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PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE PERMÉABILISATION DE
CELLULES VIVANTES objet de l'invention
Le transfert de matériel génétique nouveau ainsi que de protéines étrangères ou autres molécules ou macromolécules dans des cellules vivantes a gagné en importance depuis les derniers développements en biochimie et notamment en génétique.
La présente invention est relative à ce domaine et concerne plus particulièrement un procédé de perméabilisation des membranes de cellules vivantes ainsi qu'un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé.
Etat de la technique
Parmi les différentes méthodes destinées à rendre les membranes cellulaires perméables, de façon à permettre l'introduction de"corps étrangers"on connaît notamment les techniques de perméabilisation par chocs électriques, couramment dénommées"électroporation".
L'article"Enhancer-dependent expression of human immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation"de HUNTINGTON POTTER et al., Proc. Natl.
Acad. Sci-USA, Vol. 81, pages 7161-7165, Novembre 1984, mentionne l'utilisation d'impulsions de relativement faible intensité (de 1, 2 à 4 kV) pour rendre certaines cellules perméables à l'ADN cloné. En fait, une suspension de cellules et de ADN clone est soumise à une décharge électrique.
Par l'article"Electric shock-mediated transfection of cells", Biochem. J. (1988) 251, 427-434, de David J.
Winterbourne et al., il est connu d'appliquer des impulsions
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t relativement longues à une solution contenant les cellules à percer ainsi que de l'ADN à faire pénétrer dans lesdites cellules.
On y mentionne notamment des impulsions du type rectangulaire créant un champ électrique de l'ordre de 2,5 à 3 kV/cm. Il y a également été découvert une corrélation entre la durée des impulsions (100 s à 500 s) et l'efficacité de l'opération, l'ADN étant ainsi soumis à un mouvement d'électrophorèse.
Toutefois, l'application d'un champ électrique entraîne une dissipation d'énergie importante dans la solution qui a pour résultat une mortalité élevée des cellules.
L'article"High efficiency transformation of E. COLI by high voltage electroporation", Nucleic Acids Research (1988), volume 16, n 13,6127-6144, de William J. Dower et al. mentionne des essais faisant appel à une électroporation à l'aide d'impulsions de forte intensité mais de courte durée.
On y atteint des résultats satisfaisants avec des intensités allant jusqu'à 12,5 kV/cm et 16,7 kV/cm et une corrélation entre l'intensité et la durée des impulsions est également établie.
Bien que l'énergie dissipée dans la solution soit réduite, l'efficacité de l'opération est limitée par une mortalité des cellules dues à l'éclatement suite à des chocs électriques trop importants.
But de l'invention
La présente opération vise à fournir un procédé de perméabilisation des membranes cellulaires qui ne présente pas les inconvénients de l'état de la technique et qui permet d'améliorer le rendement des manipulations en augmentant le taux de cellules percées et/ou la survie des cellules et/ou l'entrée des molécules étrangères dans les cellules.
Un autre but de la présente invention consiste à fournir un dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé.
Eléments essentiels de l'invention
Conformément à la présente invention, on applique
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à une solution contenant les cellules à rendre perméables ainsi que les molécules destinées à être logées à l'intérieur des cellules, successivement au moins une décharge électrique de haut voltage et de courte durée et ensuite au moins une décharge électrique de bas voltage et de plus longue durée.
On a constaté que cette façon de procéder permet de réduire le taux de mortalité des cellules tout en augmentant le taux de pénétration de celles-ci.
Il est bien entendu que les deux étapes de l'inven- tion doivent se suivre d'un laps de temps très court. En effet, plus le laps de temps séparant les deux étapes est important, plus le taux de mortalité des cellules est élevé déjà à la suite de la première étape. On a constaté qu'un temps d'environ 30 s constitue un seuil à ne pas dépasser.
Avantageusement, la décharge de haut voltage et de courte durée consiste en une impulsion à décroissance exponentielle, notamment obtenue par la décharge d'un condensateur.
Les amplitudes peuvent atteindre 400 à 20.000 V/cm en fonction de la durée de l'impulsion et du type de cellules à traiter, la durée étant de l'ordre d'l s à 1 ms.
Par ailleurs, la décharge de bas voltage peut avantageusement consister en une tension essentiellement continue, par exemple fournie par une alimentation stabilisée, de l'ordre de 10 à 400 V/cm, en fonction de la durée de l'impulsion et du type de cellules à traiter, appliquée pendant un temps cumulé de l'ordre de 1 à 100 ms.
Selon une autre variante, on peut, dans certains cas d'application, préférer une impulsion courte de forte intensité du type rectangulaire, l'impulsion à basse tension étant éventuellement une impulsion à décroissance exponentielle.
Selon une forme d'exécution préférée, la première décharge et/ou la-seconde décharge peut consister en un train d'ondes. Dans ce cas, on peut encore prévoir de permuter la polarité de la différence de potentiel aux bornes de la solution au cours de la décharge.
Pour ce qui concerne la décharge de haut voltage,
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un effet de résonance dû à l'inversion de la polarité peut augmenter la création de pores dans la paroi cellulaire.
D'autre part, l'inversion de polarité lors de la décharge à bas voltage peut provoquer des mouvements de vaet-vient de la molécule, par exemple l'ADN, à introduire dans les cellules ; ce qui augmente les chances de pénétration dans la cellule.
Le procédé de la présente invention permet de percer des parois cellulaires que l'on n'était pas encore arrivé à pénétrer jusqu'à présent. Des expériences sur lymphocytes humains et sur certaines souches de levure ont été particulièrement concluantes.
Dans la mesure où la durée de vie des cellules dans le milieu considéré le permet, on peut encore augmenter le taux de pénétration en effectuant successivement plusieurs démarches conformes à l'invention.
Le dispositif qui permet la mise en oeuvre du procédé de l'invention comporte au moins un condensateur associé à un circuit de charge et une alimentation stabilisée, la tension dégagée par l'un et l'autre étant alternativement mise aux bornes d'électrodes adaptées à une cuvette destinée à contenir la solution.
Avantageusement, la tension maximum et la constante de temps de la décharge du condensateur sont programmables.
On comprend aisément que l'appareil conforme à l'invention est moins onéreux et de conception plus simple que les appareils de l'état de la technique.
En effet, on évite, conformément à l'invention, d'agencer plusieurs condensateurs destinés à être déchargés successivement ; ce qui en réduit le coût, simplifie le câblage et la commande. En outre, le poids et l'encombrement en sont réduits ; ce qui est toujours bien venu dans un laboratoire devant notamment fonctionner dans des conditions stériles.
La combinaison décharge de condensateur/alimentation stabilisée permet en outre d'éviter les pertes de temps entre deux décharges capacitives, dues à la charge des condensateurs ; ce qui est bénéfique pour la survie des
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cellules.
Avantageusement, le dispositif de l'invention peut être équipé d'une résistance de shuntage visant à réduire la dissipation d'énergie dans le milieu.
Le procédé ainsi que le dispositif de l'invention conviennent particulièrement bien pour la perméabilisation de parois cellulaires afin d'y introduire des molécules telles que l'ADN, des protéines, des anticorps, des drogues ou autres produits chimiques.
Une autre application réside dans l'extraction de molécules, notamment de l'ADN, de cellules rendues perméables. Cette technique permet notamment d'obtenir de l'ADN "propre", n'exigeant quasiment plus d'étape de purification ultérieure.
On peut encore trouver une application du procédé de l'invention dans la modification de cellules et éventuellement dans la fusion de celles-ci.
L'invention est décrite plus en détail ci-dessous à l'aide d'exemples d'exécution.
Exemple 1.
Perméabilisation de cellules de la lignée GH (GC, GH3b6, GH4,...)
On prépare les cellules comme pour une électroporation classique. On les concentre à 4 millions de cellules/800 gl, dans le milieu de culture habituel de ces cellules. On ajoute l'ADN, de 3 Mg à 50 pg suivant le plasmide ou le fragment d'ADN utilisé. On dépose 800 cl du mélange dans une cuvette d'électroporation classique de 4 mm. On applique une première décharge de 750 V (1875 V/cm), avec une résistance de shuntage de 74 n et un condensateur de 40 MF. On applique ensuite, une seconde décharge de 100 V (250 V/cm) avec une résistance de shuntage de 74 n et un condensateur de 1800 MF.
Les cellules sont ensuite transvasées dans du milieu de culture frais, endéans les 30 s. Par la méthode de mesure enzymatique"CAT", on obtient une réponse 10 fois supérieure par rapport à l'état de la technique.
Exemple 2 Perméabilisation de levures
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On procède de façon analogue à l'exemple l en utilisant les paramètres suivants : - première décharge : 750 V à 1500 V suivant la souche shunt 74 n condensateur 40 MF cuvettes de 2 mm - deuxième décharge : 100 V shunt 74 n condensateur 1800 MF
On obtient 103 à 107 transformants/jng ADN, c'est-à- dire 10 à 20 fois plus que selon l'état de la technique.
Exemple 3 Perméabilisation de bactéries
On procède de manière analogue avec les paramètres suivants : - première décharge : voltage de 2000 à 2500 V shunt de 74 n condensateur de 40 F cuvettes de 2 mm - deuxième, décharge : voltage de 100 V shunt de 74 n condensateur de 1800 F
Dans le cas de bactéries gram-, on obtient 106 à 10ll transformants/jng ADN, c'est-à-dire jusqu'à 10 fois plus que selon l'état de la technique.
Dans le cas des bactéries gram +, on obtient 104 à 107 transformants/jng ADN, c'est-à-dire jusqu'à 100 fois plus.
Exemple 4 Perméabilisation de protoplastes
On procède de façon analogue aux exemples précédents avec les paramètres suivants : - première décharge : voltage de 150 à 250 V shunt de 74 n condensateur de 40 F cuvettes de 4 mm - deuxième décharge : voltage de 50 à 100 V shunt de 74 n condensateur de 1800 F
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On obtient 101 à 103 transformants/g ADN.
Le dispositif de l'invention représenté à la figure 1 comporte un condensateur 1 associé à un circuit de charge 3 et une alimentation stabilisée 5. La tension aux bornes du condensateur 1 et de l'alimentation stabilisée 5 est appliquée à la cuvette d'essai 7. Des résistances de shuntage 9 sont prévues en parallèle sur le condensateur 1. L'alimentation stabilisée 5 ainsi que le circuit de charge 3 du condensateur sont commandés par un circuit de régulation Il qui permet de programmer la constante de temps de la décharge et la tension maximum.
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METHOD AND APPARATUS FOR PERMEABILITY OF
LIVING CELLS object of the invention
The transfer of new genetic material as well as foreign proteins or other molecules or macromolecules into living cells has gained importance since the last developments in biochemistry and in particular in genetics.
The present invention relates to this field and relates more particularly to a process for permeabilization of living cell membranes as well as to a device for implementing this process.
State of the art
Among the various methods intended to make cell membranes permeable, so as to allow the introduction of "foreign bodies", techniques are known in particular for permeabilization by electric shock, commonly called "electroporation".
The article "Enhancer-dependent expression of human immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation" by HUNTINGTON POTTER et al., Proc. Natl.
Acad. Sci-USA, Vol. 81, pages 7161-7165, November 1984, mentions the use of relatively low intensity pulses (1, 2 to 4 kV) to make certain cells permeable to cloned DNA. In fact, a suspension of cloned cells and DNA is subjected to an electric shock.
By the article "Electric shock-mediated transfection of cells", Biochem. J. (1988) 251, 427-434, by David J.
Winterbourne et al., It is known to apply pulses
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t relatively long in a solution containing the cells to be pierced as well as DNA to be made to penetrate said cells.
Mention is made in particular of pulses of the rectangular type creating an electric field of the order of 2.5 to 3 kV / cm. There was also discovered a correlation between the duration of the pulses (100 s to 500 s) and the efficiency of the operation, the DNA being thus subjected to an electrophoresis movement.
However, the application of an electric field results in significant energy dissipation in the solution which results in high cell mortality.
The article "High efficiency transformation of E. COLI by high voltage electroporation", Nucleic Acids Research (1988), volume 16, n 13,6127-6144, by William J. Dower et al. mentions tests using electroporation using high intensity but short duration pulses.
Satisfactory results are achieved with intensities up to 12.5 kV / cm and 16.7 kV / cm and a correlation between the intensity and duration of the pulses is also established.
Although the energy dissipated in the solution is reduced, the efficiency of the operation is limited by the mortality of the cells due to bursting following excessive electrical shocks.
Purpose of the invention
The present operation aims to provide a process for permeabilization of cell membranes which does not have the drawbacks of the state of the art and which makes it possible to improve the performance of manipulations by increasing the rate of pierced cells and / or cell survival. and / or the entry of foreign molecules into cells.
Another object of the present invention consists in providing a device allowing the implementation of the method.
Essential elements of the invention
In accordance with the present invention,
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to a solution containing the cells to be made permeable as well as the molecules intended to be housed inside the cells, successively at least one high voltage and short duration electrical discharge and then at least one low voltage electrical discharge and more long duration.
It has been found that this procedure makes it possible to reduce the mortality rate of the cells while increasing the penetration rate of the latter.
It is understood that the two stages of the invention must be followed by a very short period of time. In fact, the greater the time separating the two stages, the higher the mortality rate of the cells already following the first stage. It has been found that a time of around 30 s constitutes a threshold not to be exceeded.
Advantageously, the high voltage and short duration discharge consists of an exponentially decreasing pulse, in particular obtained by the discharge of a capacitor.
The amplitudes can reach 400 to 20,000 V / cm depending on the duration of the pulse and the type of cells to be treated, the duration being of the order of 1 s to 1 ms.
Furthermore, the low-voltage discharge can advantageously consist of an essentially continuous voltage, for example supplied by a stabilized supply, of the order of 10 to 400 V / cm, depending on the duration of the pulse and the type of cells to be treated, applied for a cumulative time of the order of 1 to 100 ms.
According to another variant, it is possible, in certain application cases, to prefer a short high-intensity pulse of the rectangular type, the low-voltage pulse possibly being an exponentially decreasing pulse.
According to a preferred embodiment, the first discharge and / or the second discharge may consist of a train of waves. In this case, provision can also be made to swap the polarity of the potential difference across the solution during the discharge.
Regarding the high voltage discharge,
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a resonance effect due to reverse polarity can increase the creation of pores in the cell wall.
On the other hand, the reversal of polarity during low voltage discharge can cause back and forth movements of the molecule, for example DNA, to be introduced into cells; which increases the chances of penetration into the cell.
The process of the present invention makes it possible to pierce cell walls which we had not yet managed to penetrate until now. Experiments on human lymphocytes and certain strains of yeast have been particularly successful.
Insofar as the lifetime of the cells in the medium allows, the penetration rate can be further increased by successively carrying out several steps in accordance with the invention.
The device which allows the implementation of the method of the invention comprises at least one capacitor associated with a charging circuit and a stabilized supply, the voltage released by one and the other being alternately placed at the terminals of suitable electrodes to a bowl intended to contain the solution.
Advantageously, the maximum voltage and the time constant of the discharge of the capacitor are programmable.
It is easily understood that the device according to the invention is less expensive and simpler in design than the devices of the prior art.
Indeed, in accordance with the invention, it is avoided to arrange several capacitors intended to be discharged successively; which reduces the cost, simplifies wiring and control. In addition, the weight and size are reduced; which is always welcome in a laboratory which must in particular operate under sterile conditions.
The combination of capacitor discharge / stabilized supply also makes it possible to avoid time losses between two capacitive discharges, due to the charge of the capacitors; which is beneficial for the survival of
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cells.
Advantageously, the device of the invention can be equipped with a shunt resistor aimed at reducing the dissipation of energy in the medium.
The method and the device of the invention are particularly suitable for permeabilization of cell walls in order to introduce molecules such as DNA, proteins, antibodies, drugs or other chemicals.
Another application lies in the extraction of molecules, in particular DNA, from cells made permeable. This technique allows in particular to obtain "clean" DNA, requiring almost no further purification step.
An application of the method of the invention can also be found in the modification of cells and possibly in the fusion of these.
The invention is described in more detail below with the aid of working examples.
Example 1.
Permeabilization of cells of the GH line (GC, GH3b6, GH4, ...)
The cells are prepared as for a conventional electroporation. They are concentrated at 4 million cells / 800 gl, in the usual culture medium for these cells. DNA is added, from 3 Mg to 50 μg depending on the plasmid or the DNA fragment used. 800 cl of the mixture are placed in a conventional 4 mm electroporation cuvette. A first discharge of 750 V (1875 V / cm) is applied, with a shunt resistance of 74 n and a capacitor of 40 MF. Then apply a second discharge of 100 V (250 V / cm) with a shunt resistance of 74 n and a capacitor of 1800 MF.
The cells are then transferred to fresh culture medium, within 30 s. By the enzymatic measurement method "CAT", one obtains a response 10 times superior compared to the state of the art.
Example 2 Permeabilization of Yeasts
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The procedure is analogous to Example l using the following parameters: - first discharge: 750 V to 1500 V according to the shunt 74 n strain 40 MF capacitor 2 mm cuvettes - second discharge: 100 V shunt 74 n 1800 MF capacitor
103 to 107 transformants / dng DNA are obtained, that is to say 10 to 20 times more than according to the state of the art.
EXAMPLE 3 Permeabilization of Bacteria
We proceed in an analogous manner with the following parameters: - first discharge: voltage from 2000 to 2500 V shunt of 74 n capacitor of 40 F 2 mm cuvettes - second, discharge: voltage of 100 V shunt of 74 n capacitor of 1800 F
In the case of gram- bacteria, 106 to 10 μl transformants / jng DNA are obtained, that is to say up to 10 times more than according to the state of the art.
In the case of gram + bacteria, 104 to 107 transformants / jng DNA are obtained, that is to say up to 100 times more.
Example 4 Permeabilization of Protoplasts
We proceed in a similar way to the previous examples with the following parameters: - first discharge: voltage from 150 to 250 V shunt of 74 n capacitor of 40 F 4 mm cuvettes - second discharge: voltage of 50 to 100 V shunt of 74 n capacitor from 1800 F
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101 to 103 transformants / g DNA are obtained.
The device of the invention shown in FIG. 1 comprises a capacitor 1 associated with a charging circuit 3 and a stabilized supply 5. The voltage across the terminals of the capacitor 1 and of the stabilized supply 5 is applied to the test cell 7. Shunt resistors 9 are provided in parallel on the capacitor 1. The stabilized power supply 5 as well as the charging circuit 3 of the capacitor are controlled by a regulation circuit II which makes it possible to program the time constant of the discharge and the maximum voltage.