0,1% трифлуороцетна киселина) с един 5%-ен степенен градиент) се получава азндът, съединение

D-4,

2,50

3,95 (Послед.и дент.№49).

’НЯМР (400 MHz, CD3OD) δ 1,14 (d, J=6,l Hz, 3H), (dd, J=15,6 и 9,9 Hz, 1H), 2,84 (dd, J=15,6 и 3,3 Hz, 1H), (dd, J=11,2 и 3,1 Hz, 1Н), 4,05 (m, 2H), 4,56 (m, ЗН), 4,98 (dd, J=8,5 и 3,5 Hz, 1H), 5,10 (dd, J=8,3 и 4,2 Hz, 1H), 5,26 (dd,

J=8,5 и 2,2 Hz, 1H), 6,74 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,12 (d, J=8,6 Hz,2H),

7,44 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,76 (d, J=9,9 Hz, 1H), 8,26 (d, J=8,l Hz, 1H), 8,83 (d, J»8,7 Hz, 1H), 9,00 (d, J=8,5Hz, 1H).

FAB-MS (Li), m/z 1096,9 (MH+Li)⁺.

ИЧ (нуйол, cm^-1) 2110.

Част В. Получаване на амин (Послед.идент.№ 4)

Смес от азида D-4, получен в част А, (137 mg, 0,126 mmol) и 10% Pd/C (137 mg) в ледена оцетна киселина (10 mL) се хидрогенира под налягане от бутилка за период от 14 часа. Катализаторът се отстранява чрез филтриране и филтратът се лиофилизира като се получава суров продукт амин. След пречистване посредством HPLC (RP-C18, 35-41% CH3CN/H2O (0,1% трифлуороцетна киселина) с един 3%-ен степенен градиент) и след това лиофилизиране на подходящите фракции се получава азасъединение, съединение 1-1, rIIjRHI = ц (Послед.идент.№ 1) като сол на трифлуороцетната киселина. Добив 48%.

*НЯМР (400 MHz, CD3OD) δ 1,13 (d, J= 6,1 Hz, 3H),

2,49 (dd, J=15,6 и 9,8 Hz, 1H), 2,81 (dd, 3=15,6 и 3,4 Hz, 1H),

3,97 (dd, J=11,1 и 3,1 Hz, 1H), 4,03 (m, 1H), 4,11 (m, 1H), 4,47 (dd, J=ll,7 и 5,5 Hz, 1H), 4,57 (m, 2H), 5,00 (m, 1H), 5,14 (d,

J=2,2 Hz, 1H), 6,74 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,12 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,42

- 35 прибавя трифлуороцетна киселина (2,50 mL) и след това триетилсилан (5,00 mL). Хетерогенната смес се разбърква бързо в продължение на 6 часа, след което време се открива малко или не се открива никакъв изходен пнеумокандин Βθ !

посредством аналитична iHPLC (С18 ZORBAX, 45% разтворител А/55% разтворител В/0,1% трифлуороцетна киселина, 1,5 ml/min). Сместа се излива в 200 mL дестилирана вода, филтрира се и се суши на въздуха. Влажният твърд продукт се разбърква с диетилов етер, филтрира се и се суши на въздуха, като се получава 5,6 g суров моноредуциран пнеумокандин Βθ, (съединение А-1, Послед.идент.№ 16).

Суровият изолат получен по-горе се прибавя като твърдо вещество към предварително приготвен разтвор на ΗΝθ, получен при разтваряне на ΝβΝθ (3,06 g, 47,0 mmol) в 100 mL трифлуороцетна киселина при охлаждане. След разбъркване при стайна температура в продължение на 30 минути, реакционната смес се излива в 350 mL дестилирана вода и се разбърква в продължение на 15 минути. Утайката се филтрира, разтваря се в метанол и разтворителят се отстранява под вакуум. Останалата вода се отстранява ацеотропно с 100% етанол. Крайният твърд продукт се подлага на въздействие на висок вакуум за отстраняване на летливите компоненти. Сместа се пречиства на две еднакви порции чрез препаративна HPLC (С18 DELTAPAK, 60 ml/min, 48 mL фракции) като се използва елуиране със степенен градиент от 70% А/30% В до 50% А/50% В. Подходящите фракции се обединяват (определени чрез УВ наблюдение при λ=220 и 277 пш). Онечистените фракции се обединяват и се подлагат на повторна обработка по подобен начин на описания по-горе. По • ·· · • · · · ····· « « · ··· · · · · · · ·· ···

- 35 (d, J=8,3Hz, 1H), 8,89 (d, J=8,8 Hz, 1H).

FAB-MS(Li), m/z 1071,0 (ML1)⁺. I

Трифлуорацетатът се разтваря във вода и разтворът

I се пропуска през Bio-Rad AG2-X8 (СГ) полипреп колона, промива се с още вода. Елуатът съдържащ продукта се лиофилизира като се получава 66 mg съединение 1-4, rII'RIII = н (Послед.идент.№ 1) като хидрохлорид.

В следващите примери разтворител А - 95% вода/ 5% ацетонитрил/0,1 % трифлуороцетна киселина и разтворител В = W 95% ацетонитрил/5% вода/0,1% трифлуороцетна киселина.

Когато е използван изразът под вакуум или ротоизпаряване, това означава отстраняване на разтворителя на ротационен изпарител.

ПРИМЕР 4

А. Получаване на междинен азид, съединение D-1 (Послед.идент.№ 46)

Пнеумокандин Βθ (Съединение А-4, Послед.идент.№

19) (5,00 д, 4,69 mmol) се разтваря в 2М LiClO₄ - диетилов етер при стайна температура. Към разбърквания разтвор се

този начин се получава общо 1,7|В g (35% добив) от азида D1(Послед.идент.№ 46).

*НЯМР (400 MHz, CD₃OD): δ 7,02 (d, 2Н), 6,69 (d, 2Н), 5,30 (d, 1Н), 5,11 (d, 1H), 4,98 (d, 1H), 2,74 (dd, 1H), 1,13 (d, 3H).

FAB-MS (Li), m/z 1081 (MH+Li)⁺.

В. Получаване на амин c формула (4), съединение 1-1 (R¹¹, RH1 = H (Послед.идент.№ 1)

Пречистеният азид, съединение D-1, получен по-горе (1,50 g) се разтваря в 40 mL метанол. Прибавя се 33% водна оцетна киселина (15 mL) и след това 0,20 g 10% Pd/C, след което реакционният съд се продухва с N2 · Атмосферата вътре в колбата се променя с Н2 и сместа се розбърква бързо под атмосфера от Н2 в продължение на 3 часа. Суспензията се филтрира през 0,2 цт фрита и бистрият разтвор се

концентрира до сухо под вакуум. Остатъкът се разтваря в приблизително 20 mL дестилирана вода, замразява се и се лиофилизира като се получава 1,47 g (95%) от желания амин (Послед.идент.№ 1) като бяло твърдо вещество.

*НЯМР (400 MHz,CD₃OD): 8 7,02 (d, 2Н), 6,69 (d, 2Н),

5,09 (d, 1Н), 5,01 (d, 1H), 2,77 (dd, 1H), 1,15 (d, 3H). FAB-MS (LI), m/z 1055 (MH+LI)⁺.

·· ♦··· • · • · ···· ····· • · · · · ··· ♦ ··· · ····· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

- 37 ПРИМЕР 5 I

НО

А. Получаване на междинното съединение бензилоксикарбонил (Послед.идент.№ 1)

Аминът с формула (4) от пример 4 (200 mg, 0,100 mmol) и пентафлуорофенил N-бензилоксикарбонил-Заминопропаноат се разтваря в 1 mL диметилформамид. Прибавя се диизопропилетиламин (0,035 mL, 0,198 mmol) и сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 1 час. Реакционната смес се разрежда с 2 mis метанол и се пречиства посредством препаративна HPLC (С18 DELTAPAK , степенен градиент: 70% А/30% В до 48% А/52% В, 48 mL фракции). Подходящите фракции определени чрез УВ абсобрция (220, 277 nm) се обединяват, замразяват и лиофилизират като се получава 100 mg (44%) от желаното междинно съединение.

*НЯМР (400 MHz, CD₃OD): δ 7,32 (m, 5Н), 7,01 (d, 2Н),

6,69 (d, 2Н), 5,64 (bd, 1Н), 1,18 (d, 3H).

FAB-MS (Li), m/z 1259 (MLi)⁺.

• · · · * <» ··· • · ···· ·· ··· • · ·· · ··· · ·♦· · ····· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

- 38 В. Получаване на 3-аминопропаноил, съединение с формула (5), съединение 1-1 R¹¹ = Н, R¹¹¹ = CO(CH2)2^NH2 (Послед.идент.№ 1)

Бензилоксикарбонилът от част А (»4 mg, 0,075 mmol) се разтваря в смес от 3 mL метанол, 1 mL вода и 0,2 mL оцетна киселина. Прибавя се 20% Pd-C (48 mg) и съдът се продухва с N2 газ. След това съдът се продухва с Нг и сместа се разбърква енергично под 1 атм Н2 в продължение на 2 часа. След отстраняване на летливите компоненти под вакуум се получава твърд продукт. Твърдият продукт се разтваря в около 4 mL 50% воден ацетонитрил, замразява се и се лиофилизира като се получава 80 mg (91%) желаното съединение с формула (5) като бяло твърдо вещество.

*НЯМР (400 MHz, CD3OD): δ 7,01 (d, 2Н), 6,69 (d, 2Н), 6,67 (d,lH), 5,10 (d, 1H), 4,99 (d, 1H), 3,12 (m, 2H), 1,91 (s, 3H), 1,17 (d,3H).

FAB-MS (LI), m/z 1125 (MLI)⁺.

ПРИМЕР 6

HO

• · · · · · · * · · • a ···· ····« • ··· ····· ··· · ····· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

- 39 Получаване на N-метиламиносъединение с формула (6), съединение 1-1 (RU=H, К^1!,=СНз) (Послед.идент.№ 1)

Аминът формула (5) от пример 5 (45,6 mg, 0,135 mmol) се разтваря в 0,5 mL сух диметилформамид. Прибавя се йодометан (0,021 mL, 0,338 mmol) и след това диизопропилетиламин (0,0824 mL, 0,473 mmol). След разбъркване при стайна температура в продължение на 24 часа, летливите компоненти се отстраняват под вакуум и суровият продукт се анализира чрез масспектрометрия.

FAB-MS (LI), m/z 1068 (ML1)⁺.

ПРИМЕР 7

НО

А. Получаване на междинния нитрил(1Ч-цианометил), съединение 1-1, R^{11 β} Н, R¹¹! == CH2CN (Послед.идент.№ 1)

Аминът получен както е описано в пример 4 (500 mg,

0,451 mmol) се разтваря в 3 mL сух диметилформамид.

Прибавя се бромацетонитрил, който е пречистен чрез прекарване през слой магнезиев сулфат-натриев бикарбонат, (0,063 mL, 0,902 mmol) и след това диизопропилетиламин

4· · · · · · ··« • · ···· ····· • · · · « ··· · ··· · ····· · · · ··· ·♦ ·· ·· ·· ···

- 40 (0,157 mL, 0,902 mmol). Бистрата реакционна смес се разбърква в продължение на 12 часа и след това се разрежда с малко количество вода. Разтворът пречиства чрез ί

препаративна HPLC (С18 DELTAPAK, степенен градиент: 70% А/30% В до 47% А/53% В, 48 mL фракции). Подходящите фракции, определени чрез УВ абсорбция при 220 и 277 nm, се обединяват, замразяват и лиофилизират като се получава 338 mg (62%) желаното междинно цианометилно съединение като водонеразтворим твърд продукт.

^ЛНЯМР (400 MHz, CD3OD): δ 7,01 (d, 2Н), 6,69 (d, 2Н), 5,12 (dd, 1Н), 5,01 (dd, 1H), 3,80 (s, 2H), 2,76 (dd, 1H), 1,15 (d, 3H).

FAB-MS (LI), m/z 1094 (MH+LI)⁺.

В. Получаване на N-аминоетил, съединение c формула (7), съединение I-1, Rⁿ = H, R¹¹¹ = (CH2)2^NH2 (Послед.идент.№ 1)

Нитрилът (цианометил) получен по-горе (300 mg, 0,249 mmol) се разтваря в 5,0 mL метанол. След това се прибавя никел(П)хлорид хексахидрат (237 mg, 0,997 mmol). Към разтвора се прибавя натриев борохидрид (189 mg, 4,99 mmol) на три порции. Незабавно се образува черна утайка и сместа се разбърква в продължение на 15 минути при стайна температура. Хетерогенната смес се разрежда с около 20-40 mL вода и се прибавя приблизително 10-15 mL 2N НС1. Разбъркването продължава 45 минути докато черната утайка се разтвори и разтворът остане синьо-зелен. Пречистването се извършва чрез препаративна HPLC (С18 DELTAPAK”, степенен градиент: 70% А/30% В до 55% А/45% В, 48 mL фракции). Подходящите фракции, определени чрез УВ абсорбция при 220 • · · fl ·· ·· е * · · • · · · · • · · · ··· • · · · · • · · · · · ·· ···· • · · • · ··· ··· · • · се обединяват, замразяват и лиофилизират като се получава

180 mg (55%) желаният продукт. Този продукт се разтваря в 30 mL вода и се пропуска през йонообменна колона (СГ форма), като се промива с дестилирана вода. Разтворът се замразява и се лиофилизира като се получава 149 mg (94% добив) желаното аминоетилно съединение с формула (7) (Послед.идент.№ 1) като бяло твърдо вещество.

*НЯМР (400 MHz, CD₃OD): δ 7,01 (d, 2Н), 6,69 (d, 2Н),

5,11 (dd, 1Н), 5,07 (dd, 1H), 1,14 (d, 3H).

FAB-MS (LI), m/z 1098 (MH+Li)⁺.

ПРИМЕР 8 * T рифуороцетна киселина

2‘V

HO

А. Получаване на междинен азид (Послед.идент.№ 47) Пнеумокандин Bq нитрил (Послед.идент.№ 20) (2,00 д, 1,91 mmol) се разтваря в 24 mL 2М LICIO4 - диетилов етер. Към сместа се прибавя триетилсилан (2,00 mL) и след това трифлуороцетна киселина (1,00 mL) и сместа се разбърква бързо в продължение на 6 часа при стайна температура.

Сместа се излива в 300 mL вода разбърква се в продължение ···· ft··· • · · · · ft -ft ft • · ···· · « ··· • · ft · ft ft»· ft *··· ft ft ft ft · ft ft· ··· ·· ·· ·· ·· ··· на 15 минути и| се филтрира. Филтърната утайка се|разтваря в малко количество метанол и разтворителят се отстранява под вакуум. Останалата вода се отделя ацеотропно с 100% етанол и остатъкът ср подлага на висок вакуум за отстраняване на летливите компоненти като се получава продуктът (Послед.ндент.№ 17) моноредуциран при бензиловия въглероден атом.

Суровото твърдо вещество получено по-горе и натриев азид (1,26 д, 19,4 mmol) се преместват в облодънна колба снабдена с пръчка за разбъркване и охлаждаща баня. Бавно се прибавя трифлуороцетна киселина (50 mL), охлаждащата баня се отстранява и сместа се разбърква в продължение на 2 часа. Излива се в 300 mL вода и се филтрира. Твърдият продукт се разтваря в метанол и се подлага на висок вакуум за отстраняване на летливите компоненти. Суровият продукт се пречиства посредством препаративна HPLC (С18 DELTAPAK, степенен градиент: 55% А/45% В до 45% А/55% В, 56 mL фракции). Подходящите фракции, определени чрез УВ абсорбция при 220 и 277 nm се обединяват, замразяват и лиофилизират като се получава 0,59 g (29%) желания междинен азид (Послед.идент.№ 47).

^НЯМР (400 MHz CD3OD): δ 7,00 (d, 2Н), 6,69 (d, 2Н), 5,34 (d, 1Н), 5,07 (d, 1H), 5,00 (m, 1H), 2,88 (dd, 1H), 1,17 (d, 3H).

FAB-MS (LI), m/z 1036 (M-N₂+Li)⁺.

В. Получаване на съединение c формула (8) (Послед.идент.№ 48)

Пречистеният азид от част А (0,15 g, 0,142 mmol) се разтвря в смес от 4 mL метанол, 1 mL вода и 0,5 mL оцетна

ЗЙЖМЙЯ··

киселина. Към разтвора се прибавя 10% Pd-C (50 mg). |

Реакционната смес се продухва с N3, след това с Нз· Сместа се разбърква бързо при стайна температура в продължение на часа под 1 атмосфера налягане на Нз* След филтриране през ί

0,2 pm фрита и отстраняване на летливите компоненти се j получава 0,124 g (80%) желаното съединение с формула (8), съединение 1-2, R¹¹, R¹¹¹ = Н, R^{1 β} 9,11-диметилтридецил ί#***

V (Послед.идент.№ 2) като бяло твърдо вещество.

^}НЯМР (400 MHz, CD3OD): δ 7,00 (d,2H), 6,69 (d, 2H),

5,04 (d, 1H), 5,01 (m, 1H), 2,79 (dd, 1H), 1,18 (d, 3H).

FAB-MS (LI), m/z 1037 (MH+Li)⁺.

ПРИМЕР 9

Получаване на амин с формула (9)(Послед.идент.№ 3) Пречистеният азид-нитрил от пример 8, част А (44 mg, 0,0416 mmol) се разтваря в 1,5 mL метанол и след това C0CI2.6H20 (59 mg, 0,25 mmol). След това внимателно, на части се прибавя NaBH4 (8 х 12 mg, 2,50 mmol). Черната, хетерогенна реакционна смес се разбърква в продължение на ··· ·

минути при стайна температура. Реакцията се прекъсва чрез прибавяне на около 1,5 mL 2N НС1 и достатъчно оцетна киселина за разтваряне на утайкта. Слабооцветеният разтвор се разрежда с 3 mL вода и се пречиства чрез препаративна HPLC (CIS ZORBAX, степенен градиент: 70% А/30% В до 60% А/40% В, 15 ml/min, 15 mL фракции). Подходящите фракции, определени чрез УВ абсорбция при 220 и 277 пш се обединяват, замразяват и лиофилизират като се получава 38 mg (72%) желаният продукт с формула (9) като бяло твърдо

вещество.

^!НЯМР (400 MHz, CD3OD): δ 6,99 (d, 2Н), 6,70 (d, 2Н),

5,11 (d, 1Н), 5,0 (m, 1H), 3,05 (m, 2H), 1,17 (d, 3H).

FAB-MS (Li), m/z 1041 (MH+Li)⁺.

ПРИМЕР 10

HO

А. Получаване на междинното съединение бис-нитрил (съединение 1-2, R¹¹ « Н, R¹¹¹ = CH₂CN, R¹ = 9,11-диметилтридецил)(Послед.идент.№ 2) • ·

- 45 Нитрил-аминът от пример, 8, част В (500 mg, 0,459 mmol) се разтваря в 3 mL сух диметилформамид. Прибавя се бромацетонитрил, който е пречистен предварително чрез пропускане през слой магнезиев сулфат-натриев бикарбонат, (0,064 mL, 0,917 mmol) и след това диизопропилетиламин (0,155 mL, 0,917 mmol). Реакционната смес се разбърква при стайна температура в продължение на 18 часа. Разрежда се с вода и се пречиства чрез препаративна HPLC (С18 DELTAPAK, 60 ml/min, степенен градиент: 70% А/30% В до 50% А/50% В, 48 mL фракции). Подходящите фракции, определени чрез УВ абсорбция при 220 и 277 от се обединяват, замразяват и лиофилизират като се получава 198 mg (36%) желаното съединение 1-2, rH = Н, RIH = CH₂CN.

^JHRMP (400 MHz, CD₃OD): δ 7,00 (d, 2H), 6,69 (d, 2H), 5,08 (dd, 1H), 5,01 (dd, 1H), 3,73 (s, 2H), 2,79 (dd, 1H), 1,18 (d,

3H).

FAB-MS (Li), m/z 1076 (MH+Li)⁺.

В. Получаване на съединение c формула (10) (Послед.идент.№ 3)

Бис-нитрилът от част А (184 mg, 0,155 mmol) се разтваря в 3 mL метанол. N1C1₂.6H₂O (148 mg, 0,621 mmol) се разтваря в метанол и се прибавя NaBH₄ (117 mg, 3,1 mmol) на три порции. След 5 минути се прибавя СоС1₂.6Н₂0 148 mg, 0,621 mmol) и се разбърква 1 минута. Прибавят се още 117 mg NaBH₄ и разбъркването продължава 15 минути. Прибавя се друга порция 60 mg NaBH₄, за да се доведе процесът докрай. Сместа се разрежда с вода, подкислява се с 2N НС1 и се разбърква докато черната утайка се разтвори. Пречистването чрез препаративна HPLC (С18 ZORBAX, 15ml/min, степенен

- 46 градиент: 70% А/30% В до 55% А/45% В, 22,5 mL фракции) дава след лиофилизация твърд продукт. Твърдият продукт се разтваря във вода и се пропуска през йонообменна колона (СГ форма), замразява се и се лиофилизира като се получава

81,1 mg (44%) желаният продукт с формула (10) (съединение I-

3, Послед.идент.№ 3) като бяло твърдо вещество.

^!НЯМР (400 MHz, CD3OD): δ 7,00 (d, 2Н), 6,70 (d, 2Н),

3-3,3 (m, 6Н), 1,18 (d, ЗН).

FAB-MS (Li), m/z 1084 (MH+Li)⁺.

ПРИМЕРИ 11-14

Работи се по подобен начин на описания в пример 4, съответните циклопептиди природни продукти или модифицирани природни продукти получени както е описано по-долу при получаване на изходните продукти, се разтварят отделно в ЕЮО^диетилов етер и към разтвора се прибавя при разбъркване трнфлуороцетна киселина и триетилсилан в продължение на 5 до 10 часа. Сместа след това се излива във вода, филтрира се и твърдият продукт се разбърква с диетилов етер, след това се филтрира и се суши на въздуха като се получава циклопептид,при който R] е редуциран до Н.

Моноредуцираното съединение се прибавя към предварително приготвен разтвор на HN3 от NaN3 и трнфлуороцетна киселина) при охлаждане и разбъркване при стайна температура в продължение на 30 минути до 1 час и след това се излива във вода като се получава азиден продукт, който се извлича по описания по-горе начин.

Азидът се хидрогенира както е описано по-горе като се използва Pd/C като катализатор и продуктът се извлича от филтрата след отделяне на катализатора.

• · ···· • е • ···

Продуктите получени по този начин са:

Пример ^R1 »2 ^R3

NR¹¹ R¹¹¹ R¹

Поел. дент.№

11	Н	Н	ch₂conh₂	Η	Η	C₈H₄OC₈Hj₇	12
12	Н	Н	ch₂cn	Η	Η	С₆Н₄ОС₈Н₁₇	13
13	Н	Н	ch₂ch₂nh₂	Η	Η	^С6^Н4^ОС8^Н17	14
14	Н СН₃ СН₃	Η	Η	C₆H₄OC₈Hi₇	15

ПРИМЕРИ 15-17

Работи се по подобен начин на описания в пример 7 като съединения от примери 11,13 и 14 се разтварят в диметилформамид и към разтвора се прибавя пречистен бромоацетонитрил и диизопропилетиламин и сместа се разбърква от 12-18 часа като се получава нитрилът (Nцианометил). Последният се пречиства чрез препаративна HPLC.

Нитрилът се разтваря в метанол и се редуцира химически като се използва никел(П)хлорид и натриев борохидрид като се получава аминоетилов заместител както следва:

Пр. Rj R₂ R₃	NR¹¹ R¹¹¹ R¹	Поел. идент.№
15	H	H	ch₂conh₂	H	(CH₂)₂NH₂ c₁₀h₆oc₈h₁₇	12
16	H	H	(CH₂)₂NH₂	H	(CH₂)₂NH₂ C₁₀H₆OC₈H₁₇	14
17	H	H	CH₃	H	(CH₂)₂NH₂ Ci₀H_eoc₈H₁₇	15

- 48 ПРИМЕРИ 18-21

Работи се по подобен начин на описания в примери

1,2 и 3, като се получават съединения със заместителите i

описани по-долу:

Пр.	*1	*2	R₃ NRⁿ R^m	R¹	Поел. идент.№
18	ОН	сн₃ ch₂conh₂	H	(CH₂)₂ ^NH2	DMTD	7
19	ОН	СН₃ CH₂CH₂NH₂	H	(CH₂)₂NH2	DMTD	8
20	ОН	ОН	ch₂conh₂	H	(CH₂)2^nh2 DMTD	9
21	ОН	ОН	CH₂CH₂NH2	H	(CH₂)2^nh2 BMTD	14

'•Щ*'

ПРИМЕРИ 22-25

Работи се по подобен начин на описания в пример 1, като се получават следните съединения:

Пр. Ri Кг Кз _NrH rIII

R’

Поел.

идент.№

ОН СН₃ СН₃ Н

ОН СН₃ Η Н

OH Н (CH₂)2^nh2 Н

OH Н (CH₂)2^nh2 Н (CH₂)2NH₂ С₆Н₄ОС₈Н₁₇ 10 (CH₂)₂NH₂ С₆Н₄ОС₈Н₁₇11 (CH₂)3NH₂ DMTD6 (CH₂)2^nh2 D.MTD6 • · · · · · ····· · · · • ·· ·· · · ·· ·····

- 49 ПРИМЕР 26

Горното съединение се получава по подобен начин на описания в пример 2, част В, като вместо етилендиамин се използва диметиламин, като се получава съединение с МТ = 1334,43.

ПРИМЕР 27

НО

Горното съединение се получава по подобен начин на описания в пример 26, като вместо диметнламин се използва пиперидин като се получава съединение с МТ = 1374.

ПРИМЕР 28

1000 пресовани таблети всяка съдържаща 500 mg от съединението с формула (2), (съединение 1-6, (RU=H, rIH=2аминоетил) Послед.идент.№ 6], се получават от следните

компоненти:

Съединение Грамове

Съед. от пример 2500

Нишесте750

Двуосновен калциев фосфат, воден5000

Калциев стеарат2,5

Фино разпратените компоненти се размесват добре и се гранулират с 10% нишестена паста. Гранулатът се суши и се пресова на таблети.

ПРИМЕР 29

1000 твърди желатинови капсули, всяка съдържаща

500 mg от същото съединение се получава от следните компоненти:

Съединение Грамове

Съед. от пример 2500

Нишесте250

Лактоза750

Талк250

Калциев стеарат10

От компонентите се приготвя еднородна смес, която се използва за пълнене на твърди желатинови капсули на две части.

·· ····

ПРИМЕР 30 следните компоненти:

!

Съединение от пример 2 Lecthin NF течен концентрат Трихлорофлуорометан, NF Дихлородифлуорометан, NF

Получава се аерозолен състав като се използват

За опаковка ί

mg

1,2 mg 4,026 g 12,15 g

ПРИМЕР 31

Приготвя се 250 милилитра инжекционен разтвор по обичайните процедури като се използват следните компоненти:

Декстроза 12,5 g

Вода 250 ml

Съединение от пример 4 400 mg

Компонентите се смесват и се стерилизират за използване.

Получаване на изходните продукти

А-4, когато R¹ е 9,11-диметилтридецил, може да се получи чрез култивиране на Zalerlon arboricola ATCC 206868 в хранителна среда с манитол като основен източник на въглерод както е описано в патент на САЩ № 5 021 341, юни 4, 1991.

А-7, когато R* е 9,11-диметилтридецил, може да се получи чрез култивиране на Zalerlon arboricola ATCC 20868 в хранителна среда както е описано в патент на САЩ № 4 931 352, юни 5, 1990.

А-10, когато R* е линолеил се получава чрез култивиране на Aspergillus nidulans NRRL 11440 в хранителна

среда както е описано в патент на САЩ 4 288 549, септември 1981.

А-11, когато R¹ е 11-метилтридецил се получава чрез култивиране |на Aspergillus sydowl в хранителна среда както е описано в J. Antibiotics XL (№ 3), с. 28 (1987).

А-12 се получава чрез култивиране на Zalerlon arboricola ATCC 20958 в хранителна среда както е описано в заявка сер.№ 07/630,457, подадена декември 19,1990.

Съединенията, където Rj е водород могат да се получат както е описано в пример 4, част А.

Съединенията, където R3 е CH2CN като А-2, А-5 и

А-8 могат да се получат чрез взаимодействие на съединение с карбоксамидна група иа съответното място с излишък от цианурхлорнд в апротен разтворител. При тази реакция може да се използва молекулно сито. След завършване на взаимодействието, ситото, ако е използвано, се отстранява и филтратът се концентрира като се получава нитрилът, подробно описано в заявка cep.Ns 936,434, септември 3, 1992.

Съединенията, където R3 е CH2CH2NH2 като А-3, А-6 и А-9 могат да се получат или чрез химична или чрез каталитична редукция на нитрнла. Тя обикновено се провежда като се използва голям моларен излишък от натриев борохидрид с кобалтов хлорид както подробно е описано в заявка сер.№ 936,558, септември 3, 1992.

Изходните продукти, в които R¹ е група различна от тази в природния продукт, могат да се получат чрез деацилиране на липофилната група на природния продукт чрез подлагане на природния продукт в хранителна среда на деацилиращ ензим, докато се осъществи пълно деацилиране,

• ··♦· ·· ·· ·· ·«·· ·· · · · · · ··· • · ···· · · · · · • · * ♦ е ··· · ··· · • « 9 9 · · · · 999 99 99 99 99 999 - 53 -

като ензимът първо се получава чрез култивиране на микроорганизъм от семейство Pseudomondaceae или Actinoplanaceae както е описано в Experentia 34, 1670 (11978) или патент на САЩ № 4 293 482, извличане на деацилиррния циклопептид и след това ацилиране на деацилирания циклопептнд чрез смесването му с подходящ активен естер R^COX до получаване на съединение А с желаната ацилна група.

Изброяване на последователностите (1) Обща информация

(I) Заявители:

Balkovec, James Μ. Black, Regina M. Bouffard, Frances Aileen

(ii) Заглавие на изобретението: АЗАЦИКЛОПЕПТИДИ (ill) Брой секвенции: 60 (iv) Адрес за кореспонденция:

(A) Адрес: Elliott Korsen (B) Улица: P.O. Box 2000, 126 East Lincoln Ave (C) Град: Rahway (D) Щат: New Jearsey (E) Държава: USA (F) Код: 07065 (v) Компютър (A) Floppy disk (B) Macintosh centris 650 (C) Операционна система 7,1 (D) Software: Microsoft Word 5,1 a (vi) Текущи данни:

(A) Номер на заявката (B) Дата на подаване:

(C) Класификация:

(vii) Приоритетни данни: няма (A) Номер на заявка:

(B) Дата на подаване:

(vlll) Информация за пълномощник/агент (A) Име: Elliott Korsen (B) Регистрационен номер: 32 705 • · · · · (С) Номер на документално рефериране: 18955р (1х) Информация за телекомуникация:

(A) Телефон: 908-594-5493 (B) Телефакс: 908-594-4720 (C) Телекс:

(2) Информация за Послед.идент. № 1 (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (ii) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 1 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 2 (i) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 2 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 3 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 3 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 4 (1) Характеристика на секвенциите:

·· • ··· ··· ··· (A) Дължина: 6 | (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 4 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа (2) Информация за Послед.идент. № 5 (1) Характеристика на секвенциите: (А) Дължина: б (В) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 5 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

(2) Информация за Послед.идент. № 6 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 6 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа (2) Информация за Послед.идент. № 7 (I) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: б (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (II) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид

- 56 i (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 7 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа ’

5 (2)

Информация за Послед.идент. № 8 ι (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (И) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 8 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 9 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 9 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 ^w (2) Информация за Послед.идент. № 10 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 10 Хаа Ser Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 11 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5

(2) Информация за Послед.идент. № 12 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 12 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 13 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 13 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 14 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 14 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа • ·

(2) | - 58 Информация за Послед.идент. № 15 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пентид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 15 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5

(2) Информация за Послед.идент. № 16 (I) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (П) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 16

Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 17 (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (Н) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 17 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 18 (1) Характеристика на секвенциите:

I - 59 (А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 18 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 ί

(2) Информация за Послед.идент. № 19 (I) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 8 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (II) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (' (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 19 Хаа ТЬг Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 20 (I) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла

(11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 20 Хаа ТЪг Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 21 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 21 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 22 (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 | (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла

(11) Молекулен тип:
(А) Описание: Пепт	ид

(xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 22 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 23 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Дължина: 6 /* (В) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (II) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 23 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 24 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 24 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 25 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид ·· ····

(xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 25 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5

I (2) Информация за Послед.идент. № 26 (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (H) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 26 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. №27 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 27 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 28 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 28 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 29 (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина

S'·

·· ···· • · · · · • · * · · · · · · • «··· ····· • a · ····<♦··« • · a · · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· ··· (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръглаj ι

(Н) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед]идент.№ 29 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа ХааI (2) Информация за Послед.идент. № 30

0) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 30 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 31 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 31 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 32 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 32

Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5

- 63 (2) Информация за Послед.идент. № 33 (I) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла f

I (II) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 33 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 34 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 34 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5

(2) Информация за Послед.идент. № 35 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 35 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 36 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид ·

- 64 (xi) Описание на секвенцните: Послед.идент.№ 36 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 37 (I) Характеристика на секвенцните:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенцните: Послед.идент.№ 37 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 38 (i) Характеристика на секвенцните:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенцните: Послед.идент.№ 38 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 39 (1) Характеристика на секвенцните:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенцните: Послед.идент.№ 39 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 40 (i) Характеристика на секвенцните:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина • · * · ···· ····· • · · · · ··· · ··· · • · · · · · · · ··· · · · · ·· ·· ··· (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ Хаа Ser Хаа Хал Хаа Хаа

5

(2) Информация за Послед.идент. № 41 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 41 Хаа ТЬг Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 42 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 42 Хаа ТЪг Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 43 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 43 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 • · · · ·· ····

(2) Информация за Послед.идент. № 44 (I) Характеристика на секвенцинте:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокисели(на (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (II) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенцинте: Послед.идент.№ 44 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 45 (I) Характеристика на секвенцинте:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенцинте: Послед.идент.№ 45 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 46 (1) Характеристика на секвенцинте:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла (If) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенцинте: Послед.идент.№ 46 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 47 (I) Характеристика на секвенцинте:

·· ·· ···· • е

• · · ···· · • · ···· ·· ··· • ··· ····· ··· · ····· · · · ··· ·· ·· ·· *· ···

- 67 ί (А) Описание: Пептид ί (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 47 Хаа ТЪг Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 48 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 48 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 49 (0 Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 49 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа < ⁵ (2) Информация за Послед.идент. № 50 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 50 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 51 (1) Характеристика на секвенциите:

···· ·· ·· ·· ···· • · · ···· · · · • · · · · · ····· • ··· ····« ··· · • · · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

I - 6β - (A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла

(11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 51 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 52 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идент.Ns 52 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 53 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.идеит.№ 53 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 54 (1) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид

(χί) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2)

Информация за Послед.идент. № 55 (I) Характеристика на секвенциите:

(A) (B) (C) (D)

Дължина: 6

Тип: Аминокиселина Усукване: не се наблюдава Топология: кръгла (11) Молекулен тип:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 56 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 56 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа (2) Информация за Послед.идент. № 57 (I) Характеристика на секвенциите:

(А) Описание: Пептид (xl) Описание на секвенциите: Послед.ндент.№ 57 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа

5 (2) Информация за Послед.идент. № 58 (1) Характеристика на секвенциите:

(A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не <ке наблюдава (D) Топология: кръгла

	(11) Молекулен тип: . (А) Описание: Пептид (xi) Описание на секвенциите: Послед.ндент.№ 58 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа 1 5 (2) Информация за Послед.ндент. № 59 (1) Характеристика на секвенциите: (A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава
	(D) Топология: кръгла (И) Молекулен тип: (А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 59 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа 1 5 (2) Информация за Послед.ндент. № 60 (i) Характеристика на секвенциите: (A) Дължина: 6 (B) Тип: Аминокиселина (C) Усукване: не се наблюдава (D) Топология: кръгла
	(11) Молекулен тип: (А) Описание: Пептид (х!) Описание на секвенциите: Послед.идент.№ 60 Хаа Thr Хаа Хаа Хаа Хаа 1 5

• ·

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Съединение с обща формула в която

Rj е Н или ОН,

R₂ е Н, СН₃ или ОН.

R₃ е Н, СН₃, CH₂CN, CH₂CH₂NH₂ или CH₂CONH₂,

R¹ е Cg-C₂j- алкил, Cg-C₂j- алкенил, Cj-Cjo алкоксифенил или СрС^ - алкоксинафтил,

R¹¹ е Н, С1-С4 - алкил, С3-С4 - алкенил, (СН2)2-4^ОН(CH2)₂.₄R^IVR^V, CO(CH₂)₁.₄NH₂,

R¹¹¹ е Н, С1-С4 - алкил, C3-C4 - алкенил, (СН₂)₂_4ОН, (CH₂)2-4^{NrIVrV иаи} rH и RIH взети заедно означават -(СН₂>4, -(СН₂)5-, (СН₂)₂О(СН₂)₂- или (CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-,

R^IV е Н или С1-С4 - алкил,

R^v е Н или С1-С4 -алкил и ·· ·· ·· ···· • · · ·· · ·· · ····· • ···· ···· • · ·· ·· ·· ·· ··· техни присъединителни с кислнна соли
2. Съединение съгласно претенция 1, харктернзнрщо се с това, че R] е OH, R₂ е Н, R3 е CH₂CONH₂, R¹ е 9,10-диметилтрндецил, R11 е Н и rHI е -CH₂CH₂NH₂.

2. Съединение съгласно претенция 1, се с това, че Rj е OH, R₂ е Н, R3 е CH₂CONH₂, метнлтридецил, RH е Н и R¹¹¹ е -CH₂CH₂NH₂.
3. Съединение съгласно претенция 1, харктеризиращо

R.1 е 9,10-дихарктеризиращо се с това, че Rj е OH, R₂ е Н, R3 е CH₂CH₂NH₂, R¹ е 9,10-димеетилтридецил, RH е Н и r41 е -CH₂CH₂NH₂.
4. Съединение съгласно претенция 1, се с това, че Rj е OH, R₂ е Н, R3 е CH₂CONH₂, метнлтридецил, R^ и са Н .

ха рктеризиращо

R1 е 9,10-диха рктеризиращо
5. Съединение съгласно претенция 1, се с това, че R| е Н, R₂ е Н, R3 е CH₂CONH₂, Rl е 9,10-диметилтридецил, и R*H са Н.
6. Съединение съгласно претенция 1, харктеризиращо се с това, че Rj е Н, R₂ е Н, R3 е CH₂CONH₂, R¹ е 9,10-диметилтридецил, RH е Н и R¹¹¹ е -COCH₂CH₂NH₂.
7. Съединение съгласно претенция 1, харктеризиращо се с това, че Rj е Н, R₂ е Н, R3 е CH₂CONH₂, Rl е 9,10-диметнлтридецил, R¹¹ е Н и R¹¹! е -CH₂CH₂NH₂.
8. Съединение съгласно претенция 1, се с това, че R> е Н, R₂ е Н, R3 е CH₂CH₂NH₂, метнлтридецил, и са Н.

ха рктеризиращо

R¹ е
9,
10-ди9. Съединение съгласно претенция 1, се с това, че Rj е Н, R₂ е Н, R3 е CH₂CH₂NH₂, метнлтридецил, е Н и R¹¹¹ е -CH₂CH₂NH₂.

харктеризиращо

R1 е 9,10-ди10. Антимикробен състав характеризиращ се с това,

-L ·· ···· • · · · · · ····· • · · · ····· ··· · ····· · · · ····· ·· · · ·····

- 3 че съдържа съединение съгласно претенция 1 в смес с фармацевтнчноприемлив носител.
11. Антимикробен състав характеризиращ се с това, че съдържа съединение съгласно претенция21 в смес с фармацевтнчноприемлив носител.
12. Метод за контрол на мнкотични инфекции, характеризиращ се с това, че върху нуждаещ се млекопитаещ субект се прилага антимикотично количество от съединение съгласно претенция 1.
13. Метод за контрол на pneumocystis pneumonia у пациенти с увредена имунна система характеризиращ се с това, че се прилага трапевтичноефективно количество от съединение съгласно претенция 1.
14. Съединение с формула