"Undécapeptides cycliques analogues de la somatostatine et leur préparation" <EMI ID=1.1>
des cycliques analogues de la somatostatine et à leur synthèse par une combinaison de la méthode en phase solide et de la méthode classique de synthèse des peptides.
La somatostatine (connue également sous le nom de facteur inhibiteur de la libération de somatotropine ou SRIF) est le tétradécapeptide :
<EMI ID=2.1>
On a. identifié ce tétradécapeptide en l'isolant d'extraits de tissus hypothalamiques d'animaux de la race bovine et on a trouvé qu'il inhibe la sécrétion de l'hormone somatotropine que l'on désigne couramment par hormone de croissance (GH) ; voir Brazeau et consort, Science, 179, pages 77-79 (janvier 1973). Brazeau et consort (citation précédente), ont signalé également que la forme linéaire de ce tétradécapeptide :
<EMI ID=3.1>
a été synthétisée par une méthodologie en phase solide et qu'elle présente la même activité biologique que la somatostatine obtenue d'une source naturelle.. Dans la demande de brevet aux Etats-Unis
<EMI ID=4.1>
le n[deg.] 3.882.098, on a décrit l'undécapeptide Des-Ala -Gly -Asn SRIF et sa forme oxydée, et dans la demande de brevet des EtatsUnis d'Amérique n[deg.] 457.038 du 1 avril 1974, on a décrit le dodécapeptide Des-Ala <1> -Gly <2> -SRIF et sa forme oxydée.
Des analogues cycliques de somatostatine, ne contenant pas de cystéine, n'ont pas été décrits dans la littérature antérieure. Les undécapeptides cycliques de la présente. invention comportent une struture cyclique qui ne contient pas de soufre mais bien du carbone à titre d'élément.du noyau et qui en outre ne comporte pas les aminoacides des positions 1 et 2 de la somatostatine (c'est-à-dire Ala et Gly).
Les undécapeptides cycliques de la présente invention, qui empêchent la sécrétion de l'hormone somatotropine, sont représentés par la formule :
<EMI ID=5.1>
dans laquelle Trp représente le D-tryptophyle ou le L-tryptophyle et tous les autres aminoacides sont de la configuration L, l'in-
<EMI ID=6.1>
ques des composés précédents. Dans cette formule, n est un nombre entier de 1 à 5 ; lorsque n est égal à 1, l'aminoacide C-terminal est l'acide 'aspartique; lorsque n est égal à 2, l'aminoacide C-terminal est l'acide glutamique ; lorsque n est égal à 3, l'aminoacide C-terminal est l'acide a-aminoadipique ; lorsque n est égal à 4, l'aminoacide C-terminal est l'acide a-aminopimélique ; et lorsque n est égal à 5, l'aminoacide C-terminal est l'acide a-arninosubérique. Le composé préféré suivant la formule
<EMI ID=7.1>
Des exemples de-sels d'addition d'acide sont le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, le phosphate, le maléate, l'acétate, le citrate, le benzoate, le succinate, le malate,
<EMI ID=8.1>
1, pages VIII-XXIX (Academic Press 1965). Tous les restes d'ami-
<EMI ID=9.1>
mules présentées par la suite sont de la configuration naturelle ou configuration L, sauf pour le Trp, qui est facultativement de la configuration L ou D.
La présente invention se rapporte également à de nouveaux décapeptides de la formule :
<EMI ID=10.1>
dans laquelle R désigne un groupe protecteur a-amino. Les grou-
<EMI ID=11.1>
comme étant d'un intérêt en pratique dans la synthèse graduelle des polypeptides. parmi les classes de groupes protecteurs aamino englobés par R, on peut citer : (1) les groupes protecteurs du type acyle illustrés par les groupes suivants : formyle, trifluoroacétyle, phtalyle, toluènesulforiyle (tosyle); benzènesulfo- <EMI ID=12.1>
le, y-chlorobutyryle, etc ; (2) les groupes protecteurs du type uréthanne aromatiques., illustrés par le.benzyloxycarbonyle et les
<EMI ID=13.1>
ques, illustrés par : cyclopentyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, cyclohexyloxycarbonyle ; (5) les groupes protecteurs du type
<EMI ID=14.1>
protecteurs du type alcoyle, tels qu'illustrés par le triphénylméthyle (trityle), le benzyle ; (7) les groupes de trialcoyisilane, tels que le triméthylsilane. Le groupe protecteur a-amino préféré pour R est le ter-butyloxycarbonyle.
<EMI ID=15.1>
tecteur pour*le substituant amino de chaîne latérale de la lysine. Des exemples de groupes protecteurs appropriés du substituant amino de chaîne latérale sont le benzyloxycarbonyle et les benzyloxycarbonyles substitués, le substituant étant choisi parmi les radicaux halo (par exemple chloro, bromo, fluoro) et nitro
(par exemple 2-chlorobenzyloxycarbonyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle, 3,4-dichlorobenzyloxycarbonyle), tosyle, t-amyloxycarbonyle,
<EMI ID=16.1>
de ce groupe protecteur du substituant amino de chaîne latérale n'est pas critique sauf qu'il doit s'agir d'un groupe qui n'est pas enlevé durant la séparation du groupe protecteur a-amino au cours de la synthèse jusqu'à obtention de l'undécapeptide cyclique répondant à la séquence désirée d'aminoacides. De ce fait,
<EMI ID=17.1>
situant amino de la chaîne latérale de la lysine, désigné par R , ne peuvent pas être identiques.
Dans la formule précédente, R<2>est choisi parmi les
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1> <EMI ID=20.1>
sont choisis parmi l'acétyle, le benzoyle, le butyle tertiaire, le trityle, le benzyle, le dichloro-2,6 benzyle et le benzyloxycarbonyle..Le groupe protecteur préféré dans ce cas est le ben-
<EMI ID=21.1>
gène, ce qui signifie alors qu'il n'y a pas de groupe protecteur sur la fonction hydroxyle alcoolique.
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
Le support de résine de polystyrène est de préférence constitué par un polymère de styrène avec environ 1 à 2 % de divinylbenzène à titre d'agent de réticulation, ce qui amène le polymère de polystyrène à être totalement insoluble dans certains solvants organiques. Le polymère de polystyrène est composé de longues chaînes d'alcoyles, portant un noyau de phényle, un carbone sur deux et le reste d'aminoacide terminal (Ser) est réuni par une liaison carbone-carbone covalente à ces noyaux de phényle. Les chaînes d'alcoyles sont réticulées à peu près sur chaque cinquantième atome de carbone par des restes de p-diéthyiphényle, dérivant du divinylbenzène.
La présente invention se rapporte également à de nouveaux undéçapeptides de la formule :
<EMI ID=24.1>
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
drogène ou un groupe protecteur carboxyle de chaîne latérale, qui est enlevé sous des conditions qui ne sépareront pas le groupe <EMI ID=28.1> représenter un même groupe protecteur. Des exemples de groupes protecteurs carboxyles de chaîne latérale, représentant R , sont
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
représenté par R9 est un groupe qui est stable sous les conditions qui (<1>) séparent le groupe protecteur carboxyle R , s'il y en a un, et (2 ) séparent tout groupe protecteur a-ainino se trouvant sur le groupe lysyle de la partie N-terminale du peptide. Le
<EMI ID=31.1>
(par exemple méthyle, éthyle, butyle, pentyle, isobutyle), le benzyle, les benzyles substitués (comportant au moins un substituant des groupes nitro, méthoxy et méthyle, de sorte qu'il s'agit par exemple du p-méthoxybenzyle, du 2,4-diméthoxybenzyle,
<EMI ID=32.1>
pe R9 préféré est le benzyle.
La présente invention englobe également des composés répondant à -la formule :
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
signés par R ; R est choisi parmi l'hydrogène et les groupes
12
désignés par R ; et R est choisi parmi l'hydrogène et les grou-
<EMI ID=36.1>
On prépare les nouveaux décapeptides de la formule II en utilisant une synthèse en phase solide. On commence la synthèse à partir de l'extrémité C-terminale du peptide en utilisant une résine protégée par a-amino. On peut préparer une telle matière de départ en attachant une serine protégée par a-amino à <EMI ID=37.1>
<EMI ID=38.1>
en chaîne latérale est combinée avec. la résine chlorométhylée. suivant la procédé de Gisin, Helv. 56, pages 1476 (1973). Après la combinaison de cette serine avec le support de résine, on en-
<EMI ID=39.1>
l'acide trifluoroacêtique dans -du chlorure de méthylène, de l'aci-
<EMI ID=40.1>
sion de la protection est réalisée à une température comprise entre environ 0[deg.]C et la température ambiante. D'autres réactifs et conditions classiques de séparation, permettant l'enlèvement de groupes protecteurs a-amino particuliers, peuvent s'utiliser, com-
<EMI ID=41.1>
pages 72-75.'- Après séparation du groupe protecteur a-amino, les
<EMI ID=42.1>
re graduelle dans l'ordre désiré en vue d'obtenir un composé de la formule (II) ou bien à titre de variante de l'addition séparée de chaque aminoacide au cours de la synthèse, certains de ces
<EMI ID=43.1>
en phase solide. le choix d'un réactif approprié de combinaison est du domaine de l'expériepce courante. Un réactif de combinai-
<EMI ID=44.1>
mide. comme mentionné précédemment, les. réactifs activants utilisée dans la synthèse décrite ci-dessus sont les réactifs bien connus dans la technique des peptides. Des exemples de ces réac-
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
soutenant de l'azote monocycliques, de type aromatique, conte- nant 1 à 4 atomes d'azote dans le noyau, par exemple les imidazo- <EMI ID=47.1>
carbonyl-di-1,2,4-triazole ; (6) les acétylènes alcoxylés (par exemple éthoxyacétylène) ; (7) les réactifs qui forment un anhydride mixte avec le fragment de carboxyle de l'aminoacide (par
<EMI ID=48.1>
et (8) les composés hétérocycliques contenant de l'azote, compor-
<EMI ID=49.1>
<EMI ID=50.1>
D'autres réactifs activants et leur utilisation dans la combinaison des peptides sont décrits par Schroder & Lubke, supra, chapi-
<EMI ID=51.1>
Chaque aminoacide protégé ou séquence d'aminoacides est introduit dans la réaction en phase solide en un excès d'environ 4 fois et on réalise la combinaison dans un milieu de diméthylformamide/chlorure de méthylène (1/1) ou dans du diméthylformamide seul ou du chlorure de méthylène seul. Dans les cas où une combinaison incomplète se développe, le procédé de combinaison est répété avant enlèvement du groupe protecteur a-amino, et ce avant la combinaison de l'aminoacide suivant à la réaction en phase solide. Le succès de la réaction de combinaison, à chaque stade de la synthèse, est surveillé par la réaction à la ninhydrine, comme décrit par E. Kaiser et consort, Analyt. Biochem.,
<EMI ID=52.1>
Après obtention de .la séquence désirée d'aminoacides de la formule II, on sépare le peptide de la résine. Ceci peut se réaliser par méthanolyse pour obtenir un composé répondant à la formule :
<EMI ID=53.1>
puis l'ester méthylique C-terminal est'converti en l'acide correspondant par hydrolyse, cette opération étant suivie par l'activation du groupe carboxyle et la formation de l'hydrazide. par des méthodes classiques. de la synthèse des peptides en vue d'obtenir un composé de la formule III. Toutefois, le procédé préféré pour l'obtention d'un composé de la formule .1 est un procédé se développant suivant le schéma de réactions donné à la fin de la présente description. En considérant ce schéma, un décapepti-
<EMI ID=54.1> <EMI ID=55.1>
sont les nitrites d'alcoyles inférieurs (par exemple le nitrite de t-butyle, le nitrite d'isoamyle) ou un nitrite de métal alcalin (par exemple du nitrite de sodium, du nitrite de potassium) en présence d'un acide fort, tel que de l'acide chlorhydrique, de l'acide phosphorique, de l'acide sulfonique, etc. 'Cette réaction est réalisée en présence d'eau et/ou d'un solvant non aqueux, tel que du diméthylformamide, du tétrahydrofuranne, du dioxane, du chloroforme, du chlorure de méthylène, etc., à une température comprise entre environ -40[deg.]C et +20[deg.]C. L'azide de la formule C, qui n'est de préférence pas isolé du milieu de réaction, est alors combiné avec un aminoacide de la formule :
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
undécapeptide de la formule :
<EMI ID=58.1>
Cette combinaison est réalisée à une température com-
<EMI ID=59.1>
-25[deg.]C et +10[deg.]C.
On fait ensuite réagir l'undécapeptide de formule (E) avec un réactif de séparation qui libérera le groupe protecteur <EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
Il est essentiel que le réactif de séparation soit un réactif ne libérant pas, à ce stade de la synthèse, les groupes protecteurs a -amino de chaîne latérale en 121 et R , se trouvant sur les restes de l'aminoacide lysine dans les positions 1 et 6 de l'undêcapeptide, ni le groupe protecteur a-carboxyle représenté par R . Si ces groupes protecteurs étaient séparés à ce stade, la cyclisation désirée de la phase suivante du procédé ne se développerait pas. Un réactif de séparation particulièrement approprié est l'acide trifluoroacétique, lorsque R représente le
<EMI ID=62.1>
Le choix d'un réactif compatible pour la séparation des divers groupes protecteurs bien connus a-amino et en chaîne latérale est
<EMI ID=63.1>
soit préférable que les groupes protecteurs quelconques en chaîne
2 3 4 5
latérale, représentés par R , R , R et R , ne soient pas séparés durant la formation d'un composé de la formule F, de tels groupes peuvent toutefois être séparés, si on le désire, pour obtenir un composé de la formule :
<EMI ID=64.1>
Le composé de formule F est alors cyclisé pour produire un composé de la formule :
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
sant du N,N -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et du N-hydroxybenzotriazole en présence d'un solvant organique, dans un intervalle de températures de -40[deg.]C à +20[deg.]C. Des solvants appropriés sont le diméthylformamide, le dichlorométhane, le chloroforme, le dioxane, le tétrahydrofuranne et leurs mélanges. On peut également utiliser d'autres réactifs de cyclisation, exemplifiés notamment par les réactifs de combinaison décrits ci-dessus en liaison avec la préparation du décapeptide-résine, ainsi que
<EMI ID=67.1>
(1972).
,On convertit alors un composé de formule IV en un composé de formule I, par- séparation du groupe protecteur amino de
<EMI ID=68.1>
en même temps que les groupés protecteurs quelconques représentés
<EMI ID=69.1>
séparation est constitué par de l'hydrogène sur un catalyseur de palladium. La phase de séparation, si on le désire, peut être réalisée de manière graduelle par le choix d'un réactif qui ne séparera que le groupe protecteur a-carboxyle R , avec ensuite
<EMI ID=70.1>
les autres groupes protecteurs de chaîne latérale quelconques. A titre de variante, les groupes R peuvent être séparés d'abord, avec ensuite séparation simultanée ou de manière séquentielle des
<EMI ID=71.1>
réactifs appropriés de séparation, que l'on peut utiliser et qui sont compatibles avec le groupe particulier a-carboxyle et de chaîne latérale, a été décrit par Schroeder � Lubke, supra, pages
72-75.
Une autre méthode de préparation des composés de la formule (IV) consiste à convertir un composé répondant à la for-
<EMI ID=72.1>
dans laquelle R est choisi parmi l'hydrogène et R , et Me désigne le méthyle, en l'hydrazide correspondant par réaction avec de
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
avec ensuite conversion de ce composé en l'azide correspondant par réaction avec un réactif qui donnera de l'acide nitreux in situ, de la manière décrite précédemment. On cyclise alors l'azide après séparation préalable du groupe protecteur a-amino se trouvant sur la lysine.
Les matières.représentées par la formule D sont des matières connues de la technique antérieure et/ou on peut les préparer aisément par des techniques traditionnelles pour des ami.noacides non protégés bien connus, notamment l'acide aspartique,
<EMI ID=75.1>
lique et l'acide a-aminosubérique.. La préparation de ces aminoacides a été décrite par Farkasova et consort, col. Czechoslov. Chem. Commun. 30, 3117 (1965). La préparation d'esters protégés
<EMI ID=76.1>
673, pages 196, 208 (1964) et Rudinger et consort, Col. Czechos-
<EMI ID=77.1>
Les Exemples suivants illustreront encore plus complètement la préparation des composés de la présente invention.
Exemple 1
<EMI ID=78.1> .dM <EMI ID=79.1>
(7,5 mmoles) comme décrit par Gisin, Helv. 56, 1476 (1973). On analyse l'aminoacide-résine par une analyse quantitative des ami-
<EMI ID=80.1>
On traite cet ester polymère suivant le plan A pour l'incorpora-
<EMI ID=81.1>
OH, Boc-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH. Le reste d'asparagine est introduit sous la forme d'ester p-nitrophénylique activé, BocAsn-ONP, suivant le plan B et finalement le Boc-Lys(Clz)-OH suivant le plan A.
Plan A
<EMI ID=82.1>
résine,à raison de 10 g équivalents à 4 mmoles de sérine/g :
2. On lave trois fois avec du CH2C12
<EMI ID=83.1>
thrite (1:1:0,5%) pendant 25 minutes
<EMI ID=84.1>
6. On lave avec du diméthylformamide
<EMI ID=85.1>
mamide deux fois pendant 3 minutes.
8. On lave avec du diméthylformamide
9. On lave trois fois avec du CH2C12
10. On traite avec 20 mmoles du dérivé correspondant d'aminoacide
<EMI ID=86.1>
5 minutes
11. On ajoute en deux portions 2 5 mmoles de diisopropylcarbodii-
mide sur une période de 30 minutes, la durée de réaction étant de 18 heures
12. On lave avec du diméthylformamide
13.. On lave trois fois avec du CH2C12
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
tion incomplète, on répète les phases 10 à 14 susdites.
<EMI ID=89.1>
érythrite (1:1:0,5%) pendant 25 minutes
<EMI ID=90.1>
6. On lave avec du diméthylformamide
7. On traite avec de la triéthylamine à 12% dans du diméthylformamide, et ce deux fois pendant 3 minutes
<EMI ID=91.1>
9. On lave trois fois avec du CH2C12
10. On traite avec 40 mmoles de Boc-Asn-ONP en présence de 2-3
gouttes d'acide acétique glacial et en dissolution dans du diméthylformamicle, la durée de réaction étant de 72 heures
11. On lave trois fois avec du diméthylformamide
<EMI ID=92.1>
13. On procède à la réaction à la ninhydrine
<EMI ID=93.1>
hydrolysée et analysée.
On prépare l'analogue D-Trp par le même procédé, sauf que l'on substitue le Boc-D-tryptophane au Boc-L-tryptophane.
Exemple 2
<EMI ID=94.1>
mélangée avec 75 ml de diméthylformamide et ensuite avec 10 ml d'hydrazine (qualité de 95% et plus), et on agite le mélange pendant la nuit.
On filtre le mélange, on lave la partie solide avec une quantité supplémentaire de diméthylformamide et' on évapore <EMI ID=95.1>
te avec un excès d'eau pour donner un solide que l'on dissout dans une certaine quantité de diméthylformamide, puis on précipite à nouveau avec de l'eau, la production étant de 2,8 g.
<EMI ID=96.1>
<EMI ID=97.1>
l'Exemple 2 est dissous dans du diméthylformamide (environ 50 ml) ,
<EMI ID=98.1>
puis avec du nitrite d'isoamyle (0,2 ml) . On agite la solution
<EMI ID=99.1>
<EMI ID=100.1>
4 jours. On évapore le mélange jusqu'à siccité sous vide et on triture le reste avec ,un excès d'eau pour obtenir un solide blanc
<EMI ID=101.1>
La production est de 1,9 g.
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
terminés.
L'analogue correspondant contenant. du D-Trp est combi-
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
Trp, non déterminé.
Exemple 4
<EMI ID=107.1> <EMI ID=108.1>
(1,8 g) de l'Exemple 3 est mélangé avec 3 ml d'anisole et on traite avec 50 ml de TFA pendant 30 minutes à la température ambiante. On évapore.la solution jusqu'à siccité sous vide et on balaye deux fois le reste avec de l'éther. On triture le reste avec de l'éther et on dissout la matière solide dans une certaine quantité de diméthylformamide. On verse cette solution dans 100
<EMI ID=109.1>
On récolte la matière solide blanche qui précipite et on sèche pour obtenir 1,35 g de la matière identifiée précédemment. Analyse des aminoacides : Asp . (1) 1,02 ; Thr (2) 1,64 ; Ser (1)
<EMI ID=110.1>
Trp, non déterminé.
On supprime partiellement la protection de l'analogue D-Trp de la même manière.
Exemple 5
<EMI ID=111.1>
di dans un bain de' glace et traité avec du DCC (0,5 g) pendant 2 heures à froid, puis pendant 30 heures à la température ambiante.
On évapore le mélange jusqu'à siccité, on triture le reste avec de l'eau pour obtenir un précipité qu'on lave avec du
<EMI ID=112.1>
que, et de l'eau, puis on dessèche. On fait digérer le solide seç avec du EtOH absolu au bain-marie qu'on laisse revenir à la température ambiante, puis on filtre. La matière se trouvant sur le
<EMI ID=113.1>
<EMI ID=114.1>
drogénation pendant 20 heures. On sépare le catalyseur et on évapore le filtrat jusqu'à siccité, puis on le reprend dans du
<EMI ID=115.1>
dre qui est le produit identifié ci-dessus.
<EMI ID=116.1> <EMI ID=117.1>
0,70
<EMI ID=118.1>
0,73 ; Glu (1) 0,.89 ; Phe (3) 3 ; Lys (2) 1,91 ; NH3, Trp, non déterminés.
Exemple 6
<EMI ID=119.1>
On dissout l'undécapeptide partiellement débarrassé de la protection, issu du dernier paragraphe de l'Exemple 4 (3 g),
<EMI ID=120.1>
triéthylamine (0,2 ml) pour amener le pH à 7. On ajoute du Nhydroxybenzotriazole (1 g) et on refroidit le mélange au bain de glace, puis on traite avec du DCC (0,59 g) pendant 2 jours et sous agitation. On filtre le mélange de réaction et on évapore le filtrat jusqu'à un petit volume. On ajoute un excès d'eau pour obtenir une.matière solide blanche que l'on filtre, lave à
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
sé de sa protection, a ensuite été traité avec de l'acide fluorhydrique liquide (environ 100 ml) en présence d'anisole (5 ml) et à l'exclusion d'air pendant 35 minutes dans un bain de glace. On sépare l'excès de HF sous vide aussi vite que possible, on reprend le reste dans du AcOH aqueux 2M et on extrait la phase aqueuse avec de l'éther diéthylique pour séparer l'anisole. La solution aqueuse est lyophilisée pour donner 1,03 g de matière solide. Cette matière brute (1 g) est appliquée à une colonne de Sephadex G-25 (2,5 x 120 cm)'et on procède à une élution avec du AcOH aqueux 2M. Les fractions,(4 ml chacune) qui émergent dans les tubes 89-109 sont rassemblées et lyophilisées pour donner 155,8 mg d'un solide duveteux. On applique ce solide à une
<EMI ID=123.1>
Les éluats des tubes 13-35 sont rassemblés et lyophilisés pour
<EMI ID=124.1>
pyridine, 30/24/6/20), 0,71.
<EMI ID=125.1>
0,92 ; Glu (1) 0,99 ; Phe (3) 3,12 ; Lys (2) 2 ; NH3 (1) 1,16 ; Trp (1) 0,77.
On a déterminé les activités d'hormone de croissance des composés de l'Exemple 5, en injectant à des rats pesant envi-
<EMI ID=126.1>
de 50 mg/kg, puis 5 minutes après, par voie sous-cutanée, une solution du composé de l'Exemple 5 en solution saline à une dose
de 2 mg/kg par rat. Des échantillons de sang sont prélevés 15 minutes après injection du composé de l'Exemple 5, et le taux d'hormone de croissance est déterminé par un essai d'appréciation de l'immunité. Le taux moyen d'hormone de croissance chez les rats témoins (13 animaux) était, d'après ce que l'on a trouvé,
<EMI ID=127.1>
chez les rats (13 animaux) ayant reçu le composé de l'Exemple 5
<EMI ID=128.1>
mais la dose du composé- de l'Exemple 5 a été élevée à 2,38 mg/kg et le prélèvement d'échantillons de sang a été fait 2 heures après l'injection. Le taux moyen d'hormone de croissance chez les rats témoins (15 animaux) était de 244 t 38 ng/ml, tandis que le taux d'hormone de croissance.chez les rats (15 animaux) ayant reçu le composé de l'Exemple 5 était de 89 t 23 ng/ml.
En suivant le même procédé, on a déterminé l'activité du produit de l'Exemple 6 deux heures après administration de 1500
<EMI ID=129.1>
par ml, tandis que le taux d'un groupe témoin était de 180 � 27
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
La découverte d'une réduction importante du taux d'hormone de croissance après 2 heures démontre que les composés .de la formule 1 présentent; de façon surprenante, une activité prolongée sensiblement plus longue que celle de la somatostatine qui, d'après Brazeau et consort, Biochem. and Biophys. Res. Comm.
60, page 1202 (1974); a une demi-vie biologique d'environ 4 minutes.
On a procédé à une autre essai sur le composé de l'Exemple 5 pour déterminer son effet sur les taux d'insuline et de glucagon. La détermination in vivo donnant la libération si- <EMI ID=132.1>
a été faite en injectant à trois groupes de rats mâles pesant environ 200 à 250 g (9 animaux par groupe) du pentobarbital dans le péritoine à une dose de 50 mg/kq par rat, et en prévoyant ensuite,
15 minutes plus tard, une injection sous-cutanée du composé de
<EMI ID=133.1>
jection sous-cutanée de SRIF à une dose de 0,2 mg/kg à un autre groupe de rats et une injection sous-cutanée d'une solution saline au troisième groupe de rats. Dix minutes après une telle in-
<EMI ID=134.1>
d'arginine dans 0,5 ml de solution saline. Cinq minutes plus tard, les rats ont été décapités, on a récolté le sang et on a procédé à diverses radio-déterminations d'immunité. Les résultats ont indiqué que ni le taux de glucagon, ni le taux d'insuline n'ont été abaissés par l'administration du composé de l'Exemple 5, tandis que les taux de ces deux .hormones ont été abaissés par la somatostatine.
D'une manière analogue, on a essayé le produit de l'Exemple 6 au cours de trois expériences distinctes, et on a obtenu les résultats suivants :
<EMI ID=135.1>
<EMI ID=136.1>
mifères à sang chaud, notamment aux êtres humains, par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou orale pour empêcher la libération de l'hormone de croissance lorsque le sujet traité exige un traitement thérapeutique en raison d'un excès de sécrétion de.somatotropine, qui est associé à des états, tels que l'acromégalie. La posologie envisagée pour l'administration par voie orale, sous forme de comprimés ou de capsules, à de grands <EMI ID=137.1>
corps par jour, tandis que la posologie pour une injection intra-
<EMI ID=138.1>
mg/kg de poids de corps par jou�. Lors d'une administration sous-cutanée ou intramusculaire, on envisage une posologie d'en-
<EMI ID=139.1>
demment, la dose requise variera avec l'état particulier que l'on traite, la rigueur de cet état et la durée du traitement.
Si on administre l'ingrédient actif sous la forme de comprimés, un tel comprimé peut comprendre : un liant, tel que de la gomme adragante, de l'amidon de mais, de la gélatine ; un ex-
<EMI ID=140.1>
tion, tel que de l'amidon de mais, de l'acide alginique, etc ; un lubrifiant, tel que stéarate de magnésium ; et un agent édulcorant et/ou aromatisant, comme le sucrose, le lactose, de l'essence de wintergreen, etc. Des véhicules liquides appropriés pour une administration intraveineuse sont une solution saline isotonique, des solutions de tampons phosphates, etc.
Schéma de réactions
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
"Cyclic somatostatin analogs undecapeptides and their preparation" <EMI ID = 1.1>
cyclic analogues of somatostatin and their synthesis by a combination of the solid phase method and the conventional method of peptide synthesis.
Somatostatin (also known as Somatotropin Release Inhibitor Factor or SRIF) is the tetradecapeptide:
<EMI ID = 2.1>
We have. identified this tetradecapeptide by isolating it from extracts of hypothalamic tissues of bovine animals and it was found that it inhibits the secretion of the hormone somatotropin commonly referred to as growth hormone (GH); see Brazeau et al, Science, 179, pages 77-79 (January 1973). Brazeau et al (cited above), also reported that the linear form of this tetradecapeptide:
<EMI ID = 3.1>
has been synthesized by solid phase methodology and exhibits the same biological activity as somatostatin obtained from a natural source. In the United States patent application
<EMI ID = 4.1>
No. 3,882,098, the undecapeptide Des-Ala -Gly -Asn SRIF and its oxidized form have been described, and in United States Patent Application No. [deg.] 457,038 of April 1, 1974 , Des-Ala <1> -Gly <2> -SRIF dodecapeptide and its oxidized form have been described.
Cyclic somatostatin analogues, not containing cysteine, have not been described in the previous literature. The cyclic undecapeptides herein. The invention comprises a cyclic structure which does not contain sulfur but instead contains carbon as a nucleus element and which furthermore does not contain the amino acids at positions 1 and 2 of somatostatin (i.e. Ala and Gly).
The cyclic undecapeptides of the present invention, which prevent the secretion of the hormone somatotropin, are represented by the formula:
<EMI ID = 5.1>
wherein Trp represents D-tryptophyl or L-tryptophyl and all other amino acids are of the L configuration, the in-
<EMI ID = 6.1>
ques of the preceding compounds. In this formula, n is an integer from 1 to 5; when n is 1, the C-terminal amino acid is aspartic acid; when n is 2, the C-terminal amino acid is glutamic acid; when n is 3, the C-terminal amino acid is α-aminoadipic acid; when n is 4, the C-terminal amino acid is α-aminopimelic acid; and when n is 5, the C-terminal amino acid is α-arninosubic acid. The preferred compound according to the formula
<EMI ID = 7.1>
Examples of acid addition salts are hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succinate, malate,
<EMI ID = 8.1>
1, pages VIII-XXIX (Academic Press 1965). All the remains of friends-
<EMI ID = 9.1>
The mules presented below are of the natural configuration or L configuration, except for the Trp, which is optionally of the L or D configuration.
The present invention also relates to novel decapeptides of the formula:
<EMI ID = 10.1>
in which R denotes an α-amino protecting group. The groups
<EMI ID = 11.1>
as being of practical interest in the gradual synthesis of polypeptides. among the classes of amino protecting groups encompassed by R, there may be mentioned: (1) protecting groups of the acyl type illustrated by the following groups: formyl, trifluoroacetyl, phtalyl, toluenesulforyl (tosyl); benzenesulfo- <EMI ID = 12.1>
y-chlorobutyryl, etc; (2) aromatic urethane-type protecting groups, exemplified by benzyloxycarbonyl and
<EMI ID = 13.1>
ques, illustrated by: cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl; (5) protecting groups of the type
<EMI ID = 14.1>
alkyl type protectors, as exemplified by triphenylmethyl (trityl), benzyl; (7) trialkoyisilane groups, such as trimethylsilane. The preferred α-amino protecting group for R is tert-butyloxycarbonyl.
<EMI ID = 15.1>
detector for the side chain amino substituent of lysine. Examples of suitable protecting groups for the side chain amino substituent are benzyloxycarbonyl and substituted benzyloxycarbonyls, the substituent being selected from halo (eg chloro, bromo, fluoro) and nitro groups.
(e.g. 2-chlorobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, 3,4-dichlorobenzyloxycarbonyl), tosyl, t-amyloxycarbonyl,
<EMI ID = 16.1>
of this side chain amino substituent protecting group is not critical except that it must be a group which is not removed during separation of the α-amino protecting group during synthesis until obtaining the cyclic undecapeptide corresponding to the desired sequence of amino acids. Thereby,
<EMI ID = 17.1>
locating amino of the side chain of lysine, designated as R, may not be identical.
In the preceding formula, R <2> is chosen from among the
<EMI ID = 18.1>
<EMI ID = 19.1> <EMI ID = 20.1>
are chosen from acetyl, benzoyl, tertiary butyl, trityl, benzyl, 2,6-dichlorobenzyl and benzyloxycarbonyl. The preferred protecting group in this case is ben-
<EMI ID = 21.1>
gene, which then means that there is no protective group on the alcoholic hydroxyl function.
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
The polystyrene resin support is preferably made of a styrene polymer with about 1 to 2% divinylbenzene as a crosslinking agent, which causes the polystyrene polymer to be completely insoluble in certain organic solvents. The polystyrene polymer is made up of long chains of alkyls, carrying one phenyl ring every other carbon and the terminal amino acid residue (Ser) is joined by a covalent carbon-carbon bond to these phenyl rings. Alkyl chains are crosslinked on approximately every fiftieth carbon atom by residues of p-diethylbenzene, derived from divinylbenzene.
The present invention also relates to novel undéçapeptides of the formula:
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
drogen or a side chain carboxyl protecting group, which is removed under conditions which will not separate the group <EMI ID = 28.1> representing the same protecting group. Examples of carboxyl side chain protecting groups, representing R, are
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
represented by R9 is a group which is stable under the conditions which (<1>) separate the carboxyl protecting group R, if any, and (2) separate any α-ainino protecting group on the lysyl group of the N-terminal part of the peptide. The
<EMI ID = 31.1>
(for example methyl, ethyl, butyl, pentyl, isobutyl), benzyl, substituted benzyls (comprising at least one substituent of nitro, methoxy and methyl groups, so that it is for example p-methoxybenzyl, 2,4-dimethoxybenzyl,
<EMI ID = 32.1>
Preferred R9 is benzyl.
The present invention also encompasses compounds corresponding to the formula:
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
<EMI ID = 35.1>
signed by R; R is selected from hydrogen and the groups
12
designated by R; and R is selected from hydrogen and groups
<EMI ID = 36.1>
The novel decapeptides of formula II are prepared using solid phase synthesis. Synthesis is started from the C-terminus of the peptide using an α-amino protected resin. Such a starting material can be prepared by attaching an α-amino protected serine to <EMI ID = 37.1>
<EMI ID = 38.1>
in side chain is combined with. chloromethylated resin. following the method of Gisin, Helv. 56, pp 1476 (1973). After combining this serine with the resin carrier, we enter
<EMI ID = 39.1>
trifluoroacetic acid in -methylene chloride, acid-
<EMI ID = 40.1>
The protection is carried out at a temperature between approximately 0 [deg.] C and room temperature. Other conventional reagents and separation conditions, allowing the removal of particular α-amino protecting groups, may be used, such as
<EMI ID = 41.1>
pages 72-75 .'- After separation of the α-amino protecting group, the
<EMI ID = 42.1>
re gradually in the desired order in order to obtain a compound of formula (II) or alternatively of the separate addition of each amino acid during the synthesis, some of these
<EMI ID = 43.1>
in solid phase. the choice of an appropriate combination reagent is well within the skill of the art. A combination reagent
<EMI ID = 44.1>
mide. as mentioned earlier, the. Activating reagents used in the synthesis described above are reagents well known in the art of peptides. Examples of these reactions
<EMI ID = 45.1>
<EMI ID = 46.1>
nitrogen supporting monocyclic, aromatic type, containing 1 to 4 nitrogen atoms in the ring, for example imidazo- <EMI ID = 47.1>
carbonyl-di-1,2,4-triazole; (6) alkoxylated acetylenes (eg ethoxyacetylene); (7) reagents which form a mixed anhydride with the carboxyl moiety of the amino acid (by
<EMI ID = 48.1>
and (8) heterocyclic compounds containing nitrogen, comprising
<EMI ID = 49.1>
<EMI ID = 50.1>
Other activating reagents and their use in combining peptides are described by Schroder & Lubke, supra, chap-
<EMI ID = 51.1>
Each protected amino acid or sequence of amino acids is introduced into the solid phase reaction in about 4-fold excess and the combination is carried out in dimethylformamide / methylene chloride (1/1) medium or in dimethylformamide alone or methylene chloride alone. In cases where an incomplete combination develops, the combining process is repeated before removing the α-amino protecting group, and before combining the next amino acid to the solid phase reaction. The success of the combination reaction, at each stage of the synthesis, is monitored by the ninhydrin reaction, as described by E. Kaiser et al, Analyt. Biochem.,
<EMI ID = 52.1>
After obtaining the desired sequence of amino acids of formula II, the peptide is separated from the resin. This can be carried out by methanolysis to obtain a compound corresponding to the formula:
<EMI ID = 53.1>
then the C-terminal methyl ester is converted to the corresponding acid by hydrolysis, this operation being followed by activation of the carboxyl group and formation of the hydrazide. by conventional methods. synthesis of peptides to obtain a compound of formula III. However, the preferred process for obtaining a compound of formula .1 is a process developing according to the reaction scheme given at the end of the present description. Considering this scheme, a decapepti-
<EMI ID = 54.1> <EMI ID = 55.1>
are lower alkyl nitrites (e.g. t-butyl nitrite, isoamyl nitrite) or an alkali metal nitrite (e.g. sodium nitrite, potassium nitrite) in the presence of a strong acid, such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfonic acid, etc. 'This reaction is carried out in the presence of water and / or a non-aqueous solvent, such as dimethylformamide, tetrahydrofuran, dioxane, chloroform, methylene chloride, etc., at a temperature of between about -40 [deg.] C and +20 [deg.] C. The azide of the formula C, which is preferably not isolated from the reaction medium, is then combined with an amino acid of the formula:
<EMI ID = 56.1>
<EMI ID = 57.1>
undecapeptide of the formula:
<EMI ID = 58.1>
This combination is carried out at a temperature of
<EMI ID = 59.1>
-25 [deg.] C and +10 [deg.] C.
The undecapeptide of formula (E) is then reacted with a separation reagent which will release the protective group <EMI ID = 60.1>
<EMI ID = 61.1>
It is essential that the separation reagent is one which does not release, at this stage of the synthesis, the α -amino side chain protecting groups in 121 and R, found on the residues of the amino acid lysine in positions 1. and 6 of the undescapeptide, nor the α-carboxyl protecting group represented by R. If these protecting groups were separated at this point, the desired cyclization of the next phase of the process would not develop. A particularly suitable separation reagent is trifluoroacetic acid, when R represents
<EMI ID = 62.1>
The choice of a compatible reagent for the separation of the various well known α-amino and side chain protecting groups is
<EMI ID = 63.1>
is preferable that any chain protecting groups
2 3 4 5
side, represented by R, R, R and R, are not separated during the formation of a compound of the formula F, however such groups can be separated, if desired, to obtain a compound of the formula:
<EMI ID = 64.1>
The compound of formula F is then cyclized to produce a compound of the formula:
<EMI ID = 65.1>
<EMI ID = 66.1>
sant of N, N -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxybenzotriazole in the presence of an organic solvent, in a temperature range of -40 [deg.] C to +20 [deg.] C. Suitable solvents are dimethylformamide, dichloromethane, chloroform, dioxane, tetrahydrofuran and mixtures thereof. It is also possible to use other cyclization reagents, exemplified in particular by the combination reagents described above in connection with the preparation of the decapeptide-resin, as well as
<EMI ID = 67.1>
(1972).
A compound of formula IV is then converted to a compound of formula I by separation of the amino protecting group from
<EMI ID = 68.1>
at the same time as any protecting groups represented
<EMI ID = 69.1>
separation consists of hydrogen over a palladium catalyst. The separation phase, if desired, can be carried out gradually by choosing a reagent which will separate only the α-carboxyl protecting group R, followed by
<EMI ID = 70.1>
any other side chain protecting groups. Alternatively, the R groups can be separated first, followed by simultaneous or sequential separation of the R groups.
<EMI ID = 71.1>
Appropriate separation reagents, which can be used and which are compatible with the particular α-carboxyl and side chain group, have been described by Schroeder � Lubke, supra, pages
72-75.
Another method of preparing compounds of formula (IV) consists in converting a compound corresponding to the form
<EMI ID = 72.1>
in which R is chosen from hydrogen and R, and Me denotes methyl, to the corresponding hydrazide by reaction with
<EMI ID = 73.1>
<EMI ID = 74.1>
followed by conversion of this compound to the corresponding azide by reaction with a reagent which will give nitrous acid in situ, as previously described. The azide is then cyclized after prior separation of the α-amino protecting group on the lysine.
The materials represented by formula D are materials known from the prior art and / or can be readily prepared by conventional techniques for well known unprotected amino acids, especially aspartic acid,
<EMI ID = 75.1>
lic and α-aminosubic acid. The preparation of these amino acids has been described by Farkasova et al, col. Czechoslov. Chem. Common. 30, 3117 (1965). Preparation of protected esters
<EMI ID = 76.1>
673, pages 196, 208 (1964) and Rudinger et al., Col. Czechos-
<EMI ID = 77.1>
The following Examples will further illustrate the preparation of the compounds of the present invention.
Example 1
<EMI ID = 78.1> .dM <EMI ID = 79.1>
(7.5 mmol) as described by Gisin, Helv. 56, 1476 (1973). The amino acid-resin is analyzed by quantitative analysis of amino acids.
<EMI ID = 80.1>
This polymeric ester is treated according to plan A for the incorpora-
<EMI ID = 81.1>
OH, Boc-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH. The remainder of asparagine is introduced in the form of activated p-nitrophenyl ester, BocAsn-ONP, according to plan B and finally the Boc-Lys (Clz) -OH according to plan A.
Plan A
<EMI ID = 82.1>
resin, at a rate of 10 g equivalent to 4 mmoles of serine / g:
2. Wash three times with CH2Cl2
<EMI ID = 83.1>
thrite (1: 1: 0.5%) for 25 minutes
<EMI ID = 84.1>
6. Wash with dimethylformamide
<EMI ID = 85.1>
mamide twice for 3 minutes.
8. Washed with dimethylformamide
9. Wash three times with CH2Cl2
10. Treated with 20 mmoles of the corresponding amino acid derivative
<EMI ID = 86.1>
5 minutes
11. 25 mmol of diisopropylcarbodii-
medium over a period of 30 minutes, the reaction time being 18 hours
12. Washed with dimethylformamide
13 .. Wash three times with CH2C12
<EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
Incomplete tion, the above-mentioned phases 10 to 14 are repeated.
<EMI ID = 89.1>
erythritis (1: 1: 0.5%) for 25 minutes
<EMI ID = 90.1>
6. Wash with dimethylformamide
7. It is treated with 12% triethylamine in dimethylformamide, and this twice for 3 minutes.
<EMI ID = 91.1>
9. Wash three times with CH2Cl2
10. Treat with 40 mmoles of Boc-Asn-ONP in the presence of 2-3
drops of glacial acetic acid and dissolved in dimethylformamide, the reaction time being 72 hours
11. Washed three times with dimethylformamide
<EMI ID = 92.1>
13. The ninhydrin reaction is carried out
<EMI ID = 93.1>
hydrolyzed and analyzed.
The D-Trp analog is prepared by the same method, except that Boc-D-tryptophan is substituted for Boc-L-tryptophan.
Example 2
<EMI ID = 94.1>
mixed with 75 ml of dimethylformamide and then with 10 ml of hydrazine (quality 95% and above), and the mixture was stirred overnight.
The mixture is filtered, the solid part is washed with an additional quantity of dimethylformamide and 'evaporated <EMI ID = 95.1>
te with excess water to give a solid which is dissolved in a quantity of dimethylformamide and then precipitated again with water, the yield being 2.8 g.
<EMI ID = 96.1>
<EMI ID = 97.1>
Example 2 is dissolved in dimethylformamide (approximately 50 ml),
<EMI ID = 98.1>
then with isoamyl nitrite (0.2 ml). We stir the solution
<EMI ID = 99.1>
<EMI ID = 100.1>
4 days. The mixture is evaporated to dryness in vacuo and the remainder is triturated with excess water to obtain a white solid.
<EMI ID = 101.1>
The production is 1.9 g.
<EMI ID = 102.1>
<EMI ID = 103.1>
completed.
The corresponding analog containing. of D-Trp is combined
<EMI ID = 104.1>
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
Trp, not determined.
Example 4
<EMI ID = 107.1> <EMI ID = 108.1>
(1.8 g) of Example 3 is mixed with 3 ml of anisole and treated with 50 ml of TFA for 30 minutes at room temperature. The solution is evaporated to dryness in vacuo and the remainder is swept twice with ether. The remainder is triturated with ether and the solid is dissolved in a quantity of dimethylformamide. We pour this solution into 100
<EMI ID = 109.1>
The white solid which precipitated was collected and dried to obtain 1.35 g of the material identified above. Amino acid analysis: Asp. (1) 1.02; Thr (2) 1.64; Ser (1)
<EMI ID = 110.1>
Trp, not determined.
The protection of the D-Trp analog is partially removed in the same manner.
Example 5
<EMI ID = 111.1>
di in an ice bath and treated with DCC (0.5 g) for 2 hours in the cold, then for 30 hours at room temperature.
The mixture is evaporated to dryness, the rest is triturated with water to obtain a precipitate which is washed with
<EMI ID = 112.1>
that, and water, then we dry out. The solid seç is digested with absolute EtOH in a water bath which is allowed to come to room temperature, then filtered. The material on the
<EMI ID = 113.1>
<EMI ID = 114.1>
drogenation for 20 hours. The catalyst is separated and the filtrate is evaporated to dryness, then it is taken up in
<EMI ID = 115.1>
dre which is the product identified above.
<EMI ID = 116.1> <EMI ID = 117.1>
0.70
<EMI ID = 118.1>
0.73; Glu (1) 0.89; Phe (3) 3; Lily (2) 1.91; NH3, Trp, not determined.
Example 6
<EMI ID = 119.1>
The undecapeptide partially stripped of the protection, obtained from the last paragraph of Example 4 (3 g), is dissolved,
<EMI ID = 120.1>
triethylamine (0.2 ml) to bring the pH to 7. Nhydroxybenzotriazole (1 g) is added and the mixture is cooled in an ice bath, then treated with DCC (0.59 g) for 2 days and with stirring. . The reaction mixture is filtered and the filtrate evaporated to a small volume. Excess water is added to obtain a white solid which is filtered, washed with
<EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
dried from its protection, was then treated with liquid hydrofluoric acid (about 100 ml) in the presence of anisole (5 ml) and with the exclusion of air for 35 minutes in an ice bath. The excess HF is removed in vacuo as quickly as possible, the remainder is taken up in 2M aqueous AcOH and the aqueous phase is extracted with diethyl ether to separate the anisole. The aqueous solution is lyophilized to give 1.03 g of solid material. This crude material (1 g) is applied to a Sephadex G-25 column (2.5 x 120 cm) and elution is performed with 2M aqueous AcOH. The fractions, (4 ml each) which emerge in tubes 89-109 are pooled and lyophilized to give 155.8 mg of a fluffy solid. We apply this solid to a
<EMI ID = 123.1>
The eluates from tubes 13-35 are pooled and lyophilized for
<EMI ID = 124.1>
pyridine, 30/24/6/20), 0.71.
<EMI ID = 125.1>
0.92; Glu (1) 0.99; Phe (3) 3.12; Lily (2) 2; NH3 (1) 1.16; Trp (1) 0.77.
The growth hormone activities of the compounds of Example 5 were determined by injection into rats weighing approx.
<EMI ID = 126.1>
50 mg / kg, then 5 minutes later, subcutaneously, a solution of the compound of Example 5 in saline solution at a dose
of 2 mg / kg per rat. Blood samples are taken 15 minutes after injection of the compound of Example 5, and the level of growth hormone is determined by an immunity assay. The mean growth hormone level in control rats (13 animals) was found to be
<EMI ID = 127.1>
in rats (13 animals) which received the compound of Example 5
<EMI ID = 128.1>
but the dose of compound of Example 5 was increased to 2.38 mg / kg and blood samples were taken 2 hours after injection. The mean growth hormone level in the control rats (15 animals) was 244 t 38 ng / ml, while the growth hormone level in the rats (15 animals) given the compound of Example 5 was 89 t 23 ng / ml.
Following the same procedure, the activity of the product of Example 6 was determined two hours after administration of 1500
<EMI ID = 129.1>
per ml, while the rate of a control group was 180%. 27
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1>
The discovery of a significant reduction in the level of growth hormone after 2 hours demonstrates that the compounds of formula 1 exhibit; surprisingly, a prolonged activity significantly longer than that of somatostatin which, according to Brazeau et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm.
60, page 1202 (1974); has a biological half-life of approximately 4 minutes.
The compound of Example 5 was further tested to determine its effect on insulin and glucagon levels. The in vivo determination giving the release if- <EMI ID = 132.1>
was made by injecting three groups of male rats weighing approximately 200 to 250 g (9 animals per group) of pentobarbital into the peritoneum at a dose of 50 mg / kq per rat, and then providing,
15 minutes later, a subcutaneous injection of the compound of
<EMI ID = 133.1>
Subcutaneous injection of SRIF at a dose of 0.2 mg / kg to another group of rats and subcutaneous injection of saline to the third group of rats. Ten minutes after such an in-
<EMI ID = 134.1>
arginine in 0.5 ml of saline solution. Five minutes later, the rats were decapitated, blood collected, and various immunity radio-determinations performed. The results indicated that neither the glucagon level nor the insulin level was lowered by the administration of the compound of Example 5, while the levels of these two hormones were lowered by somatostatin.
Similarly, the product of Example 6 was tested in three separate experiments, and the following results were obtained:
<EMI ID = 135.1>
<EMI ID = 136.1>
warm-blooded mammals, especially to humans, intravenously, subcutaneously, intramuscularly or orally to prevent the release of growth hormone when the treated subject requires therapeutic treatment due to excess somatotropin secretion , which is associated with conditions, such as acromegaly. The dosage considered for oral administration, in tablet or capsule form, at large <EMI ID = 137.1>
body per day, while the dosage for intra-
<EMI ID = 138.1>
mg / kg body weight per day. When administered subcutaneously or intramuscularly, a dosage of en-
<EMI ID = 139.1>
However, the dose required will vary with the particular condition being treated, the severity of that condition and the duration of treatment.
If the active ingredient is administered in the form of tablets, such a tablet may comprise: a binder, such as tragacanth, corn starch, gelatin; an ex-
<EMI ID = 140.1>
tion, such as corn starch, alginic acid, etc; a lubricant, such as magnesium stearate; and a sweetening and / or flavoring agent, such as sucrose, lactose, oil of wintergreen, etc. Suitable liquid vehicles for intravenous administration are isotonic saline solution, phosphate buffer solutions, etc.
Diagram of reactions
<EMI ID = 141.1>
<EMI ID = 142.1>