AT505946B1 - Zellapherese - Google Patents

Description

tarssÄiies patemt AT505 946 B1 2009-08-15

Beschreibung [0001] Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum kontinuierlich durchführbaren, spezifischen Isolieren von Blutzellen, aufweisend: [0002] - ein extrakorporales kontinuierliches Zellseparationsgerät zur Auftrennung von Blut in Fraktionen mit einer Separationseinrichtung, einer Sammeleinrichtung für zumindest eine abzutrennende Leukozytenfraktion und einer Rückführeinrichtung für nicht abzutrennende Fraktionen, [0003] - einen extrakorporalen Blutkreislauf mit einem Blutzulauf zur Separationseinrichtung des Zellseparationsgeräts für kontinuierlich zugeführtes Blut, und einem Blutablauf ausgehend von der Rückführeinrichtung für nicht abzutrennende, kontinuierlich zurückzuführende Fraktionen, [0004] - eine Leukozyten-Fraktionsleitung, welche sich ausgehend von der Sammeleinrichtung des Zellseparationsgerätes in die Rückführeinrichtung erstreckt, und von der Leukozytenfraktion kontinuierlich durchfließbar ist, und die Leukozytenfraktion weiters kontinuierlich gemeinsam mit den nicht abzutrennenden Fraktionen über den Blutablauf rückführbar ist, und wobei in der Leukozyten-Fraktionsleitung zumindest eine Zellisolationseinrichtung angeordnet ist, und die Zellisolationseinrichtung auf einer Abtrennung spezifisch zellbindender Magnetpartikel durch ein Magnetfeld beruht und weiters dazu eingerichtet ist, Blutzellen kontinuierlich und spezifisch auf Grundlage biomolekularer Wechselwirkungen aus der Leukozytenfraktion abzutrennen und abzuführen.

[0005] Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zum kontinuierlichen, spezifischen Isolieren von Blutzellen mittels einer Vorrichtung zum kontinuierlich durchführbaren, spezifischen Isolieren von Blutzellen, die folgenden Schritte aufweisend: [0006] - Auftrennung von Blutbestandteilen von mittels eines Blutzulaufs kontinuierlich zugeführtem Blut in Fraktionen in einer Separationseinheit einer extrakorporalen, kontinuierlichen Zellseparationseinrichtung; [0007] - Sammeln zumindest einer abzutrennenden Leukozytenfraktion in einer Sammeleinrichtung der Zellseparationseinrichtung, Entnehmen aus der Sammeleinrichtung und spezifisches Abtrennen darin befindlicher Blutzellen auf Grundlage biomolekularer Wechselwirkungen; [0008] - Zuführen nicht abzutrennender Fraktionen in eine Rückführeinrichtung; und [0009] - kontinuierliches Rückführen der nicht abzutrennenden Fraktionen mittels eines von der Rückführeinrichtung abgehenden Blutablaufs, [0010] - kontinuierliches Zuführen der Leukozytenfraktion aus der Sammeleinrichtung in eine Leukozyten-Fraktionsleitung, wobei die Leukozytenfraktion die Fraktionsleitung kontinuierlich durchfließt; [0011] - spezifisches Abtrennen von Blutzellen aus der Leukozytenfraktion auf Grundlage biomolekularer Wechselwirkungen mittels zumindest einer in der Fraktionsleitung befindlichen Zellisolationseinrichtung, welche auf einer Abtrennung spezifisch Zell-bindender Magnetpartikel durch ein Magnetfeld beruht; und [0012] - Leiten der Leukozytenfraktion aus der Fraktionsleitung in die Rückführeinrichtung, wobei die Leukozytenfraktion gemeinsam mit den nicht-abzutrennenden Fraktionen kontinuierlich über den Blutablauf rückgeführt wird.

[0013] Aphereseverfahren sind extrakorporal durchgeführte Verfahren, bei welchen pathophy-siologisch relevante Blut- und Plasmakomponenten, beispielsweise Biomoleküle wie (Gly-ko)Proteine, Peptide, Lipide, Lipoproteine und Lipopolysaccharide aber auch Blutzellen und 1 /23 &t£S!®Cilsl5Che AT505 946B1 2009-08-15

Blutplasma entfernt werden. Aphereseverfahren können einerseits zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken eingesetzt werden, andererseits stellen sie auch eine sehr effektive Möglichkeit dar, bestimmte Blutbestandteile von gesunden Individuen in ausreichender Menge und in ausreichend hoher Reinheit zu gewinnen. Dies betrifft insbesondere die Gewinnung von Blutplasma (und darin enthaltenen Komponenten) und Blutzellen wie Erythrozyten, Thrombozyten, Leukozyten oder Stammzellen sowie Subpopulationen davon.

[0014] Große Bedeutung wird der therapeutischen Apherese zugemessen, da diese bei bestimmten Indikationen oft eine sehr wirkungsvolle und gleichzeitig nebenwirkungsarme Alternative zur medikamentösen Behandlung ist.

[0015] So kann bei Plasmaphereseverfahren das Plasma entweder vollständig abgetrennt und durch eine Substitutionslösung ersetzt werden, oder es werden nur bestimmte Bestandteile wie LDL, Endotoxine oder Immunglobuline daraus entfernt und das Plasma anschließend in den Spender/Patienten wieder zurückgeführt. Etablierte Methoden betreffen vor allem die Entfernung von IgG-Molekülen, die aufgrund der spezifischen Affinität ihrer Fc-Einheit zu Protein A -ein Zellwandprotein aus Staphylococcus aureus - mittels Protein A-beschichteten Adsorbersäulen (z.B. Immunosorba®, Fresenius Medical Care) aus dem Blut abgereichert werden. Indikationen für diese Therapieform, auch Immunapherese genannt - sind vor allem Autoimmunerkrankungen wie z.B. rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes oder Pemphigus vulgaris. Routinemäßig eingesetzt wird auch die Abreicherung des LDL-Cholesterins durch LDL-Apherese, bei welchem das Blut extrakorporal durch einen spezifischen Immunadsorber (z.B. DALI® von Fresenius AG; LDL-Therasorb® von Therasorb GmbH) oder ein Filter geleitet wird.

[0016] Vor allem, aber nicht allein durch die Entwicklung der Stammzelltechnologie gewinnt die Zellapherese, d.h. die Isolierung von Zellen oder Zellpopulationen aus Blut, zunehmend an Bedeutung und ist besonders in Hinblick auf therapeutische und diagnostische Einsatzgebiete aber auch zu Spendezwecken ins Zentrum des Interesses gerückt. Zellen können dabei spezifisch oder unspezifisch aus Blut abgetrennt werden.

[0017] Bei Spender-Zellapheresen werden in erster Linie Thrombozytenpräparate (z.B. für Krebspatienten) aber auch bestimmte weiße Blutkörperchen wie Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten sowie Stammzellen, Vorläuferzellen und Multikomponentenpräparate gewonnen. Die von gesunden Spendern gesammelten Produkte kommen vornehmlich in der Krebstherapie oder der regenerativen Medizin zur Anwendung.

[0018] Bei therapeutischen Zellapheresen werden bestimmte pathophysiologisch relevante Zellen extrakorporal zu Zwecken der Behandlung aus dem Blut entfernt. Beispiele hiezu sind im Folgenden angeführt: [0019] Bei der Erythrozytenapherese kann die Zahl überproduzierter roter Blutkörperchen gesenkt werden (z.B. Hämochromatose) bzw. können erkrankte rote Blutkörperchen durch gesunde Zellen ersetzt werden (z.B. bei Sichelzellenanämie, ABO-inkompatiblen Knochenmarkstransplantationen oder Malaria).

[0020] Eine Thrombozytenapherese zur Senkung der Thrombozytenanzahl im Blut wird bei bestimmten Leukämieformen angewendet.

[0021] Eine besondere Bedeutung kommt der Leukozytenapherese (auch Leukapherese, LCAP) zu. Die Entfernung der Leukozyten kann spezifisch oder unspezifisch erfolgen. Beispielsweise kann bei Patienten mit akuter Leukämie der Überschuss an Leukozyten schnell und problemlos entfernt werden. Als weitere wichtige Indikationsgebiete sind die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa und die Gelenksentzündung rheumatoide Arthritis anzuführen, bei welchen vor allem selektiv Granulozyten und Monozyten (Granulozyten-Apherese), z.B. mittels Elutriation oder Zellulose-Acetat-Säulen (Adacolumn™ -Otsuka Pharma), aus dem Blut entfernt werden. Besonders bei Patienten, die auf die zur Verfügung stehenden medikamentösen Therapien, z.B. mit Azathioprin, nicht ansprechen, konnten 2/23 teHÄsche AT505 946B1 2009-08-15 gute therapeutische Erfolge erzielt werden. Monozyten, die mittels Leukapherese gewonnen werden, werden in den letzten Jahren vermehrt zu dendritischen Zellen ausgereift, welche nach Beladung mit antigenem Material als neuartige Tumorvakzine zur Anwendung kommen können.

[0022] Nicht zuletzt können mit Apherese nach Verabreichung von Wachstumsfaktoren große Mengen an Stammzellen und Stammzellen-Vorläuferzellen eines Patienten oder Spenders für autologe bzw. allogene Transplantationen gewonnen werden. Für therapeutische Zwecke werden, ausgehend von einem in einem ersten Separationsschritt erhaltenen Leukozytenaphere-sepräparat, welches auch Stammzellen und Vorläuferzellen enthält, vor allem CD34+-periphere Blutstammzellen durch einen zweiten Aufreinigungsschritt mit spezifischen Säulen- oder Magnetpartikel-gebundenen Antikörpern gewonnen. Nach erfolgter Chemotherapie, bei welcher das Immunsystem des Patienten quasi ausgelöscht wird, werden die Stammzellen dem Patienten transplantiert. Mit einigen kommerziell erhältlichen Zellseparatoren können auch auf physikalischem Wege Stammzellen angereichert werden. Allerdings enthalten solche Leukapheresepro-dukte neben den Stammzellen auch andere Zellen, die bei der Anwendung des Produkts stören können (z.B. allogene Transplantationen).

[0023] Ein weiteres Anwendungsgebiet der Leukozytenapherese ist der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen, welche ebenfalls durch einen zweiten spezifischen Aufreinungsschritt erhalten werden können.

[0024] Aufgrund fortschreitender Forschungserkenntnisse betreffend die Funktion und pa-thophysiologischer Relevanz spezifischer Blutzellen und deren Subpopulationen sowie im Sinne der Erhaltung der Selbstregulation des lebenden Organismus ist eine Isolierung einer spezifischen homogenen Zellpopulation einer unspezifischen Isolierung einer inhomogenen Zellpopulation vorzuziehen. Dieser Ansatz ermöglicht eine zielgerichtete und personalisierte Therapie bzw. eine Separation einer spezifischen Zellpopulation zu therapeutischen, diagnostischen und forschungsbezogenen Zwecken.

[0025] Die spezifische Isolierung von Blutzellen erfolgt wie oben bereits kurz angeschnitten vorwiegend in einem 2-Schritt-Verfahren. In einem ersten kontinuierlich durchführbaren Schritt wird Blut eines Spenders/Patienten aus einer Armvene entnommen und nach Zugabe eines Antiko-agulans (z.B. Heparin) in ein kontinuierliches extrakorporales Zellseparationsgerät geleitet. Leukozyten/Stammzellen werden auf Grundlage ihrer physikalischen Eigenschaften (z.B. Dichte, Sedimentationsgeschwindigkeit, Zellgröße) selektiv, aber unspezifisch aus dem Vollblut aufkonzentriert (Leukozytenpräparat). Das Leukozytenpräparat enthält auch die begehrten Stammzellen und Vorläuferzellen. Plättchenreiches Plasma und die Erythrozytenfraktion werden wieder über den extrakorporalen Blutkreislauf in den Spender/Patienten rückgeführt. Aus dem Leukozytenpräparat werden in einem zweiten spezifischen Schritt Zellsubpopulationen isoliert, welche letztendlich für therapeutische, diagnostische oder forschungsbezogene Zwecke verwendet werden können. Die restlichen Leukozyten werden verworfen, da sie aus Sterilitätsgründen nicht mehr in den Spender/Patienten rückgeführt werden können.

[0026] An solche Verfahren und Geräte werden sehr hohe Maßstäbe gesetzt. Einerseits bestehen hohe Anforderung an die Reinheit und Flomogenität der damit gewonnen Zellprodukte, andererseits sollen die Geräte hocheffizient arbeiten, sodass die erforderlichen Mengen für eine klinische Anwendung gewonnen werden können. Weiters gilt es, den aseptischen Anforderungen gerecht zu werden.

[0027] Aus dem Stand der Technik sind verschiedene kontinuierlich betriebene, extrakorporale Zellseparationsgeräte und Verfahren zur Herstellung einer Leukozytenfraktion bekannt. Die meisten Vorrichtungen basieren auf dem Prinzip der Zentrifugation. Beschreibungen zu solchen Geräten finden sich beispielsweise in der US 3489145, der US 3655123 und einer Fachpublikation von Sugai, M. [Sugar M. (2003). Fresenius AS.TEC204 Blood Cell Separator.Ther Apher & Dial 7:37-43]. Als Anbieter/Hersteller handelsüblicher Zellseparationsgeräte zur Herstellung von Leukozytenpräparaten sind Gambro (Cobe Spectra), Fresenius (AS-TEC 204, COM-TEC), 3/23 ävEe??csdiSihts patesrat AT505 946B1 2009-08-15

Baxter (Fenwal) oder Heamonetics (Haemonetics) anzuführen. Die WO 2005/032565 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Leukozytenbank für autologe Transplantationen. Andere kontinuierlich betriebene Zellseparationsgeräte, wie in der WO 2007/055785 oder der EP 1 375 006 beschrieben, basieren auf dem Prinzip der Elutriation, bei welcher die Zellen auf Grundlage ihrer Sedimentationsgeschwindigkeit, welche von der Zellgröße und weniger von der Zelldichte abhängig ist, abgetrennt werden. Ein handelsübliches Gerät speziell zur Monozytenanreicherung ist der Elutra™ - cell Separator von Gambro BCT, dessen Aufbau und Anwendung in einer Publikation von Berger et al. [Berger et al (2005). J Immunol Meth 298:61-72] beschrieben ist. Andere Zellseparatoren arbeiten auf Basis von Filtern.

[0028] Mit einigen der oben angeführten Zellseparatoren ist es auch möglich, Leukozytenfraktionen, die mit einer speziellen Art von Leukozyten- oder Stammzellen angereichert sind, zu erhalten. Die Anreicherung erfolgt aber nur aufgrund der physikalischen Eigenschaften der Zellen. Eine spezifische Abtrennung, z.B. Abtrennung spezifischer zirkulierender Tumorzellen oder einer bestimmten T-Zell-Subpopulation, ist nicht möglich.

[0029] Der zweite Schritt, bei welchem Zellen spezifisch aus dem mittels Zellseparator erhaltenen Leukozytenpräparat abgetrennt werden, erfolgt üblicherweise entweder mit Adsorbermatrices (z.B. Adsorbersäulen) oder mit immununomagnetischen Trennverfahren. Dieser Schritt nutzt spezifische biomolekulare Wechselwirkungen zwischen den zu isolierenden Zellen und funktionellen Einheiten auf der Adsorbermatrix oder der Magnetpartikeloberfläche aus.

[0030] Für Adsorbersäulenmatrices werden im Allgemeinen sehr hydrophile Polymere bzw. Oberflächen benutzt, wie z.B. Hydrogele, Cryogele, welche mit spezifischen Funktionalitäten (z.B. Antikörper, Liganden) funktionalisiert werden können. Diese Polymere zeichnen sich durch eine hohe Biokompatibilität aus. Affinitäts-Cryogele zur spezifischen Abtrennung von Zellen sind sind z.B. aus der WO 2006/121396 und der Fachliteratur bekannt [Kumar A et al. (2003) J Immunol Methods 283:185-194; Kumar A et al. (2005) J Mol Recognit 18:84-93; Dainiak et al. (2006). Journal of Chromatography A1123:145-150].

[0031] Im Rahmen des EU-Projektes "Ovarian Cancer - Diagnosis of a Silent Killer (OVCAD)", werden, unter Beteiligung des Anmelders bzw. der Erfinder, Adsorbermatrices verwendet, die mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenrezeptoren Her2, EGFR oder EpCAM funktionalisiert sind. Zirkulierende Tumorzellen können spezifisch an solche Matrices binden.

[0032] Die Zellabtrennung mittels funktionalisierten Magnetpartikeln ist beispielsweise aus der WO 01/06254, der US 6,190,870, der EP 1262 776 A2 und der US 5,541,072 bekannt. Die Isolierung von Vorläuferzellen aus Leukapheresepräparaten unter Anwendung eines immunmagnetischen Separationsverfahrens wird in einer Publikation von Jing et al. beschrieben [Jing et al. (2006). Biotechnology and Bioengineering 96:1139-1154], Zur klinischen Anreicherung von Blutstammzellen aus Leukozytenpräparaten oder Knochenmark hat sich das automatisierte Zellsortierungsgerät cliniMACS der Firma Miltenyi Biotec etabliert. Ein weiterer magnetischer Zellseparator (Isolex 300i) wird von der Firma Baxter angeboten.

[0033] Der Nachteil des oben beschriebenen 2-Schritt-Verfahrens liegt darin, dass es bislang nicht automatisiert und kontinuierlich durchgeführt werden kann. Zwar läuft der erste Schritt -die Herstellung eines Leukozytenpräparates mittels extrakorporalen Zellseparator - kontinuierlich ab, der zweite Schritt - die spezifische Abtrennung der isolierten Zellen - erfolgt jedoch diskontinuierlich. Das gewonnene Leukozytenpräparat wird batch-weise in eine weitere Vorrichtung transferiert, in welcher der spezifische Abtrennungsschritt erfolgt. Dies bringt den Nachteil mit sich, dass das Verfahren aufgrund der batch-weisen Verarbeitung des Leukozytenpräparates aufwändig und mühselig ist. Weiters ist es nicht möglich, das Gesamtblut eines Spen-ders/Patienten in einem Arbeitsschritt zu prozessieren. Nachteilig ist der Verfahrensablauf auch in Hinblick auf die Sterilität, da die beiden Abtrennungsschritte bislang nicht in einer in sich geschlossenen Vorrichtung und nicht in einem Arbeitsschritt durchgeführt werden. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens ist die Tatsache, dass die gesammelten Leukozyten nach dem spezifi- 4/23 te'iKäiiSd'ES patenuimt AT505 946 B1 2009-08-15 sehen Abtrennungsschritt aus Sterilitätsgründen nicht mehr in den Spender/Patienten zurückgeführt werden. Die entnommenen Leukozyten werden vom Organismus zwar relativ schnell nachproduziert und sind für einen gesunden Blutspender wenig belastend, dennoch können aus gesundheitlichen Gründen nicht übermäßig große Mengen an Leukozyten abgetrennt werden. Wie bereits erwähnt liegt ein weiterer großer Nachteil darin, dass es mit dem bekannten Verfahren nicht möglich ist, das Gesamtblut zu prozessieren, wodurch die Ausbeute pro Spende bzw. die Therapieeffizienz nicht ausreichend hoch ist. Dieser Nachteil betrifft vor allem Zellen, die für diagnostische Untersuchungen aus dem Blut isoliert werden sollen (z.B. zirkulierende Tumorzellen), da diese oft in sehr geringer Konzentration vorliegen. Bei Stammzellenspenden sind in den meisten Fällen mehrere Zellapheresen notwendig, um die benötigte Menge zu sammeln.

[0034] Eine selektive bzw. spezifische Abtrennung von Zellen kann auch in einem extrakorporal durchgeführten 1-Schritt-Verfahren betrieben werden. Leukozytenapherese-Säulen (z.B. Cell-sorba® von ASAHI Medical; Adacolumn® von Otsuka) zur selektiven Abtrennung von Leukozytenarten aus einem extrakorporalen Blutkreislauf befinden sich bereits auf dem Markt. Aus der WO 2006/012884 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur spezifischen Entfernung von Zellen, Biopartikeln und/oder Molekülen aus Blut mit Hilfe von funktionalisierten Mikropartikeln bekannt. Der Vorteil solcher Systeme ist ihre Einfachheit, da die selektive bzw. spezifische Abtrennung der Zellen dabei nicht aus einem Leukozytenpräparat sondern direkt aus dem Blut erfolgt, d.h. die Abtrennung erfolgt in einem einzigen Schritt. Der Nachteil ist, dass unspezifische Wechselwirkungen zwischen nicht gewünschten Zellen und dem Adsorbermaterial bzw. den funktionellen Einheiten auf den Mikropartikeln nicht ausgeschlossen werden können und die Effizienz daher nicht zufriedenstellend ist. Dieser kommt besonders dann zum Tragen, wenn die gewünschten Zellen nur in sehr geringer Konzentration im Blut vorhanden sind. Vor allem in Hinblick auf die Gewinnung von Blutzellen aus gesunden Donoren ist eine hohe Reinheit der Blutzellprodukte von hoher Wichtigkeit und deshalb auch erstrebenswert. Aus diesen Gründen ist dem oben genannten 2-Schritt-Verfahren der Vorzug zu geben.

[0035] Automatisierte und kontinuierliche Vorrichtungen zur spezifischen Isolierung von Blutzellen auf Grundlage des oben genannten 2-Schritt-Verfahrens sind aus der DE 101 27 068 A1, der US 4 512 763 A1 und der US 5 225 353 A1 bekannt geworden. Bei diesen Vorrichtungen findet das 2-Schritt-Verfahren nicht mehr räumlich getrennt, sondern kontinuierlich und in einer in sich geschlossenen Vorrichtung statt. Mit diesen Vorrichtungen ist es möglich, gewünschte Zellen in großer Reinheit und hoher Ausbeute zeitsparend und unter sterilen Bedingungen zu gewinnen. Die spezifische Isolierung gewünschter Zellen erfolgt kontinuierlich, da die Leukozytenfraktion kontinuierlich durch die Leukozyten-Fraktionsleitung zur Zellisolationseinrichtung geleitet wird und von dort nach der spezifischen Abtrennung gewünschter Zellen gemeinsam mit den restlichen Fraktionen wieder zurück in den Spender/Patienten gelangt. Dies bedeutet, dass der Großteil der Leukozyten wieder in den Spender/Patienten unter sterilen Bedingungen zurück kommt und nur die gewünschten Zellen abgetrennt werden. Dadurch ist es möglich, die gesamte Blutmenge in einem Durchlauf zu prozessieren. Daraus ergibt sich, dass die Belastung des Spenders/Patienten trotz der großen prozessierten Blutmenge äußerst gering bleibt und die Sortierungsrate dennoch den für eine klinische Anwendung oder Diagnostik benötigten Mengen entspricht. Besondere Bedeutung können solche Vorrichtungen für das Gebiet der Stammzell-Therapie haben, da bereits bei einer Sitzung die benötigte Menge an Stammzellen gewonnen werden kann. Dies bringt nicht nur Vorteile für den Patienten, sondern ist auch ressourcenschonend hinsichtlich Kosten, Zeit und Material.

[0036] Eine Vorrichtung und ein Verfahren der eingangs genannten Art wurden in der DE 101 27 068 A1 beschrieben. Bei dieser Vorrichtung bzw. diesem Verfahren besteht jedoch die Möglichkeit, dass Magnetpartikel, die nicht in der Zellisolationseinrichtung abgetrennt werden, ungehindert in den Blutablauf und von dort in den Blutkreislauf des Patienten gelangen können, beispielsweise dann, wenn die Magnetpartikel aufgrund einer Überfüllung der "magnetischen Falle" unzureichend abgetrennt werden. Dies wirkt sich nachteilig auf die Patientensicherheit aus. 5/23 &t£S!iÄ»hi5 AT505 946B1 2009-08-15 [0037] Es ist eine Aufgabe der Erfindung diesen Nachteil zu beseitigen und die Patientensicherheit hoch zu halten.

[0038] Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, bei welcher erfindungsgemäß die Vorrichtung eine Sicherheitseinrichtung zum Einfangen von nicht in der zumindest einen Zellisolationseinrichtung abgetrennten Magnetpartikeln aufweist, wobei die Sicherheitseinrichtung an der Leukozyten-Fraktionsleitung stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung angeordnet ist und einen Magneten zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Inneren der Leukozyten-Fraktionsleitung aufweist.

[0039] Diese Aufgabe wird weiters mit einem Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei welchem erfindungsgemäß die in der zumindest einen Zellisolationseinrichtung nicht abgetrennten Magnetpartikel durch ein Magnetfeld im Inneren der Leukozytenfraktionsleitung stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung eingefangen werden.

[0040] Vorzugsweise ist die Erfindung in Form einer Sicherheitseinrichtung realisiert, welche an der Außenseite der Leukozyten-Fraktionsleitung stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung angeordnet ist und einen Magneten zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Inneren der Leitung aufweist. Magnetpartikel, die nicht mit dem Magneten der Zellisolationseinrichtung erfasst wurden, können mit diesem zweiten Magneten abgetrennt werden.

[0041] Weiters ist es, wie aus der AT 413153 B hervorgehend, auch möglich, einen geringen Prozentsatz der Magnetpartikel mit Fluorophoren zu koppeln. Das Dokument beschreibt eine Sicherheitsvorrichtung sowie ein Verfahren zur Detektion von Fluoreszenz-markierten magnetischen Mikropartikeln. Fluoreszenz-gelabelte Mikropartikel können von einem Fluoreszenzdetektor, der stromab der Zellisolationseinrichtung angeordnet ist, detektiert werden. Wird eine Fluoreszenz detektiert, so ist dies ein Zeichen, dass die Magnetpartikelabtrennung nicht oder nicht ausreichend funktioniert. Infolgedessen kann ein optischer und/oder akustischer Alarm ausgelöst und die Vorrichtung zum Halten gebracht werden.

[0042] Die zumindest eine Zellisolationseinrichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung beruht auf einer Abtrennung spezifisch Zell-bindender Magnetpartikel durch ein Magnetfeld. Vorrichtungen mit welchen die Zellen mittels Magnetpartikeln abgetrennt werden können, wurden weiter oben schon angeführt und können auch in der vorliegenden Erfindung Anwendung finden. Die magnetischen Partikel können mit Funktionalitäten wie im folgenden Absatz beschrieben gekoppelt und stromauf der Zellisolationseinrichtung in den Leukozytenfraktionsstrom infundiert werden, sodass die abzutrennenden Zellen spezifisch an diese binden können. Die Magnetpartikel mit den gebundenen Zellen werden mit Hilfe eines Magneten aus der Fraktion abgetrennt.

[0043] Den der spezifischen Zellisolationseinrichtung zugrunde liegenden spezifischen biomolekularen Wechselwirkungen sind keine Grenzen gesetzt. Da diese Einrichtung jedoch im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlungsvorrichtung eingesetzt wird, ist es aus Gründen der Patientensicherheit notwendig, dass in der Zellisolationseinrichtung aseptische Bedingungen herrschen, die während der gesamten Prozessdauer aufrecht erhalten werden müssen. Biomolekulare Wechselwirkungen beziehen sich auf eine Wechselwirkung zwischen einer gewünschten Zelle und zumindest einer mit den Zell-bindenden Magnetpartikeln gekoppelten Funktionalität. Die Leukozytenfraktion wird über den Fraktionskreislauf in die Zellisolationseinrichtung geleitet und passiert diese, wobei die abzutrennende Zelle mit der zumindest einen Zellbindenden Funktionalität in Wechselwirkung tritt und an diese bindet. Die Zelle wird in der Zellisolationseinrichtung zurückgehalten und somit aus der Leukozytenfraktion abgetrennt. Solche Zell-bindenden Funktionalitäten können z.B. sein: Antikörper und Fragmente davon, (Gly-ko)Proteine, (Glyko)Peptide, (Glyko)Polypeptide, Rezeptoren, Liganden, Antigene, Kohlenhydrate, Lektine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Streptamere, chemische Gruppen und Mischungen davon. Die Funktionalitäten können nativer oder synthetischer Natur sein. Es können entweder eine, aber auch mehr spezifische Funktionalitäten an der Oberfläche immobilisiert wer- 6/23 fcSssKÄhe AT505 946B1 2009-08-15 den. Damit die Funktionalitäten gut zugänglich sind, können sie über einen dazwischen liegenden Spacer an die Oberfläche gebunden sein.

[0044] Eine Vorraussetzung für die Anwendbarkeit solcher funktionalisierter Zell-bindender Oberflächen ist ihre Biokompatibilität. Unter dem Begriff "Biokompatibilität" wird eine biologische Verträglichkeit zwischen dem Zell-bindenden Material und einem Biosystem -hier eine Leukozytenfraktion- verstanden.

[0045] Mit Bezug auf die spezifische Abtrennung ist es ganz besonders zweckmäßig, wenn die zumindest eine Zellisolationseinrichtung dazu eingerichtet ist, zumindest eine Blutzellensubpopulation spezifisch aus der zumindest einen Leukozytenfraktion zu entfernen, wobei die zumindest eine Blutzellensubpopulation gewählt ist aus Subpopulationen der Lymphozyten und der Granulozyten, Monozyten, endothelialen Vorläuferzellen, endothelialen, hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen, und zirkulierenden Tumorzellen. Bei therapeutischen Anwendungen, bei welchen allein schon durch die Zellabtrennung ein therapeutischer Effekt erreicht wird, werden insbesondere "Entzündungszellen" wie Lymphozyten (insbesondere spezifische T-Lymphozyten), Granulozyten, Monozyten oder Makrophagen entfernt. Mit dieser Art von Therapie konnten vor allem bei Autoimmunerkrankungen wie Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Rheumatoider Arthritis bereits gute Erfolge erzielt werden. Einsatzgebiete für endotheliale, hämatopoetische und mesenchymale Stammzellen und endotheliale Vorläuferzellen (auch endotheliale Progenitorzellen genannt) liegen vor allem in der regenerativen Medizin und bei Transplantationen nach Chemotherapien. Gesammelte Monozyten aus gesunden Spendern können weiter zu Dendritischen Zellen für Krebstherapien ausgereift werden. Besonders effizient ist die Erfindung bei der Anreicherung von tumor-spezifischen T-Zellen und zirkulierenden Tumorzellen im Blut, die diese oft in nur geringer Konzentration vorliegen. Dank der Erfindung ist es möglich, die gesamte Blutmenge nach zirkulierenden Tumorzellen zu screenen und eine Reaktivierung eines Tumors in einem frühen Stadium zu diagnostizieren.

[0046] Der Blutablauf und Blutzulauf des extrakorporalen Blutkreislaufs sowie die Leukozyten-Fraktionsleitung sind vorzugsweise in einer Anordnung von Schläuchen realisiert, die nach einmaliger Verwendung aus Sterilitätsgründen entsorgt werden. Die Körperflüssigkeiten werden mittels Pumpen durch die Vorrichtung transportiert. In einer extrakorporal betriebenen Vorrichtung können weiters eine Antikoagulationseinrichtung, Ventile, Filter und Sicherheitseinreichtungen (z.B. Luftblasendetektor, Druckdetektor) vorgesehen sein. Die Antikoagulation kann beispielsweise mit Heparin oder Citrat erfolgen. Da die Citrat-Antikoagulation im Gegensatz zur Heparin-Antikoagulation für nahezu alle Spender-/Patientengruppen bzw. Empfängergruppen nebenwirkungsfrei anwendbar ist, wird dieser der Vorzug gegeben. Aufgrund der langsamen Flussgeschwindigkeit des Blutes (40 bis 50 ml/min) im Blutzulauf und im Blutablauf ist eine Entfernung des Citrats bei lebergesunden Spendern/Patienten nicht notwendig. Citrat wird komplett in der Leber in Bicarbonat umgewandelt.

[0047] Um den 2-schrittigen Abtrennungsprozess möglichst effektiv zu gestalten, ist es von Vorteil, wenn der extrakorporale Blutkreislauf und das Zellseparationsgerät dazu eingerichtet sind, 40 - 50 ml Blut/min zu transportieren bzw. zu verarbeiten und weiters die Leukozyten-Fraktionsleitung und die zumindest eine Zellisolationseinrichtung eingerichtet sind, 3 - 6 ml Leukozytenfraktion/min zu transportieren bzw. zu verarbeiten. Bei Zellseparationsgeräten wird die Blutflussrate im extrakorporalen Kreislauf üblicherweise auf einen Wert zwischen 40 - 50 ml/min eingestellt. Die Flussrate der Leukozytenfraktion in der Leukozyten-Fraktionsleitung beträgt aufgrund des geringeren Volumens vorteilhafterweise 3-6 ml/min. Die Flussraten des Plasmas und der Erythrozyten werden vorteilhafterweise auf einen Wert zwischen 17 - 23,5 ml/min eingestellt. Die Einstellung der Flussraten auf diese Werte hat den Vorteil, dass einerseits eine große Menge an Blut innerhalb kurzer Zeit physikalisch in ihre Komponenten aufgetrennt werden kann und gleichzeitig eine effektive spezifische Isolierung von Zellen aus der Leukozytenfraktion im Gleichklang durchführbar ist. Das System kann unter Berücksichtigung dieser Flussraten kontinuierlich betrieben werden. Üblicherweise würde die Flussrate der Leu- 7/23

ästeifcscfistiiö patent AT505 946B1 2009-08-15 kozytenfraktion ca. 1 ml/min betragen, damit eine Verunreinigung mit Erythrozyten und Thrombozyten möglichst niedrig gehalten wird. Hier ist es jedoch möglich, die Flussrate der Leukozytenfraktion zu erhöhen, da aufgrund des spezifischen Zellisolationsschrittes Verunreinigungen durch Erythrozyten bzw. Thrombozyten keine wesentliche Rolle spielen. Dadurch kann die Effektivität erheblich (ca. um das 5fache) gesteigert werden. Da der zweite Schritt (spezifische Zellisolierung) mit dem ersten Schritt (Zellseparationsgerät) zeitlich mitläuft, ergibt sich nochmals eine Beschleunigung des Verfahrens.

[0048] Während der Behandlung können sich ca. 400 - 500 ml Körperflüssigkeit (Blut und Leukozytenfraktion) in der gesamten Vorrichtung befinden. In einer Sitzung kann je nach Spen-der/Patient eine Gesamtblutmenge von ca. 5000 - 8000 ml durch die Vorrichtung fließen. Die Sitzungsdauer beträgt ca. 100 - 200 min.

[0049] Für die Herstellung einer Leukozytenfraktion können alle Arten von Zellseparatoren verwendet werden, sofern sie für die Sammlung einer Leukozytenfraktion geeignet sind und als extrakorporales "continuous-flow" Gerät betrieben werden können.

[0050] Hinsichtlich der Gewinnung einer Leukozytenfraktion in einem ersten Schritt mittels eines Zellseparationsgerätes ist es für die praktische Anwendung empfehlenswert, wenn die Separationseinrichtung dazu eingerichtet ist, das Blut in zumindest eine nichtabzutrennende Fraktion und in zumindest eine Leukozytenfraktion zu trennen, wobei die zumindest eine Leukozytenfraktion zumindest eine Blutzellenart aufweist, die gewählt ist aus Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Stammzellen, Vorläuferzellen. Weiters kann die Leukozytenfraktion alle Arten von Leukozyten inklusive Stammzellen, Vorläuferzellen (auch Progenitorzellen und determinierte Stammzellen genannt) und zirkulierende Tumorzellen beinhalten. Je nach Separationsverfahren bzw. Separationsgerät ist es auch möglich, Leukozytenfraktionen zu erhalten, die mit einer bestimmten Art von Leukozyten angereichert sind. Die Elutriation ist beispielsweise eine Möglichkeit Monozyten selektiv anzureichern.

[0051] In Bezug auf das extrakorporale Zellseparationsgerät ist es weiters besonders vorteilhaft, wenn die Separationseinrichtung des Zellseparationsgerätes dazu eingerichtet ist, Blut mittels Zentrifugation und/oder Elutriation in Fraktionen aufzutrennen. Mittels Zentrifugationstechnik und/oder Elutriation können große Blutmengen in kurzer Zeit separiert werden. In der Praxis wird die Elutriation einer Zentrifugation nachgeschaltet. Weiters sind Auftrennungsverfahren und Zellseparatoren, die auf diesen Techniken basieren, gut etabliert und für die klinische Anwendung zugelassen und erprobt.

[0052] Um die spezifisch abgetrennten Zellen aus der Zellisolationseinrichtung am Ende der Behandlung in ein Sammelbehältnis abzuführen stehen mehrere Wege offen. In Abhängigkeit der Menge der zu sammelnden Zellen, kann es weiters notwendig sein, die in der Zellisolationseinrichtung spezifisch abgetrennten Zellen in regelmäßigen Zeitabständen abzuführen. Als limitierender Faktor der Erfindung ist nämlich die Kapazität der Zellisolationseinrichtungen zu berücksichtigen. Während dieser Faktor bei Apheresen für diagnostische Zwecke - z.B. Anreicherung von im Blut in geringer Konzentration verteilten zirkulierenden Tumorzellen oder tumorspezifischen T-Zellen - keine wesentliche Rolle spielen wird, können besonders bei therapeutischen Anwendungen oder bei Spenden größere Mengen an Zellen aus der Leukozytenfraktion abzutrennen sein. Dies kann zu einer unzureichenden Abtrennung der Magnetpartikel aufgrund einer Überfüllung der "magnetischen Falle" führen. Um zu verhindern, dass Magnetpartikel in die Blutbahn des Patienten gelangen, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Sicherheitseinrichtung wie oben beschrieben auf.

[0053] Die zumindest eine Zellisolationseinrichtung kann von der Vorrichtung entfernbar sein und weiters dazu eingerichtet sein, nach Zuführen eines Elutionsmittels isolierte Blutzellen bzw. Magnetpartikel-gebundene Blutzellen freizugeben und in ein Sammelbehältnis abzuführen. Dies stellt wohl die einfachste Art und Weise dar, die gebundenen Zellen am Ende des Abtrennungsvorgangs aus der Zellisolationseinrichtung in ein Sammelbehältnis zu überführen. Um die Pati- 8/23

oiteüsäisd'is patenuimt AT505 946 B1 2009-08-15 entensicherheit und die Qualität der erhaltenen Zellprodukte zu gewährleisten, ist allerdings erhöhte Vorsicht hinsichtlich der Wahrung der Sterilität nötig. Vorteilhafterweise ist die Zellisolationseinrichtung über Luer-Anschlüsse an die Leukozyten-Fraktionsleitung lösbar angeschlossen.

[0054] Selbstverständlich ist es auch möglich, den Abtrennungsvorgang in regelmäßigen Zeitabständen durch Anhalten der Vorrichtung kurz auszusetzen und die mit Magnetpartikelgebundenen Zellen beladene Zellisolationseinrichtung zu Eluierungszwecken gegen eine unbe-ladene auszutauschen. Aus Sterilitätsgründen ist dies jedoch weniger erwünscht.

[0055] Vielmehr ist es für die Sicherstellung einer aseptischen Zellapherese bei einer weiteren Variante von großem Vorteil, wenn die Vorrichtung eine Zuleitung zum Zuführen eines Elutionsmittels in die zumindest eine Zellisolationseinrichtung zum Eluieren der in der zumindest einen Zellisolationseinrichtung isolierten Magnetpartikel-gebundenen Zellen und eine Ableitung zum Abführen der Magnetpartikel-gebundenen Zellen von der zumindest einen Zellisolationseinrichtung in ein Sammelbehältnis aufweist, wobei in der Leukozyten-Fraktionsleitung stromauf und stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung jeweils ein Ventil und/oder eine Schlauchklemme angeordnet sind, welche beim spezifischen Isolieren geöffnet sind und beim Eluieren geschlossen sind. Diese Variante hat jedoch den Nachteil, dass die Zellisolationseinrichtung insgesamt vier Anschlüsse auf weisen muss (zwei für das Zu- und Ableiten der Leukozytenfraktion und zwei für das Zu- und Ableiten des Elutionsmittels).

[0056] Da vor allem bei Säulen nur zwei Anschlüsse vorgesehen sein können, ist es bei einer weiteren Variante zweckmäßig, wenn die Vorrichtung weiters aufweist: eine Zuleitung zum Zuführen eines Elutionsmittels in die Leukozyten-Fraktionsleitung an einer ersten Schnittstelle stromauf der zumindest einen Zellisolationseinrichtung zum Eluieren der in der zumindest einen Zellisolationseinrichtung isolierten Magnetpartikel-gebundenen Zellen; und eine Ableitung aus der Leukozyten-Fraktionsleitung an einer zweiten Schnittstelle stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung zum Abführen der zu eluierenden Magnetpartikel-gebundenen Zellen in ein Sammelbehältnis, wobei an der ersten und der zweiten Schnittstelle jeweils ein Dreiwegeventil angeordnet ist und beim Eluieren die Dreiwegeventile für die Leukozytenfraktion geschlossen und für das Elutionsmittel geöffnet sind.

[0057] Bei den beiden letztgenannten Varianten zum Eluieren der Magnetpartikel-gebundenen Zellen liegt ein Verfahren zugrunde, welches folgende Schritte aufweist: [0058] - Anhalten der Vorrichtung; [0059] - Schließen von Ventilen und/oder Schlauchklemmen welche an der Fraktionsleitung stromauf und stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung angeordnet sind; [0060] - Zuführen des Elutionsmittels über eine Zuleitung in die zumindest eine Zellisolationseinrichtung und Eluieren der Magnetpartikel-gebundenen Zellen über eine Ableitung in ein Sammelbehältnis; [0061] - Spülen der zumindest einen Zellisolationseinrichtung mit einer physiologisch kompatiblen Lösung;und [0062] - Beenden des Verfahrens oder Weiterführen des Verfahrens nach Öffnen der Ventile und/oder Schlauchklemmen.

[0063] Bei einer weiteren vorteilhaften Realisierung kann es weiters vorgesehen sein, dass die Vorrichtung zumindest zwei Zellisolationseinrichtungen aufweist, die dazu eingerichtet sind, simultan und/oder alternierend ein spezifisches Isolieren von Zellen durchzuführen. Diese Variante hat den Vorteil, dass die Zellapherese kontinuierlich durchführbar ist, auch wenn ein zwischenzeitliches Eluieren der Magnetpartikel-gebundenen Zellen aus der Zellisolationseinrichtung notwendig ist. Durch entsprechende Anordnung von Ventilen und/oder Schlauchklemmen kann die Leukozytenfraktion durch die eine Zellisolationseinrichtung fließen, 9/23 teieicfehis patemt AT505 946 B1 2009-08-15 während die andere Zellisolationseinrichtung mit Elutionsmittel gespült wird. Nachteilig zu den zuvor genannten Varianten ist der höhere Materialaufwand, da zumindest zwei Zellisolationseinrichtungen pro Sitzung verwendet werden.

[0064] Zusammengefasst liegt der große Vorteil einer in der Vorrichtung integrierten Elutionseinrichtung besonders darin, dass eine Zellapheresesitzung bis zu ihrem endgültigen Abschluss aseptisch durchgeführt werden kann. Die Elutionsmittel wird selbstverständlich unter aseptischen Bedingungen über die Zuleitung in die zumindest eine Zellisolationseinrichtung eingebracht und ebenso aseptisch werden die eluierten Zellen über eine Ableitung in ein Sammelbehältnis eluiert. Das Sammelbehältnis wird vorteilhafterweise erst nach Beenden der Zel-lapherese von der Vorrichtung gelöst. Muss die Zellisolationseinrichtung nach Zugabe des Elutionsmittels gespült werden, kann diese vor Weiterführung der Zellapherese mit einer physiologisch kompatiblen Lösung - z.B. physiologischer Kochsalzlösung - gespült werden. Die stromauf- und stromab der Zellisolationseinrichtung angeordneten Ventile bzw. Schlauchklemmen sind während des Eluierungsvorgangs geschlossen, so dass das Elutionsmittel durch die Zellisolationsvorrichtung geführt werden kann.

[0065] Im Folgenden wird die Erfindung samt weiteren Vorzügen anhand von nicht einschränkenden Ausführungsbeispielen näher erläutert, welche in der beigefügten Zeichnung dargestellt ist. Die Zeichnung zeigt in [0066] Fig. 1 eine Vorrichtung nach dem Stand der Technik, bei welcher die Zellapherese mittels adsorptiver Zellisolationseinrichtung durchgeführt wird, [0067] Fig. 2 eine schematische Darstellung der mittleren Flussgeschwindigkeiten des Blutes und der Fraktionen, [0068] Fig. 3 die Vorrichtung aus der Fig. 1 erweitert um eine Einrichtung zum Eluieren der isolierten Zellen aus der Zellisolationseinrichtung, [0069] Fig. 4 eine erfindungsgemäße Vorrichtung, bei welcher die Zellisolationseinrichtung auf einer Abtrennung spezifisch Zell-bindender Magnetpartikel beruht, und [0070] Fig. 5 eine Vorrichtung mit zwei adsorptiven Zellisolationseinrichtungen.

[0071] Die Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung nach dem Stand der Technik. Das Blut, welches dem Spender/Patienten aus einer peripheren Vene des linken oder rechten Arms entnommen wird, wird zur Auftrennung in Fraktionen über einen Blutzulauf 110 in das Zentrifugenteil 101 des Zellseparationsgerätes 100 gepumpt. Dies erfolgt mit einer im Blutzulauf angeordneten Blutpumpe 111, wobei die mittlere Flussgeschwindigkeit des Blutes (Blutfluss) auf 40-50 ml/min eingestellt wird. Stromauf der Blutpumpe 111 wird noch ein Antikoagulationsmittel aus einem Behältnis 112 über eine Zuführleitung 113 mittels einer Pumpe 155 in den Blutzulauf 110 infundiert. Im Zentrifugenteil 101 des Zellseparationsgerätes 100 erfolgt eine Auftrennung des Blutes in die Fraktionen (plättchenreiches) Plasma, Erythrozyten und Leukozyten. Das Plasma wird vom Zentrifugenteil 101 mittels einer Plasmapumpe 108 mit einer mittleren Flussgeschwindigkeit von 11 - 22,5 ml/min über eine Plasmaleitung 105 in die Rückführeinrichtung 109 des Zellseparationsgerätes 100 geleitet. Die Erythrozytenfraktion wird mittels einer Erythrozytenpumpe 107 über eine Erythrozytenleitung 104 mit einer mittleren Flussgeschwindigkeit von 11 - 22,5 ml/min ebenfalls in die Rückführeinrichtung 109 gepumpt. Die Leukozytenschicht wird mit der Leukozytenpumpe 106 über eine Leukozyten-Sammelleitung 103 in eine Sammeleinrichtung 102 und von dort über die Zuleitung 117a der Leukozyten-Fraktionsleitung 117 in die Zellisolationseinrichtung 118 - hier eine Adsorptionssäule 118 - geleitet. In der Adsorptionssäule 118 werden spezifische Zellen aus der Leukozytenfraktion adsorbiert und die verbleibenden Leukozyten über die Ableitung 117b der Leukozyten-Fraktionsleitung 117 in die Rückführeinrichtung 109 geführt. Die Adsorptionssäule 118 ist mittels der Luerlockanschlüsse 119 an die Zu- und Ableitungen 117a,117b angeschlossen. Von der Rückführeinrichtung 109 gelangen die Plasma-, die Erythrozyten- und die Rest-Leukozytenfraktion über den Blutablauf 114 zurück in 10/23 &t£S!®cilsl5Chi$ AT505 946B1 2009-08-15 den intrakorporalen Blutkreislauf des Spenders/Patienten. Die mittlere Flussgeschwindigkeit des Blutes im Blutablauf 114 beträgt 40 - 50 ml/min.

[0072] Aus Sicherheitsgründen sind im Blutablauf 114 noch eine Luftfalle 121 zur Vermeidung von Embolien sowie ein Sicherheits-Schlauchventil 144 eingebracht. Letzteres kann im Alarmfall geschlossen werden. Die Luftfalle 121 und das Sicherheits-Schlauchventil 144 sind neben den Pumpen 111,106,107,108, den Leitungen 103,104,105, dem Zentrifugenteil 101, der Sammeleinrichtung 102 und der Rückführeinrichtung 109 ebenfalls Bestandteile des Zellseparationsgerätes 100. Die Pumpen 111,106,107,108, das Zentrifugenteil 101, die Luftfalle 121 und das Schlauchventil 144 stehen mit der zentralen Steuerung 115 des Zellseparationsgerätes 100 über Signalverbindungen in Kontakt (die einzelnen Signalverbindungen sind als gestrichelte Linien eingezeichnet).

[0073] Bei der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung erfolgt die Ablösung der isolierten Zellen aus der Adsorptionssäule 118 vorzugsweise nach Ende der Sitzung, d.h. nach Durchfluss von ca. 5000 - 8000 ml Blut und Abhängen des Spenders/Patienten vom Gerät. Die Adsorptionssäule 118 wird durch Lösen der Luerlockanschlüsse 119 von der Vorrichtung entfernt. Danach werden die Zellen mittels eines durch die Säule geleiteten Elutionsmittels von der Adsorptionsmatrix gelöst und in ein steriles Behältnis transferiert. Natürlich besteht auch die Möglichkeit, die mit Zellen beladene Säule während der Sitzung gegen eine frische Säule auszutauschen; aus Gründen der aufrecht zu erhaltenden Sterilität ist dies jedoch weniger erwünscht.

[0074] In der Fig. 2 sind die mittleren Flussgeschwindigkeiten des Blutes und der einzelnen nach der Separation erhaltenen Fraktionen ergänzend zur Beschreibung der Fig. 1 schematisch dargestellt. Dies sei noch an folgendem Beispiel kurz erläutert: ein Blutentnahmefluss (angenommen 40 ml/min) resultiert in einer Summe von Erythrozyten-, Plasma- und Leukozytenfluss von ebenfalls 40 ml/min, weil ja die gleiche Menge pro Zeit entnommen und zurückgeführt wird, abzüglich der gesammelten Milliliter. Ein Blutentnahmefluss von 40 ml/min bei einem Leukozytenfluss von 3ml/min würde etwa in einem Erythrozytenfluss von 17 ml/min und einem Plasmafluss von 20 ml/min resultieren.

[0075] Die Fig. 3 zeigt eine Weiterbildung der Vorrichtung aus der Fig. 1. Die Bezugszeichen der meisten Vorrichtungselemente aus der Fig. 3 entsprechen daher jenen aus der Fig. 1, sofern nicht anders angeführt.

[0076] Diese Variante weist eine Einrichtung zum Eluieren von adsorbierten Zellen aus der Adsorptionssäule 118 auf, ohne dass diese von der Vorrichtung durch Lösen der Luerlockanschlüsse 119 gelöst werden muss. Das Eluieren kann wahlweise nach der Sitzung oder während der Sitzung stattfinden. Der Vorteil dieser Variante ist, dass während der Sitzung bis hin zum Eluieren der Zellen aus der Adsorptionssäule 118 (auch wenn dies während der Sitzung erfolgt) die aseptischen Bedingungen aufrecht erhalten werden können. Um dies zu bewerkstelligen sind stromauf und stromab der Adsorptionsäule 118 jeweils ein Dreiwegeventil 136,136' in der Leukozyten-Fraktionsleitung 117c angeordnet.

[0077] Um die in der Adsorptionssäule 118 gebundenen Zellen am Ende einer Sitzung zu eluieren, werden der Blutfluss durch entsprechende Anpassung des Zellseparationsgerätes 100 und der Pumpe 155 (Antikoagulation) auf die Hälfte (ca. 20 ml/min) reduziert und die Dreiwegeventile 136,136' für die Leukozytenfraktion geschlossen. Die Plasmapumpe 108, die Erythrozytenpumpe 107 und die Leukozytenpumpe 106 werden dem reduzierten Blutfluss angepasst. Die Leukozytenfraktion wird in der Zwischenzeit, da diese ja die Leukozytenfraktionsleitung 117c nicht passieren kann (Dreiwegeventile 136,136' geschlossen), in der Sammeleinrichtung 102 gesammelt. Dann wird ein Elutionsmittel aus einem Reservoir 131 durch eine an das Dreiwegeventil 136' angeschlossene Zuleitung 130 mittels einer Pumpe 137 in die Adsorptionssäule 118 geleitet. Das Elutionsmittel passiert dabei das Dreiwegeventil 133. Die abgelösten Zellen werden mit dem Elutionsmittel über eine an das Dreiwegeventil 136 angeschlossene Ableitung 134 nach Passieren eines weiteren Dreiwegeventils 138 in einem sterilen Zell-Sammelbehältnis 135 11/23 &t£S!iÄ»hi5 AT505 946B1 2009-08-15 aufgefangen. Nach dem Elutionsvorgang kann die Adsorptionssäule 118 noch mit isotonischer Kochsalzlösung gespült werden, indem die isotonische Kochsalzlösung nach Umschalten der Dreiwegeventile 133,138 aus einem Reservoir 132 durch die Adsorptionssäule 118 in ein Auffangbehältnis 150 geleitet wird.

[0078] Dieser Vorgang kann natürlich auch während einer Sitzung bei angeschlossenem Spen-der/Patienten in Zeitabständen erfolgen, um die Ausbeute an Zellen zu erhöhen. Für diesen Fall wird der Blutfluss wie oben bereits beschrieben auf die Hälfte reduziert und die Dreiwegeventile 136,136' geschlossen. Danach wird wie zuvor beschrieben zuerst das Elutionsmittel aus dem Reservoir 131 mittels der Pumpe 137 durch die Adsorptionssäule 118 perfundiert und die de-sorbierten Zellen in das Sammelbehältnis 135 geleitet. Im Anschluss daran wird mindestens die 5-fache Menge an isotonischer Kochsalzlösung (im Vergleich zur Menge an Elutionsmittel) durch die Adsorptionssäule perfundiert und in das Auffangbehältnis 150 geleitet. Im Auffangbehältnis 150 kann zusätzlich eine Sicherheitseinrichtung vorgesehen werden, z.B. Messung des pFI-Werts zur Sicherstellung einer ausreichenden Spülung der Säule mit isotonischer Kochsalzlösung. Nach diesem Vorgang kann die Zellapherese weiter fortgesetzt werden, indem die Dreiwegeventile 136,136' wieder für die Leukozytenfraktion geöffnet und der Blutfluss wieder auf eine mittlere Flussgeschwindigkeit von 40-50 ml/min erhöht.

[0079] Um eine ausreichende Sicherheit zu gewährleisten sind in den Zu- und Ableitungen 130,134 zusätzlich Schlauchklemmen 145,146,147,148,149 vorgesehen, um den Zugang zu den einzelnen Reservoirs 131,132 bzw. Sammelbehältnissen 135,150 sperren zu können.

[0080] In der Fig. 3 ist noch eine andere Variante angedeutet, bei welcher die Zu- und Ableitungen für das Elutionsmittel bzw. für die isotonische Kochsalzlösung nicht von den Dreiwegeventilen 136,136' sondern direkt von der Zellisolationseinrichtung 118 abzweigen. Diese Variante ist durch die Zuleitung 134b und die Ableitung 134a (strichliert) dargestellt. Die Dreiwegeventile 136,136' sind bei dieser Ausführungsform einfache Absperrventile oder Schlauchklemmen zum Absperren des Leukozytenflusses während des Eluierungsvorgangs.

[0081] Der Fig. 4 ist eine Ausführungsform gemäß der Erfindung zu entnehmen, wobei das Prinzip der spezifischen Zellisolation auf einer Abtrennung Magnetpartikel-gebundener Zellen mit Hilfe eines Magnetfeldes basiert. Wenn nicht anders angeführt, entsprechen die Vorrichtungselemente aus der Fig. 4 im Wesentlichen jenen aus der Fig. 1 - die spezifische Zellisolierungseinrichtung und die Einrichtung zum Eluieren/Spülen ausgenommen.

[0082] Bei Benutzung spezifischer Magnetpartikel mit der Eigenschaft, spezifisch an Zellen zu binden, wird aus dem Magnetpartikel-Reservoir 141 in Abhängigkeit der erwarteten abzutrennenden Zellzahl der zu separierenden Zellen eine gewisse Anzahl von Magnetpartikeln dem Leukozytenfluss zugeführt. Dies erfolgt mittels einer Pumpe 142 über eine Magnetpartikelzuleitung 140, welche stromauf der Zellisolationseinrichtung 118' in die Zuleitung 117a' mündet. Die gewünschten Zellen treten dabei mit den Magnetpartikeln in Wechselwirkung. Mittels eingeschalteten Magnetfelds, welches durch einen in der Zellisolationseinrichtung 118' angeordneten Magneten erzeugt wird, werden die nunmehr Magnetpartikel-gebundenen Zellen im Magnetfeld konzentriert. Die Zellisolationseinrichtung ist über Luerlockanschlüsse 119' an die Zu- und Ableitungen 117a',117b' der Leukozyten-Fraktionsleitung 117' angeschlossen.

[0083] Das Sammeln der Zellen wird bei dieser Ausführungsform dadurch erreicht, dass - nach Reduktion des Blutflusses durch entsprechende Anpassung des Zellseparationsgerätes 100 und der Pumpe 155 (Antikoagulation) auf die Hälfte (ca. 20 ml/min) und Schließen der Dreiwegeventile 136a,136a' für den Leukozytenfluss - mittels der Pumpe 137' in der Zuleitung 130' zur Zellisolationsvorrichtung 118’ isotonische Kochsalzlösimg aus einem Reservoir 131' in die Zellisolationsvorrichtung 118' geleitet wird. Bei abgeschaltetem Magnetfeld werden die Magnetpartikel-gebundenen Zellen durch die Ableitung 134' in ein steriles Sammelbehältnis 135' transferiert. Die Schlauchklemmen 145' und 148' sind dabei offen, die Schlauchklemmen 147' und 146' geschlossen. Dieser Vorgang kann des öfteren während der Sitzung durchgeführt werden. Die 12/23 fetssKÄhe AT505 946B1 2009-08-15 im Sammelbehältnis 135' gesammelten Magnetpartikel-gebundenen Zellen können von den Magnetpartikeln gelöst werden, indem ein Elutionsmittel aus einem Reservoir 132' mit der Pumpe 137' in das Sammelbehältnis 135' gepumpt wird. Die so behandelten Zellen werden nach Öffnen der Schlauchklemme 147' in dem Sammelbehältnis 151 steril aufgefangen werden. Letzterer Vorgang wird vorteilhafterweise aus Sicherheitsgründen nach Ende der Sitzung und Abhängen des Spenders/Patienten vom Gerät umgesetzt, wohingegen das Eluieren der Magnetpartikel-gebundenen Zellen aus der Zellisolationseinrichtung 118' in das Sammelbehältnis 135' wie bereits erwähnt auch während der Sitzung mehrfach nahezu gefahrlos durchgeführt werden kann.

[0084] Um die Sicherheit des Patienten zusätzlich hoch zu halten, ist an der Außenseite der Ableitung 117b' der Leukozyten-Fraktionsleitung 117' erfindungsgemäß eine Sicherheitsseinrichtung 143 angeordnet. Magnetpartikel, die nicht in der Zellisolationseinrichtung 118' abgetrennt wurden, werden durch das Magnetfeld eines in der Sicherheitseinrichtung 143 befindlichen Magneten abgefangen.

[0085] In der Fig. 5 ist eine weitere Variante dargestellt, die im Wesentlichen eine Erweiterung der Ausführungsformen aus der Fig. 1 bzw. der Fig. 3 ist. Sofern nicht anders angegeben, entsprechen die Bezugszeichen der Fig. 5 jenen aus der Fig. 1 bzw. der Fig. 3. Bei dieser Variante weist die Vorrichtung zwei redundante Adsorptionssäulen 118a, 118b auf, die über Luerlo-ckanschlüsse 119a",119" an die Zuleitung 117a" bzw. 117b" der Leukozyten-Fraktionsleitung 117" angeschlossen sind. Stromauf- und stromab der Adsorptionssäulen 118a, 118b sind Dreiwegeventile 160, 161, 162, 163 angeordnet. Die Zuleitung 130" für Elutionsmittel bzw. isotonische Kochsalzlösung mündet dabei in die Dreiwegeventile 160, 161 und die Ableitung 134" in die Dreiwegeventile 162,163.

[0086] Durch entsprechende Stellung der Dreiwegeventile 160,161,162,163 kann die Leukozytenfraktion eine Säule passieren, während die andere mit Elutionsmittel bzw. isotonischer Kochsalzlösung gespült wird und vice versa. Das Eluieren wurde bereits in der Beschreibung zur Fig. 3 eingehend erklärt und ist in dieser Weise auch für diese Variante anwendbar. Bei dieser Variante kann beispielsweise durch Öffnen der Dreiwegeventile 160,163 für den Leukozytenfluss (und Schließen der Dreiwegeventile 161,162) der Leukozytenfluss durch die Adsorptionssäule 118a aber nicht durch die Adsorptionssäule 118b fließen. Die Dreiwegeventile 161, 162 sind in dieser Stellung hingegen für das Elutionsmittel passierbar, welches aus dem Reservoir 131 mittels einer Pumpe 137 in die Adsorptionssäule 118b geleitet wird. Die in der Adsorptionssäule 118b adsorbierten Zellen werden desorbiert und in einem sterilen Sammelbehältnis 135 aufgefangen. Nach dem Elutionsvorgang kann die Adsorptionssäule 118b mit isotonischer Kochsalzlösung aus dem Reservoir 132 gespült werden, wobei die Lösung in einem Auffangbehältnis 150 aufgefangen wird.

[0087] Sind alle Dreiwegeventile 160, 161, 162, 163 für den Leukozytenfluss offen, dann können beide Adsorptionssäulen 118a, 118b simultan Zellen isolieren. Am Ende der Sitzung und nach Abhängen des Spenders/Patienten vom Gerät können die Zellen aus beiden Säulen gleichzeitig zu eluiert werden.

[0088] Um auch hier eine ausreichende Sicherheit zu gewährleisten sind in den Zu- und Ableitungen 130", 134" zusätzlich Schlauchklemmen 145, 146, 147, 148, 149 vorgesehen, um den Zugang zu den einzelnen Reservoirs 131, 132 bzw. Sammelbehältnissen 135,150 sperren zu können.

[0089] Die oben beschriebenen Verwirklichungen sind nur Beispiele unter vielen und folglich nicht als einschränkend zu betrachten. 13/23

BEZUGSZEICHENLISTE

Fig.1 100 Zellseparationsgerät 101 Zentrifugenteil 102 Sammeleinrichtung - Leukozyten 103 Leukozyten-Sammelleitung von Zentrifuge zur Sammeleinrichtung 104 Erythrozytenleitung 105 Plasmaleitung 106 Leukozytenpumpe 107 Erythrozytenpumpe 108 Plasmapumpe 109 Rückführeinrichtung 110 Blutzulauf 111 Blutpumpe 112 Reservoir Antikoagulationsmittel 113 Zuführleitung für Antikoagulationsmittel 114 Blutablauf 115 Steuerung des Zellseparationsgerätes 117 Leukozyten-Fraktionsleitung 117a Zuleitung Leukozyten-Fraktionsleitung 117b Ableitung Leukozyten-Fraktionsleitung 118 Zellisolationseinrichtung - Adsorbtionssäule 119 Luerlockanschlüsse 121 Luftblasendetektor 144 Sicherheits-Schlauchventil 155 Pumpe für Antikoagulationsmittel 14/23

oiteüsäisd'is patenuimt AT505 946 B1 2009-08-15

Fig.3 117 c Leukozytenfraktionsleitung 130 Zuleitung Elutionsmittel/Phys NaCI-Lösung 131 Elutionsmittelreservoir 132 Phys. NaCI-Lösung 133 3-Wege-Ventil 134 Ableitung Elutuionsmittel + Zellen 134a Ableitung (Alternative Ausführungsform) 134b Zuleitung (Alternative Ausführungsform) 135 Sammelbehältnis Zellen 136 Dreiwegeventil 136' Dreiwegeventil 137 Pumpe 150 Auffangbehältnis 145,146,147,148,149 Schlauchklemmen

Fig. 4 (siehe auch Fig. 3) 117a' Zuleitung Fraktionsleitung 117b' Ableitung Fraktionsleitung 117' Leukozyten-Fraktionsleitung 118' Zellisolationseinrichtung - Magnetpartikelabscheidung 119' Luerlockanschlüsse 130' Zuleitung Elutionsmittel/Phys. NaCI-Lösung 131' Kochsalzlösung Reservoir 132' Elutionsmittel Resveroir 134' Ableitung für Magnetpartikel-gebundene Zellen 135' Sammelbehältnis Magnetpartikel-gebundene Zellen 15/23

0ίίΚ»ϊϊβ(ϊ5ί!'Κ patenuimt AT505 946 B1 2009-08-15 136a Dreiwegeventil 136a' Dreiwegeventil 137 Pumpe 140 Zuleitung Magnetpartikel 141 Magnetpartikel-Reservoir 142 Magnetpartikelpumpe 143 Sicherheitssystem mit Magnet 145',146',147',148' Schlauchklemmen

Fig.5 117a" Zuleitung Fraktionsleitung 117b" Ableitung Fraktionsleitung 117" Leukozyten-Fraktionsleitung 118a erste Adsorptionssäule 118b zweite Adsorptionssäule 119" Luerlockanschlüsse 130" Zuleitung Elutionsmittel 134" Ableitung Elutionsmittel 160,161,162,163 Dreiwegeventile 16/23

Claims (7)

1. oiteüsäisd'is patenuimt AT505 946 B1 2009-08-15 Patentansprüche 1. Vorrichtung zum kontinuierlich durchführbaren, spezifischen Isolieren von Blutzellen, aufweisend: - ein extrakorporales kontinuierliches Zellseparationsgerät (100) zur Auftrennung von Blut in Fraktionen mit einer Separationseinrichtung (101), einer Sammeleinrichtung (102) für zumindest eine abzutrennende Leukozytenfraktion und einer Rückführeinrichtung (109) für nicht abzutrennende Fraktionen, - einen extrakorporalen Blutkreislauf mit einem Blutzulauf (110) zur Separationseinrichtung (101) des Zellseparationsgeräts (100) für kontinuierlich zugeführtes Blut, und einem Blutablauf (114) ausgehend von der Rückführeinrichtung (109) für nicht abzutrennende, kontinuierlich zurückzuführende Fraktionen, - eine Leukozyten-Fraktionsleitung (117'), welche sich ausgehend von der Sammeleinrichtung (102) des Zellseparationsgerätes (100) in die Rückführeinrichtung (109) erstreckt, und von der Leukozytenfraktion kontinuierlich durchfließbar ist, und die Leukozytenfraktion weiters kontinuierlich gemeinsam mit den nicht abzutrennenden Fraktionen über den Blutablauf (114) rückführbar ist, und wobei in der Leukozyten-Fraktionsleitung (117') zumindest eine Zellisolationseinrichtung (118') angeordnet ist, und die Zellisolationseinrichtung (118') auf einer Abtrennung spezifisch zell-bindender Magnetpartikel durch ein Magnetfeld beruht und weiters dazu eingerichtet ist, Blutzellen kontinuierlich und spezifisch auf Grundlage biomolekularer Wechselwirkungen aus der Leukozytenfraktion abzutrennen und abzuführen, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Sicherheitseinrichtung (143) zum Einfangen von nicht in der zumindest einen Zellisolationseinrichtung (118') abgetrennten Magnetpartikeln aufweist, wobei die Sicherheitseinrichtung (143) an der Leukozyten-Fraktionsleitung (117') stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung (118') angeordnet ist und einen Magneten zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Inneren der Leukozyten-Fraktionsleitung (117’) aufweist.
2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sicherheitseinrichtung an der Außenseite der Leukozyten-Fraktionsleitung (117') angeordnet ist.
3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Leukozytenfraktionsleitung (117') sich durchgehend durch die Sicherheitseinrichtung (143) erstreckt.
4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Fluoreszenzdetektor zum Detektieren mittels der Sicherheitseinrichtung (143) eingefangener, fluoreszenzmarkierter Magnetpartikel.
5. 5. Verfahren zum kontinuierlichen, spezifischen Isolieren von Blutzellen mittels einer Vorrichtung zum kontinuierlich durchführbaren, spezifischen Isolieren von Blutzellen, die folgenden Schritte aufweisend: - Auftrennung von Blutbestandteilen von mittels eines Blutzulaufs (110) kontinuierlich zugeführtem Blut in Fraktionen in einer Separationseinheit (101) einer extrakorporalen, kontinuierlichen Zellseparationseinrichtung (100); - Sammeln zumindest einer abzutrennenden Leukozytenfraktion in einer Sammeleinrichtung (102) der Zellseparationseinrichtung (100), Entnehmen aus der Sammeleinrichtung (102) und spezifisches Abtrennen darin befindlicher Blutzellen auf Grundlage biomolekularer Wechselwirkungen; - Zuführen nicht abzutrennender Fraktionen in eine Rückführeinrichtung (109); und - kontinuierliches Rückführen der nicht abzutrennenden Fraktionen mittels eines von der Rückführeinrichtung (109) abgehenden Blutablaufs (114), - kontinuierliches Zuführen der Leukozytenfraktion aus der Sammeleinrichtung (102) in eine Leukozyten-Fraktionsleitung (117'), wobei die Leukozytenfraktion die Fraktionsleitung 17/23 &t£S!»Cilsl5Che AT505 946B1 2009-08-15 (117') kontinuierlich durchfließt; - spezifisches Abtrennen von Blutzellen aus der Leukozytenfraktion auf Grundlage biomolekularer Wechselwirkungen mittels zumindest einer in der Fraktionsleitung befindlichen Zellisolationseinrichtung (118'), welche auf einer Abtrennung spezifisch Zell-bindender Magnetpartikel durch ein Magnetfeld beruht; und - Leiten der Leukozytenfraktion aus der Fraktionsleitung (117') in die Rückführeinrichtung (109), wobei die Leukozytenfraktion gemeinsam mit den nicht-abzutrennenden Fraktionen kontinuierlich über den Blutablauf (114) rückgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die in der zumindest einen Zellisolationseinrichtung (118') nicht abgetrennten Magnetpartikel durch ein Magnetfeld im Inneren der Leukozytenfraktionsleitung (117') stromab der zumindest einen Zellisolationseinrichtung (118') eingefangen werden.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussgeschwindigkeit des Blutes im extrakorporalen Blutkreislauf auf 40-50 ml/min und die Flussgeschwindigkeit der Leukozytenfraktion in der Leukozytenfraktionsleitung (117') auf 3-6 ml/min eingestellt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mittels der Sicherheitseinrichtung (143) eingefangenen Magnetpartikel fluoreszenzmarkiert sind und mittels eines Fluoreszenzdetektors detektiert werden. Hierzu 5 Blatt Zeichnungen 18/23