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Culture de virus.
La présente invention concerne la culture de virus, plus particulièrement dans les cellules d'une culture tissulaire.
La culture de virus est importante tant pour la production de vaccins que pour la recherche radical et vétérinaire. Lr pré- sence de cellules vivantes est essentielle pour la prolifération et les virus se multiplieront en général librement dans les cellules d'une culture tissulaire. Toutefois, dans les cultures de virus à grande échelle, il est souvent difficile déporter les quantités recuises de cellules vivantes appropriées.
Par exemple, le virus de la fièvre aphteuse est cultivé couramment pour la production tle vaccins dans des milieux constituéspar les tissus de .ceins de porc ou de veau. Etant donné que les cellules vivantes ne survivait que pendant quelques générations, le procédé est laborieux et nécessite
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constamment de nouvelles cultures de tissus de reins fraie. Cela constitue un inconvénient à cause de la variabilité des cultures issues d'animaux différents et à cause du risque de contamination par les bactéries et les virus des animaux.
Pour remplacer les préparations de cellules de tissus fraie pour la culture des virus, on a essayé d'établir des lignées de cel- Iules qui peuvent être cultivées et repiquées pour constituer une source standard de cellules convenant pour la croissance des virus* Il existe diverses lignées de cellules, mais on ne dispose pas de système de culture satisfaisant pour la reproduction de certains virus, par exemrle, du virus de la fièvre aphteuse. La difficulté principale réside dans le fait que les cellules changent souvent de caractère après un certain temps de culture et deviennent impropre* à la croissance des virus.
On a découvert à présent une nouvelle lignée de cellules qui peut être cultivée et repiquée pendant de nombreux mois sans manifester de modification sensible de caractère. En outre, les cel- lules de cette nouvelle lignée se multiplient plus rapidement oue ne le font d'habitude .Le! autres cellules. On a découvert également nue la nouvelle lignée de cellules entretient facilement la croissance de divers virus et, pouvant être cultivée et repiquée continuelle- ment et conservée, si nécessaire, à des températures inférieures à 0 C, elle constitue une source appropriée de cellules pour la cul- ture de virus.
La nouvelle lignée de cellules est une lignée de fibrocytes de rein de jeunes hamsters dorés et est appelée BHK 21. L'idiogramme des cellules semble être le même que celui rencontré dans les cultu- res primaires de rein de hamsters. Les cellules sont fibroblastiques et croissent en couche monocellulaire avec une tendance bien marquée à s'orienter parallèlement. Flles se développent rapidement et se di- visent à peu près toutes les douze heures, et ces caractéristiques ont été conservées pendant plusieurs mois de culture. Cette propriété les distingue d'autres lignées de cellules.
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La nouvelle lignée de cellules a été développée à partir d'une culture de cellules de rein de jeunes hamsters préparée comme
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décrit par Stoker et Macpherson, Virology, .., pages 359-370. Des lots de cellules ont été propagés en traitant par de la trypsine les couches monocellula1rs avant quelles ne deviennent complètement 1 contluentes et en opérant le repi("u8f:e avec un dixième ou un vingtiè- me de la suspension de cellules. Cela nécessite un reiouage tous les' ! ou 5 Jours. Le milieu de culture utilisé consiste en 10;ti de sérum i non chauffé de veau et de 10 de bouillon de tryptose phosphate trai- té en autoclave dans le milieu de base d'Eagle porte au double de la : concentration normale en acides aminés et en vitamines.
A une seule exception près, les lots de cellules cessent de se développer après ;
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quelques repiquages, cette exception étant la lignée de cellules BHK ; 21. Celle-ci provient de cultures de la suspension originale de cel- lules de rein conservées en croissance logarithmique nendant 30 jours.
Les cellules sont traitées ensuite par de la trypsine, remises en !
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suspension dans un milieu contenant 20 de séruin de veau et 5 de glycérol et refroidies à -'70pC. Apres 6 jours de conservation à cette ' température, les cellules sont isolées en les réchauffant rapidement
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à 37OCe Les cellules sont ensuite utilisées pendant 35 jours encore, après quoi elles croissent rapidement et elles ont une vitesse moyen- ne de doublement de 12 heures et un pouvoir de recouvrement de 2 à 10%. Par la suite, les cellules ne changent pas de caractère et con- servent leur vitesse de croissance logarithmique.
On a également découvert que la lignée de cellules BHK 21 est modifiée par le virus du polyome, Les cellules modifiées peuvent. être obtenues à partir de cellules de lignée BHK 21 en leur inoculant le virus du polyome. Une semaine après, il est possible de déceler des cellules modifiées parmi les cellules normales et ces cellules
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modifiées sont séparées et purifiées par rep1cluay,e..
Les cellules de lignée BHK 21 et des cellules de cette même lignée qui ont été modifiées par l'action du virus du polyome, sont cultivées sur un milieu nutritif. Lo système de culture comprend
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donc les cellules de cette lignée dans un milieu nutritif approprié qui contient habituellement des acides aminés, des vitamines, des hydrates de carbone et des sels. En outre, des antibiotiques sont avantageusenent ajoutés pour empêcher l'envahissement de la culture par des bactéries et des cryptogames. Il est commode d'utiliser à cette fin le milieu de base d'Eagle additionné de 10% de tryptose phosphate (Difco) et de 10% ae sérum de veau.
Suivant la présente invention, dans un procédé de culture d'un virus, on inocule le virus à un système comprenant des cellules de la ligne cellulaire BHK 21 ou des cellules de la ligne BHK 21 modifiées par l'action du virus du polyome, et des agents nutritifs en ouantités suffisantes afin de maintenir en vie les cellules pour la culture du virus.
Les cellules peuvent être cultivées d'une façon appropriée quelconque dans de l'air contenant 5% d'anhydride carbonique, par exemple en recourant à une culture stationnaire ou tournante ou agi- tée.
Le milieu nutritif utilisé pour la croissance de certains virus peut être avantageusement le même que celui décrit plus haut pour la culture de la lignée de cellules. Toutefois, la croissance satisfaisante d'autres virus peut exiger un milieu nutritif modifié.
L'invention s'applique en particulier à la culture de vi- rus aui sont importants en médecine humaine et vétérinaire. Ainsi, le virus de la fièvre aphteuse, le virus du trachome et le virus herpétique peuvent tre cultivés avantageusement par le procédé de l'invention, et on a réalisé également la culture du virus de la maladie de Newcastle et du virus de la peste aviaire, ainsi que des virus de la grippe et d'arbovirus, par exemple le virus de la dengue.
La culture du virus de la fièvre aphteuse est spécialement impor- tante et on a montré maintenant que la production à grande échelle de vaccins contre cette maladie utilisant la technique de cultures en suspension est réalisable en pratiaue.
Il est relativement facile pour le virologiste d'établir
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Si les cellules BHK 21 conviennent pour un virus donné. En utilisant les conditions de culture, par exemple le pH et la température em- ployés normalement pour le virus dans d'autres systèmes de cellules, la viabilité de la nouvelle lignée cellulaire est déterminée facile- ment un certain temps après l'inoculation, temps qui varie d'un virus à l'autre, en mesurant le rendement en virus et en examinant les cellules pour déterminer l'effet cytopathique caractéristique qui est indicatif de la croissance du virus; les cellules s'arron- dissent, deviennent granuleuses et se détachent de la surface de verre sur laquelle elles ont formé une couche unique.
Les cellules utilisées aux fins de l'invention proviennent de préférence, mais non nécessairement, du même clone.
Pour préparer les vaccins correspondants à partir des vi- rus cultivés suivant l'invention, il est nécessaire de traiter les virus par des procédés connus.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1.-
Des cellules BHK 21 dans un milieu de culture consistant en 10% de sérum non chauffé de veau et en 10% de bouillon de trypto- se phosphate traité en autoclave, dans le milieu de base d'Eagle porté au double de la concentration normale en acides aminés et en vitamines sont inoculées avec une souche 997 (type C) du virus de la ! fièvre aphteuse après 204 passages dans des cultures de cellules de rein de porc. Le virus croît dans la lignée cellulaire, le titre @ viral étant de 107,0.
EXEMPLE 2.-
On répète deux fois le procédé de l'exemple 1 en utilisant des souches différentes de virus de la fièvre aphteuse , Les souches utilisées sont (1) la souche RV 11 (type SAT 1 - virus modifié) qui a été transplantée 34 fois sur des souris adultes et 2 fois sur des souris non sevrées et (2) la souche RV 11 (virus du bétail) oui a été transplantée 25 fois sur du bétail (filtrat conservé). Les deux souches se développent dans les lignées de cellules et les titres
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viraux sont respectivement de 107,8 et de 106,5.
EXEMPLE 3.
Lorsque des cellules BHK 21 sont inoculées avec le virus HFEM de l'herpès simplex, puis incubées à 37 C dans le milieu décrit dans l'exemple 1, le virus accuse une croissance de plusieurs ordres de grandeurs en quelques jours en provoquant une dégénérescence si- multanée des cellules.
EXEMPLE 4.-
Des cellules BHK 21 en suspension dans un milieu de culture consistant en sérum physiologique de Hank, en hydrolysat de lactalbumine, en sérum humain (10%) et en sérum de veau (10%)sont mélangées avec la souche de T'ang (TESS) du virus de trachome égale- ment en suspension dans un milieu analogue, et le mélange 'est agité doucement pendant heure à 37 C, Les cellules sont séparées de la suspension par 10 minutes de centrifugation à 850 tours/minute, puis remises en suspension dans un milieu neuf, sédimentées sur un couvre-objet et incubées pendant 24 heures à 37 C. La croissance du virus peut être alors constatée.
EXEMPLE 5.-
Des cellules BHK 21 sont cultivées à monocouches dans des boites de Pétri dans le milieu décrit dans l'exemple 1. Lorsque la culture de cellules est devenue juste confluente et avant d'avoir atteint l'âge de 4 jours, le milieu est lavé avec du sérum normal qui ne contient pas de sérum animal. Le virus de la maladie de Newcastle adapté sur oeuf est inoculé en petites quantités aux monocouches lavées de cellules BHK 21, en accordant 30 minutes pour l'adsorption du virus et les cellules sont ensuite recouvertes de milieu nutritif.
L'incubation entre 35 et 38 C a pour effet une croissance du virus qui est comparable à sa croissance naturelle dans l'embryon de pou- let et la destruction de la monocouche dans les deux jours. L'effet est transmissible dans les cellules BHK 21.
EXEMPLE 6.-
En appliquant le procédé décrit dans l'exemple t à la
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culture du virus de la peste aviaire, une croissance importante du virus se produit et la monocouche de cellules BHK 21 est détruite.: L'effet est transmissible dans les cellules PHK 21.
EXEMPLE 7.-
Des cellules BHK 21 qu'on, a fait croître comme dans l'exem- ple 5 sont inoculées avec de petites doses de la souche neuropatho- ; gène (NWS) du virus A de la grippe. La couche de cellules est dé- truite et il se forme un virus NWS parfaitement infectieux. L'effet est transmissible dans les oréparations de cellules BHX 21.
EXEMPLE 8.-
On procède suivant l'exemple 5, mais les cellules BHK 21 sont infectées par de grosses quantités, par exemple 10 à 100 par- ticules par cellule, d'une souche non neuropathogène du virus A de la grippe. Après 18 heures d'incubation à 37 C, il se forme de grandes quantités d'hémagglutinine de virus non infectieux et de l'antigène soluble de virus qui sont intéressants pour l'immunisa- tion expérimentale et pour des tests sérologiques. Les cellules BHK .
21 sont détruites, mais l'effet ne peut être transmis d'une prépara- tion de cellules BHK 21 à une autre.
EXEMPLE 9 . -
Une souche de- cellules BHK 21 de même clone (clone n 13) qui a subi 110 oassages en monocouche est mise en suspension dans 200 cm3 d'un milieu de culture constitué par le milieu de base d'Eagle porté au double de la concentration normale en acides ami- nés et en vitamines et par 10% de sérum bovin passé au filtre de Seitz et par 10% de bouillon de tryptose phosphate, et contenant de la pénicilline (100 unités/cm3), de la streptomycine (100 unités/cm), de la mycostatine (25 unités/cm3) et de la néomycine (70 unités/cm3).
La suspension est introduite dans un récipient cylindrique en Pyrex d'un diamètre de 7,6 cm et d'une hauteur de 25,4. cm, comportant deux admissions en verre à l'extrémité supérieure.
On prépare une série de tels systèmes, chaque récipient étant agité par des barreaux magnétiques revêtus de Téflon entraînas
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à 335 tours/minute par des aimants extérieurs mus mécaniquement. Les récipients sont maintenus au bain-matie à 37 C. Ils sont bouchés à l'émeri après l'ensemencement et on faère pas.
Pour éviter l'agglomération des cellules et la croissance sur les parois des récipients, les cellules sont collectées toutes les 24 heures, remises en suspension dans un mélange versène-trypsine (0,01%) pendant 1 heure, puis introduites dans un milieu neuf. Après une période initiale, il se produit une croissance régulière et il se forme 2 - 3,6 x 108,0 cellules par 48 heures.
Une nouvelle propagation peut être exécutée dans des réci- pients de 5 litres munis de dispositifs de réglage du pli et d'aéra- tion, L'aération à l'aide d'un mélange air/C02 suffisante à mainte- nir le pH à 7,0 - 7,2 s'est avérée appropriée. En choisissant soi- gueusement les conditions de culture, la croissance du virus de la fièvre aphteuse et d'autres virus dans une culture de cellules en suspension est également possible.
EXEMPLE 10.-
Une culture en couche monocellulaire de 4 jours de la sou- che BHK 21 (clone 13) dans un flacon de Roux, à savoir environ 108 cellules, est inoculée avec 1,0 car d'une suspension de virus de la fièvre aphteuse du type SAT 2 ayant un titre ID50/cm3 chez la sou- ris de 107,0.. Après 1 heure d'absorption du virus à 37 C, la cultu- re est lavée 5fois avec du sérum physiologique tamponné au phospha- te, puis additionnée de 80 car de milieu d'Eagle modifié et de 10% de bouillon de tryptose phosphate. Après 22 heures d'incubation, le fluide est recueilli et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Au liquide surnageant, on ajoute un volume égal de glycérol et la préparation de vaccin est conservée à -20 C.
Les tata d'inocuité et de pouvoir immunogène du vaccin chez le bétail donnent des résultats comparables à ceux obtenus avec un vaccin de tissus de souris.
Des cellules BHK 21 sont déposées en Angleterre à la "Medical Research Council's Division or Immunological Products
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Contrôla Hampstead, Londres, et sont disponibles également au Wistar Institute, Philadelphie, Etats-Unis d'Amérique.
REVENDICATIONS.
1.- Utilisation de cellules de la lignée de fibrocytes de ; rein de jeunes hamsters dorés, appelée BHK 21, ou des mêmes cellules modifiées par le virus du polyome pour la culture de virus suscep- bibles de se multiplier dans les cellules.
2. - Procédé de culture d'un virus du groupe formé par le virus de la fièvre aphteuse, du virus de la maladie de Newcastle, du virus de la peste aviaire, d'arbovirus, du virus d'herpes simplex, du. virus du trachome et de virus de la grippe dans une culture tissu- laire, caractérisé en ce que les cellules-hôtes utilisées sont des cellules de la lignée de fibrocytes de rein de jeunes hamsters dorés, appelée BHK 21, ou des mêmes cellules modifiées par le virus du poly- ome.
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Virus culture.
The present invention relates to the culture of viruses, more particularly in cells of a tissue culture.
Virus culture is important both for vaccine production and for radical and veterinary research. The presence of living cells is essential for proliferation and viruses will generally multiply freely in cells of tissue culture. However, in large-scale virus cultures it is often difficult to deport the annealed amounts of appropriate live cells.
For example, foot-and-mouth disease virus is commonly cultivated for vaccine production in media consisting of tissue from pig or calf breasts. Since living cells only survive for a few generations, the process is laborious and requires
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constantly new tissue cultures from spawning kidneys. This is a disadvantage because of the variability of cultures from different animals and because of the risk of contamination by bacteria and viruses from the animals.
To replace spawning tissue cell preparations for virus culture, attempts have been made to establish cell lines which can be cultured and passaged to provide a standard source of cells suitable for virus growth. cell lines, but a satisfactory culture system for the reproduction of some viruses, eg, foot-and-mouth disease virus, is not available. The main difficulty lies in the fact that the cells often change character after a certain period of culture and become unsuitable * for the growth of viruses.
A new cell line has now been discovered which can be cultured and subcultured for many months without showing any noticeable change in character. In addition, the cells of this new line multiply faster than they usually do. other cells. It has also been discovered that the new cell line readily supports the growth of various viruses and, being capable of being continuously cultured and subcultured and stored, if necessary, at temperatures below 0 ° C, it provides a suitable source of cells for the growth. virus culture.
The new cell line is a kidney fibrocyte line from young golden hamsters and is called BHK 21. The cell idiogram appears to be the same as that found in primary hamster kidney cultures. The cells are fibroblastic and grow in a single cell layer with a marked tendency to orient themselves in parallel. The flowers grow rapidly and divide about every twelve hours, and these characteristics have been retained for several months in culture. This property distinguishes them from other cell lines.
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The new cell line was developed from a culture of young hamster kidney cells prepared as
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described by Stoker and Macpherson, Virology, .., pages 359-370. Batches of cells were propagated by trypsinizing the single cell layers before they became completely contluent and performing the repi ("u8f: e with one tenth or one twentieth of the cell suspension. This requires rewetting every 1 or 5 days. The culture medium used consists of 10 µl of unheated calf serum and 10 of tryptose phosphate broth autoclaved in Eagle's base medium at double. de la: normal concentration of amino acids and vitamins.
With one exception, the groups of cells stop growing afterwards;
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some subcultures, this exception being the BHK cell line; 21. This is from cultures of the original suspension of kidney cells stored in log growth for 30 days.
The cells are then treated with trypsin, put back in!
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suspension in medium containing 20 calf seruin and 5 glycerol and cooled to -70pC. After 6 days of storage at this temperature, the cells are isolated by heating them quickly
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at 37 ° C. The cells are then used for an additional 35 days, after which they grow rapidly and have an average doubling rate of 12 hours and a recoverability of 2 to 10%. Subsequently, the cells do not change character and retain their logarithmic growth rate.
It has also been found that the BHK 21 cell line is modified by the polyoma virus. The modified cells can. be obtained from cells of the BHK 21 line by inoculating them with the polyoma virus. A week later, it is possible to detect modified cells among normal cells and these cells
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modified are separated and purified by rep1cluay, e ..
The cells of the BHK 21 line and cells of this same line which have been modified by the action of the polyoma virus are cultured on a nutrient medium. The cultivation system includes
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therefore cells of this line in a suitable nutrient medium which usually contains amino acids, vitamins, carbohydrates and salts. In addition, antibiotics are advantageously added to prevent invasion of the culture by bacteria and fungi. It is convenient to use for this purpose Eagle's base medium supplemented with 10% tryptose phosphate (Difco) and 10% calf serum.
According to the present invention, in a method of culturing a virus, the virus is inoculated into a system comprising cells of the BHK 21 cell line or cells of the BHK 21 line modified by the action of the polyoma virus, and sufficient nutrients to keep cells alive for virus culture.
The cells can be cultured in any suitable manner in air containing 5% carbon dioxide, for example using stationary or rotating or shaking culture.
The nutrient medium used for the growth of certain viruses can advantageously be the same as that described above for the culture of the cell line. However, the satisfactory growth of other viruses may require a modified nutrient medium.
The invention is particularly applicable to the culture of viruses which are important in human and veterinary medicine. Thus, the foot-and-mouth disease virus, the trachoma virus and the herpes virus can be cultivated advantageously by the process of the invention, and the culture of the Newcastle disease virus and the fowl plague virus has also been carried out. , as well as influenza and arbovirus viruses, for example the dengue virus.
Cultivation of the FMD virus is especially important and it has now been shown that the large-scale production of vaccines against this disease using the suspension culture technique is practically feasible.
It is relatively easy for the virologist to establish
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Whether BHK 21 cells are suitable for a given virus. Using the culture conditions, eg, pH and temperature normally employed for the virus in other cell systems, the viability of the new cell line is readily determined some time after inoculation. which varies from virus to virus, by measuring virus yield and examining cells for the characteristic cytopathic effect which is indicative of virus growth; the cells round, become granular and break away from the glass surface on which they have formed a single layer.
The cells used for the purposes of the invention are preferably, but not necessarily, from the same clone.
In order to prepare the corresponding vaccines from the cultured viruses according to the invention, it is necessary to treat the viruses by known methods.
The following examples illustrate the invention.
EXAMPLE 1.-
BHK 21 cells in culture medium consisting of 10% unheated calf serum and 10% autoclaved tryptose phosphate broth, in Eagle's stock medium brought to double the normal concentration of amino acids and vitamins are inoculated with strain 997 (type C) of the! Foot-and-mouth disease after 204 passages in cultures of pig kidney cells. The virus grows in the cell line, the viral titer being 107.0.
EXAMPLE 2.-
The process of Example 1 is repeated twice using different strains of foot-and-mouth disease virus. The strains used are (1) strain RV 11 (type SAT 1 - modified virus) which was transplanted 34 times on adult mice and 2 times in unweaned mice and (2) strain RV 11 (cattle virus) yes was transplanted 25 times into cattle (retained filtrate). Both strains grow in cell lines and titers
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viral values are 107.8 and 106.5, respectively.
EXAMPLE 3.
When BHK 21 cells are inoculated with the HFEM herpes simplex virus, then incubated at 37 ° C. in the medium described in Example 1, the virus shows growth of several orders of magnitude in a few days, causing degeneration if - multiple cells.
EXAMPLE 4.-
BHK 21 cells suspended in a culture medium consisting of Hank's physiological serum, lactalbumin hydrolyzate, human serum (10%) and calf serum (10%) are mixed with the strain of T'ang (TESS ) trachoma virus also in suspension in a similar medium, and the mixture is stirred gently for hour at 37 ° C. The cells are separated from the suspension by 10 minutes of centrifugation at 850 rpm, then resuspended in fresh medium, sedimented on a coverslip and incubated for 24 hours at 37 ° C. Growth of the virus can then be observed.
EXAMPLE 5.-
BHK 21 cells are cultured as monolayers in Petri dishes in the medium described in Example 1. When the cell culture has become just confluent and before having reached the age of 4 days, the medium is washed with normal serum which does not contain animal serum. The adapted Newcastle disease virus in egg is inoculated in small amounts into the washed monolayers of BHK 21 cells, allowing 30 minutes for virus adsorption and the cells are then covered with nutrient medium.
Incubation between 35 and 38 C results in growth of the virus which is comparable to its natural growth in the chick embryo and destruction of the monolayer within two days. The effect is transmissible in BHK 21 cells.
EXAMPLE 6.-
By applying the method described in example t to
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culture of the fowl plague virus, significant growth of the virus occurs and the BHK 21 cell monolayer is destroyed .: The effect is transmissible in PHK 21 cells.
EXAMPLE 7.-
BHK 21 cells which were grown as in Example 5 are inoculated with small doses of the neuropatho- strain; influenza A gene (NWS). The cell layer is destroyed and a perfectly infectious NWS virus is formed. The effect is transmissible in BHX 21 cell preparations.
EXAMPLE 8.-
The procedure is according to Example 5, but the BHK 21 cells are infected with large amounts, for example 10 to 100 particles per cell, of a non-neuropathogenic strain of influenza A virus. After 18 hours of incubation at 37 ° C, large amounts of non-infectious virus hemagglutinin and soluble virus antigen are formed which are useful for experimental immunization and for serological testing. BHK cells.
21 are destroyed, but the effect cannot be transferred from one BHK 21 cell preparation to another.
EXAMPLE 9. -
A strain of BHK 21 cells of the same clone (clone n 13) which has undergone 110 massages in a monolayer is suspended in 200 cm3 of a culture medium consisting of Eagle's base medium brought to double the concentration. normal in amino acids and vitamins and by 10% bovine serum passed through the Seitz filter and by 10% tryptose phosphate broth, and containing penicillin (100 units / cm3), streptomycin (100 units / cm), mycostatin (25 units / cm3) and neomycin (70 units / cm3).
The suspension is placed in a cylindrical Pyrex container with a diameter of 7.6 cm and a height of 25.4. cm, with two glass inlets at the upper end.
A series of such systems are prepared, each container being stirred by magnetic bars coated with Teflon entrained
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at 335 revolutions / minute by mechanically driven external magnets. The receptacles are kept in a matie bath at 37 C. They are stoppered with emery after inoculation and they are not made.
To avoid cell agglomeration and growth on the walls of the vessels, the cells are collected every 24 hours, resuspended in a versen-trypsin (0.01%) mixture for 1 hour, then introduced into new medium. . After an initial period, steady growth occurs and 2 - 3.6 x 108.0 cells are formed per 48 hours.
Further propagation can be carried out in 5-liter containers fitted with fold adjustment and aeration devices. Aeration with an air / C02 mixture sufficient to maintain the pH at 7.0 - 7.2 has been found to be suitable. By carefully choosing the culture conditions, the growth of foot-and-mouth disease virus and other viruses in suspension cell culture is also possible.
EXAMPLE 10.-
A 4-day single-cell layer culture of strain BHK 21 (clone 13) in a Roux flask, i.e. about 108 cells, is inoculated with 1.0 car of a suspension of foot-and-mouth disease virus type SAT 2 having a titer ID50 / cm3 in mice of 107.0 .. After 1 hour of absorption of the virus at 37 C, the culture is washed 5 times with physiological saline buffered with phosphate, then added. 80 bc of modified Eagle's medium and 10% tryptose phosphate broth. After 22 hours of incubation, the fluid is collected and the cell debris is removed by centrifugation. To the supernatant liquid, an equal volume of glycerol is added and the vaccine preparation is stored at -20 ° C.
The safety and immunogenicity of the vaccine in cattle give results comparable to those obtained with a mouse tissue vaccine.
BHK 21 cells are deposited in England at the "Medical Research Council's Division or Immunological Products
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Controlled Hampstead, London, and are also available at the Wistar Institute, Philadelphia, USA.
CLAIMS.
1.- Use of cells of the fibrocyte line; kidney of young golden hamsters, called BHK 21, or the same cells modified by polyoma virus to cultivate viruses which are likely to multiply in cells.
2. - Method for culturing a virus of the group formed by the foot-and-mouth disease virus, Newcastle disease virus, fowl plague virus, arbovirus, herpes simplex virus,. trachoma virus and influenza virus in tissue culture, characterized in that the host cells used are cells of the kidney fibrocyte line of young golden hamsters, called BHK 21, or the same cells modified by polyoma virus.