BG110665A - Биокомпоненти от охлюви - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до биокомпоненти, представляващи биологично активни пептиди с антимикробна активност, и до метод за получаването им. Биокомпонентите са получени от слузта и хемолимфата на градински охлюв Helix aspersa и морски охлюв Rapana venosa, като са доказани терапевтичните им свойства.

Description

Изобретението се отнася до биокомпоненти, изолирани от слузта и хемолимфата на градински охлюв Helix aspersa и хемолимфата на морски охлюв Rapana venosa с антимикробна активност, които намират приложение като терапевтичен агент в различни области на медицината.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Напоследък броя на бактериите, резистентни към антибиотици стана сериозен проблем за медицината. За преодоляването му е необходимо разработване на антибиотици с нов механизъм на действие [7]. Ето защо през последните две десетилетия са разработени голяма група нискомолекулни продукти от различни организми. Въпреки огромното разнообразие в структурата и химичната им природа, повечето от тях проявяват антимикробна активност и са известни като антимикробни пептиди (АП). Те са нова алтернатива на синтетичните антибиотици, с обещаващо бъдеще за приложение в биотехнологиите и се наричат “природни антибиотици”.

Известено е, че АП са важни компоненти на неспецифичната първична имунна система при различни организми от растения, насекоми, до животни като молюски, артроподи, земноводни и бозайници [2]. Досега се считаше, че антимикробните пептиди проявяват своето първоначално действие върху клетъчните мембрани, но според новите данни действието на тези пептиди е по-широко и включва селективно инхибиране на вътреклетъчни структури [6]. Тези пептиди са ценни за първичната имунна система, защото не проявяват специфичност или памет. Техния малък размер ги прави лесни за синтезиране. Също така, много от тях проявяват забележителна активност срещу прокариотите и в същото време не са токсични за еукариотната клетка [15].

Откритите АП са класифицирани в няколко групи, въз основа на тяханта аминокиселинна последователност, вторична структура и функционални сходства. Пептиди: 1) с α-спирална структура, 2) с β-листовидна структура и малки протеини, 3) с тиоетерни пръстени, 4) пептиди с преобладаващи една или две аминокиселини (като пролин, хистидин или триптофан), 5) липопептиди и 6) макроциклични цистеинови пептиди [4].

Изучени са АП, изолирани от различни източници, като Drosophila melanogaster, която продуцира поне седем различни групи антимикробни пептиди с напълно различен спектър на активност [5], както и нов вид антимикробен пептид temporin-SHf, от кожата на жабата Pelophylax saharica [6]. В хемолимфата на молюски и артроподи са идентифицирани различни пептиди, като ароматни дипептиди и пептиди, получени от хидролиза на кислород-свързващи протеини [1,7, 8]. Доказано е, че в хемолимфата на молюски и артроподи се съдържат и други биологично активни компоненти с различни молекулни маси и свойства [1,2,7-11]. Установено е, че хемолимфата на синия рак С. sapidus, Scylla serrata, Т. crenata, Galleria mellonella и домашната муха (Musca domestica) проявяват антибактериална активност срещу Грам-отрицателни бактерии [7, 12, 13]. Антимикробна активност срещу Е. coli, Staph, aureus, и Candida albicans, е наблюдавана при Ixodes sinensis [14], както и за некатионните дефенсин-подобни пептиди, изолирани от хемолимфата на Amblyomma hebraeum [15]. Също така, наличието на антимикробни пептиди е доказано и при някои видове молюски [1].

Известно е, че антимикробните пептиди действат, както на отделната бактериална клетка, така и на група патогенни клетки, каквито често се срещат в природата [14]. Ето защо приложението на тези вещества е разработено от различни биотехнологични компании за локално и системно лечение на инфекции, като е анализирана основната функция на антимикробните пептиди в организма, който ги синтезира. Същността на действието им се изразява в предотвратяване на развитието на бактериалната инфекция, а не в премахването й. Един от предложените механизми включва взаимодействието им с бактериалната клетъчна мембрана, което води до повишаване на пропускливостта й. Друго предположение е, че те, с положителния си заряд повлияват на липидите в мембраната, като променят разположението им, в резултат на което сбщия заряд на мембраната се променя и тя се дестабилизира. Съществуват хипотези за действието на антимикробните пептиди, след попадането им в клетката, които не изключват и убиването на клетката-мишена, чрез индуциране на хидролази, които разграждат клетъчните стени, нарушават функциите на мембраната и повреждат основни вътреклетъчни компоненти [6].

Нарастващият проблем с резистентността на бактериите към антибиотици, налага да се получават нови антибактериални пептиди с активност върху щамове патогенни бактерии, резистентни на общоприетите (традиционните) антибиотици, като се разширява суровинната база за получаването им с използване на биологично чисти природни продукти при контролирани условия. Разработените методи за получаване на антимикробните пептиди осигуряват получаването на големи количества чисти препарати и с по-малко разходи, което е от особено значение за използването на тези продукти с широк диапазон на приложение.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението представлява, охарактеризиране на нови биокомпоненти (пептиди и протеини) от слузта и хемолимфата на градински охлюви Helix aspersa (На) и морски охлюв Rapana venosa (Rv), както и методи за получаването им.

Изходният материал се събира от слузта и хемолимфта на градински охлюв Н. aspersa, който се отглежда в специални ферми в България и хемолимфата на морски охлюв Rapana venosa от Черно море. След центрофугиране при 3000-5000 оборота, и температура 0 - 8 °C, супернатантата се концентрира с различни мембрани Amicon®, (от 5 до 100 кДа). Компонентите, съдържащи се в така получените фракции се оазделят с бързо-разделителна течна хроматографска система (FPLC) и колона Resource 6ml или с високоефективна течна хроматографска система (HPLC), на колона Nucleosil R С18, с буфер А (0.1% трифлуороцетна киселина-ТФОК) и буфер Б (80% ацетонитрил, 0.08% TOOK) (Ф/г.1). След прилагане на стъпаловиден или линеен градиент на различни концентрации на ацетонитрил (20, 50 и 80% в 0,1% ТФОК), получените фракции се лиофилизират, след което се разтварят в малки обеми Milli-Q вода. Молекулните маси и чистотата на изолираните компоненти се определя с масспектрометър (Фиг.2).

Следващата стъпка включва охарактеризиране на получените биокомпоненти от слузта и хемолимфата. Биокомпонентите с маса под 10 кДа са идентифицирани чрез определяне на N-крайните им аминокиселинни последователности (Фиг.З) и молекулни маси, докато биокомпонентите с маса над 10 кДа са идентифициране чрез 2Делектрофореза на 10% гел (Фиг.4) и мас спектрометрия (Фиг. 5). Получените резултати са сравнени чрез BioTools софтуер със съществуващите структури на протеини в база данни.

Определени са и различните биокомпоненти, изолирани от хемолимфата на градински охлюв Helix aspersa, които проявяват антимикробна активност спрямо пет вида бактерии: Staph.epidermidis, Enterococcus faecium, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staph, aureus.

За определяне на антимикробиалната активност на биокомпонентите от хемолимфата на Rapana venosa са използвани два различни бактериални щама: Грам положителен (Staphylococcus aureus) и Грам отрицателен (Klebsiella pneumoniae) като референтни щамове бактерии.

Като резултат се получават чисти компоненти от слузта и хемолимфата на охлюви, с молекулна маса между 3 и 10 кДа, както и други компоненти с маса над 10 кДа. Доказани са специфичните антимикробни свойства на получените биокомпоненти от хемолимфта на Н. aspersa и R. venosa (Фиг.6) (Табл. 1).

Изобретението се илюстрира с приведените по-долу примери, които не го ограничават.

ПОЯСНЕНИЯ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

Фигура 1. Хроматограма на разделяне на фракция, получена от хемолимфата на Н. aspersa (А) и Rapana venosa (Б), с маса между 3 и 10 кДа на колона Nucleosil R С18, с високоефективна течна хроматограсрска система (HPLC). Компонентите са елуирани със стъпаловиден градиент с буфер А (вода и 0.1% ТФОК) и буфер Б (80% ацетонитрил, 0.08% ТФОК).

Фигура 2. Мас-спектър на пептид с маса 7867.3 Да, получен от слузта на Н. aspersa.

Олгур.·:. 3. Сравняване на N-крайните аминокиселинни последователности на изолираните пегтиди от хемолимфата на R. venosa.

Фигура 4. 2Д-електрофореза на 10% гел за разделяне на протеините с маса над 10 кДаФигура 5. Мас-спектър на получените пептиди след хидролиза с трипсин на отделните телчета от 2-Д електрофореза, показана на Фиг. 4.

Фигура 6. Определяне на антимикробната активност на пептиди, получени от хемолимфата на Н. aspersa.

Таблица 1. Антимикробна активност на пептиди, получени от хемолимфата на Н. asperse. и R. venosa срещу различни бактерии.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Биокомпонентите с маса под 10 кДа, получени от слузта на градински охлюви Н. aspersa

Пример 1 ьиокомпоненти с маса под 10 кДа се изолират от слузта на градински охлюви Helix aspersa. Слузта се отделя от чрез прилагане на техника с променлив ток и сопез/ разтвор 0.1 М натриев хлорид. Отделената слуз се концентрира чрез вакуум лиосЬилш-атоо след което се дези^тегрира, като се използва механичен дезинтегратор в продължение на 20 мин. Различните компоненти на слузта се разделят в зависимост от молекулната им маса с мембранна техника за микрофилтрация. Получената слуз се разделя на 3 Фракции с Мигипор мембрани (А, под 10 кДа; Б, 10-100 кДа и В, над 100 кДа), след което получените фракции се лиофилизират и съхраняват в продължение на месеци при 4°С.

Поотделно, фракциите с маса под 10 кДа са подложени на високоефективна течна хроматография HPLC, с колона Nucleosil С18 (250 mm*10 mm; Macherey-Nagel, Duren, Germany), калибрирана c буфер A (H₂O, 0.1% ТФОК). Елуирането е проведено със линеен градиент на буфер Б (80% ацетонитрил, с 0.08% ТФОК), в продължение на 60 мин , със скорост на потока 1.5 мл/мин. Абсорбцията в ултравиолетовата област е следена при 280 и 214 nm. Елуираните фракции са събрани и изсушени с помощта на Еакууч-конценгратор. Фракциите са разтворени в Milli-Q вода с 0 10% ТФОК (v/v). За рехроматография е използван линеен градиент от 5% А (Н₂О, 0.1% ТФОК) до 100% В (0.085% ’’ФОК в ацетонитрил) в продължение на 50 минути, при скорост на потока ' мл/мин

Примео 2 ьиокомпоненти с маса под 10 кДа се изолират от слузта на градински охпюви Helix aspersa Слузта се отделя чрез престояване на охлювите в солеви разтвор от 0.25 М натриев хлорид в продължение на 10 мин. с разбъркване. Отделената слуз се концентрира чрез лиофилизиране, след което се дезинтегоира като се използва механичен дезинтегратор в продължение на 30 мин. Различните компоненти в слузта се разделят в зависимост от молекулната им маса с мембранна техника за микрофилтрация. Получената слуз се разделя на 2 фракции с Милипор мембрани (А, под 10 кДа и над 100 кДа) и фракции се лиофилизират, и се съхранява в продължение на месеци при 4°С.

Получените фракции с маса под 10 кДа са разделени с високоефективна течна хроматографска система (HPLC), на колона Nucleosil С18 (250 mm* 10 mm; MachereyNagel, Duren, Germany), която предварително е калибрирана с буфер А (Н₂О, 0.1% ТФОК). Елуирането на фракцията с маса под 10 кДа е проведено със стъпаловиден градиент на буфер Б (100% ацетонитрил, с 0.08% ТФОК), в три стъпки 20, 50 и 80% буфер Б, с продължителност на всяка стъпка от 20-30 мин., със скорост ча потока 1.5 мл/мин. Елуираните фракции са събрани и изсушени с помощта на вакуумконцентратор. Фракциите са разтворени в Milli-Q вода с 0 1% ТФОК (v/v). За рехроматография е използван линеен градиент от 5% А (0.1% ТФОК във вода) до 100% Е (0.085% ТФОК в ацетонитрил) в продължение на 50 минути, при скорост на потока 1 МЛ/МИН.

Биокампанентите с маси под 10 хДа, получени от хемолимфата ма градински охлюви Н. aspersa

Пример.;!

Биокомгонентите с маса под 10 «Да се изолират от хемслимфата на градински охлюви Helix asperse която се събира, като се разрязва ходилото със скалпел. Получената течност се подлага на ултрацентрофугиране при 5000 g в продължение на 30 мин. и температура 0°С като се събира супернатантата. Пептидите се изолират от супег.чатонтота чрез Милипор мембрани с различни размери (А, под 10 кДа). Получените фракции се лиофилизират и се съхраняват в продължение на месеци в Ί рис/HCI, при 4°С.

Получената фракция А (с маса под 10 кДа) е разделена чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), на колона Nucleosil С4 (250 mm* 10 mm; Macherey-Nagel, Duren, Germany), предварително уравновесена c буфер A (H₂O, 0A% ТФОК). Елуирането на биокомпонентите е проведено със стъпаловиден градиент на буфер Б (00% ацетони грип, с 0.08% ТФОК), в три стъпки с 20, 50 и 80% буфер Б, с продължителност на всяка стъпка 20-30 мин. и скорост на потока 1.5 мл/мин. Абсорбцията в ултравиолетовата област е следена при 280 и 214 пт. Елуираните фракции са събрани и изсушени е помощта на вакуум концентратор, след което са разтворени в MilhQ вода е 0.10% ТФОК (v/v). За рехроматография на някои фракции е приложен линеен градиент от 5% А (0.1% ТФОК във вода) до 100% В (0.085% ТФОК в ацетонитрил) а продължение на 50 минути, при скорост на потока 1 мл/мин.

Пример 2

Биокомпонентите с маса под 10 кДа се изолират от хемолимфата на градински охлюви Helix aspersa, която се събира, като се разоязва ходилото със скалпел. Полудената течност се подлага на ултрацентрофугиране при 30000 о в продължение на4 ч и температура 0°С. като се събира суперчатантата. Пептидите се изолират от с^пернатан^ата чрез Мипипор мембрани (10 кДа). Получените фракции се лиофилизират и се съхраняват в продължение на месеци в Трис/HCI, при 4°С.

Получената фракция с маса под 10 кДа е разделена с HPLC система, с колона Nucleosil С4 (250 mm* 10 mm; Macherey-Nagel, Duren, Germany), калибрирана c буфер A (H₂O, 0.1% ТФОК). Елуирането е проведено с линеен градиент на буфер Б (100% ацетонитрил, с 0.08% ТФОК), в продължение на 70 мин., със скорост на потока 1.5 мл/мин. Абсорбцията в ултравиолетовата област е следена при 280 и 214 nm. Елуираните фракции са събрани и изсушени с помощта на вакуум концентратор, след което фракциите са разтворени в Milli-Q вода с 0.1% ТФОК (v/v). За рехроматография е използван линеен градиент от 3% А (Н₂О, 0.1% ТФОК) до 80% В (0.085% ТФОК в ацетонлтрип) в продължение на 50 минути, при скорост на потока ¹ мл/мин.

Биокомпонен^итз с маси под 10 кДс, получени от хемол и меката нг морски охлю& Rapane venosa

Пример J

Хемолимфата на морски охлюв R. venosa се събира, като се разоязва ходилото със ска пиел. Получената течност се подлага на ултрацентросф/гиране при 5000 g в продължение на 30 мин. и температура 0^сС, като се събира супернататнтата. Пептиоюе се изолират от супеона~ант?та чрез Мипипор мембрани с различни размери (А под 10 кДа). Получените фракции се лиофилизират и се съхраняват в продължение на месеци в Трис/HCI, при 4°С.

Получената фракция А (с маса под 10 кДа) е разделена чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), на колона Nucleosil С4 (250 mmxlO mm; Macherey-Nagel,

Duren, Germany), предварително уравновесена c буфер A (H₂O, 0 · % ТФОК). Елуирачето на компонентите е проведено със стъпаловиден градиен- ча буфер Б (80% ацетонигрил, с 0.08% ТФОК), в три стъпки с 5, 50 и 80% буфер Б с посдължителност на всяка стъпка 20-30 мин. и скорост на потока 1.0 мл/мин. Абсорбцията в ултравиолетовата област е следена при 280 и 214 пт. Елуираните фракции са събрани ч изсушен!- с помощта на вакуум концентратор. след което са разтворени в MilliQ вода с 0.10% ТФОК (v/v). За рехроматография на някои фракции е приложен линеен градиент от 20% А (0.1% ТФОК във вода) до 100% В (0.085% ТФОК в ацетонигрил) з продължение на 50 минути, при скорост на потока 1 мл/мин.

Пример.,2 .Хемолимфата на. морски охлюв R. venosa се събира, като се разрязва ходилото със скалпел. Попушената течност се подлага на ултрацентрофугиране при 30000 g в продължение ча 4 ч и температура 0°С, като се събира суперна^та’нтата. Пептидите се изолират от сулернатантата чрез Милипоо мембрани (10 кДа). Получените, фракции се лиофипизират и се съхраняват в продължение ча месеци в ТриОНС! при 4°С.

Получената фракция с маса под 10 кДа е разделена с HPLC система, с колона Nucleosil С4 (250 mm* 10 mm; Macherey-Nagei, Duren, Germany), калибрирана c буфер A (H₂O, 0.1% ТфОК). Елуирането е проведено линеен градиент на буфер Б (100% ацегонмтрил, с 0.08% ТФОК), в продължение на 70 мин., със скорост на потока 1.5 мл/мин. Абсообция~а в ултравиолетовата обласг е следена пои 280 и 214 пт. Елуираните фоакиии са събрани и изсушени с помощта на вакуум-концентратор, след което фракциите са разтворени в MihiQ вода с 0.10% ТФОК (v/v). За рехроматография е използван линеен градиент от 3% А (Н₂О, 0.1% ТФОК) до 80% В (0.085% ТФОК в ацетонигрил' ^с продължение на 50 минути, при скорост на потока 1 мл/мин.

Биохомяонентитъ с маси над 100 кДа

Пример 1.

Получената фракция от слузта, на градински охлюви Н asperse, с маса над 100 кДа, е подложена на обратнофазова високоефективна хроматография HPLC. с колона Nucieosii С18 /250 mmx10 mm; Macherey-Nagei, Duren, Germany), калибрирана c буфер A (H₂O 0.1% ТФОК). Разделянето на компонентите е проведено чрез епуиране на колоната в продължение на 60 μ·ή о линеен градиент на буфер Б, съдържащ 100% ацетонитрил ;ACN) и 0.08% ТФОК и скорост на потока 1.5 мл/мин. Отчитана е абсорбцията в ултравиолетовата област при 280 и 21^ nm. Ел'’-праните фракции са събрани и изсушени с помощта на вакуум изпарител Чистотата им е определена епектрофоретично.

Пример 2

Получената фракция от слузта на на градински охлюви Н. aspersa, с маса между щ и 100 кДа е подложена на йонообменна хроматография на FPLC система, с Resource Q 6 мг. колона, калибрирана с буфер А (Трис/НС!). Няколко фракции са елуирани с буфер A, pH 8.0 и солеви градиент на натриев хлорид (NaCI) 0-0.7 М. Абсорбцията л ултраЕ1иолетовата област е следена при 280 nm. Чистотата на всички елуирани фрагменти се доказва чрез електрофореза и масспектрометър. Молекулните им маси са определени, както електрофоретично, така и с помощта на масспектоометър. С аминосеквенатор са получени N-крайните амичокиселинни последователности за всички фракции.

Примес .3

Получената (фракция от слузта на градински охлюви Н. азр&ъа, с, маса над 100 хДн е подложена на йонообменна хроматография FPLC, Q-Sepharose Fast Flow та.тона, ..алибрирана с буфер А (Трис/HCi), pH S.C и солев?. градиент на натриев /лор/д FiaCI) С-i.O М. Абссрбцйята в ултравиолетовата област е следена при 230 nm. Чистотата нг еси*.-:и елупрзни -фрагменти е доказана чрез електрофореза и м а ссп е ктоом етъ р.

Пример 4

Разделяне на фракциите от слузта с маса над 10 кДа чрез 2Д-електрофореза. Разделянето на протеините е проведено на два етапа: 1; според изоелектричната точка и.ги заряда на протеина и 2) според молекулното тегло. За целта са използвани стрипове с pH градиент от 3 до 10 за изоелектрично фокусиране. Анализирани са настъпилите промени в някои протеини, изразени в промяна на интензитета или разпог.-ктенмето им на 2Д-гела. Протеиновите петна са изрязани от пслиакриламидния тел и обезлветени. след което са подложени на хипропуг-а за 24 ч с трипсин (съотношение 150), за разкъсване на молекулата н?1 протеина на пептиди.

Пептидите са секвенирани с масспектрометър, като е определена аминокиселинната им последователност след анализиране на тези спектри. Получените резултати са сравнени чрез BioTools софтуер със съществуващите структури на протеини в база данни.

Идентифициране на получените биокомпоненти

Пример 1

Получените чисти биокомпоненти от фракциите с маса под 10 кДа са разтворени в 40% ме’ано.ч/1 % мравчена киселина, след което са подложени на автоматично Едманово разграждане с Pulsed Liquid Protein Sequencer (Applied Biosystems GmbH, Foster City СА). Определени са N-крайните аминокиселинни последователности на всички биокомпоненти и са сравнени със съществуващите в база данни.

Молекулните маси на компонентите са измерени на Autofiex™ III, Highperformance MALDLTOF & TO^C/TOF Systems (Broker Daitonics). като за анализ са юползвони по около 50 pmol от всеки пептид. а-циано-^Рхидроксиканелена киселина е използвана каго .матрица. Получените стойности за масите на ле птиците са между 3 и £ ,ДД.

Пречистените биокомпоненти са тествани за наличие на захари, като 2-4 μΙ от асеки пй.-тид ое накапват на плака за гънкоспсйка хроматография и се изсушават на въздуха като се внимава диаметъра на капката да е 2-3 мм. Плаката се напръсква с орцинол/ЬЬЗСц и се нагрява за 20 минути при 10С °C.

За анализиране на антимикробиалната активност на изолираните пептиди от хемолилфата .-.a Карапа v&nosa са използвани два различни бактврналки щама: Грам .хлсж/лепе:-. шоосооз аг.еиг, и Грам отрицателен (/febs.^;e<7a pneumoniae') като референти^ шзчиоое бактерии Klebsiella pneumoniae е често срещан натопен, който р.о/.чиняиа /и фе/ш-ч' на уротенкщалния тракт, пневмонии и ин’.раа5доминални ι :чгдек;лн<. ,S. очто? пличинайз най-^есто кожни инфекции, както и инфеиши на други органи.

За анализиране на антимикробиалната активност на изолираните пептиди от уемолимф.вта чя He^!ix aspersa са използвани пет различни бактериални щама· Грам положителните (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epic'ennidis и Enterococcus faecium) и Грям отрицателните (E. coli и Pseudomonas aeruginosa) като референтни щамове бактерии. S. aureus причинява най-често кожни инфекции, както и инфекции на доуги органи. Въпреки че обикновено S. epidermidis е непатогенен микроорганизъм, е възможно хора със слаба имунна система да развият инфекция. Enterococcus faecium също не е болестотворен микроорганизъм, част от нормалната чревна микрофлора, но може и да предизвика болести, като неонатален менингит. Pseudomonas aeruginosa е често срещана бактерия, причинител на различни инфекции при животни и хора.

Пример.1

Изолираните биокомг/оне.-гги са тествани за антимжробиална активност в течна хранителна среда. ГЗцл от компонентите са добаьени към 6 мл бактериална суспензия с логари.гмична-фаза, в хранителна среда-обикноввн бульон. > % декстроза, с определена оптична плътност по McFarland (McF). Микробиалният растеж е отчетен като промяна в стойността на ,VlcF, след иниубиране за 24 часа при 37 °C. Като контрола е използвана същата хранителна среда, без добавяне на пептидите, инкубирана при същите условия. Ефна единица no McF отговаря на 3x10’ клетки/мл. Мьтността е измерена с помощта на DENSIMAT (BioMerieux, France).

Пример 2 /карираните пептиди са изследвани за наличието на антимифсоиална актлвнсст нраг радиален диФузионен растеж. Радиалният дифузионен растеж се оппедд.л.^! ι чрез: джфундиране :-.а антимикробяите пептиди и гллксиет.тид·/., нанесени в йчки. ? твърдата хранителна среда, коя те е предварително посята с определен инокег.ум (чиг.-а бактериална култура). Така се определя зоната на инхибиране, поопорц/онална не чувствителността на бактериите към съответния пептид. Този метод е удобен за изследване на антимикробната активност на голям брой пептиди, и може да бъде използван за тяхното предварително тестване.

Примес 7 /Ьолир ihvive СЧгжс‘?.';сиенти са лзеледаани за - ашчиегт на ач.'и.мик;·обсадна с.лглуносг ирц.г ivierc,: .-.а пределните разреждани!» в течна хран:пдт.на среда. Чрез него ся определя зсректа на различни концентрации ,ча изол.-.раните пептиди и п;икспел;;|ди срещу бактериална суспензия, с лредааригелно определена, подходяща концечфац'.'.*, е течна хранителна среда, с определен състав. Така се определят и най-ниските концентрации на тестваните пептиди и гликопептиди, които инхибират растежа на определен вид бактерии. Минималната инхибираща концентрация (МИК) обикновено се изразява в мг/мл или мг/л.

ПРЕДИМСТВА НА ТЕЗИ МЕТОДИ

1. Получени са нови Биокомлоненти с ангимикробно действие, кои го показват активност въоху щамове патогенни бактерии, резистентни към общоприетите (тоадинионните) антибиотици, използвани в медицината. Проявяването на резистентност към природните антибиотици се наблюдава по-рядко, за разлика от тези, които се прилагат в клиничната практика.

2. Разширена е и суровинната база за получаване на антимикробни пептиди. като се използва·' биологично чисти природни източници, отглеждани при контоолирани условия.

3. Разработените г/етоди за получаване на Еиокожононтите осигуряват получаването на големи колмчестза чисти препарати и с по-малко разходи, което е от особено значение за използването на тези продукти с широк диапазон на приложение в IV ^!sp,V L И ·’ t ЧсГ^:г Te,C.3i ПЯ.

4. Свойствата на биокомпонентите са определени в естествените условия, при които получеча* информация позвслязч да бъдач ~ред?идени проблемите, които биха възникнали при прилагането на антимикробни пептиди.

5. Изпопззанего на тези бис-компонентк е с голели възможности, тъй гатс те може да се прилагат, както индивидуално, така и комбинирано за лечение на бактериални инфекции при хора яли животни. Тези продукти са мощни агенти при борбата с баггериз.сните иисЬекции могат да бъдат решение на нарастващия проблем с рюзистбнтността.

А Р. D'-jIashka-Angulcw., A. DoEshki. S. К. Sawkk-s, R. Frlsteva, ’. чСш Bseurr.en, W. Voeltrr, В.

Deweese. U. Weser. P. Di Muro. B. Salvalo and S. Stevanovic, “Structure of Hemocyanin Subunit C^eSS?. cf ike СплЛзссап Mediterranean Crab Carcinus aestuariC. J. Biochemistry 138 (3) 3037. Akl·.Hinder ’3?la^;,hki, Jurgen Schutz. Rumyana Hristova, Wolfgang Voelter and Pavlina

Doi&shka-AAgelova Spectroscopic properties of non-glycosnated tunciional unit KLH|- c of keyhole limpet hemocyanin“ World J. Aerie. Scien. 1 (2)129-136(2005).

3. R loshkova, E. Ivanova, M-D. Nastke. S. Stcvanovic, L. Velkova, W. Voelter P. DolashkaAngeiova,. Hemocyanins as immuno stimulators. IDOSI, Global J. Mol. Sci. 1, 22-32 (2006).

4. R. Tosnkova, L. Velkova, W. Voelter, P. Dolashka-Angeiova, Protective effect of Rapana venosa hemocyanin (Rvll) on survivability of hamsters with transplanted myeloid Graffi tumours. Comotes rendus de I Academic bulgare des sciences 59,(9) 977-982 (2006).

5. R. Toshkova. E. Aanova, R. Hristova, W. Voelter P. Dolashka-Angeiova, Effect of Rapana venosa Hemocyanin on Antibody-Dependent Cell Cytotoxicicity iADCC) and Mitogen Responsibility of Lymphocytes from Hamsters with Progressing Myeloid Tumors, accepted in [DOSi (200 /1.

6. Krumova, E., Dolashka-Angeiova. P.. Pashova, S., Stefanova. L., Van Beeumen, J.. Vassilev, S, Angelova, M. improved production by fed-batch cultivation and some properties of Cu/Znsuperexide dismutase from the fungal s:ram Emuicok lutea 103. Enzyme and Microb. Technology 43, -:, 524-532 .20373

7. K. Sar.dra, P. Dolashka-Angeiova, B. Devreese, J. Van Beeumen, New insights in Rapana venosa liemocyani N-glycosylation resulting from on-line mass speermruetra analyses. Glycobiology, 17(2), .41-56 (200’;

8. P. Washk»--Angelova, St. Stefanovic, A. Dolashki, 3. Devreese, E. Tzvetkova,. W. Voelter,. J. Van Beeumen, B. Salvato, A challengig insight on the structural unit 1 cf mollvscan Rapana ver.'jsj lemocyaniu. Atch. BMchein. Biophys 1,459(153-8 (200?)

9. Salvato, B„ and Beltramini, M. (1990) Hemocyanin: Molecular architecture: structure and reactivity of the hmuciear copper active site. Life Chem. Rep. 8, 1 -47.

10. Oola?hka., P., Genov. N., rervar.o'a, K., Voelter, W., Geiger, and M„ Stoeva. (1996) Rapana Oiomasiana grosse (gastropoda) haemocyanin: spectroscopic studies of the stricture in solution and th e conformational stability of the native protein and its structural suburits. Bicchem J. 315,

11. Camp ). M.S.. O'Neil. B.W., Grindlay, G.J., Curtis, F., Knowles, G., and Chandrachud, L. (1997) A neptire encoding a B-ceP epitope from the N-terminus of the capsid protein L2 of bovine papfdorna v.ius-4. Virology 234, 261-266.

12. Timm. J. A. ano Tayior, S .W. i 2004)A:iiimic labial agents ana chemotherapy. Antimicrobial pepudes from rnarcie invertebrates. 48,10, 3645-3654.

13. Marsha l, S. E., ar.·: ..Menas. G. (2003) Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical

14. TaniM, K. (2OG1_? P-13- kinase p85 is a target molecule of proline-rich antimicrobial peptide to runmvss pr3i feiaiion of vas-transformed ceils. Japanese J. of Cancer Research. 92, 959-967.

15. л·: M.;tr V.C ATm; J.. Mmt G., (V ry, C , and Rolhlnss-Sniith. I.. (200') :nactivntio.i frog virus. ? and char nel c=.rf.sb. virus by cs alentin-2P and ranatuerin-2P. two antimicrobial peptides isolalce from freg skin·. Virclogv 288, 351- >57.

Kir , ml., Beckee-, G., Pleskach, V.A., Filatova, N.A., Anikin, V.B., Platonov, V.G., (2002)Antiviral and. antitumor peptides from insects. Proceedings of the National Science'US A. 99.20, 12623-12632.'

17. Jiravanlctipaisal, P., Lee, S.Y., Kim, ¥., Andren, T„ and Soderhall, I. (2G0~) Antibacterial peptides m nemoc-ytes anc. hematopoietic tissue from freshwater crayfish Pacifastacus ieniusculus: Characterization and expression pattern. Developmental and Comparative Immunology. 31, 441455..

18. Hancock,R. E. W. and Chappie, D. (1999) Peptide Antibiotics. Antimicrobial agents and chemotherapy. 1317 -13 23.

19. Cytryoska, M.. Мяк. P., Suder P., and Jakubowicz, T. (2007) Purification and characterization of eight, peptides from Dalleria mellonella immune hemolymph. Peptides. 28, 533-546.

20. Qtvos.. Jr L. (2002) The short proline-rich antibacterial peptide family Cell. Mol. Life Sci. 59, 1138-1150.

21. T _ti. D , Sheng. Z , Xu_; X , Li, J . Vang,H., Liu, Ζ., H Rees H. and Lai, R. A novel antimicrobial peptide from salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis. (2005).

Claims (9)

1. Биокомпоненти, представляващи биологично активни пептиди, изолирани от охлюви, характеризиращи се с това, че са изолирани от слузта на градински охлюв Helix aspersa или от хемолимфата на Helix aspersa и на морски охлюв Rapana venosa с молекулна маса от 3 до 10 кДа.

2. Биокомпоненти, съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са изолирани от слузта на градински охлюв Helix aspersa.

3. Биокомпоненти, съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са изолирани от хемолимфата на градински охлюв Helix aspersa.

4. Биокомпоненти, съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че са изолирани от хемолимфата на морски охлюв Rapana venosa.

5. Биокомпоненти, представляващи биологично активни вещества, изолирани от охлюви, характеризиращи се с това, че са изолирани от слузта на градински охлюв Helix aspersa.

6. Метод за изолиране на биокомпоненти, съгласно претенции 1, 2 или 5, характеризиращ се с това, че се състои от следните операции: изолиране на слузта от градински охлюв Helix aspersa, концентриране на слузта чрез лиофилизация, дезинтегриране, разделяне на фракции с мембранна техника и отделяне на фракциите с молекулна маса под 10 кДа, след което получените фракции се лиофилизират и съхраняват при 4 °C.

7. Метод за изолиране на биокомпоненти, съгласно претенции 1, 3 или 4, характеризиращ се с това, че се състои от следните операции: събиране на хемолимфата от охлюва, ултрацентрофугиране на хемолимфата, събиране на супернатантата, изолиране на пептидите от супернатантата чрез мембрани с размери под 10 кДа, след което получените фракции се лиофилизират и съхраняват при 4 °C.

8. Биокомпоненти, съгласно претенции 1, 2 или 3 за индивидуално или комбинирано антибактериално приложение спрямо бактерии Klebsiella pneumoniae и Staph, aureus.

9. Биокомпоненти, съгласно претенции 1 или 4 за индивидуално или комбинирано антибактериално приложение спрямо бактерии Е. coli, Staph, aureus, Pseudomonas aeruginosa, E. faecium, C. albicans и Staph, epidermidis.