WO2021132213A1 - 細胞外小胞の回収方法、および採血管 - Google Patents

細胞外小胞の回収方法、および採血管 Download PDF

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WO2021132213A1
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chelating agent
nonionic surfactant
extracellular vesicles
whole blood
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然 顧
達俊 犬塚
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富士レビオ株式会社
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    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting extracellular vesicles, a blood collection tube, and the like.
  • Extracellular vesicles are tiny vesicles with a membrane structure secreted from various types of cells and are present in body fluids such as blood.
  • extracellular vesicles secreted extracellularly for example, exosomes, exosomes, and apoptosis vesicles are known. Since extracellular vesicles contain various substances that carry out functions such as signal transduction between cells, they have been analyzed for purposes such as diagnosis and drug discovery. Therefore, there is a need to develop a method useful for collecting extracellular vesicles that can be applied to such analysis.
  • Patent Document 1 describes an immune response between extracellular vesicles and anti-CD antibody in buffer (more specifically, the use of magnetic particles and wash buffer provides a liquid medium from serum to buffer. It is described that non-specific adsorption in (immune reaction between the exchanged extracellular vesicle-containing buffer solution) and the anti-CD antibody) can be suppressed by a nonionic surfactant (Test Example 4, FIG. 2).
  • Patent Document 2 states that although the amount of extracellular vesicles recovered can be improved in the presence of a low concentration of EDTA (chelating agent) of less than about 3.0 mg / mL (about 8 mM), a higher concentration of EDTA is present. It is described below that not only the recovery amount of extracellular vesicles cannot be improved, but rather the recovery amount is significantly reduced (Example 1, FIGS. 1A to 1C).
  • EDTA chelating agent
  • plasma and serum which can be prepared from whole blood, are widely used as blood samples. It is also widely known that hemolysis caused by the destruction of red blood cells affects the results of blood tests, and it is recognized that hemolysis should be avoided. Further, in the treatment of whole blood for preparing a blood sample, a blood collection tube is widely used in clinical practice from the viewpoint of convenience and speed of treatment.
  • An object of the present invention is to provide a method useful for collecting extracellular vesicles.
  • the present inventors have found that the amount of extracellular vesicles recovered from whole blood can be remarkably improved by mixing a nonionic surfactant and a chelating agent with whole blood.
  • Patent Document 1 describes that nonionic surfactant can suppress nonspecific adsorption in the immune reaction between extracellular vesicles and anti-CD antibody in the buffer solution.
  • Patent Document 1 states that whole blood is mixed with a nonionic surfactant (the nonionic surfactant is allowed to act on whole blood), and that the mixing can improve the recovery amount of extracellular vesicles. Is not described.
  • the improvement of the recovery amount of extracellular vesicles from whole blood by mixing a nonionic surfactant and a chelating agent with whole blood and the suppression of non-specific adsorption in the immune reaction are independent effects.
  • Patent Document 1 does not teach or suggest the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • Method for collecting extracellular vesicles including the following: (1) Mixing whole blood with a nonionic surfactant and a chelating agent to produce a mixed solution containing extracellular vesicles, a nonionic surfactant and a chelating agent; and (2) the mixed solution. Isolating extracellular vesicles from.
  • the nonionic surfactant having a polyoxyethylene alcohol structure is alcohol ethoxylate.
  • the chelating agent is hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), nitrilotriacetic acid (NTA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) (EDTMP),
  • HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • HEDTA hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ETMP ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid)
  • the method of the present invention can significantly improve the amount of extracellular vesicles recovered from whole blood, and can also be expected to reduce or avoid hemolysis.
  • the blood collection tube of the present invention has high versatility that it can significantly improve the recovery amount of extracellular vesicles from whole blood and can be used not only for analysis of extracellular vesicles but also for ordinary blood tests. ..
  • the present invention provides methods for recovering extracellular vesicles, including: (1) Mixing whole blood with a nonionic surfactant and a chelating agent to produce a mixed solution containing extracellular vesicles, a nonionic surfactant and a chelating agent; and (2) the mixed solution. Isolating extracellular vesicles from.
  • Whole blood can be collected from animals.
  • animals include mammals (eg, primates such as humans and monkeys; rodents such as mice, rats and rabbits; ungulates such as cows, pigs, goats, horses and sheep, dogs and cats). Meat), birds (eg, chickens).
  • the animal is a mammal such as a human.
  • Whole blood contains extracellular vesicles. Therefore, mixing whole blood with a nonionic surfactant and a chelating agent produces a mixture containing extracellular vesicles, a nonionic surfactant and a chelating agent.
  • Extracellular vesicles are tiny vesicles with a membrane structure that are secreted by various types of cells.
  • Extracellular vesicles include, for example, exosomes, ectosomes, and apoptotic vesicles.
  • the extracellular vesicle is an exosome.
  • Extracellular vesicles can also be defined by their size.
  • the size of the extracellular vesicle is, for example, 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, and more preferably 80 to 200 nm.
  • the size of extracellular vesicles can be measured by NanoSight (manufactured by Malvern Instruments).
  • Extracellular vesicles can also be defined by extracellular vesicle markers.
  • extracellular vesicle markers include extracellular vesicle internal markers and surface markers.
  • internal markers for extracellular vesicles include cancer fetal antigen (CEA), CA125, CA15-3, actin family, TSG101, ALIX, Charged multive protein body protein (CHMP) family, Glyceraldehyde 3-phosphate HD , Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) family, AFP, CA19-9, Flotillin-I, Flotillin-II, Rab protein, promoted cell death (PDCD) 6, voltage-dependent scramblaze (PLSCR) family.
  • CEA cancer fetal antigen
  • CA125 CA125
  • CA15-3 actin family
  • actin family TSG101
  • ALIX Charged multive protein body protein
  • CHMP Charged multive protein body protein
  • PARP Poly (ADP-ribose) polymerase
  • Extracellular vesicles Family, Lamine family, Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Tubulin family, TATA binding protein (TBP), Voltage-dependent anion channel protein (VDAC), Amyloid beta, Tau protein.
  • PCNA Proliferating cell nuclear antigen
  • TBP TATA binding protein
  • VDAC Voltage-dependent anion channel protein
  • Tau protein Tau protein.
  • surface markers for extracellular vesicles include tetraspanin membrane proteins (extracellular vesicle membrane-specific four-transmembrane proteins, eg, CD9, CD63, CD81), extracellular matrix metalloprotease inducers (eg, CD147).
  • HSP Heat shock protein
  • MHC major tissue compatibility complex
  • LAMP lysosome-related membrane protein
  • IAM intercellular adhesion molecule
  • integrin integrin
  • ceramide cholesterol
  • phosphatidylserine examples include Annexins, Caveolin-I, and EpCAM.
  • the extracellular vesicle marker is preferably an extracellular vesicle surface marker, more preferably a tetraspanin membrane protein, and even more preferably CD9.
  • hemolysis can be reduced or avoided by using a nonionic surfactant among the surfactants.
  • a nonionic surfactant any nonionic surfactant can be used, but a nonionic surfactant having a polyoxyethylene alcohol structure is preferably used.
  • Non-ionic surfactant having a polyoxyethylene alcohol structure preferably, -O - straight containing - (CH 2 -CH 2 -O-) x -H structure represented by (polyoxyethylene alcohol structure) It is a chain or branched chain compound (a compound that does not contain a cyclic structure).
  • x is an integer of 1 or more, preferably an integer of 10 or more, more preferably an integer of 20 or more, even more preferably an integer of 30 or more, and particularly preferably an integer of 40 or more. May be good.
  • x is also an integer of 400 or less, preferably an integer of 350 or less, more preferably an integer of 300 or less, even more preferably an integer of 280 or less, and particularly preferably an integer of 270 or less.
  • x is an integer of 1 to 400, preferably an integer of 10 to 350, more preferably an integer of 20 to 300, even more preferably an integer of 30 to 280 or less, and particularly preferably 40 to 270 or less. It may be an integer of. In the present specification, the value of x shall indicate an average value.
  • the nonionic surfactant having a polyoxyethylene alcohol structure may consist of only a single bond or may contain an unsaturated bond (double / triple bond), but only from a single bond.
  • Compounds are preferred.
  • Such a compound may contain, for example, an alkyl structure (straight chain or branched chain) and / or a polyoxyalkylene structure (straight chain or branched chain) as a structure other than the polyoxyethylene alcohol structure.
  • the alkyl structure may be, for example, a C 6 to 31 alkyl structure, preferably a C 6 to 31 linear alkyl structure.
  • the alkylene in the polyoxyalkylene structure may be, for example, C 1 to 6 alkylene.
  • C 1 to 6 alkylene examples include C 1 alkylene (methylene), C 2 alkylene (ethylene group, ethylidene group), C 3 alkylene (propylene, propylene, trimethylene, isopropylene), and C 4 alkylene (eg, tetramethylene). ), C 5 alkylene (eg, pentamethylene), C 6 alkylene (eg, hexamethylene).
  • Such a compound may consist of a carbon atom, a hydrogen atom, and an oxygen atom.
  • nonionic surfactant having a polyoxyethylene alcohol structure examples include alcohol ethoxylate and a polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer (eg, polyoxyethylene-polyoxypropylene). Block copolymer).
  • Alchol ethoxylate is also called poly (oxyethylene) alkyl ether, and is a compound in which a hydrophilic polyoxyethylene (POE) chain and a hydrophobic alkyl group are bonded by an ether bond.
  • Alchol ethoxylate can be represented by the following formula (1).
  • the values of x1, y1 and z1 shall indicate average values.
  • x1 is an integer of 1 or more, preferably an integer of 10 or more, more preferably an integer of 20 or more, even more preferably an integer of 30 or more, and particularly preferably an integer of 40 or more. May be good. x1 is also an integer of 300 or less, preferably an integer of 250 or less, more preferably an integer of 200 or less, even more preferably an integer of 150 or less, and particularly preferably 100 or less, 80 or less, It may be an integer of 60 or less, or 50 or less. More specifically, x1 is an integer of 1 to 300, preferably an integer of 10 to 250, more preferably an integer of 20 to 200, even more preferably an integer of 30 to 150 or less, particularly preferably 40 to 100. It may be an integer of 40-80, 40-60, or 40-50.
  • Y1 is an integer of 0 or more, preferably an integer of 1 or more, and more preferably an integer of 5 or more. y1 may also be an integer of 30 or less, preferably an integer of 20 or less, and more preferably an integer of 13 or less. More specifically, y1 may be an integer of 0 to 30, preferably an integer of 1 to 20, and even more preferably an integer of 5 to 13.
  • Z1 is an integer of 0 or more, preferably an integer of 1 or more.
  • z1 is also an integer of 15 or less, preferably an integer of 10 or less, which may be 7. More specifically, z1 may be an integer of 0 to 15, preferably an integer of 1 to 10, and even more preferably an integer of 1 to 7.
  • y1 and z1 may satisfy the relationship of y1 ⁇ z1. y1 and z1 may also satisfy the relationship that y1 + z1 is an integer of 5 to 30. Preferably, y1 + z1 may satisfy the relationship which is an integer of 10 to 14.
  • the alcohol ethoxylate may be either a branched chain alcohol ethoxylate or a straight chain alcohol ethoxylate.
  • the alcohol ethoxylate may be a branched chain alcohol ethoxylate.
  • the branched-chain alcohol ethoxylate corresponds to a compound represented by the above formula (1) in which y1 is an integer of 1 or more and z1 is an integer of 1 or more.
  • examples of such branched-chain alcohol ethoxylates include polyoxyethylene (40) sec-tridecyl ether.
  • Specific examples of such branched-chain alcohol ethoxylates include TERGITOR® series compounds such as Tergitol 15-S-40.
  • the linear alcohol ethoxylate corresponds to the compound in which z1 is 0 in the compound represented by the above formula (1).
  • Specific examples of linear alcohol ethoxylates include BRIJ® series compounds such as BrijS100.
  • the linear alcohol ethoxylate can also be expressed by the following formula (1').
  • x1 and y1 in the formula (1') are the same as the preferred examples of x1 and y1 in the formula (1), respectively.
  • the compound represented by the formula (1) is as follows.
  • x1 is an integer from 40 to 100; y1 is an integer greater than or equal to 0; z1 is an integer greater than or equal to 0; y1 ⁇ z1; y1 + z1 is an integer of 5 to 30. (Preferable ranges of x1, y1 and z1 are the same as described above.)
  • examples of the alcohol ethoxylate corresponding to the compound represented by the formula (1) include Tergitol 15-S-40 and BrijS100.
  • the alcohol ethoxylate is Tergitol 15-S-40.
  • Polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer is a block copolymer containing a polyoxyethylene block and a polyoxyalkylene block.
  • the alkylene in the polyoxyalkylene block may be, for example, C 1 to 6 alkylene, for example, C 1 alkylene (methylene), C 2 alkylene (ethylene, ethylidene), C 3 alkylene (propylene, propylene, trimethylene, isopropy). LIDEN), C 4 alkylene (eg tetramethylene), C 5 alkylene (eg pentamethylene), C 6 alkylene (eg hexamethylene).
  • polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer examples include block copolymers having a structure of HO- [polyoxyethylene block]-[polyoxyalkylene block]-[polyoxyethylene block] -OH. Be done.
  • the polyoxyethylene-polyoxyalkylene block copolymer may preferably be a polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer.
  • Polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer is a compound represented by the following formula (2).
  • x2, y2, z2 are integers of 1 or more).
  • the values of x2, y2 and z2 shall indicate average values.
  • X2 and z2 are integers of 1 or more, respectively.
  • the sum of x2 and z2 is an integer of 2 or more, preferably an integer of 20 or more, more preferably an integer of 80 or more, and particularly preferably an integer of 150 or more.
  • the sum of x2 and z2 is also an integer of 400 or less, preferably an integer of 350 or less, more preferably an integer of 300 or less, and particularly preferably an integer of 270 or less. More specifically, the sum of x2 and z2 may be an integer of 2 to 400, preferably an integer of 20 to 350, more preferably an integer of 80 to 300, and particularly preferably an integer of 150 to 270.
  • y2 is an integer of 1 or more, preferably an integer of 5 or more, more preferably an integer of 10 or more, even more preferably an integer of 15 or more, and particularly preferably an integer of 20 or more. May be good. y2 is also an integer of 200 or less, preferably an integer of 150 or less, more preferably an integer of 100 or less, even more preferably an integer of 80 or less, and particularly preferably an integer of 70 or less. You may. More specifically, x1 is an integer of 1 to 200, preferably an integer of 5 to 150, more preferably an integer of 10 to 100, even more preferably an integer of 15 to 80 or less, particularly preferably 20 to 70. It may be an integer.
  • polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer examples include poloxamer 188, poloxamer 388, and poloxamer 407.
  • Specific examples of the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer include compounds of the PLURONIC® series such as Pluronic F68, Pluronic F108, and Pluronic F127.
  • the compound represented by the formula (2) is as follows.
  • x2 is an integer greater than or equal to 1; y2 is an integer of 15-80;
  • z2 is an integer greater than or equal to 1;
  • x2 + z2 is an integer of 80 to 280. (The preferred range of x2, y2 and z2 is the same as above.)
  • examples of the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer corresponding to the compound represented by the formula (2) include poloxamer 188 (eg, Pluronic F68) and poloxamer 108 (eg, Pluronic F38). ), Poloxamer 217 (eg, Pluronic F77), poloxamer 237 (eg, Pluronic F87), poloxamer 238 (eg, Pluronic F88), poloxamer 288 (eg, Pluronic F98), poloxamer 388 (eg, Pluronic F108), poloxamer 40.
  • Pluronic F127 can be mentioned.
  • the polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer includes poloxamer 188 (eg, Pluronic F68), poloxamer 388 (eg, Pluronic F108), and poloxamer 407 (eg, Pluronic F127).
  • poloxamer 188 eg, Pluronic F68
  • poloxamer 388 eg, Pluronic F108
  • poloxamer 407 eg, Pluronic F127.
  • the nonionic surfactant may be an HLB 18 or higher nonionic surfactant.
  • HLB value 18 or more
  • extracellular vesicles can be recovered while more easily avoiding lysis of blood cell components.
  • erythrocytes contain EV-related proteins such as tetraspanin protein containing CD9 and other proteins that may become impurities, they are blood cell components when recovering extracellular vesicles. It is desirable to avoid lysis of red blood cells.
  • the HLB value can be determined by the Griffin method.
  • nonionic surfactant alchol ethoxylate / polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer
  • compound represented by the above formula (1) or (2) is shown below. That's right.
  • one kind of nonionic surfactant may be used, or a plurality of kinds (eg, two kinds, three kinds, four kinds) of nonionic surfactants may be used in combination.
  • the concentration of the nonionic surfactant when the nonionic surfactant is allowed to act on the whole blood is the amount of extracellular vesicles recovered from the whole blood by using the nonionic surfactant in combination with the chelating agent.
  • the concentration is not particularly limited as long as the concentration can improve.
  • the concentration of the nonionic surfactant when the ionic surfactant is allowed to act on the whole blood is the same as the concentration of the nonionic surfactant in such a mixed solution.
  • the concentration of the chelating agent when the nonionic surfactant is allowed to act on the whole blood can be defined as the concentration of the nonionic surfactant in such a mixed solution.
  • concentration of the nonionic surfactant is 0.02 W / V% or more, 0.04 W / V% or more, 0.06 W / V% or more, 0.08 W / V% or more, 0.1 W / V or more.
  • % Or more, 0.2 W / V% or more, or 0.5 W / V% or more. Such concentrations are also 8 W / V% or less, 6 W / V% or less, 5 W / V% or less, 4 W / V% or less, 3 W / V% or less, 2 W / V% or less, or 1 W / V% or less. There may be. More specifically, the concentrations of the nonionic surfactants are 0.02 to 8 W / V%, 0.04 to 6 W / V%, 0.06 to 5 W / V%, 0.08 to 4 W / V. %, 0.1 to 3 W / V%, 0.2 to 2 W / V%, or 0.5 to 1 W / V%.
  • the chelating agent is a compound or a salt thereof having a coordination portion capable of coordinating with a metal ion.
  • the number of coordination portions is preferably 2 or more, more preferably 3 or more (eg, 3 or 6).
  • Examples of the coordinating atom as the coordinating portion include an oxygen atom, a phosphorus atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a chlorine atom.
  • the coordination atom is preferably an oxygen atom or a phosphorus atom, and more preferably an oxygen atom.
  • the coordinating group as the coordinating portion include the group having the coordinating atom.
  • the coordinating group is preferably a carboxylic acid group or a phosphoric acid group, and more preferably a carboxylic acid group.
  • the chelating agent examples include hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), nitrilotriacetic acid (NTA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) (EDTMP), and the like.
  • the salt include metal salts (eg, monovalent metal salts such as sodium salt and potassium salt, and divalent metal salts such as calcium salt and magnesium salt) and inorganic salts (eg, fluoride, chloride, etc.).
  • Halogen salts such as bromide and iodide, and ammonium salts
  • organic salts eg, ammonium salts substituted with alkyl groups
  • acid addition salts eg, sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitrate, phosphoric acid.
  • Salts with inorganic acids such as acetic acid, oxalic acid, lactic acid, citric acid, trifluoromethanesulfonic acid, and organic acids such as trifluoroacetic acid).
  • the chelating agent may be a chelating agent that is widely used as a component contained in a blood collection tube for clinical examination.
  • chelating agents include EDTA, EGTA, NTA, HEDTA, EDTMP, HIDA, citric acid and salts thereof.
  • the use of such chelating agents is also desirable from the viewpoint of clinical application.
  • one kind of chelating agent may be used alone, or a plurality of kinds (eg, two kinds, three kinds, four kinds) of chelating agents may be used in combination.
  • the concentration of the chelating agent when the chelating agent is allowed to act on the whole blood is particularly high as long as the amount of extracellular vesicles recovered from the whole blood can be improved by using the chelating agent in combination with the nonionic surfactant. Not limited.
  • the chelate in light of the fact that mixing whole blood with a nonionic surfactant and a chelating agent produces a mixed solution containing extracellular vesicles, a nonionic surfactant and a chelating agent, the chelate.
  • the concentration of the chelating agent when the agent is allowed to act on the whole blood is the same as the concentration of the chelating agent in such a mixed solution.
  • the concentration of the chelating agent when the chelating agent is allowed to act on the whole blood can also be defined as the concentration of the chelating agent in such a mixed solution.
  • concentration of the chelating agent varies depending on factors such as the type and concentration of the nonionic surfactant used in combination with the chelating agent, but is, for example, 10 mM to 1000 mM.
  • the concentration of the chelating agent may be 20 mM or more, 30 mM or more, 40 mM or more, 50 mM or more, 60 mM or more, 80 mM or more, or 100 mM or more.
  • Such concentrations may also be 800 mM or less, 600 mM or less, 500 mM or less, 450 mM or less, 400 mM or less, 350 mM or less, or 300 mM or less. More specifically, the concentration of the chelating agent may be 20-800 mM, 30-600 mM, 40-500 mM, 50-450 mM, 60-400 mM, 80-350 mM, or 100-300 mM.
  • Mixing in step (1) can be performed in any format.
  • mixing can be done by inversion mixing and / or stirring.
  • the order of mixing whole blood and the nonionic surfactant and chelating agent is not particularly limited.
  • mixing may be carried out by first mixing whole blood with one of the nonionic surfactants or chelating agents and then with the other.
  • Mixing may also be done by mixing whole blood with a mixture of nonionic surfactant and chelating agent.
  • the mixing time is not particularly limited as long as it is sufficient for mixing whole blood and the nonionic surfactant and chelating agent, and may be, for example, 1 second to 30 minutes, preferably 30 seconds to 5 minutes. ..
  • the temperature at the time of mixing may be, for example, 4 to 37 ° C, preferably 15 to 30 ° C.
  • the standing time may be, for example, 1 second to 60 minutes, preferably 5 seconds to 20 minutes.
  • the mixing can be performed after the whole blood has been placed in a blood collection tube containing a nonionic surfactant and a chelating agent (preferably a vacuum blood collection tube sealed by a sealing means).
  • a nonionic surfactant and a chelating agent preferably a vacuum blood collection tube sealed by a sealing means.
  • inversion mixing is preferable. Details of the blood collection tube will be described later.
  • the separation in step (2) can be performed in any manner.
  • the separation may be performed by any of the following (A) to (C): (A) Separation of supernatant from mixed solution; (B) Use of a substance that binds to the extracellular vesicle surface marker for the mixture; or (C) Separation of the supernatant from the mixture and binding to the extracellular vesicle surface marker for the supernatant. Use of substances.
  • the supernatant can be separated from the mixed solution by any method.
  • a method include centrifugation of the mixed solution and standing of the mixed solution. From the viewpoint of rapidly obtaining a clear supernatant, it is preferable to separate the supernatant from the mixture after centrifuging the mixture.
  • Centrifugation can be performed under normal centrifugation conditions. Such conditions vary depending on factors such as the radius of gyration of the rotor of the centrifuge, but 10 at a rotation speed of 100 to 100,000 ⁇ g (preferably 200 to 5,000 ⁇ g). Conditions of seconds to 1 hour (preferably 1 to 10 minutes) and 40 ° C. or lower (preferably 30 ° C. or lower) can be adopted.
  • the supernatant thus obtained can contain a chelating agent and a surfactant in addition to the extracellular vesicles.
  • concentration of the chelating agent and the surfactant in the supernatant thus obtained may be the same as the concentration of the chelating agent and the surfactant in the mixture.
  • substances that bind to the surface markers of extracellular vesicles include antibodies against the above-mentioned extracellular vesicle surface markers, aptamers, phosphatidylserine-binding proteins, and ceramide-binding proteins.
  • a substance that binds to the surface marker of extracellular vesicles a single substance or a plurality of types (eg, 2 types, 3 types, 4 types) of substances can be used.
  • the substance that binds to the surface marker of the extracellular vesicle is an antibody against the surface marker of the extracellular vesicle from the viewpoint of ensuring specificity for the surface marker of the extracellular vesicle and easiness of preparation.
  • Antibodies include, for example, full-length antibodies (eg, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies) and antigen-binding fragments thereof.
  • the antigen-binding fragment may be any antibody fragment that maintains binding to the extracellular vesicle surface marker of interest, and examples thereof include Fab, Fab', F (ab') 2 , scFv and the like.
  • a single antibody or a plurality of types (eg, 2 types, 3 types, 4 types) of antibodies can be used.
  • the substance (preferably an antibody) that binds to the surface marker of the extracellular vesicle may be immobilized on a solid phase for facilitating the separation of the extracellular vesicle.
  • the solid phase include beads and particles (eg, cepharose beads, agarose beads, magnetic beads (magnetic particles)) and supports (eg, plates such as plastic plates, membranes).
  • the substance can be fixed to the solid phase by any method.
  • the substance that binds to the extracellular vesicle surface marker immobilized on the solid phase is mixed with a mixed solution containing the extracellular vesicle, and the substance that binds to the extracellular vesicle surface marker and the extracellular vesicle are combined.
  • extracellular vesicles can be separated from the mixture.
  • extracellular vesicles can be separated from the mixed solution by centrifuging after forming the complex and removing the supernatant.
  • extracellular vesicles may be separated from the mixed solution by collecting magnetism after forming the complex and removing the supernatant.
  • extracellular vesicles can be separated from the mixed solution by removing the mixed solution after the formation of the complex.
  • the present invention also provides methods for analyzing extracellular vesicles, including: (1) Mixing whole blood with a nonionic surfactant and a chelating agent to produce a mixed solution containing extracellular vesicles, a nonionic surfactant and a chelating agent; (2) Isolate extracellular vesicles from the mixture; and (3) analyze extracellular vesicles.
  • the steps (1) and (2) in the analysis method of the present invention can be performed in the same manner as the steps (1) and (2) in the recovery method of the present invention.
  • the analysis of extracellular vesicles can be performed after the separation of extracellular vesicles or at the same time as the separation of extracellular vesicles.
  • the analysis target in the analysis of extracellular vesicles includes, for example, components contained in extracellular vesicles (eg, components contained inside extracellular vesicles, membrane components of extracellular vesicles, extracellular vesicles). The components present on the membrane surface) and the extracellular vesicles themselves (particles).
  • Analysis of components contained in extracellular vesicles can be performed qualitatively or quantitatively. Such an analysis is also a one-component or multi-component analysis.
  • Ingredients to be analyzed include, for example, proteins, nucleic acids (eg, RNA, DNA), sugars, lipids, amino acids, vitamins, polyamines, and peptides. According to the present invention, since the amount of extracellular vesicles recovered is increased, the components in the extracellular vesicles can be analyzed with high accuracy.
  • the analysis of the components can be performed by any method known in the art.
  • the component to be analyzed is a protein
  • examples of the analysis method include immunoassay and mass spectrometry.
  • Immunoassays include, for example, direct competition, indirect competition, and sandwich methods.
  • immunoassays include chemoluminescence immunoassay (CLIA) [eg, chemoluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)], immunoturbidimetric method (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competitive ELISA).
  • CLIA chemoluminescence immunoassay
  • TIA immunoturbidimetric method
  • EIA enzyme immunoassay
  • a proteome analysis may be performed.
  • the analysis method include a hybridization method using a probe, a gene amplification method using primers (eg, 2, 3, or 4 primers), and a mass spectrometry method. ..
  • the analysis method includes, for example, immunoassay and mass spectrometry. If multiple components are analyzed, a metabolome analysis may be performed.
  • Analysis of the extracellular vesicle itself can also be performed qualitatively or quantitatively.
  • the analysis of extracellular vesicles can be performed by an instrument such as a particle analyzer, an electron microscope, or a flow cytometer. In this case, the number of extracellular vesicle particles, the size and shape of the particles, and their distribution can be analyzed.
  • the present invention also provides a blood collection tube containing a nonionic surfactant and a chelating agent.
  • the blood collection tube an arbitrary form can be used, but a tubular form can be preferably used.
  • the tubular form of the blood collection tube preferably has an annular cross section (eg, circular, substantially circular).
  • the blood collection tube is a blood collection tube for clinical examination.
  • an unsealed blood collection tube and a vacuum blood collection tube sealed by a sealing means such as a rubber stopper or a film sheet can be used.
  • a vacuum blood collection tube sealed by the above-mentioned sealing means is preferable. ..
  • the degree of decompression in the vacuum blood collection tube can be appropriately set according to factors such as the amount of blood collected.
  • any material can be used as the material for the blood collection tube, and a colorless and transparent material can be preferably used.
  • a material for the blood collection tube examples include glass and plastic (eg, polyethylene terephthalate).
  • the size of the blood collection tube used in the present invention can be defined by the volume of whole blood that can be accommodated.
  • a blood collection tube having a size suitable for accommodating 1 to 10 mL of whole blood is widely used in clinical examinations. Therefore, in the present invention, a blood collection tube of such a size can be preferably used.
  • a blood collection tube having a size of less than 1 mL (for example, 0.5 mL or more and less than 1.0 mL) or a blood collection tube having a size of more than 10 mL (for example, more than 10 mL and less than 15 mL) can be appropriately used depending on the purpose. it can.
  • the details of the nonionic surfactant and chelating agent contained in the blood collection tube are the same as those described above in the method of the present invention.
  • the form of the nonionic surfactant and the chelating agent is not particularly limited as long as they are contained in the blood collection tube.
  • the nonionic surfactant and the chelating agent may be contained in the blood collection tube in the form of a liquid or a solid (eg, powder), respectively.
  • Nonionic surfactants and chelating agents may also be provided in a liquid or solid manner at the bottom of the blood collection tube and coated or impregnated inside the blood collection tube (and sealing means). It may be provided in the form.
  • the nonionic surfactant and the chelating agent contained in the blood collection tube may be one kind or a plurality of kinds (eg, two kinds, three kinds, four kinds), respectively.
  • the nonionic surfactant and chelating agent When whole blood is added to the blood collection tube and mixed with whole blood, the nonionic surfactant and chelating agent have the above-mentioned concentrations of the nonionic surfactant and the chelating agent in the mixed solution as described above. It is preferably contained in the blood collection tube in an achievable amount.
  • the amount of such a nonionic surfactant varies depending on factors such as the size of the blood collection tube and the volume of whole blood added, but is, for example, 0.1 to 2000 mg (0.1 mg to 1 mL of whole blood).
  • 200 mg preferably 0.2 to 1500 mg (0.2 mg to 150 mg per 1 mL of whole blood), more preferably 0.5 to 1000 mg (0.5 mg to 100 mg per 1 mL of whole blood), and even more preferably 1 to 700 mg (1 to 700 mg per 1 mL of whole blood). It may be 1 mg to 70 mg per 1 mL of whole blood), particularly preferably 2 mg to 500 mg (2 mg to 50 mg per 1 mL of whole blood).
  • the amount of such a chelating agent also varies depending on factors such as the size of the blood collection tube and the volume of whole blood added, but for example, 3.8 to 3800 mg (3.8 to 380 mg per 1 mL of whole blood).
  • It is preferably 7.6 to 1900 mg (7.6 to 190 mg per 1 mL of whole blood), more preferably 15.2 to 1500 mg (15.2 to 150 mg per 1 mL of whole blood), and even more preferably 30.4 to 1200 mg (whole blood). It may be 30.4 to 120 mg per 1 mL of blood), particularly preferably 60.8 to 1000 mg (60.8 to 100 mg per 1 mL of whole blood).
  • the chelating agent may be the above-mentioned chelating agent that is widely used as a component contained in a blood collection tube for clinical examination.
  • the use of such chelating agents in blood collection tubes is also desirable from the standpoint of clinical application.
  • the blood collection tube may further contain one or more general-purpose components other than the chelating agent contained in the blood collection tube for clinical examination. Therefore, the blood collection tube may further contain one or more general-purpose components selected from the group consisting of heparin or a salt thereof, and fluoride (eg, sodium fluoride). Examples of the salt include those described above.
  • the blood collection tube of the present invention containing a nonionic surfactant and a chelating agent can significantly improve the recovery amount of extracellular vesicles from whole blood, and thus can be used for analysis of extracellular vesicles. It is useful for the preparation of.
  • the blood collection tube of the present invention also contains a chelating agent, which is an anticoagulant component contained in a blood collection tube for a normal blood test, and a nonionic surfactant that enables reduction or avoidance of hemolysis, and thus extracellular. It is useful for preparing a highly versatile blood sample that can be used not only for vesicle analysis but also for ordinary blood tests. Since the blood collection tube of the present invention can be suitably used for the method of the present invention, it is useful for the simple and rapid implementation of the method of the present invention.
  • Each antibody-immobilized particle is suspended in a particle diluent (50 mM Tris buffer, 1 mM EDTA ⁇ 2Na, 0.1% NaN 3 , 2.0% BSA, pH 7.2), and each antibody-immobilized particle solution is prepared. Obtained.
  • the reaction mixture was purified using Superdex 200 column chromatography (General Electric) to obtain an ALP-labeled anti-CD9 antibody.
  • Each ALP-labeled antibody was suspended in labeled diluent (50 mM MES buffer, 150 mM NaCl 2 , 0.3 mM ZnCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 0.1% NaN 3 , 2.0% BSA, pH 6.8). Each labeled antibody solution was obtained.
  • the measurement method of the EV surface marker (CD9) in the following examples is as follows. 20 ⁇ L of the measurement sample and 50 ⁇ L of the anti-CD9 antibody-immobilized particle solution were dispensed into the reaction vessel and stirred. Then, the obtained mixed solution was incubated at 37 ° C. for 8 minutes (primary reaction), and B (bonded) / F (free) separation / washing was performed. 50 ⁇ L of ALP-labeled antibody was dispensed into a reaction vessel, stirred, and incubated at 37 ° C. for 8 minutes for B / F separation and washing.
  • Lumipulse (registered) containing the chemiluminescent substrate 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ′′ -phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane / 2-sodium salt (AMPPD).
  • a substrate solution (Fujirebio) was dispensed into a reaction vessel, stirred, incubated at 37 ° C. for 4 minutes, and then the amount of luminescence was measured with a luminometer. A count value was obtained as a measured value.
  • the amount of luminescence was measured by a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system (Lumipulse L2400 (Fujirebio)).
  • an antibody that recognizes the same epitope in CD9 was used. Since multiple CD9s are present on one extracellular vesicle, a sandwich immunoassay using an antibody that recognizes the same epitope as the immobilized antibody as an ALP-labeled antibody shows that a plurality of CD9s are used as surface markers instead of free CD9s. It is possible to measure extracellular vesicles that present CD9.
  • Example 1 Recovery of extracellular vesicles (EV) from whole blood to which a chelating agent was added A chelating agent was added to human whole blood, and after centrifugation, CD9 in the supernatant was measured.
  • the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA.2Na), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA), nitrilotriacetic acid (NTA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), and ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) (EDTMP). ), And hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA) was used.
  • EDTA.2Na ethylenediaminetetraacetic acid disodium
  • EGTA glycol etherdiaminetetraacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • HEDTA hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid
  • Example 2 Confirmation of the presence or absence of hemolysis in the whole blood to which the surfactant was added The presence or absence of hemolysis was confirmed by adding the surfactant to the human whole blood.
  • nonionic surfactants Tergitol 15-S-30, Brij 35, Pluronic F68, TWEEN20, and PVPK30 were used.
  • cationic surfactant octyltrimethylammonium bromide (C8TAB) and hexadecyltrimethylammonium chloride (C16TAC) were used.
  • N-decanoyl sarcosine sodium N-DSS (NDS)
  • N-lauroyl sarcosine sodium hydrate N-lauroyl sarcosine sodium hydrate
  • amphoteric surfactant CHAPS and N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate (C12APS) were used. More specifically, 900 ⁇ L of whole blood after blood collection was added to a polypropylene 5 mL test tube (manufactured by nunc) containing 100 ⁇ L of D-PBS ( ⁇ ) to which a surfactant was added.
  • the surfactant was added so that the final concentration after mixing with whole blood was 0.5 W / V%. After adding whole blood, the test tube was inverted and mixed, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was collected to visually confirm the presence or absence of hemolysis. As a result, it was confirmed that nonionic surfactants such as Tween, Brij, and tergitol do not cause hemolysis (Table 2).
  • Example 3 Recovery of EV from whole blood to which a chelating agent and a surfactant were added A chelating agent and a surfactant were added to human whole blood, and CD9 in the supernatant was measured after centrifugation. EDTA.2Na and EGTA were used as chelating agents. Tergitol 15-S-40 was used as the surfactant.
  • 100 ⁇ L of D-PBS (-) to which a chelating agent was added and 100 ⁇ L of D-PBS (-) to which a surfactant was added were placed in a polypropylene 5 mL test tube (manufactured by nunc), and the chelating agent and the surfactant were placed.
  • a blood collection tube model containing the above was prepared.
  • the chelating agent was set so that the final concentration after mixing with whole blood was 60 mM.
  • the surfactant was set so that the final concentration after mixing with whole blood was 0.5%.
  • 800 ⁇ L of whole blood after blood collection was added to this test tube (blood collection tube model). After adding whole blood, the test tubes are inverted and mixed, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), and the supernatant is collected by the method described in (Materials and Methods).
  • CD9 a surface marker protein for extracellular vesicles (EV), was measured.
  • a blood collection tube containing neither a chelating agent nor a surfactant and a blood collection tube containing a chelating agent but not containing a surfactant were prepared, and CD9 was measured in the same manner.
  • the supernatant prepared from whole blood to which the chelating agent and the surfactant have been added is prepared from the whole blood to which the chelating agent has been added and no surfactant has been added.
  • the count value was significantly higher than that of the supernatant (Table 3).
  • Example 4 Examination of Concentrations of Chelating Agent and Surfactant Various concentrations of chelating agent and surfactant were added to human whole blood, and CD9 in the supernatant after centrifugation was measured.
  • 100 ⁇ L of D-PBS (-) supplemented with various concentrations of EGTA and 100 ⁇ L of D-PBS (-) supplemented with various concentrations of Tergitol 15-S-40 were placed in a polypropylene 5 mL test tube (manufactured by nunc).
  • a tube collection model containing a chelating agent and a surfactant was prepared.
  • EGTA was set so that the final concentration after mixing with whole blood was 0, 10, 50, 100, 200 mM.
  • the Tergitol 15-S-40 was set so that the final concentration after mixing with whole blood was 0,0.1,0.25,1.0,2.0%.
  • 800 ⁇ L of whole blood after blood collection was added to this test tube (blood collection tube model).
  • the test tubes are inverted and mixed, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), and the supernatant is collected by the method described in (Materials and Methods).
  • CD9 a surface marker protein for extracellular vesicles (EV), was measured.
  • the chelating agent increased the reactivity in a concentration-dependent manner (Table 4).
  • Example 5 Examination of the action of the chelating agent and the surfactant It was confirmed whether the action of the chelating agent and the surfactant was on whole blood or on the immune reaction.
  • 125 ⁇ L of D-PBS (-) to which a chelating agent (EGTA) was added and 125 ⁇ L of D-PBS (-) to which a surfactant (tergitol 15-S-40) was added were added to a polypropylene 5 mL test tube (manufactured by nunc). ), And a blood collection tube model containing a chelating agent and a surfactant was prepared.
  • EGTA a chelating agent
  • tergitol 15-S-40 a surfactant
  • the chelating agent and the surfactant were set so that the final concentration after mixing with whole blood was the concentration shown in Table 6.
  • 1000 ⁇ L of whole blood after blood collection was added to this test tube (blood collection tube model).
  • the test tubes are inverted and mixed, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), and the supernatant is collected by the method described in (Materials and Methods).
  • CD9 a surface marker protein for extracellular vesicles (EV), was measured. Further, when measuring CD9, the measurement was also carried out by adding 100 mM EGTA to the CD9 antibody-immobilized particle solution.
  • the EGTA concentration during the primary reaction becomes 71.4 mM.
  • the EGTA concentration during the primary reaction becomes 57.1 mM. If EGTA acts during the immune response, the count value should be high even when EGTA is added to the CD9 antibody-immobilized particle solution.
  • any of the conditions [200 mM EGTA and 0% tergit technicallyl 15-s-40, and 200 mM EGTA and 1% tergitol 15-S-40] using a supernatant prepared from whole blood supplemented with a final concentration of 200 mM EGTA. Also, the count value was significantly higher than the condition using the supernatant prepared from whole blood to which the same concentration of EGTA was not added [0 mM EGTA and 0% tergit Albany Albany (%)” in Table 6).
  • Example 6 Examination of types of surfactants It was confirmed whether various nonionic surfactants could act on whole blood.
  • a surfactant Tergitol 15-S-40, Pluronic F68, Pluronic F108, and Pluronic F127 were used.
  • 125 ⁇ L of D-PBS (-) to which EGTA was added and 125 ⁇ L of D-PBS (-) to which various surfactants were added were placed in a polypropylene 5 mL test tube (manufactured by nunc) to form a chelating agent and a surfactant.
  • a blood collection tube model containing the above was prepared.
  • the chelating agent and the surfactant were set so that the final concentration after mixing with whole blood was the concentration shown in Table 7.
  • 1000 ⁇ L of whole blood after blood collection was added to this test tube (blood collection tube model).
  • the test tubes are inverted and mixed, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), and the supernatant is collected by the method described in (Materials and Methods).
  • CD9 a surface marker protein for extracellular vesicles (EV), was measured.
  • the supernatant prepared from whole blood to which a chelating agent and a surfactant have been added is prepared from whole blood to which a chelating agent has been added and no surfactant has been added.
  • the count value was significantly higher than that of the supernatant (Table 7).
  • the amount of EV present in the chelating agent and the supernatant prepared from the whole blood to which the surfactant was added is that the chelating agent is added and the surfactant is added. It is shown to be significantly increased compared to the amount of EV present in the supernatant prepared from unwhole blood. Therefore, it was shown that the amount of EV recovered can be significantly increased by adding a chelating agent and various surfactants to whole blood.
  • the present invention is useful for clinical examination of extracellular vesicles.

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Abstract

本発明は、細胞外小胞の回収に有用な手法を提供する。より具体的には、本発明は、下記（Ｉ）および（ＩＩ）を提供する。 （Ｉ）以下を含む、細胞外小胞の回収方法： （１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；ならびに （２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること。 （ＩＩ）非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管。

Description

細胞外小胞の回収方法、および採血管
　本発明は、細胞外小胞の回収方法、および採血管などに関する。
　細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ：ＥＶ）は、種々の種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｌｅｂ）が知られている。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含むことから、診断、創薬等の目的のために分析されている。よって、このような分析に応用することができる、細胞外小胞の回収に有用な手法の開発が求められている。
　例えば、特許文献１には、緩衝液における細胞外小胞と抗ＣＤ抗体の間の免疫反応（より具体的には、磁性粒子および洗浄緩衝液の使用により、血清から緩衝液へと液体媒体が交換された細胞外小胞含有緩衝液と、抗ＣＤ抗体との間の免疫反応）における非特異吸着が非イオン性界面活性剤により抑制できることが記載されている（試験例４、図２）。
　特許文献２には、約３．０ｍｇ／ｍＬ（約８ｍＭ）未満という低濃度のＥＤＴＡ（キレート剤）の存在下で細胞外小胞の回収量を向上できるものの、それより高濃度のＥＤＴＡの存在下では細胞外小胞の回収量を向上できないばかりか、むしろ、その回収量が著しく低下することが記載されている（実施例１、図１Ａ～１Ｃ）。
　ところで、臨床の血液検査の現場では、血液試料として、全血から調製可能である血漿および血清が汎用されている。また、赤血球の破壊により引き起こされる溶血が血液検査の結果に影響を与えることが広く知られているため、溶血が回避されるべきものとして認識されている。さらに、血液試料を調製するための全血の処理では、処理の簡便性および迅速性等の観点より、採血管が臨床の現場で汎用されている。
国際公開第２０１５／０６８７７２号 米国特許出願公開第２０１５／０１２５８６４Ａ１明細書
　本発明の目的は、細胞外小胞の回収に有用な手法を提供することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を全血と混合することで、全血からの細胞外小胞の回収量を顕著に向上できることを見出した。
　一般に、界面活性剤は、脂質二重膜を破壊するため赤血球の破壊による溶血を引き起こすことから、血液検査を前提とする全血の処理におけるその使用が忌避されるべきものと臨床の現場で認識されている。しかしながら、界面活性剤のなかでも非イオン性界面活性剤（特に、特定の非イオン性界面活性剤）を選択して使用することで溶血を回避し易くなることから、このような非イオン性界面活性剤をキレート剤と併用することで、全血からの細胞外小胞の回収量を顕著に向上できるばかりか、溶血の低減または回避も期待することができる。したがって、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を全血に適用することで、細胞外小胞の分析のみならず、通常の血液検査にも使用できる汎用性の高い血液試料を調製することができる。
　特許文献１には、上述のとおり、緩衝液における細胞外小胞と抗ＣＤ抗体との間の免疫反応における非特異吸着が非イオン性界面活性剤により抑制できることが記載されている。しかし、特許文献１は、全血を非イオン性界面活性剤と混合すること（非イオン性界面活性剤を全血に作用させること）、および当該混合により細胞外小胞の回収量を向上できることを記載していない。また、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を全血と混合することによる全血からの細胞外小胞の回収量の向上と、免疫反応における非特異吸着の抑制とは、独立した別の効果と考えられることに照らしても（実施例５）、特許文献１は、本発明を教示も示唆もしていない。
　本発明者らはまた、非イオン性界面活性剤およびキレート剤の双方を利用することで、全血からの細胞外小胞の回収量を顕著に向上できる採血管、ならびに細胞外小胞の分析のみならず、通常の血液検査にも利用できるという高い汎用性を有する採血管を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、細胞外小胞の回収方法：
（１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；ならびに
（２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること。
〔２〕非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤である、〔１〕の方法。
〔３〕ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤がアルコールエトキシレートである、〔２〕の方法。
〔４〕ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体である、〔２〕の方法。
〔５〕非イオン性界面活性剤が、ＨＬＢ　１８以上の非イオン性界面活性剤である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記混合液中の非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０１～１０重量／体積％である、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕キレート剤が、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、またはそれらの塩である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕前記混合液中のキレート剤の濃度が、１０ｍＭ～１０００ｍＭである、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕混合が、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管に全血を入れた後に行われる、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕分離が、下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかにより行われる、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法：
（Ａ）前記混合液からの上清の分取；
（Ｂ）前記混合液に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用；または
（Ｃ）前記混合液からの上清の分取、および上清に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用。
〔１１〕細胞外小胞がエクソソームである、〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；
（２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること；ならびに
（３）細胞外小胞を分析すること。
〔１３〕非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管。
〔１４〕採血管中の非イオン性界面活性剤の量が、０．１～２０００ｍｇである、〔１３〕の採血管。
〔１５〕採血管中のキレート剤の量が、３．８～３８００ｍｇである、〔１３〕または〔１４〕の採血管。
　本発明の方法は、全血からの細胞外小胞の回収量を顕著に向上でき、また、溶血の低減または回避も期待することができる。
　本発明の採血管は、全血からの細胞外小胞の回収量を顕著に向上でき、また、細胞外小胞の分析のみならず、通常の血液検査にも利用できるという高い汎用性を有する。
　本発明は、以下を含む、細胞外小胞の回収方法を提供する：
（１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；ならびに
（２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること。
　全血は、動物から採取することができる。動物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等の食肉類）、鳥類（例、ニワトリ）が挙げられる。好ましくは、動物は、ヒト等の哺乳動物である。
　全血は細胞外小胞を含む。したがって、全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合することにより、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液が生成される。
　細胞外小胞は、種々の種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行うことができる。
　細胞外小胞はまた、細胞外小胞マーカーにより規定することができる。このような細胞外小胞マーカーとしては、例えば、細胞外小胞の内部マーカーおよび表面マーカーが挙げられる。細胞外小胞の内部マーカーとしては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、アクチンファミリー、ＴＳＧ１０１、ＡＬＩＸ、Ｃｈａｒｇｅｄ　ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＨＭＰ）ファミリー、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ―ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）ファミリー、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－ＩＩ、Ｒａｂタンパク質、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ（ＰＤＣＤ）６、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｃｒａｍｂｌａｓｅ（ＰＬＳＣＲ）ファミリー、シトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）ファミリー、ラミンファミリー、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、チューブリンファミリー、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、電位依存性アニオンチャネルタンパク質（ＶＤＡＣ）、アミロイドベータ、タウタンパク質が挙げられる。細胞外小胞の表面マーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（細胞外小胞膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（例、ＣＤ１４７）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、ＥｐＣＡＭが挙げられる。細胞外小胞マーカーは、好ましくは細胞外小胞表面マーカーであり、より好ましくはテトラスパニン膜タンパク質であり、さらにより好ましくはＣＤ９である。
　本発明では、界面活性剤のなかでも非イオン性界面活性剤を用いることで、溶血の低減または回避が可能になる。非イオン性界面活性剤としては、任意の非イオン性界面活性剤を用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤が用いられる。
　ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤は、好ましくは、－Ｏ－（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）ｘ－Ｈで表される構造（ポリオキシエチレンアルコール構造）を含む直鎖または分岐鎖化合物（環状構造を含まない化合物）である。ｘは、１以上の整数であり、好ましくは１０以上の整数であり、より好ましくは２０以上の整数であり、さらにより好ましくは３０以上の整数であり、特に好ましくは４０以上の整数であってもよい。ｘはまた、４００以下の整数であり、好ましくは３５０以下の整数であり、より好ましくは３００以下の整数であり、さらにより好ましくは２８０以下の整数であり、特に好ましくは２７０以下の整数であってもよい。より具体的には、ｘは、１～４００の整数、好ましくは１０～３５０の整数、より好ましくは２０～３００の整数、さらにより好ましくは３０～２８０以下の整数、特に好ましくは４０～２７０以下の整数であってもよい。本明細書において、ｘの値は、平均値を示すものとする。
　ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤は、単結合のみからなるものであってもよく、または不飽和結合（二重／三重結合）を含んでいてもよいが、単結合のみからなる化合物が好ましい。このような化合物は、ポリオキシエチレンアルコール構造以外の構造として、例えば、アルキル構造（直鎖または分岐鎖）、および／またはポリオキシアルキレン構造（直鎖または分岐鎖）を含んでいてもよい。アルキル構造は、例えば、Ｃ６～３１アルキル構造であってもよく、Ｃ６～３１直鎖アルキル構造が好ましい。ポリオキシアルキレン構造におけるアルキレンは、例えば、Ｃ１～６アルキレンであってもよい。Ｃ１～６アルキレンとしては、例えば、Ｃ１アルキレン（メチレン）、Ｃ２アルキレン（エチレン基、エチリデン基）、Ｃ３アルキレン（プロピリデン、プロピレン、トリメチレン、イソプロピリデン）、Ｃ４アルキレン（例、テトラメチレン）、Ｃ５アルキレン（例、ペンタメチレン）、Ｃ６アルキレン（例、ヘキサメチレン）が挙げられる。このような化合物は、炭素原子、水素原子、および酸素原子からなるものであってもよい。
　より具体的には、ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルコールエトキシレート、およびポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体（例、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体）が挙げられる。
　アルコールエトキシレートは、ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテルとも呼ばれており、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）鎖と疎水性のアルキル基がエーテル結合で結合している化合物である。アルコールエトキシレートは、下記式（１）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、ｘ１は、１以上の整数であり；
　ｙ１は、０以上の整数であり；
　ｚ１は、０以上の整数であり；
　ｙ１≧ｚ１である）。
　本明細書において、ｘ１、ｙ１およびｚ１の値は、平均値を示すものとする。
　ｘ１は、１以上の整数であり、好ましくは１０以上の整数であり、より好ましくは２０以上の整数であり、さらにより好ましくは３０以上の整数であり、特に好ましくは４０以上の整数であってもよい。ｘ１はまた、３００以下の整数であり、好ましくは２５０以下の整数であり、より好ましくは２００以下の整数であり、さらにより好ましくは１５０以下の整数であり、特に好ましくは１００以下、８０以下、６０以下、または５０以下の整数であってもよい。より具体的には、ｘ１は、１～３００の整数、好ましくは１０～２５０の整数、より好ましくは２０～２００の整数、さらにより好ましくは３０～１５０以下の整数、特に好ましくは４０～１００、４０～８０、４０～６０、または４０～５０の整数であってもよい。
　ｙ１は、０以上の整数であり、好ましくは１以上の整数であり、より好ましくは５以上の整数である。ｙ１はまた、３０以下の整数であり、好ましくは２０以下の整数、さらに好ましくは１３以下の整数であってもよい。より具体的には、ｙ１は、０～３０の整数、好ましくは１～２０の整数、さらにより好ましくは５～１３の整数であってもよい。
　ｚ１は、０以上の整数であり、好ましくは１以上の整数である。ｚ１はまた、１５以下の整数であり、好ましくは１０以下の整数、７であってもよい。より具体的には、ｚ１は、０～１５の整数、好ましくは１～１０の整数、さらにより好ましくは１～７の整数であってもよい。
　好ましくは、ｙ１およびｚ１は、ｙ１≧ｚ１という関係を満たすものであってもよい。ｙ１およびｚ１はまた、ｙ１＋ｚ１が５～３０の整数である関係を満たしていてもよい。好ましくは、ｙ１＋ｚ１は、１０～１４の整数である関係を満たしていてもよい。
　アルコールエトキシレートは、分岐鎖アルコールエトキシレートまたは直鎖アルコールエトキシレートのいずれであってもよい。好ましくは、アルコールエトキシレートは、分岐鎖アルコールエトキシレートであってもよい。
　分岐鎖アルコールエトキシレートは、上記式（１）で表される化合物において、ｙ１が１以上の整数であり、ｚ１が１以上の整数である化合物に該当する。このような分岐鎖アルコールエトキシレートとしては、例えば、ポリオキシエチレン（４０）ｓｅｃ－トリデシルエーテルが挙げられる。このような分岐鎖アルコールエトキシレートの具体例としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－４０等のＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。
　直鎖アルコールエトキシレートは、上記式（１）で表される化合物において、ｚ１が０である化合物に該当する。直鎖アルコールエトキシレートの具体例としては、ＢｒｉｊＳ１００等のＢＲＩＪ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。直鎖アルコールエトキシレートは、下記式（１’）としても表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、ｘ１は、１以上の整数であり；
　ｙ１は、１以上の整数である）。
　式（１’）におけるｘ１およびｙ１の好ましい例は、それぞれ、式（１）におけるｘ１およびｙ１の好ましい例と同じである。
　好ましくは、式（１）で表される化合物は、以下である。
　ｘ１が、４０～１００の整数であり；
　ｙ１が、０以上の整数であり；
　ｚ１が、０以上の整数であり；
　ｙ１≧ｚ１であり；
　ｙ１＋ｚ１が、５～３０の整数である。
（ｘ１、ｙ１およびｚ１の好ましい範囲は、上述と同じである。）
　より具体的には、式（１）で表される化合物に該当するアルコールエトキシレートとしては、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－４０、ＢｒｉｊＳ１００が挙げられる。好ましくは、アルコールエトキシレートは、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－４０である。
　「ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体」は、ポリオキシエチレンブロックおよびポリオキシアルキレンブロックを含むブロック共重合体である。ポリオキシアルキレンブロックにおけるアルキレンは、例えば、Ｃ１～６アルキレンであってもよく、例えば、Ｃ１アルキレン（メチレン）、Ｃ２アルキレン（エチレン、エチリデン）、Ｃ３アルキレン（プロピリデン、プロピレン、トリメチレン、イソプロピリデン）、Ｃ４アルキレン（例、テトラメチレン）、Ｃ５アルキレン（例、ペンタメチレン）、Ｃ６アルキレン（例、ヘキサメチレン）が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体としては、例えば、ＨＯ－［ポリオキシエチレンブロック］－［ポリオキシアルキレンブロック］－［ポリオキシエチレンブロック］－ＯＨの構造を有するブロック共重合体が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体は、好ましくは、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体であってもよい。
　「ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体」は、下記式（２）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、ｘ２、ｙ２、ｚ２は、１以上の整数である）。
　本明細書において、ｘ２、ｙ２およびｚ２の値は、平均値を示すものとする。
　ｘ２およびｚ２はそれぞれ、１以上の整数である。ｘ２とｚ２の合計は、２以上の整数であり、好ましくは２０以上の整数であり、より好ましくは８０以上の整数であり、特に好ましくは１５０以上の整数であってもよい。ｘ２とｚ２の合計はまた、４００以下の整数であり、好ましくは３５０以下の整数であり、より好ましくは３００以下の整数であり、特に好ましくは２７０以下の整数である。より具体的には、ｘ２とｚ２の合計は、２～４００の整数、好ましくは２０～３５０の整数、より好ましくは８０～３００の整数、特に好ましくは１５０～２７０の整数であってもよい。
　ｙ２は、１以上の整数であり、好ましくは５以上の整数であり、より好ましくは１０以上の整数であり、さらにより好ましくは１５以上の整数であり、特に好ましくは２０以上の整数であってもよい。ｙ２はまた、２００以下の整数であり、好ましくは１５０以下の整数であり、より好ましくは１００以下の整数であり、さらにより好ましくは８０以下の整数であり、特に好ましくは７０以下の整数であってもよい。より具体的には、ｘ１は、１～２００の整数、好ましくは５～１５０の整数、より好ましくは１０～１００の整数、さらにより好ましくは１５～８０以下の整数、特に好ましくは２０～７０の整数であってもよい。　
　ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体としては、例えば、ポロキサマー１８８、ポロキサマー３８８、ポロキサマー４０７等が挙げられる。ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体の具体例としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７等のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）シリーズの化合物が挙げられる。
　好ましくは、式（２）で表される化合物は、以下である。
　ｘ２が、１以上の整数であり；
　ｙ２が、１５～８０の整数であり；
　ｚ２が、１以上の整数であり；
　ｘ２＋ｚ２が、８０～２８０の整数である。
（ｘ２、ｙ２およびｚ２の好ましい範囲は、上述と同じである。）
　より具体的には、式（２）で表される化合物に該当するポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体としては、例えば、ポロキサマー１８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８）、ポロキサマー１０８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ３８）、ポロキサマー２１７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ７７）、ポロキサマー２３７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８７）、ポロキサマー２３８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ８８）、ポロキサマー２８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ９８）、ポロキサマー３８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１０８）、ポロキサマー４０７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７）が挙げられる。好ましくは、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体は、ポロキサマー１８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８）、ポロキサマー３８８（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１０８）、ポロキサマー４０７（例、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７）が挙げられる。
　特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ＨＬＢ　１８以上の非イオン性界面活性剤であってもよい。ＨＬＢ値が１８以上であれば、血球成分の溶解をより容易に回避しつつ細胞外小胞を回収することができる。特に、赤血球中には、ＣＤ９を含むテトラスパニンタンパクなどのＥＶ関連蛋白質やそれ以外の夾雑物となる可能性のあるタンパク質が含まれることから、細胞外小胞の回収に際して、血球成分である赤血球の溶解を回避することが望ましい。ＨＬＢ値は、グリフィン法により求めることができる。
　参考のため、非イオン性界面活性剤（アルコールエトキシレート／ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体）と上記式（１）または（２）で表される化合物との関係を示すと以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明では、１種の非イオン性界面活性剤を用いてもよいし、複数種（例、２種、３種、４種）の非イオン性界面活性剤を併用してもよい。
　非イオン性界面活性剤を全血に作用させる際の非イオン性界面活性剤の濃度は、非イオン性界面活性剤をキレート剤と併用することで、全血からの細胞外小胞の回収量を向上できる濃度である限り特に限定されない。本発明では、全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合することにより、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液が生成されることに照らすと、非イオン性界面活性剤を全血に作用させる際の非イオン性界面活性剤の濃度は、このような混合液中の非イオン性界面活性剤の濃度と同じである。したがって、本発明では、非イオン性界面活性剤を全血に作用させる際のキレート剤の濃度は、このような混合液中の非イオン性界面活性剤の濃度として規定することもできる。このような濃度は、非イオン性界面活性剤と併用されるキレート剤の種類および濃度等の因子によっても変動するが、例えば、０．０１～１０重量／体積％（Ｗ／Ｖ％）である。好ましくは、非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０２Ｗ／Ｖ％以上、０．０４Ｗ／Ｖ％以上、０．０６Ｗ／Ｖ％以上、０．０８Ｗ／Ｖ％以上、０．１Ｗ／Ｖ％以上、０．２Ｗ／Ｖ％以上、または０．５Ｗ／Ｖ％以上であってもよい。このような濃度はまた、８Ｗ／Ｖ％以下、６Ｗ／Ｖ％以下、５Ｗ／Ｖ％以下、４Ｗ／Ｖ％以下、３Ｗ／Ｖ％以下、２Ｗ／Ｖ％以下、または１Ｗ／Ｖ％以下であってもよい。より具体的には、非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０２～８Ｗ／Ｖ％、０．０４～６Ｗ／Ｖ％、０．０６～５Ｗ／Ｖ％、０．０８～４Ｗ／Ｖ％、０．１～３Ｗ／Ｖ％、０．２～２Ｗ／Ｖ％、または０．５～１Ｗ／Ｖ％であってもよい。
　キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子又はリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
　キレート剤としては、例えば、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、並びにそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。
　特定の実施形態では、キレート剤は、臨床検査用の採血管中に含まれる成分として汎用されるキレート剤であってもよい。このようなキレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＨＩＤＡ、クエン酸およびそれらの塩が挙げられる。本発明では、このようなキレート剤の使用もまた、臨床応用の観点から望ましい。
　本発明では、１種のキレート剤を単独で使用してもよいし、複数種（例、２種、３種、４種）のキレート剤を併用してもよい。
　キレート剤を全血に作用させる際のキレート剤の濃度は、キレート剤を非イオン性界面活性剤と併用することで、全血からの細胞外小胞の回収量を向上できる濃度である限り特に限定されない。本発明では、全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合することにより、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液が生成されることに照らすと、キレート剤を全血に作用させる際のキレート剤の濃度は、このような混合液中のキレート剤の濃度と同じである。したがって、本発明では、キレート剤を全血に作用させる際のキレート剤の濃度は、このような混合液中のキレート剤の濃度として規定することもできる。このような濃度は、キレート剤と併用される非イオン性界面活性剤の種類および濃度等の因子によっても変動するが、例えば、１０ｍＭ～１０００ｍＭである。好ましくは、キレート剤の濃度は、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、または３００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、２０～８００ｍＭ、３０～６００ｍＭ、４０～５００ｍＭ、５０～４５０ｍＭ、６０～４００ｍＭ、８０～３５０ｍＭ、または１００～３００ｍＭであってもよい。
　工程（１）における混合は、任意の様式において行うことができる。例えば、混合は、転倒混和、および／または撹拌により行うことができる。全血、ならびに非イオン性界面活性剤およびキレート剤の混合の順番は、特に限定されない。例えば、混合は、全血を、先ず非イオン性界面活性剤またはキレート剤の一方と混合し、続いて他方と混合することにより行われてもよい。混合はまた、全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤の混合物と混合することにより行われてもよい。混合時間は、全血、ならびに非イオン性界面活性剤およびキレート剤の混合に十分な時間である限り特に限定されず、例えば１秒～３０分、好ましくは３０秒～５分であってもよい。混合の際の温度は、例えば４～３７℃であり、好ましくは１５～３０℃であってもよい。混合後、混合液は静置されてもよい。静置時間は、例えば１秒～６０分、好ましくは５秒～２０分であってもよい。
　特定の実施形態では、混合は、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管（好ましくは、密封手段で密封された真空採血管）に全血を入れた後に行うことができる。この場合、混合としては、転倒混和が好ましい。採血管の詳細は、後述のとおりである。
　工程（２）における分離は、任意の様式において行うことができる。例えば、分離は、下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかにより行われてもよい：
（Ａ）混合液からの上清の分取；
（Ｂ）混合液に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用；または
（Ｃ）混合液からの上清の分取、および上清に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用。
　（Ａ）混合液からの上清の分取について説明する。本発明では、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血（混合液）から分取された上清に存在する細胞外小胞の量が、キレート剤または界面活性剤のいずれか一方、または双方を添加していない全血から分取された上清に存在する細胞外小胞の量に比べて、有意に増加することが実証されている（実施例）。したがって、本分離によれば、全血中の多量の夾雑物が除外された高濃度の細胞外小胞（細胞外小胞を豊富に含む上清）を簡便かつ迅速に回収することができる。
　混合液からの上清の分取は、任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、混合液の遠心分離、および混合液の静置が挙げられる。清澄な上清を迅速に入手する観点では、混合液からの上清の分取は、混合液の遠心分離後に上清を分取することが好ましい。遠心分離は、通常の遠心分離の条件下で行うことができる。このような条件としては、例えば、遠心分離機のローターの回転半径等の因子によっても変動するが、１００～１００，０００×ｇ（好ましくは、２００～５，０００×ｇ）の回転速度で１０秒～１時間（好ましくは、１～１０分）、４０℃以下（好ましくは、３０℃以下）の条件を採用することができる。このようにして得られる上清は、細胞外小胞に加えて、キレート剤及び界面活性剤を含むことができる。このようにして得られる上清中のキレート剤及び界面活性剤の濃度は、混合液中のキレート剤及び界面活性剤の濃度と同様であり得る。
　（Ｂ）混合液に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用について説明する。本発明では、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血（混合液）から得られたサンプルにおいて、細胞外小胞の表面マーカーを用いて測定された細胞外小胞の量が、キレート剤または界面活性剤のいずれか一方、または双方を添加していない全血から得られたサンプルにおいて、細胞外小胞の表面マーカーを用いて測定された細胞外小胞の量に比べて、有意に増加することが実証されている（実施例）。したがって、本分離によれば、高純度の細胞外小胞を簡便かつ迅速に多量に回収することができる。
　細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質としては、例えば、上述した細胞外小胞表面マーカーに対する抗体、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。本発明では、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質として、単一の物質、または複数種（例、２種、３種、４種）の物質を用いることができる。
　好ましくは、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質は、細胞外小胞の表面マーカーに対する特異性の確保、および調製の簡便さ等の観点より、細胞外小胞の表面マーカーに対する抗体であってもよい。抗体としては、例えば、全長抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片が挙げられる。抗原結合性断片は、対象とする細胞外小胞表面マーカーに対する結合性を維持している抗体断片であればよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。本発明では、単一の抗体、または複数種（例、２種、３種、４種）の抗体を用いることができる。
　細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質（好ましくは、抗体）は、細胞外小胞の分離を容易にするための固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズおよび粒子（例、セファロースビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ（磁性粒子））、支持体（例、プラスチックプレート等のプレート、メンブレン）が挙げられる。固相への物質の固定は、任意の方法により行うことができる。このように固相に固定された細胞外小胞表面マーカーに結合する物質を、細胞外小胞を含む混合液と混合し、細胞外小胞表面マーカーに結合する物質と細胞外小胞の複合体を形成させ、この複合体を混合液から分離することで、細胞外小胞を混合液から分離することができる。例えば、固相としてビーズ又は粒子を用いる場合は、複合体の形成後に遠心分離し、上清を除くことで、細胞外小胞を混合液から分離することができる。固相として磁性ビーズを用いる場合は、複合体の形成後に集磁し上清を除くことで、細胞外小胞を混合液から分離してもよい。固相として支持体を用いる場合は、複合体の形成後に混合液を除くことで、細胞外小胞を混合液から分離することができる。
　（Ｃ）混合液からの上清の分取、および上清に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用は、上記（Ａ）および（Ｂ）を組み合わせて行うことができる。
　本発明はまた、以下を含む、細胞外小胞の分析方法を提供する：
（１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；
（２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること；ならびに
（３）細胞外小胞を分析すること。
　本発明の分析方法における工程（１）および（２）は、本発明の回収方法における工程（１）および（２）と同様にして行うことができる。
　工程（３）において、細胞外小胞の分析は、細胞外小胞の分離後、または細胞外小胞の分離と同時に行うことができる。細胞外小胞の分析における分析対象としては、例えば、細胞外小胞中に含まれる成分（例、細胞外小胞の内部に含まれる成分、細胞外小胞の膜成分、細胞外小胞の膜表面に存在している成分）、および細胞外小胞自体（粒子）が挙げられる。
　細胞外小胞中に含まれる成分の分析は、定性的または定量的に行うことができる。このような分析はまた、一成分または複数成分の分析である。分析される成分としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。本発明によれば、細胞外小胞の回収量が増加するので、細胞外小胞中の成分を高精度で分析することができる。
　成分の分析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
　分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
　分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
　分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
　細胞外小胞自体（粒子）の分析もまた、定性的または定量的に行うことができる。例えば、細胞外小胞の分析は、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。この場合、細胞外小胞の粒子数、粒子の大きさおよび形状、並びにそれらの分布を分析することができる。
　細胞外小胞は、癌等の種々の疾患に関与し得ることが報告されている（国際公開第２０１４／００３０５３号；国際公開第２０１４／１５２６２２号；Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ　Ｏｎｃｏｌ，１００（２００８）　ｐｐ１３－２１）。したがって、本発明は、例えば、細胞外小胞に基づく診断および創薬に有用である。
　本発明はまた、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管を提供する。
　採血管としては、任意の形態のものを用いることができるが、筒状の形態のものを好適に用いることができる。筒状の形態の採血管は、その断面が環状（例、円形、略円形）であることが好ましい。好ましくは、採血管は、臨床検査用の採血管である。
　また、採血管としては、密封されていない採血管、およびゴム栓、フィルムシート等の密封手段で密封された真空採血管を用いることができる。注射器からの一定量の血液の容易な回収、および採血管中に含まれる非イオン性界面活性剤およびキレート剤の保持等の観点より、上記のような密封手段で密封された真空採血管が好ましい。真空採血管中の減圧の程度は、採血量等の因子に応じて適宜設定することができる。
　採血管の材料としては、任意の材料を用いることができ、無色透明な材料を好適に用いることができる。このような材料としては、例えば、ガラス、プラスチック（例、ポリエチレンテレフタラート）が挙げられる。
　本発明で用いられる採血管のサイズは、それが収容可能な全血の容量で規定することができる。例えば、採血管としては、１～１０ｍＬの全血の収容に適したサイズのものが臨床検査で汎用されている。したがって、本発明では、このようなサイズの採血管を好適に使用することができる。勿論、本発明では、目的に応じて、１ｍＬ未満のサイズ（例えば、０．５ｍＬ以上１．０ｍＬ未満）、または１０ｍＬを超えるサイズの採血管（例えば、１０ｍＬ超１５ｍＬ以下）も適宜使用することができる。
　採血管に含まれる非イオン性界面活性剤およびキレート剤の詳細は、本発明の方法において上述したものと同様である。非イオン性界面活性剤およびキレート剤は、採血管中に含まれる限り、その形態は特に限定されない。例えば、非イオン性界面活性剤およびキレート剤は、それぞれ、液体、または固体（例、粉末）の形態で、採血管中に含まれていてもよい。非イオン性界面活性剤およびキレート剤はまた、採血管中の底に液体または固体として集積された様式で提供されてもよく、また、採血管（および密封手段）の内側にコーティング又は含浸された様式で提供されてもよい。採血管中に含まれる非イオン性界面活性剤およびキレート剤はそれぞれ、１種であっても、複数種（例、２種、３種、４種）であってもよい。
　非イオン性界面活性剤およびキレート剤は、採血管に全血が添加され、全血と混合された場合に、上述したような混合液中の非イオン性界面活性剤およびキレート剤の上記濃度を達成できる量で採血管中に含まれることが好ましい。このような非イオン性界面活性剤の量は、採血管のサイズ、添加される全血の容量等の因子に応じて変動するが、例えば０．１～２０００ｍｇ（全血１ｍＬあたり０．１ｍｇ～２００ｍｇ）、好ましくは０．２～１５００ｍｇ（全血１ｍＬあたり０．２ｍｇ～１５０ｍｇ）、より好ましくは０．５～１０００ｍｇ（全血１ｍＬあたり０．５ｍｇ～１００ｍｇ）、さらにより好ましくは１～７００ｍｇ（全血１ｍＬあたり１ｍｇ～７０ｍｇ）、特に好ましくは２ｍｇ～５００ｍｇ（全血１ｍＬあたり２ｍｇ～５０ｍｇ）であってもよい。このようなキレート剤の量もまた、採血管のサイズ、添加される全血の容量等の因子に応じて変動するが、例えば３．８～３８００ｍｇ（全血１ｍＬあたり３．８～３８０ｍｇ）、好ましくは７．６～１９００ｍｇ（全血１ｍＬあたり７．６～１９０ｍｇ）、より好ましくは１５．２～１５００ｍｇ（全血１ｍＬあたり１５．２～１５０ｍｇ）、さらにより好ましくは３０．４～１２００ｍｇ（全血１ｍＬあたり３０．４～１２０ｍｇ）、特に好ましくは６０．８～１０００ｍｇ（全血１ｍＬあたり６０．８～１００ｍｇ）であってもよい。
　特定の実施形態では、キレート剤は、臨床検査用の採血管中に含まれる成分として汎用される上記キレート剤であってもよい。採血管におけるこのようなキレート剤の使用もまた、臨床応用の観点から望ましい。
　別の特定の実施形態では、採血管は、臨床検査用の採血管中に含まれるキレート剤以外の汎用成分を１種以上さらに含んでいてもよい。したがって、採血管は、ヘパリンまたはその塩、およびフッ化物（例、フッ化ナトリウム）からなる群より選ばれる１種以上の汎用成分をさらに含んでいてもよい。塩としては、上述したものが挙げられる。
　非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む本発明の採血管は、全血からの細胞外小胞の回収量を顕著に向上することができるため、細胞外小胞の分析に使用できる血液試料の調製に有用である。本発明の採血管はまた、通常の血液検査用の採血管に含まれる血液凝固防止成分であるキレート剤、および溶血の低減または回避を可能にする非イオン性界面活性剤を含むため、細胞外小胞の分析のみならず、通常の血液検査にも使用できる汎用性の高い血液試料の調製に有用である。本発明の採血管はまた、本発明の方法に好適に利用できるため、本発明の方法の簡便かつ迅速な実施に有用である。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中で記載される％はいずれも、Ｗ／Ｖ％である。
（材料および方法）
（１）抗体固相化粒子（固相抗体）の調製
　１０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で磁性粒子０．０１ｇ／ｍＬに、細胞外小胞（ＥＶ）表面マーカーであるＣＤ９を認識するマウス抗ＣＤ９モノクローナル抗体（富士レビオ社）０．２ｍｇ／ｍＬを添加し、２５℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、磁性粒子を集磁し、粒子を洗浄液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）にて洗浄し、抗ＣＤ９抗体固相化粒子を得た。各抗体固相化粒子を粒子希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％ＮａＮ３、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）に懸濁し、各抗体固相化粒子溶液を得た。
（２）アルカリホスファターゼ標識抗体の調製
　脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）（終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ）を混合し、３０℃で１時間静置してＡＬＰのマレイミド化を行った。次いで、カップリング用反応液（１００ｍＭ　リン酸緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ６．３）中で、Ｆａｂ’化したマウス抗ＣＤ９モノクローナル抗体と、マレイミド化ＡＬＰを１：１のモル比で混合し、２５℃で１時間反応させた。反応液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムクロマトグラフィー（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社）を用いて精製し、ＡＬＰ標識抗ＣＤ９抗体を得た。各ＡＬＰ標識抗体を標識体希釈液（５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２、０．３ｍＭ　ＺｎＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％ＮａＮ３、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に懸濁し、各標識抗体溶液を得た。
（３）ＥＶ表面マーカー（ＣＤ９）の測定方法
　以下の実施例におけるＥＶ表面マーカー（ＣＤ９）の測定方法は、次のとおりである。
　測定用サンプル２０μＬ及び抗ＣＤ９抗体固相化粒子溶液５０μＬを反応槽に分注し、攪拌した。その後、得られた混合液を３７℃で８分間インキュベーションし（一次反応）、Ｂ（結合）／Ｆ（遊離）分離・洗浄を行った。ＡＬＰ標識抗体５０μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で８分間インキュベーションし、Ｂ／Ｆ分離・洗浄を行った。その後、化学発光基質である３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社）２００μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で４分間インキュベーションした後、発光量をルミノメーターで測定した。測定値として、カウント値を得た。発光量の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社））にて行った。
　磁性粒子に固相化した抗体とＡＬＰ標識抗体は、ＣＤ９中の同一エピトープを認識する抗体を使用した。一つの細胞外小胞上には、複数のＣＤ９が存在するため、固相化抗体と同一エピトープを認識する抗体をＡＬＰ標識抗体として用いたサンドイッチイムノアッセイにより、遊離ＣＤ９ではなく、表面マーカーとして複数のＣＤ９を提示する細胞外小胞を測定することが可能である。
実施例１：キレート剤を添加した全血からの細胞外小胞（ＥＶ）の回収
　ヒト全血にキレート剤を添加し、遠心分離後、上清中のＣＤ９を測定した。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、及びヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）を用いた。
　より具体的には、各キレート剤を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１００μＬを入れたポリプロピレン製５ｍＬ試験管（ｎｕｎｃ製）に、採血後の全血９００μＬを添加した。キレート剤は、全血と混合後の終濃度が１５ｍＭになるように添加した。全血を添加後、試験管を転倒混和し、３０分室温で静置させ、遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ　ＣＦ５ＲＥ、３０００ｒｐｍ（２１３０ｘｇ）、５分、室温）を行い、上清を回収して、（材料と方法）で述べた方法により、細胞外小胞（ＥＶ）の表面マーカータンパク質であるＣＤ９を測定し、カウント値を得た。コントロール（未添加）として、キレート剤を添加していないＤ－ＰＢＳ（－）を用いて同様に測定した。
　その結果、検討した全てのキレート剤について、キレート剤を添加した全血から調製された上清は、キレート剤を添加しない全血から調製された上清に比べて、有意に高いカウント値を示した（表１）。このことは、キレート剤を添加した全血から調製された上清に存在するＥＶの量が、キレート剤を添加しない全血から調製された上清に存在するＥＶの量に比べて、有意に増加することを示す。
　したがって、キレート剤を全血に添加することでＥＶの回収量を有意に増加できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例２：界面活性剤を添加した全血における溶血の有無の確認
　ヒト全血に界面活性剤を添加し、溶血の有無を確認した。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－３０、Ｂｒｉｊ　３５、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ６８、ＴＷＥＥＮ２０、及びＰＶＰＫ３０を用いた。陽イオン性界面活性剤としては、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ８ＴＡＢ）、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｃ１６ＴＡＣ）を用いた。陰イオン性界面活性剤としては、Ｎ－デカノイルサルコシンナトリウム（Ｎ－ＤＳＳ（ＮＤＳ））、及びＮ－ラウロイルサルコシンナトリウム水和物（ＮＬＳ）を用いた。両イオン性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、及びＮ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（Ｃ１２ＡＰＳ）を用いた。
　より具体的には、界面活性剤を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１００μＬを入れたポリプロピレン製５ｍＬ試験管（ｎｕｎｃ製）に、採血後の全血９００μＬを添加した。界面活性剤は、全血と混合後の終濃度が０．５Ｗ／Ｖ％になるように添加した。全血を添加後、試験管を転倒混和し、３０分室温で静置させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を回収して、溶血の有無を目視で確認した。
　その結果、ＴｗｅｅｎやＢｒｉｊ、ｔｅｒｇｉｔｏｌのような非イオン性界面活性剤は溶血を引き起こさないことが確認された（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例３：キレート剤および界面活性剤を添加した全血からのＥＶの回収
　ヒト全血にキレート剤および界面活性剤を添加し、遠心分離後上清中のＣＤ９を測定した。キレート剤として、ＥＤＴＡ・２Ｎａ及びＥＧＴＡを用いた。界面活性剤としてＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０を用いた。
　先ず、キレート剤を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１００μＬ、及び界面活性剤を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１００μＬを、ポリプロピレン製５ｍＬ試験管（ｎｕｎｃ製）に入れて、キレート剤及び界面活性剤を含む採血管モデルを作製した。この採血管モデルの作製では、キレート剤は、全血と混合後の終濃度が６０ｍＭになるように設定した。界面活性剤は、全血と混合後の終濃度が０．５％になるように設定した。
　次いで、この試験管（採血管モデル）に、採血後の全血８００μＬを添加した。全血を添加後、試験管を転倒混和し、３０分室温で静置させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を回収して、（材料と方法）で述べた方法により、細胞外小胞（ＥＶ）の表面マーカータンパク質であるＣＤ９を測定した。
　また、比較対象として、キレート剤と界面活性剤の何れも含まない採血管、およびキレート剤を含むが界面活性剤を含まない採血管を作製し、同様にＣＤ９を測定した。
　その結果、キレート剤の種類にかかわらず、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血から調製された上清は、キレート剤を添加し、かつ界面活性剤を添加していない全血から調製された上清に比べて、有意に高いカウント値を示した（表３）。このことは、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血から調製された上清に存在するＥＶの量が、キレート剤を添加し、かつ界面活性剤を添加していない全血から調製された上清に存在するＥＶの量に比べて、有意に増加することを示す。
　したがって、キレート剤及び界面活性剤を全血に添加することでＥＶの回収量を有意に増加できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例４：キレート剤及び界面活性剤の濃度の検討
　ヒト全血に、様々な濃度のキレート剤および界面活性剤を添加し、遠心分離後上清中のＣＤ９を測定した。
　先ず、様々な濃度のＥＧＴＡを添加したＤ－ＰＢＳ（－）１００μＬ、及び様々な濃度のＴｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１００μＬを、ポリプロピレン製５ｍＬ試験管（ｎｕｎｃ製）に入れて、キレート剤及び界面活性剤を含む採血管モデルを作製した。この採血管モデルの作製では、ＥＧＴＡは、全血と混合後の終濃度が０，１０，５０，１００，２００ｍＭになるように設定した。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－４０は、全血と混合後の終濃度が０，０．１，０．２５，１．０，２．０％になるように設定した。
　次いで、この試験管（採血管モデル）に、採血後の全血８００μＬを添加した。全血を添加後、試験管を転倒混和し、３０分室温で静置させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を回収して、（材料と方法）で述べた方法により、細胞外小胞（ＥＶ）の表面マーカータンパク質であるＣＤ９を測定した。
　その結果、キレート剤は濃度依存的に反応性を増加させた（表４）。界面活性剤は、単独では反応性を増加させなかったが、キレート剤との組合せにおいて、反応性を増加させた（表５）。また、キレート剤との組み合わせにより、界面活性剤の濃度が高いほど、反応性が増加した（表４，５）。このことは、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血から調製された上清に存在するＥＶの量が、キレート剤及び界面活性剤の濃度に依存して増加することを示す。
　したがって、高濃度のキレート剤及び高濃度の界面活性剤を全血に添加することでＥＶの回収量を増加できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例５：キレート剤および界面活性剤の作用の検討
　キレート剤および界面活性剤の作用が、全血に対するものであるのか、又は免疫反応に対するものであるのかを確認した。
　先ず、キレート剤（ＥＧＴＡ）を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１２５μＬ、及び界面活性剤（ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－４０）を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１２５μＬを、ポリプロピレン製５ｍＬ試験管（ｎｕｎｃ製）に入れて、キレート剤及び界面活性剤を含む採血管モデルを作製した。この採血管モデルの作製では、キレート剤及び界面活性剤は、全血と混合後の終濃度が表６中の濃度になるように設定した。
　次いで、この試験管（採血管モデル）に、採血後の全血１０００μＬを添加した。全血を添加後、試験管を転倒混和し、３０分室温で静置させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を回収して、（材料と方法）で述べた方法により、細胞外小胞（ＥＶ）の表面マーカータンパク質であるＣＤ９を測定した。
　また、ＣＤ９を測定する際に、ＣＤ９抗体固相化粒子溶液に１００ｍＭ　ＥＧＴＡを添加したものでも測定を行った。
　ＣＤ９抗体固相化粒子溶液（粒子希釈液）に１００ｍＭ　ＥＧＴＡを添加した場合は、一次反応中のＥＧＴＡ濃度は７１．４ｍＭとなる。採血管に全血と混合後の終濃度が２００ｍＭになるようにＥＧＴＡを添加した場合は、一次反応中のＥＧＴＡ濃度は５７．１ｍＭとなる。もし、ＥＧＴＡが免疫反応時に作用するであれば、ＣＤ９抗体固相化粒子溶液にＥＧＴＡを添加した場合でもカウント値が高くなるはずである。
　まず、終濃度２００ｍＭのＥＧＴＡを添加した全血から調製された上清を用いた条件〔２００ｍＭ　ＥＧＴＡ及び０％　ｔｅｒｇｉｔоｌ　１５－ｓ－４０、並びに２００ｍＭ　ＥＧＴＡ及び１％　ｔｅｒｇｉｔｏｌ　１５－Ｓ－４０〕はいずれも、同濃度のＥＧＴＡを添加していない全血から調製された上清を用いた条件〔０ｍＭ　ＥＧＴＡ及び０％　ｔｅｒｇｉｔоｌ　１５－ｓ－４０）〕に比べて、有意に高いカウント値を示した（表６中の「対未添加（％）」を参照）。一方、ＥＧＴＡをＣＤ９抗体固相化粒子溶液に添加した場合は、ＥＧＴＡがＣＤ９抗体固相化粒子溶液に添加されていない場合に比べて、有意に高いカウント値を示さなかった（表６中の「対ＥＧＴＡ無（％）」を参照）。このことは、キレート剤および界面活性剤の作用が、ＣＤ９測定系における免疫反応に対するものでなく、全血に対するものであることを示す。
　したがって、キレート剤及び界面活性剤は全血に添加することで、細胞外小胞の回収量を向上できることが実証された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例６：界面活性剤の種類の検討
　種々の非イオン性界面活性剤が全血に作用できるか確認した。界面活性剤として、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－４０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１０８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７を用いた。
　先ず、ＥＧＴＡを添加したＤ－ＰＢＳ（－）１２５μＬ、及び各種界面活性剤を添加したＤ－ＰＢＳ（－）１２５μＬを、ポリプロピレン製５ｍＬ試験管（ｎｕｎｃ製）に入れて、キレート剤及び界面活性剤を含む採血管モデルを作製した。この採血管モデルの作製では、キレート剤及び界面活性剤は、全血と混合後の終濃度が表７中の濃度になるように設定した。
　次いで、この試験管（採血管モデル）に、採血後の全血１０００μＬを添加した。全血を添加後、試験管を転倒混和し、３０分室温で静置させ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を回収して、（材料と方法）で述べた方法により、細胞外小胞（ＥＶ）の表面マーカータンパク質であるＣＤ９を測定した。
　その結果、界面活性剤の種類にかかわらず、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血から調製された上清は、キレート剤を添加し、かつ界面活性剤を添加していない全血から調製された上清に比べて、有意に高いカウント値を示した（表７）。このことは、界面活性剤の種類にかかわらず、キレート剤及び界面活性剤を添加した全血から調製された上清に存在するＥＶの量が、キレート剤を添加し、かつ界面活性剤を添加していない全血から調製された上清に存在するＥＶの量に比べて、有意に増加することを示す。
　したがって、キレート剤及び種々の界面活性剤を全血に添加することでＥＶの回収量を有意に増加できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　例えば、本発明は、細胞外小胞の臨床検査に有用である。

Claims (15)

  1. 　以下を含む、細胞外小胞の回収方法：
    （１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；ならびに
    （２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること。
  2. 　非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤である、請求項１記載の方法。
  3. 　ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤がアルコールエトキシレートである、請求項２記載の方法。
  4. 　ポリオキシエチレンアルコール構造を有する非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン－ポリオキシアルキレンブロック共重合体である、請求項２記載の方法。
  5. 　非イオン性界面活性剤が、ＨＬＢ　１８以上の非イオン性界面活性剤である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　前記混合液中の非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０１～１０重量／体積％である、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 　キレート剤が、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、またはそれらの塩である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　前記混合液中のキレート剤の濃度が、１０ｍＭ～１０００ｍＭである、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 　混合が、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管に全血を入れた後に行われる、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 　分離が、下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかにより行われる、請求項１～９のいずれか一項記載の方法：
    （Ａ）前記混合液からの上清の分取；
    （Ｂ）前記混合液に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用；または
    （Ｃ）前記混合液からの上清の分取、および上清に対する、細胞外小胞の表面マーカーに結合する物質の使用。
  11. 　細胞外小胞がエクソソームである、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 　以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
    （１）全血を非イオン性界面活性剤およびキレート剤と混合して、細胞外小胞、非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む混合液を生成すること；
    （２）前記混合液から細胞外小胞を分離すること；ならびに
    （３）細胞外小胞を分析すること。
  13. 　非イオン性界面活性剤およびキレート剤を含む採血管。
  14. 　採血管中の非イオン性界面活性剤の量が、０．１～２０００ｍｇである、請求項１３記載の採血管。
  15. 　採血管中のキレート剤の量が、３．８～３８００ｍｇである、請求項１３または１４記載の採血管。
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