WO2019107370A1 - 検出方法 - Google Patents

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明 溝口
光司 田中
一志 木村
哲哉 野阪
匡介 田中
淑杰 王
愛加 垣内
煌植 崔
裕二 問山
英仁 後藤
昌彦 杉本
有平 西村
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国立大学法人三重大学
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Definitions

  • the present invention relates to a biological staining inspection method and a tissue visualization method for discriminating cancer cells and normal cells in an organ by laser irradiation after organ tissue in vivo staining with an edible dye stain.
  • Cancer is currently the leading cause of death in Japan, with 1 in 2 of the population suffering from cancer and 1 in 4 currently dying from cancer. Moreover, the number of deaths due to cancer is still increasing, and reducing the number of deaths due to cancer is a longing for the public.
  • the basic strategy to reduce cancer mortality is considered to be the early detection of cancer, but with current endoscopy, the cancer must have grown to a diameter of around 10-20 mm. There is a limit that it is difficult to find. Therefore, at present, most cancer patients are mainly treated by surgical removal of cancer, and it is urgently necessary to develop pre-operative and intra-operative rapid decision support technology.
  • the goal of surgical cancer removal surgery is the simultaneous achievement of the very difficult goal of achieving as complete as possible complete removal of cancer cells and maximal preservation of organ function after debridement. Many surgical technical improvements and efforts have been made to achieve this very difficult goal.
  • rapid pathological diagnosis has been one of the keys to improving the results of surgical cancer treatment. It is possible that the operating doctor can accurately grasp the extent to which cancer cells infiltrate and metastasize at the pathological diagnosis level in the organ where the cancer was generated and in the surrounding organs, lymph nodes and blood vessels before and during surgery. It will be a huge help.
  • the surgery is basically performed from the serosal side of the organ, if the infiltration range of cancer cells can be predicted before or during surgery from the serosal side before removal of the affected area, the removal range can be reduced, Combined with the advantages of the thoracic cavity and abdominal cavity endoscopic surgical robots, the burden on cancer patients is extremely small. For that purpose, the technique which makes the cancer tissue stump clear from the serosal side is needed. Also, for example, when taking a capsule endoscope, it is necessary to observe cancerous tissue from the lumen of the digestive tract.
  • the inventors have been developing a rapid pathological diagnosis system during surgery using cancer cell specific biological staining and a laser microscope, and after applying a specific edible dye such as curcumin to the gastrointestinal tract mucosal surface, the laser microscope When the cells stained in vivo were observed, it was found that cancer cells were stained more deeply than normal cells. The staining rapidly detected cancer cells, and further enabled clear visualization of cell morphology, including the morphology of cell nuclei. As a result, in pathological diagnosis, it has become possible to reliably discriminate cell variants and structural variants, and succeeded in developing a method capable of detecting and treating minute cancers. In this method, a human orally-acceptable edible pigment such as curcumin or red No.
  • Robotic techniques for endoscopic surgery of the thoracic cavity and / or abdominal cavity are basically performed from the serosal side of the organ, so the infiltration range of cancer cells is predicted before the operation from the serosal side, and postoperative cancer cells If it is possible to judge the presence or absence of the remaining, while it is possible to radically remove the cancer, the removal range can be small and the burden on the patient can be greatly reduced.
  • a specific edible dye such as curcumin is applied to the tissue from the luminal surface or the serosal side, or by oral ingestion, a tissue or tissue stained in the vicinity of the surgical site is imaged with a laser microscope.
  • a method of identifying tissue or cancer cells is as follows.
  • a method for examining a biological stain comprising administering a cell stain capable of observing a living tissue by laser irradiation to an organ, and irradiating the organ with a multiphoton laser or a confocal laser.
  • a cell stain capable of observing a living tissue by laser irradiation to an organ
  • a multiphoton laser or a confocal laser comprising administering a cell stain capable of observing a living tissue by laser irradiation to an organ, and irradiating the organ with a multiphoton laser or a confocal laser.
  • the cell staining agent is one or more staining agents selected from the group consisting of sulflatin, curcumin, red 3 (erythrosine) and red 106.
  • the administration of the cell staining agent is performed by application, dropping or spraying from the serosal side of the organ.
  • the administration of the cell staining agent is performed by application, dripping or spraying from the lumen of an organ.
  • Administration of the cytostain is oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous injection administration, intramuscular injection administration, intra-organ injection administration, intrathoracic administration or subarachnoid administration of [1]-[4] The method described in either. [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the laser irradiation is performed using a multiphoton laser microscope endoscope, a confocal laser microscope microscope or a laser fluorescence microscope endoscope. [9] A method for detecting cancer cells, which comprises visualizing cancer cells using the method according to [8].
  • a method for determining cancer infiltration into regional lymph node tissue in the case where cancer is present in an organ suspected of having cancer, which is dripping from above the surface coating covering lymph node tissue Alternatively, a cell staining agent capable of observing a living tissue by laser irradiation is administered to the lymph node tissue by a method of injection into the lymph node, and then a multiphoton laser or a confocal laser is applied to the lymph node tissue.
  • the method according to [9] comprising irradiating the light.
  • the cancer primary lesion is a mucosal epithelium and the cancer cells infiltrate or reach the Meissner plexus
  • the cancer is determined to be a progressive cancer, as described in [17].
  • Method described [19]
  • the cancer primary lesion is a mucosal epithelium, and the cancer cells infiltrate or reach the Meissner plexus and the smooth muscle layer, the cancer is determined to be a progressive cancer. The method described in [17].
  • the primary tumor of the cancer is a mucosal epithelium, the cancer is determined to be an early cancer when the cancer cells do not invade or reach the Meissner plexus, as described in [17]. Method described.
  • the method according to any of [9] to [20] which comprises notifying by sound or light that a cancer cell has been detected.
  • [22] [9] A method of treating a cancer patient by removing a single cancer cell from the serosal side or a lumen using the method according to any one of [9] to [21].
  • [23] Using the method described in any of [9] to [21], cancer cells remaining in the living body from the serosal side or the lumen after surgery are confirmed and removed in units of cancer cells how to.
  • [24] [9] A method for treating a colon cancer patient, comprising using the method according to any one of [9] to [21].
  • [28] [9] A method for treating a patient with esophageal cancer comprising using the method according to any one of [9] to [21].
  • the organ tissue After staining the organ tissue with curcumin or sulflatin, the organ tissue is examined from the serosal side or lumen using a multiphoton laser microscope, a confocal laser microscope, or a laser fluorescence microscope. Irradiation, and based on the visualized images obtained for the cytoplasm and nucleus of nerve cells and the form of nerve fibers and / or nerve fibers present in the organ tissue, and / or the form of a myelin sheath surrounding nerve fibers and axons, The method according to [8], which identifies the type of neural network and neural network.
  • [34] [9] A method for detecting cancer in an individual, characterized by using the method according to [9], wherein the individual is judged to be atypical in comparison with normal cells based on the visualized image. Identifying cancer as having cancer, or identifying individual as having cancer if it is judged that the regularity of the distribution pattern of glandular structure / crypt structure is lost as compared to normal cells. How to detect cancer, including [35] [17] The method for diagnosing advanced cancer according to claim 1, wherein the cancer cell infiltrates the Meissner plexus based on the visualized image in the case where the primary site of the cancer is a mucosal epithelium.
  • the cancer cell has invaded or reached the Meissner plexus and smooth muscle layer in the process where it is determined that the cancer is an advanced cancer, or in the case where the cancer primary site is a mucosal epithelium.
  • a method of diagnosing advanced cancer including the step of determining the cancer as advanced cancer.
  • a method for diagnosing early cancer including the step of determining that the cancer is early cancer if it does not invade or reach the [37] A method of visualization of exocrine cells of the pancreas and islets of Langerhan using the method described in [8]. [38] A method of visualizing taste buds present in the tongue or soft palate using the method according to [8]. [39] A method for visualizing peripheral nerves such as sciatic nerves, using the method according to [8]. [40] A method of visualizing brain tissue, using the method described in [8]. [41] The brain tissue is cerebral cortex, hippocampus, amygdala, hypothalamus or cerebellum [40] The method described in.
  • [42] The determination method of a brain disease or a brain symptom using the visualized image obtained by the method as described in [40] or [41].
  • [44] A method of visualization of ocular tissue using the method according to [8].
  • [45] The method of [44], wherein the ocular tissue is a retina.
  • [46] [44] A method for determining an eye disease or condition, which uses a visualized image obtained by the method according to [44] or [45].
  • the eye disease or condition includes macular degeneration, retinal degeneration, diabetic retinopathy, retinoblastoma, proliferative vitreoretinopathy, glaucoma, retinal detachment and retinal edema, [46] The method described in. [48] [10] A method for determining whether or not cancer cells are present in the lymph node, before lymph node dissection, during laparoscopic surgery, characterized by using the method described in [10]. [49] The cancer cells that have metastasized to the lymph node are destroyed by laser vaporization of only one cancer cell by laser evaporation, and the dead body of the cancer cell is recognized by the immune cell to activate the activated lymphocytes.
  • Cancer immunotherapy characterized by attacking cancer cells in the nest.
  • Oral and intraperitoneal administration of curcumin, cell structures of gut, body cells of whole brain and retina, sensory cells of taste and smell, endocrine cells, lymph nodes, lymph nodes, skeletal muscle, lung, pancreas, liver A method to diagnose all diseases that cause abnormalities in cell location, number, shape, size and arrangement by visualizing and visualizing visualized cell structures with a laser microscope and a fluorescence microscope.
  • [50] A method of destroying and removing a problematic cell in unit of one by laser irradiation, characterized by using the method described in [50].
  • [56] [9] A method for treating tongue cancer, throat cancer, laryngeal cancer and thyroid cancer, which comprises using the method according to any one of [9] to [21].
  • [57] [9] A method for diagnosing the cause of tonsillitis, which comprises using the method according to any one of [9] to [21].
  • [58] In leukocytes infiltrating the tonsils, bacterial infective tonsillitis if large neutrophil infiltration is present, bacterial infective tonsillitis if large infiltration of eosinophils, allergic tonsilladenitis if large infiltration of lymphocytes, virus is present if many lymphocytes infiltrate [57] The method according to [57], comprising the step of determining infectious tonsillitis.
  • [59] Analyze the morphology of sensory cells of taste and olfactory epithelium using the method according to any one of [9] to [21], [38], and diagnose dysgeusia and / or olfactory disorder how to.
  • [60] A method of analyzing the morphology of skeletal muscle and diagnosing a lesion of sarcopenia and / or myasthenia gravis, characterized by using the method according to any one of [9] to [21].
  • [61] Analyze the morphology of endocrine cell cells of the islets of the pancreas and / or the thyroid gland, using the method according to any one of [9] to [21], and diagnose diabetes and / or bassedo disease how to.
  • the method of the present invention after allowing the human orally-accepted edible pigment sulfitin, curcumin, red No. 3 or red No. 106 solution to be sprayed from the luminal or serosal tissue for about 1 to 5 minutes, or After oral administration of the curcumin solution, cell morphology can be imaged and identified from the serosal side by multiphoton laser microscopy or confocal laser. Curcumin and Red No. 3 can stain cells highly expressing the cancer-related gene products STAT3 and RAS, respectively.
  • the dye is spray-coated according to the method, the time to image acquisition is within 5 minutes, and the tissue site of interest to the surgeon can be searched continuously at multiple locations.
  • the present invention provides a method of identifying tissues and cells necessary for a surgeon to immediately perform pathological diagnosis during surgery.
  • the multiphoton laser microscope or confocal laser microscope image obtained by this method is extremely sharp, and the morphology of nuclei of individual cells is clearly visualized, so that the cell variant and structure variant of cancer should be judged with certainty.
  • (A) Normal colon mucosa (B) Colon cancer tumor area It is the photograph which carried out biostaining of the mouse
  • a nerve cell body can be identified by strongly enlarging an example of confocal laser microscopic visualization of Auerbach's plexus in the muscle layer by biological staining from the serous side with curcumin on a mouse isolated large intestine (normal mucosal tissue).
  • Fig. 6 shows a multiphoton laser microscopic image in which the intramuscular Auerbach plexus is visualized by biological staining from the serous side with curcumin for a mouse isolated large intestine (normal mucosal tissue).
  • FIG. 6 is a diagram visualizing glandular structure and crypt structure of a mouse isolated large intestine (normal mucosal tissue) by in vivo staining with red No. 106 and imaging from the serous side with a multiphoton laser microscope.
  • FIG. 5a is a picture taken with focus on Figure 5a).
  • curcumin stains glandular cells positively to visualize glandular structure
  • red No. 106 stains connective tissue and capillaries positively as circumferential structure, thus crypt structure Is shown to be identifiable.
  • B Photographs taken with focus on (1) the layers of the epithelium and glands and (2) the mucous membrane muscle (see FIG. 5a).
  • Fig. 5 is a picture taken focusing on the mucous membrane muscle (see Fig. 5a). The figure shows that even when stained from the luminal side, smooth muscle (mucosal muscle plate) is stained with curcumin, and that the connective tissue and capillaries are stained with red No.
  • FIG. 2 is a schematic view showing the degree of progress determination and treatment plan by local invasion and metastasis of cancer.
  • This figure illustrates the cellular architecture of cancer and the local invasion of advanced cancer.
  • colon tissue from the serous side of the large intestine (cancerous tumor part) is stained with curcumin, and the photograph is taken from the serous side with a confocal laser microscope.
  • A Two arrows in the figure indicate a smooth muscle layer and a cancer cell, respectively.
  • B Three arrows in the figure indicate blood vessels, smooth muscle layers and cancer cells, respectively.
  • colon tissue from the luminal side of the large intestine (cancerous tumor site) is stained with curcumin, and the photograph is taken from the luminal side with a multiphoton laser microscope.
  • colon tissue from the serous side of the large intestine (cancerous tumor part) is stained with red No. 106, and the photograph is taken from the serous side with a multiphoton laser microscope.
  • normal lung tissue is stained with curcumin (A) or red No.
  • a nerve cell body can be identified by enlarging strongly the example which visualized the muscle layer autonomic plexus (Meissner's plexus) by laser microscopy after performing the biological staining from the serous side by a curcumin. It is a figure which shows typically the progress of infiltration of a cancer cell, and the staging of a cancer. It is a figure which shows the example which visualized exocrine cells of the pancreas and the islet of Langerhans with a laser microscope by strong magnification, after performing a biological staining by intraperitoneally administering curcumin.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of visualizing miso, which is a sense device of taste, with a laser microscope after being subjected to biological staining by applying curcumin on the tongue mucosa, with strong magnification.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of visualizing miso, which is a sense device of taste, with a laser microscope after being subjected to biological staining by applying curcumin on the tongue mucosa, with strong magnification.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of visualizing miso, which is a sense device of taste, with a laser microscope after being subjected to biological staining by applying curcumin on the tongue mucosa, with strong magnification.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example in which the sensory neurons of miso, which is a sense device of taste, are visualized with a laser microscope after being subjected to in vivo staining by applying curcumin on the tongue mucosa;
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of retinal nerve cell groups visualized by laser microscopy with strong magnification after biological staining is performed by intraperitoneally administering curcumin.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of retinal nerve cell groups visualized with a laser microscope in a large-magnification view after being stained in vivo by intravitreal injection of curcumin.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of an olfactory receptor neuron, which is a sensory cell of odor, visualized with a laser microscope after being subjected to in vivo staining by applying curcumin on the nasal mucosa, with strong magnification. It is a figure which shows the example which visualized the thyroid by laser microscope after performing biological staining by intraperitoneally administering curcumin by strong magnification.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the skeletal muscle actin / myosin striation, nucleus and muscle fibers visualized by laser microscopy after being subjected to in vivo staining by applying curcumin on the fascia, with strong magnification.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the structure of the bright center and the dark shell of the secondary nodule of the lymph node visualized by laser microscopy with strong magnification after the biological staining is performed by applying curcumin on the lymph node.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the structure of the bright center and the dark shell of the secondary nodule of the lymph node visualized by laser microscopy with strong magnification after the biological staining is performed by applying curcumin on the lymph node.
  • FIG. 4 is a diagram in which curcumin was administered intraperitoneally to mice, and cell bodies of hippocampal neurons were visualized by laser microscopy. It is the figure which administered curcumin intraperitoneally to the mouse
  • FIG. 4 is a diagram in which curcumin was administered intraperitoneally to mice and cell bodies and blood vessels of cerebellar neurons were visualized by a laser microscope.
  • Cell stains used in the present invention include biological stains comprising one or more edible dye compounds.
  • the pigment compounds are tar dyes (red 3 (erythrosine), red 104 (phloxine), red 105, red 106, green 3 (fast green FCF), red 2, red 102, blue 2) (Indigo Carmine), Yellow No. 4 (Tartrazine), Yellow No. 5 (Sunset Yellow FCF), Iridoid dyes (Hymelon P-2 (gardenia blue: geniposide), Hi Blue AT (gardenia blue pigment: geniposide) etc.
  • tar dyes red 3 (erythrosine), red 104 (phloxine), red 105, red 106, green 3 (fast green FCF), red 2, red 102, blue 2) (Indigo Carmine), Yellow No. 4 (Tartrazine), Yellow No. 5 (Sunset Yellow FCF), Iridoid dyes (Hymelon P-2 (gardenia blue: geniposide), Hi Blue AT (gardenia blue pigment:
  • Carotenoid pigment (Hymelon P-2 (Yelogen: Crocin), Anatol (Annat-N2R25, Red tree fruits: bixin, norvixin), Hymelon P-2 (gardenia blue: geniposide), Crocin G150 (gardenia yellowster), Crocin L (gardenia yellow pigment), ⁇ -carotene, Annatto WA-20 (anatol pigment, red pepper Tree seeds: Norubixin etc.), flavonoid pigments (High Red G 150 (grape skin pigment, anthocyanin), High Red RA 200 (red radish pigment: pelargonidin acyl glycoside), High Red V 80 (purple amber pigment: cyanidin acyl glucoside and Paeonidin Acyl Glucoside), Apigeninidine (Coulian Pigment), Cyanidin, Delphinidin (Nass Pigment), Fisetidin (Molishima Acacia Pigment), Malvidine (Blue Sweet Pea Pigment),
  • Preferred examples of the cell staining agent used in the present invention include one or more types of staining agents selected from the group consisting of sulfuretin, curcumin, red No. 3 (erythrosine) and red No. 106.
  • the administration method of the cell staining agent is not particularly limited.
  • the cell staining agent of the present invention may be administered directly into the lumen of an organ or submucosally, or may be administered from the serosal side of the organ.
  • administration method thereof administration by application, dropping or spraying can be adopted.
  • oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, intrapleural administration or intrathecal administration can also be performed as a method of administering a cytostain.
  • the administration method can be selected depending on the organ or the site of the organ to be stained. When the staining ability of the staining agent is weak, the mucous surface can be treated with pronase to remove mucus and improve the visibility of the cell structure.
  • the dosage form of the staining agent is preferably a liquid, but can also be used in the form of granules, tablets and the like.
  • additives necessary as appropriate, for example, additives such as tonicity agents, pH adjusters, stabilizers, thickeners, preservatives, flavors or adhesives to the staining agent.
  • additives such as tonicity agents, pH adjusters, stabilizers, thickeners, preservatives, flavors or adhesives to the staining agent.
  • pronase may be blended in advance with the staining agent of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic view showing the stepwise canceration process of a living cell group on the wall surface of the digestive tract.
  • the process of canceration of a living cell group is shown in the order of first stage, second stage, third stage and fourth stage.
  • the first stage is the stage where canceration is initiated in part of the living cell population.
  • the first step is considered to be caused by the weakening of the activity of cancer-related genes of the APC / ⁇ -catenin system and the reduction in the function of suppressing cell proliferation.
  • cell proliferation is slightly enhanced, at least indicating that a precancerous state that can become cancer cells in the future is expressed.
  • the second stage is a precancerous condition in which carcinogenesis has progressed more than the first stage.
  • the activity of the ras cancer-related gene is intensified and the cell proliferation is enhanced.
  • cancer-related genes of STAT3 system may be activated at this stage.
  • the size of the cancer cell population is small, and its diameter is, for example, 0.1 mm or more and 0.4 mm or less.
  • the diameter of a cancer cell population is the diameter when the cancer cell population is regarded as a circle having the same area as the cancer cell population. This stage is not a stage that immediately threatens the patient's life, but it is desirable to establish a treatment plan etc. in preparation for the future.
  • the third stage is a stage in which a part of the living cell group has become infiltrated and cancer cells have become apparent.
  • the third step is considered to be caused by the weakening of the activity of cancer-related genes of the p53 system and the function of suppressing cell proliferation.
  • the activity of the tumor suppressor gene products of both the p53 system and the APC / ⁇ -catenin system is weakened, and the function of suppressing cell proliferation is greatly reduced. Therefore, the growth of cancer cells accelerates and cancer cells infiltrate surrounding tissues.
  • the diameter of the cancer cell population reaches 0.5 mm or more, and leaving it as it is will complete the cancer that induces the death of the individual.
  • the fourth stage is the stage in which, after cancer cells completed in the third stage become cancer, they produce additional gene mutations and further progress to malignant cancers in which cell proliferation, invasion and metastasis are likely to occur.
  • This stage is a stage where cancer metastasis to other distant organs other than the digestive tract begins, and is a dangerous stage which threatens the life of the patient.
  • the speed of progression from these first stage to fourth stage is considered to be influenced by the activation state of the cancer-related gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a growth curve of human cancer cells.
  • the number of cancer cells increases according to a predetermined growth curve.
  • the slope of the growth curve is small during the three years when canceration is about to start (when the diameter of the cancer cell population is less than 0.2 mm), after 4 years (the diameter of the cancer cell population is 0.5 mm) In the above period, the slope of the growth curve becomes large. Then, the slope of the growth curve becomes slightly smaller after seven and a half years.
  • cancer is detected clinically and treatment is performed after 7 years. This is because the cancer cell population can not be detected unless its diameter is 10 mm or more.
  • removal of cancer cells by surgical excision is the mainstream, as cancer is generally found after the cancer is over 20 mm in diameter.
  • the size of the cancer cell population increases exponentially in the range indicated by the broken line A of the growth curve in FIG.
  • This exponential increase means that in cancer cells in the cancer cell population, the first through third cancerous gene mutations that should occur are completed, and the cancer cells divide at a uniform rate. It means that it is repeating.
  • the cancer cell population itself is as small as 1 mm or less in diameter, these cancer cell populations If it is possible to detect (ultra-early cancer), these ultra-early cancers are small enough to be completely removed easily, so that the cancer can be eradicated.
  • it is possible to grasp the malignancy level of canceration as an abnormality in the expression pattern of cancer-related genes at an extremely early stage it is possible to fundamentally treat cancer before it becomes a dangerous stage. It becomes.
  • the present inventors image the cancer related gene expression pattern of a living cell group with a multiphoton laser microscope or a confocal laser microscope and visualize the activity state of the cancer related gene for detection of ultra-early cancer. Then, I tried to grasp the malignancy level of canceration.
  • the inventors performed imaging by coloring cancer-related gene products in a chromatic color using a staining agent containing an edible dye.
  • the edible pigment is, among natural pigments or artificially synthesized pigments, pigments that are permitted to be administered to humans (for example, pigments for coloring food or pigments that can be taken with a supplement).
  • a staining agent containing curcumins can be used as a staining agent for selectively staining STAT3 cancer-related gene products.
  • a staining agent for selectively staining a ras-based cancer-related gene expression pattern a staining agent containing red No. 3 (erythrosine) can be used.
  • a curcumin-containing solution containing 1% by weight of curcumin was prepared as a staining agent containing curcumins, and a solution containing red 3 containing 1% by weight of phloxine was prepared as a staining agent containing red 3 .
  • a staining agent containing curcumins a solution obtained by diluting a curcumin solution (for example, a stock solution containing 5% of curcumin, 45% glycerol, a liquid containing 50% ethanol) by 1/5 to 1/100 with physiological saline May be.
  • the phloxine solution (10 mg / mL of the stock solution) may be diluted by 1/10 as it is.
  • a solution of 0.45% glycerol and 0.5% ethanol diluted with chemically synthesized curcumin to about 1 mg / ml is used.
  • 1 g of Okinawa curcumin powder is dissolved in 10 ml of PBS and diluted to about 1 mg / ml. Both (i) and (ii) are sterilized with a sterilizing filter and administered to a living body immediately before use.
  • a staining agent containing curcumins When using a staining agent containing curcumins, expression of a STAT3 cancer-related gene product in a living cell can be visualized by staining.
  • a staining agent containing Red No. 3 when used, the expression of cancer-related gene in the ras system in living cells can be visualized by staining. After staining, excess stain can be removed by washing. Excess staining solution can be removed by washing about three times for about 10 seconds with a physiological solution that does not damage cells or living tissues such as physiological saline or phosphate buffered saline.
  • the staining time of each staining agent may be 1 to 5 minutes, respectively. At the above-mentioned concentration, if it is within 10 minutes after the start of staining, penetration into the cytoplasm does not penetrate into the nucleus in the cell, so that the nucleus surrounded by the cytoplasm can be clearly visualized, which makes the analysis clearer Will be able to
  • the staining time until observation is 1 to 30 minutes after administration when applied directly to the mucosal surface or organ surface, 30 minutes to 1 hour after administration for oral administration, and 3 minutes to 1 after administration for intravenous administration Time, 3 minutes to 1 hour after administration when administered intraperitoneally 3 minutes to 1 hour after administration when administered subcutaneously, 3 minutes to 1 hour after administration when administered intramuscularly In the case of 5 minutes to 30 minutes after administration, in the case of intrathoracic administration or intrathecal administration, 3 minutes to 1 hour after administration.
  • Staining of cancer cells with the above-mentioned cell stain can be performed directly on organs.
  • the organ may be of human or animal origin.
  • the organ to be stained may be extracted or in vivo.
  • the organs include, but are not limited to, the large intestine, lung, prostate, stomach, esophagus, bladder, lymph nodes and the like.
  • staining a lymph node it is preferable to apply the staining solution after removing the surface tissue covering the lymph node tissue in order to increase the permeability of the staining solution.
  • Cells stained by cell stains can be imaged using multiphoton laser microscopy or confocal laser microscopy.
  • the laser wavelength is preferably 600 nm to 1600 nm in order to obtain sufficient imageable depth and resolution from the organ surface.
  • a laser wavelength of 400 nm to 700 nm is preferable.
  • the staining solution to the organ can be performed from the serosal side covering the organ surface.
  • tubular organs such as the large intestine, stomach and esophagus, it can also be performed from the luminal side.
  • the application means applying, dropping or spraying cell staining solution to an organ.
  • tissue staining can be performed from the luminal side.
  • tissue staining can be performed from the serosal side of the organ.
  • the staining solution from the serosal side When applying the staining solution from the serosal side, apply, drip or spray the sterilized staining solution to the organ serosa in the surgical field, and within 10 minutes after application of the staining solution, preferably 1 to 5 minutes, more preferably 1 At -3 minutes, the organ is washed with physiological saline or the like to remove the staining solution. After this, the stained image can be observed immediately with a multiphoton laser microscope or a confocal laser microscope. Alternatively, the staining agent can be administered systemically before surgery and the tissue can be observed with a laser microscope during surgery.
  • the administration method may be oral administration or intravenous administration.
  • curcumin or red No. 3 is suitable for staining epithelial and glandular cells and cancerous cells from them.
  • red No. 106 is suitable for staining of connective tissue and capillaries. By laser irradiation, curcumin gives a green fluorescent color, while Red No. 3 and Red No. 106 give a red fluorescent color. Therefore, double staining with curcumin and red No. 106 makes it easy to distinguish tissue cell structures by superimposing stained images, and as a result, it is infiltrating or infiltrating a fine cancer tissue with a diameter of about 1 mm. Detection of cancer cell population is possible.
  • FIG. 4 shows the results of biological staining of a mouse isolated large intestine (normal mucosal tissue) with curcumin and red 106 from the luminal side and imaging with a multiphoton laser microscope from the luminal side.
  • curcumin stains the cytoplasm of epithelial cells and glandular cells
  • red No. 106 stains connective tissue, capillaries, and cell membranes of epithelial cells and glandular cells, so that the tissue cell structure can be clearly distinguished by double staining. Is shown.
  • the tissue staining it was found that the observation image by the laser microscope was different between the normal tissue in which the cancer cell is not present and the tumor tissue in which the cancer cell is present.
  • the large intestine mucosa is stained with curcumin (see FIG. 3)
  • the cytoplasm of epithelial cells and glandular cells is stained, and the nucleus is not stained. Because of this, the morphology of individual cells and nuclei is clearly visible.
  • the size of individual cells is unequal, the nucleus is large, and the arrangement or arrangement of cells is uneven.
  • cancer cells can be detected, that is, pathological diagnosis of cancer, based on an image showing the above difference between normal tissue and cancer tissue.
  • cancer cell infiltration can be detected in relation to the five-layer structure of normal colon.
  • the histology of the normal colon is shown in FIG. 5a, and the five-layer structure is shown as (1)-(5). That is, when imaged by confocal laser and multiphoton laser microscopy, the normal large intestine is directed from the surface facing the lumen through which food passes (1) to the layer of epithelium and gland, It is shown to have a very regular layered structure consisting of five layers of (2) mucosal muscularis, (3) submucosal layer, (4) muscular layer, and (5) serous membrane.
  • the surface facing the lumen is (1) the epithelial and glandular layers are completely covered by epithelial cells, and the epithelial cells are in the form of ridges that are vertically depressed from the surface of the gland (this vertically depressed structure Crypt structure (also called crypt structure) is formed at regular intervals.
  • the epithelium appears as a sheet of cells with tightly packed epithelial cells, as shown by focal plane P in FIG. 5a.
  • focal plane C in FIG. 5a about 10 glandular cells are concentrically arranged toward the central opening, and the outer side is a capillary with a diameter of about 10 ⁇ m. It has a shape that surrounds it.
  • the height of the gland is about 0.5 to 1.0 mm, and the deep third of the gland is called the gland bottom, and the cells in this part undergo cell division and renew glandular cells and epithelial cells. It is thought that cancer occurs due to the abnormal cell division of the cells at the bottom of the gland.
  • the mucous membrane muscle plate is a thin smooth muscle layer present deep in the glandular structure, and the stage at which cancer has not developed beyond this mucous membrane muscle plate is called early-stage cancer.
  • the submucosal layer is a layer of sparse connective tissue.
  • the muscle layer is a thick layer of smooth muscle and responsible for peristaltic movement of the intestine (as indicated by focal plane B, in this layer, a group of elongated smooth muscle cells is observed).
  • the serous membrane is a flat layer of cells.
  • curcumin (1) strongly positive for glandular cells in the epithelial and glandular layers
  • (4) weakly positive for smooth muscle in the muscle layer it was found that the Auerbach's plexus inside the muscle layer was strongly stained positively, and the red No. 106 (1) was strongly positive for the capillary network surrounding the glandular structure of the epithelial and glandular layers. It turned out that (2) the smooth muscle of the mucous membrane muscle plate is weakly positive, (4) the smooth muscle of the muscle layer is weakly positive, and the thick blood vessel wall inside the muscle layer is strongly positive.
  • the pathological diagnosis of cancer can be applied to a rapid search pathological diagnosis in the body during surgery.
  • the histopathological diagnosis of cancer is performed by the difference in cell size and form or disorder (cell variant) and disorder in the structure of tissue (structural variant).
  • the strong variant is cancer (malignant) and the weak variant is judged benign.
  • the focal plane with respect to the organ can be varied by manipulating the position of the objective lens of the laser microscope.
  • cell morphology from the organ surface to a depth of 0.05 to 1.0 mm can be clearly observed as a tomographic image.
  • the large intestine tissue is observed from the serosal side
  • the focal depth is sequentially changed from the serosa to the luminal direction, it exists in a relatively thick blood vessel near the serosa, the smooth muscle layer and its inside, It is possible to observe the controlling Auerbach plexus and then the glandular structures including capillaries.
  • the smooth muscle layer even cancer cells infiltrated into the smooth muscle layer can be detected.
  • 5 b shows the results of staining of the isolated large intestine (normal mucosal tissue) of a mouse with curcumin from the luminal side and photographing with a multiphoton laser microscope while changing the focal distance from the serosal side.
  • tissue structure of the large intestine described above (5) serosal surface at focal distance of 0 ⁇ m, (4) smooth muscle of muscle layer at focal distance of 50 ⁇ m, and (1) gland of epithelial and gland layer at focal distance of 80 to 160 ⁇ m.
  • the structure (crypt structure) is clearly visible.
  • the plexus can be visualized by using the method of the present invention.
  • FIG. 5 c is an image obtained by biological staining of a mouse isolated large intestine (normal mucosal tissue) with curcumin from the serous side and observation with a confocal laser microscope. From this figure, it is shown that the Auerbach plexus in the muscle layer is stained positively. That is, it is understood that curcumin visualizes the Auerbach's plexus as a network-like structure, since it darkens nerve cell bodies and lightly stains nerve fibers.
  • the Auerbach's plexus belongs to the autonomic nervous system and consists of nerve cell bodies and nerve fibers connecting them.
  • FIG. 5 d is a magnified view of the confocal laser microscope observation image of the above-mentioned intramuscular Auerbach plexus.
  • This figure shows that neural cell bodies can also be identified.
  • curcumin only stains the cytoplasm and not the nuclei, so the cytoplasm is recognized as a positive image and the nuclei as a negative image. This makes it possible to accurately determine the morphology of the nerve cell body.
  • Cancer cells develop in (1) epithelial and glandular layers (see FIG. 5a), then spread to other layers and migrate (this phenomenon is called cancer cell infiltration).
  • the intramuscular Auerbach plexus can be observed with a multiphoton laser microscope.
  • FIG. 5 e is a diagram showing visualization of Auerbach's plexus in muscle by staining with curcumin.
  • multiphoton laser microscope images many tomographic images can be superimposed, so that the network structure of Auerbach's plexus can be visualized in a wider range.
  • thick blood vessels and smooth muscles can be visualized by vital staining with red 106.
  • Smooth muscle and blood vessel wall are stained when the stained large intestine (normal mucosal tissue) of the stained mouse is photographed by focusing on the serous side (4) muscle layer (see FIG. 5a) with a multiphoton laser microscope Is shown.
  • tissue stained with red 106 can be imaged from the serous side by multiphoton laser microscopy to visualize glandular and crypt structures.
  • FIG. 5g is taken with focus on (1) layers of epithelium and gland (see FIG. 5a). From the obtained image, the distribution pattern of regular glandular structure and crypt structure is visualized because the connective tissue and capillaries run around the glandular cells circumferentially and run like a mesh. There is.
  • This regular glandular structure and distribution pattern of crypt structure is a major feature of the normal colon tissue structure, and when cancer occurs, the morphology of this glandular structure and crypt structure at the site where the cancer is present The regularity in is lost.
  • Cancer is generally a cell located at the base of the gland, and normal but undifferentiated cells that undergo cell division and proliferation undergo the stepwise gene mutation shown in FIG. 1 to cause cell division and proliferation. Is thought to be caused by abnormal acceleration of The stage where cancer cells do not go out of epithelial cells is defined as carcinoma in stage 0, or very early stage cancer. Although cancer cells proliferate beyond the area where epithelial cells originally exist at the local area where they were generated, the stage at which the cancer cells do not exceed the mucosal muscularis is defined as stage 1 or early stage cancer.
  • stage 2-3 The stage in which cancer cells infiltrate the submucosa and muscle layer beyond the mucous membrane muscle plate is defined as stage 2-3.
  • stage 4 The stage at which cancer cells metastasize to other organs beyond the local tissue or organ where they were generated is defined as stage 4.
  • treatment involves endoscopic removal of cancerous tissue in stages 0–1, surgical removal of cancerous tissue in stages 2-3, and chemotherapy and radiation in stage 4.
  • the main subjects are therapy and immunotherapy.
  • the utility of the present invention is that, when cancer tissue is removed or excised by surgery for cancer of the second to third stages, the cancer from the serosal side by using a vital stain and a laser endoscope.
  • An object of the present invention is to present support image data for determining an infiltration area of cells and an area where cancer tissue should be removed or ablated.
  • cancer cells diffuse diffusely along blood vessels and nerves in the connective tissue in the smooth muscle layer or submucosa (see FIG. 9). This phenomenon is called local infiltration of cancer cells. It is extremely difficult to accurately determine the extent of this local infiltration by methods such as current gross examination and changes in tissue hardness due to palpation.
  • cancer cells can be clearly observed by staining the tumor site of the colon cancer mouse with curcumin from the serosa side and observing from the serosa side with a confocal laser microscope.
  • FIG. 10A a large number of curcumin-positive large cells are scattered diffusely in the smooth muscle layer. These cells are judged to be invading cancer cells.
  • the cytoplasm of these cells is stained deeper than the surrounding tissue by curcumin staining and recognized as a positive image, these cells are judged to be cancer cells. That is, these cells are judged to be cancer cells by the finding that cells which should not be present under normal conditions exist where they should not be present.
  • FIG. 10B blood vessels and smooth muscle layers and cancer cells infiltrated therein are observed. The concentration of some cancer cells around blood vessels suggests that cancer cells move along blood vessels and have the property of infiltrating.
  • FIG. 11A and FIG. 11B are photographs of a tumor tumor part of a colon cancer mouse stained with curcumin from the luminal side and photographed from the luminal side with a multiphoton laser microscope. From these photographs, it was shown that cancer cells were strongly stained positively in the cytoplasm and negatively stained in the nucleus. As a result, structural variants and cancerous variants of cancer can be distinguished.
  • FIG. 12 is a photograph taken from the serosal side of a tumor tumor part of a colon cancer mouse stained with red 106 from the serosal side, and taken from the serosal side with a multiphoton laser microscope, and a schematic view of progressive cancer infiltration.
  • normal tissues it can be confirmed that crypt structure is regularly distributed.
  • cancer tissues the regular distribution of crypt structure has disappeared, and it can be judged as cancer. That is, it is determined that cancer cells are present at this site because the normal structure is not at the normal site.
  • the intramuscular Auerbach plexus can be visualized by laser microscopy.
  • FIG. 16 is an example of visualizing the Auerbach's plexus within the muscle layer with a laser microscope after the mouse large intestine is stained with curcumin from the serosal side. Based on FIG. 16, curcumin staining can identify neuronal cell bodies. Since curcumin stains only the cytoplasm and not the nucleus in the neuronal cell body, the cytoplasm is viewed as a positive image and the nucleus is viewed as a negative image, and the morphology of the neuronal cell body can be accurately determined.
  • cancer cells develop in (1) the epithelial and gland layers (see FIG. 5a), they expand and migrate to other layers (this is called cancer cell infiltration), but It is known that cases tend to move along blood vessels and peripheral nerves. Therefore, the ability to visualize the Auerbach's plexus in the muscle layer by the biological staining of curcumin indicates that the infiltration route of cancer can be visualized, which is useful in determining the infiltration range of cancer. In addition, early cancer and advanced cancer can be determined.
  • the intramuscular autonomic plexus (Meissner plexus) can be visualized by laser microscopy.
  • FIG. 17 shows an example in which the mouse large intestine is stained with curcumin from the serosal side, and then the Meisner plexus is visualized by a laser microscope. Based on FIG. 17, curcumin staining can identify neuronal cell bodies. The Meisner plexus exists in the submucosa, and one to several neurons form a population.
  • the cytoplasm is viewed as a positive image and the nucleus is viewed as a negative image, and the morphology of the neuronal cell body can be accurately determined.
  • cancer generally originates from mucosal epithelial cells, the primary site necessarily remains inside the mucosal epithelium.
  • cancer tissue develops, cancer cells infiltrate from the inside of the mucosal epithelium to the deep part. If the cancer cells have not yet invaded or reached the mucosal musculature and the Meissner plexus, the cancer is judged as an early stage cancer. On the other hand, when the cancer cells infiltrate or reach the Meissner plexus and the smooth muscle layer, the cancer is determined to be a progressive cancer.
  • FIG. 19 is a diagram showing the exocrine cells of the pancreas and the islets of Langerhans visualized by laser microscopy after biostaining by intraperitoneal administration of curcumin to mice.
  • FIG. 19 further shows hematoxylin and eosin (HE) stained images of pancreatic tissue.
  • HE hematoxylin and eosin
  • An exocrine cell is larger than an endocrine cell, has many secretory granules in the cell, and several cells are gathered in a tufted form.
  • Peritoneal administration of a solution of sterilized curcumin enables visualization of the islets of Langerhans of the pancreas, which can be used for diagnosis of diabetes and insulinoma in the endocrine area.
  • FIGS. 20 to 22 are diagrams showing a taste sensor, which is a sensory device for taste, visualized with a laser microscope after being subjected to biological staining by applying curcumin on mouse tongue mucosa.
  • Figures 20 and 21 further show hematoxylin-eosin stained images of miso. The nuclei of sensory neurons are not stained with curcumin and are recognized as black negative images.
  • curcumin By applying curcumin on the oral mucous membrane, it is possible to visualize nerve cells of miso which is a sensory device of taste, so that it is possible to test taste disorder in the otolary region.
  • FIGS. 23 and 24 are views of retinal nerve cell groups visualized by laser microscopy after biological staining was performed by intraperitoneal administration of curcumin to mice. These figures include hematoxylin and eosin stained images of retinal tissue. The figure shows that retinal nerve cell groups and synapses can be visualized. Visualization of membrane nerve cell groups and synapses is also possible by oral administration or intravitreal injection of curcumin. In the ophthalmologic area, for example, it is possible to determine the stage of diabetic retinopathy, macular degeneration, retinal degeneration, proliferative vitreoretinopathy, glaucoma and edema retinoblastoma.
  • curcumin allows staining of olfactory nerve fibers (FIG. 25) and olfactory receptor neurons (FIG. 26), which are sensory cells of odor, and can be visualized by laser microscopy.
  • FIG. 26 includes hematoxylin and eosin stained images.
  • curcumin the cytoplasm of olfactory receptor neurons and cilia having an odor receptor are positively stained, and the nucleus is not stained so that it is visible as a black negative image.
  • curcumin By applying curcumin on the nasal cavity mucosa, it is possible to visualize olfactory receptor neurons, which are sensory cells of odor, so that it is possible to examine an olfactory disorder.
  • the thyroid after in vivo staining with curcumin, the thyroid can be visualized by laser microscopy (FIG. 27).
  • Curcumin vital staining of the thyroid stains the structure of the vesicles.
  • the thyroid is formed by spherical vesicles of various sizes. These vesicles are bordered in the squamous or cubic epithelium of a monolayer and filled with colloids that stain the lumen evenly with eosin by hematoxylin-eosin staining. It can be seen that the vesicles are surrounded by a dense capillary network.
  • actin-myosin striations, nuclei and muscle fibers of skeletal muscle can be visualized by laser microscopy after performing biological staining by applying curcumin on the fascia ( Figure 28).
  • curcumin By applying sterile curcumin solution onto fascia, muscle fibers and actin molecules of skeletal muscle can be visualized, which can be applied to morphological light biopsy diagnosis of muscle weakness and flail syndrome Sex is shown.
  • the structure of the bright center and the dark shell of the secondary nodule of the lymph node can be visualized by a laser microscope ( Figure 29).
  • Figure 29 In bright centers, many cells with large bright nuclei are seen. These cells are reticular cells and large lymphocytes during cell division.
  • the dark shell has a structure in which small lymphocytes proliferated at the bright center are accumulated around the bright center.
  • the surface application of the sterilized curcumin solution enables visualization of the cell structure inside the lymph nodes, so in urology and gastrointestinal surgery, it is possible to determine the presence or absence of lymph node metastasis of cancer during laparoscopic robot surgery. It will be possible.
  • the soma of pyramidal cells can be visualized in hippocampus CA3 area by laser microscopy (FIG. 30).
  • the cerebral cortex cell bodies of blood vessels and pyramidal cells can be visualized (FIG. 31).
  • the cerebellum blood vessels and cell bodies of Purkin cells can be visualized ( Figure 32).
  • a disease in which the morphology, relative position and arrangement of cells in a tissue, and the number of cells in a tissue change or fluctuate in all organs in comparison with normal tissue can be determined or diagnosis of a disease in which the morphology, relative position and arrangement of cells in a tissue, and the number of cells in a tissue change or fluctuate in all organs in comparison with normal tissue.
  • diseases include, but are not limited to, the diseases exemplified above such as cancer, diabetes, diabetic retinopathy, macular degeneration, retinal degeneration, taste disorder, olfactory disorder, Alzheimer's disease, cerebral infarction and the like.
  • diseases in which only the function of cells changes or fluctuates such as schizophrenia, can not be determined or diagnosed by the present invention.
  • the method of the present invention is characterized in that cancer tissue can be visualized before disease removal prior to or during surgery by performing tissue staining and laser irradiation from the serous side of an organ suspected of having cancer present. .
  • marking the excision site of the organ that is, the cancer tissue edge
  • surgical threads or tapes may be used as well-known surgical biological markings, and marking dyes may be used.
  • the biological marking pigment for surgery examples include sulfobromophthalein sodium, indocyanine green, fluorourene sodium, methylene blue, indigo carmine, toluidine blue, pictanin blue and the like.
  • These marking dyes can be enhanced in tissue adhesion by mixing them with, for example, sodium carboxymethylcellulose, sodium hyaluronate, gum arabic and the like as a thickener.
  • a tip probe for laser irradiation in addition to a general objective lens with a diameter of about 20 mm, a stick-type objective lens with a diameter of about 5 mm and a needle-type objective lens with a diameter of about 0.3 to 2 mm can be used.
  • notifying the operator that cancer cells have been detected is useful as a support method that leads the cancer treatment to the surgeon to be successful.
  • Such notification can be made to the operator by sound or light.
  • a system for notifying the presence of a cancerous tissue by collating an image captured by a laser microscope with a cancerous tissue image stored in advance in a database is preferable as a means for preventing the remaining of the cancerous tissue.
  • the test conditions in the above test that is, preparation of a cell staining solution, animals used, colon cancer model mouse preparation method and conditions of laser irradiation are as follows.
  • [Preparation of cell staining solution] 100 mg of curcumin (Tokyo Kasei, catalog number C2302, purity 97.0%) was suspended in 5 mL of ethanol, and was further diluted 10-fold with ethanol. This was mixed with the same amount of glycerin and further diluted 10-fold with glycerin. This mixture was mixed with the same amount of purified water to form a curcumin staining solution.
  • Red No. 106 a solution of the powder in 1 mg / mL in physiological saline was used as a staining solution.
  • C57BL / 6N mice purchased from Japan SLC Co., Ltd. were used. All tests were conducted using male, 8-week-old, 20-25 gram-weight mice.
  • Method for preparing colon cancer model mice A colon cancer model mouse was prepared by intraperitoneally administering 10 mg / kg of azoxymethane (azoxymethane, AOM) dissolved in saline to C57BL / 6N mice at weekly intervals four times.
  • AOM azoxymethane
  • the multiphoton laser microscope used FVMPE-RS manufactured by Olympus Corporation, and the irradiation wavelength was 800 nm.
  • Laser irradiation was performed at an output of 5.8 to 48.2% of the full power output.
  • the confocal laser microscope used Olympus FV1000, and made the irradiation wavelength 488 nm and 594 nm.
  • the 488 nm laser irradiation was performed at 15 to 29.4% of the full power output, and the 594 nm laser irradiation was performed at 13 to 13.5% of the full power output.
  • the direction of irradiation and the staining from the serosal side or the lumen side are described in the figure.
  • the cancer inspection apparatus 201 includes a laser oscillator 213, a beam diameter adjuster 215, a two-dimensional scanner 217, a dichroic mirror 219, and an objective lens 221.
  • the light collecting depth adjuster 223, the light detector 225, the fluorescence image generation unit 227, the monitor 229, and the control unit 231 are provided.
  • the laser oscillator 213 one capable of adjusting the output of pulse laser light in a pulse width of tens to hundreds of femtoseconds and pulse repetition frequency in a range of tens to hundreds of MHz is used.
  • the beam diameter adjuster 215 is a beam expander that changes the beam diameter of pulse laser light in accordance with the beam diameter adjustment signal from the control unit 231.
  • the two-dimensional scanner 217 is formed of, for example, two galvano mirrors, and changes the focusing position of the pulse laser light in two axial directions perpendicular to the optical axis.
  • the dichroic mirror 219 separates the fluorescence generated in the cancer-related gene product of a living cell upon irradiation with pulsed laser light.
  • the objective lens 221 condenses the pulse laser light emitted from the laser oscillator 213 onto a living cell, and condenses the fluorescence generated in the cancer-related gene product by the multiphoton absorption phenomenon.
  • the objective lens 221 can be moved in the direction of the optical axis by the focusing depth adjuster 223 based on the control signal, and can adjust the focusing position.
  • the photodetector 225 detects the fluorescence generated in the cancer-related gene product and converts it into an electrical signal according to the fluorescence intensity.
  • the scanning state of the two-dimensional scanner 217 and the adjustment position (position in the depth direction) of the collection depth adjuster 223 become parameters representing the coordinates of the collection position, and the fluorescence image generation unit 227 determines the parameters representing these coordinates.
  • the electrical signal (ie, fluorescence intensity) sent from the light detector 225 are associated and stored, and these data are processed to generate a fluorescence image.
  • the generated fluorescence image is displayed on the monitor 229.
  • the control unit 231 includes an operation control unit 233, an inspection pulse intensity setting unit 235, an irradiation range setting unit 239, and an irradiation time setting unit 241.
  • the operation control unit 233 controls the operations of the laser oscillator 213, the beam diameter adjuster 215, the two-dimensional scanner 217, and the focus depth adjuster 223.
  • the examination pulse intensity setting unit 235 sets the pulse laser beam intensity of an intensity suitable for acquiring a fluorescence image of the cancer-related gene expression pattern, in order to conduct an examination.
  • the irradiation range setting unit 239 sets the range in which the living cells are irradiated with the pulse laser beam. Then, the operation control unit 233 controls the operations of the two-dimensional scanner 217 and the collection depth adjuster 223 to irradiate and collect pulse laser light in the set irradiation range and depth.
  • the irradiation time setting unit 241 sets the time for irradiating living cells with pulsed laser light. Then, the operation control unit 233 controls the output of the laser oscillator 213 to emit pulsed laser light for a set time.
  • control unit 231 includes a storage unit 51 and a determination unit 52. That is, the cancer inspection apparatus 201 determines in real time the malignancy level and prognosis of canceration of the living cell group based on the staining state of the living cell group of the image obtained by imaging.
  • this cancer inspection apparatus 201 determines the malignancy level of canceration based on the staining condition of the cancer-related gene expression pattern of the living cell group, grasping the canceration of the living cell group at an early stage Can. Moreover, since the malignancy level of canceration can be grasped
  • the cancer inspection apparatus 201 includes a therapeutic pulse intensity setting unit 237, and can set an intensity of pulsed laser light having an intensity sufficient to destroy a living cell for performing a treatment. Thereby, cancer treatment can be performed at an early stage on the discovered cancer cell population.
  • cancer inspection apparatus 201 can be used in various forms.
  • a beam diameter adjuster 215, a two-dimensional scanner 217, an optical system composed of a dichroic mirror 219 and an objective lens 221, and an optical path between them While providing a depth adjuster 223, a patient fixing base 245 for placing a patient and a moving device 247 can be further provided to perform a cancer test.
  • imaging is performed using the cancer inspection apparatus 201, and the malignancy degree of canceration The level may be determined.
  • application of the staining agent 45 to the living cell group may be performed before scraping the living cell group, or may be performed before imaging after scraping the living cell group.
  • it can also be used as a post-excision cancer inspection apparatus for accurately cutting out a cancerous part in real time at the time of surgery, or indicating that it has been correctly cut off.
  • an accurate position in cm is known in advance using a normal endoscope, CT, X-ray imaging, etc., in order to specify a site to be subjected to the surgical operation.
  • a surgical thread or tape may be used as a surgical biological marking, or a marking dye may be used.
  • a marking dye nozzle interlocked with the objective lens 221 of FIG. It is particularly useful.
  • it is also effective to partially burn the cancer tissue peripheral contour or to evaporate it in a broken line shape by increasing the laser irradiation intensity.
  • determining the peripheral part move the movable part including the objective lens of the cancer inspection apparatus 201 in the XY direction by moving the distance including the peripheral part of the central part of the cancer and mark the point where the fluorescence density is lowest. . Thereafter, by rotating the angle of the movable portion, for example, by about 5 degrees and repeating the same moving sweep, it is possible to mark the peripheral portion of the outermost periphery to be cut out including the progressive cancer.
  • the present invention provides a method of identifying tissues and cells necessary for a surgeon to immediately make a pathological diagnosis during surgery, thereby allowing the radical removal of cancer while allowing removal of tissues while allowing a radical removal of cancer. It can be minimized. As a result, the burden on patients who undergo cancer removal surgery is greatly reduced.

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Abstract

可食性色素染色剤であるクルクミン、赤色3号または赤色106号による臓器組織染色を行った後、レーザー照射により、臓器の漿膜側または管腔内でがん細胞と正常細胞とを識別する生体染色検査方法を提供する。

Description

検出方法
  本発明は、可食性色素染色剤による臓器組織生体染色後、レーザー照射により、臓器においてがん細胞と正常細胞とを識別する生体染色検査方法および組織可視化方法に関する。
  がんは、現在、わが国において、死亡原因の一位であり、国民のうち２人に１人ががんに罹患し、４人に１人ががんで死亡しているのが現状である。しかも、がんによる死亡者数は、現在、なお増加しており、がんによる死亡者を減少させることは、国民の悲願となっている。がん死亡を減少させる基本的な方策は、がんの早期発見であると考えられているが、現行の内視鏡検査では、がんが直径10～20ミリ程度に成長したものでなければ発見困難であるという限界がある。従って、現在、大部分のがん患者は、外科的ながんの切除により治療されることが主流になっており、術前・術中の迅速判断支援技術の開発が急務となっている。
  外科的がん切除手術のゴールは、がん細胞の可及的完全な除去と病巣除去後の臓器機能の最大限の温存という、両立が極めて困難な目標の同時達成である。この非常に困難な目標達成のために、多くの外科技術的な改善・努力がなされている。外科手術的ながん治療の成績向上の鍵の一つとして、従来から迅速病理診断がある。術前・術中に執刀医が、がんを発生した臓器とその周辺の臓器やリンパ節および血管において、どの範囲までがん細胞が浸潤・転移しているかを病理診断レベルで正確に把握できることは、極めて大きな支援となる。
  クルクミン、スルフレチン、赤色3号、赤色106号等の可食性色素染色によりin vivoで消化管等の内腔面から染色し、内腔面よりレーザー顕微内視鏡などファイバーによりがん細胞と通常細胞を識別する方法が報告されている（特許文献１）。一方、術前・術中に消化管等の漿膜面または管腔内からがん細胞と通常細胞を識別する有効な方法はほとんどなく、そのような方法の開発が強く求められる。
国際公開第２０１４／１５７７０３号
  胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボットの導入により、開腹をせずに侵襲性の小さい手術が実施され、患者への負担は大幅に軽減されている。一方、がんの場合には、微細浸潤による再発を避けるために、胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボットを用いた場合でも、摘出部位は広範囲とならざるをえず、患者への負担軽減を図るためには、摘出範囲を小さくすることが求められる。当該手術は基本的に臓器の漿膜側より実施するため、漿膜側からがん細胞の浸潤範囲を術前・術中において、患部の切除前に予測できれば、摘出範囲を小さくすることが可能であり、胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボットの利点と相まって、がん患者への負担が極めて小さくなる。そのためには、漿膜側からがん組織断端を明確にする技術が必要となる。また、例えばカプセル内視鏡を内服する場合には、消化管の内腔からのがん組織観察が必要となる。
  発明者らは、がん細胞特異的生体染色とレーザー顕微鏡を用いた術中の迅速病理診断システムの開発を行っており、クルクミンなどの特定の可食性色素を消化管粘膜表面に塗布後、レーザー顕微鏡で生体染色した細胞を観察すると、がん細胞が正常細胞より濃く染色されることを見いだした。当該染色により、がん細胞を迅速に検出し、さらに、細胞の核の形態を含めた細胞形態の明瞭な可視化が可能となった。その結果、病理診断において、細胞異型および構造異型の確実な判別が可能となり、微小がんを検出・治療できる方法の開発に成功した。当該方法は、クルクミンや赤色3号などのヒト経口摂取認可済み可食性色素を1 mg/mL程度の無菌溶液として、in vivoの消化管内腔面、リンパ節やex vivoの切除断端に塗布し、約1～５分間静置し、レーザー顕微鏡によって数秒以内に画像化できるので、術中迅速病理診断に、大きく寄与できる技術である。
  胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボット技術等は、基本的に臓器の漿膜側より実施するため、漿膜側からがん細胞の浸潤範囲を術前に予測し、術後のがん細胞の取り残しの有無を判断することができれば、がんの根治的切除を可能としつつ、摘出範囲は少なくて済み、患者負担は大幅に軽減される。
  そこで本発明は、クルクミンなどの特定の可食性色素を内腔面もしくは漿膜側から組織に塗布し、または経口摂取により、執刀部位近傍の生体染色した組織または細胞をレーザー顕微鏡で画像化し、がん組織またはがん細胞を識別する方法を提供する。
  すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］
レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法。
［２］
臓器の漿膜側から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、［１］に記載の方法。
［３］
臓器の管腔内から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、［１］に記載の方法。
［４］
前記細胞染色剤が、スルフレチン、クルクミン、赤色3号（エリスロシン）および赤色106号からなる群より選ばれる１種類以上の染色剤である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
細胞染色剤の投与が、臓器の漿膜側からの塗布、滴下または噴霧により行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
細胞染色剤の投与が、臓器の管腔内からの塗布、滴下または噴霧により行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［７］
細胞染色剤の投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下注射投与、筋肉内注射投与、臓器内注射投与、胸腔内投与またはくも膜下投与である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［８］
レーザー照射が、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて行われる、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
［８］に記載の方法を使用し、がん細胞を可視化することを特徴とする、がん細胞の検出方法。
［１０］
がんの存在が疑われる臓器において、がんが存在する場合に、所属リンパ節組織へのがんの浸潤を判定するための方法であって、リンパ節組織を覆う表面被膜の上から滴下、または、リンパ節内部に注射する方法で、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を当該リンパ節組織に投与し、次に、当該リンパ節組織に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することことを含む、［９］に記載の方法。
［１１］
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する細胞の細胞質および核の形態について得られた可視化画像に基づいて細胞の種類を同定することを特徴とする、［９］に記載の方法。
［１２］
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
がんの存在が疑われる臓器において、赤色106号染色により臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該臓器組織内に存在するがん細胞および正常細胞周囲の毛細血管の走行パターンを比較し、がん細胞周囲で見られる毛細血管の消失および／または変形に基づき、がん細胞を検出することを特徴とする、［９］に記載の方法。
［１４］
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
臓器表面から0.05～1.0 mmまでの深さの細胞形態を可視化することを含む、［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
さらに、がん組織の位置を、臓器におけるがん組織辺縁を蛍光染色することにより特定することを含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在するマイスナー神経叢またはアウエルバッハ神経叢を可視化することを含む、［９］に記載の方法。
［１８］
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［１９］
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［２０］
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定されることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［２１］
さらに、がん細胞が検出されたことを音または光により通知することを含む、［９］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、漿膜側または管腔内からがん細胞を一個単位で除去し、がん患者を治療する方法。
［２３］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、術後に漿膜側または管腔内から生体に残存するがん細胞を確認し、がん細胞一個単位で除去する方法。
［２４］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、大腸がん患者を治療する方法。
［２５］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、肺がん患者を治療する方法。
［２６］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、前立腺がん患者を治療する方法。
［２７］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、胃がん患者を治療する方法。
［２８］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、食道がん患者を治療する方法。
［２９］
［９］～［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、膀胱がん患者を治療する方法。
［３０］
クルクミンまたはスルフレチンによる臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する神経細胞の細胞質および核ならびに神経線維の形態、および/または神経線維・軸索を囲む髄鞘の形態について得られた可視化画像に基づいて、神経細胞の種類および神経ネットワークを同定する、［８］に記載の方法。
［３１］
前記神経細胞が自律神経細胞であり、前記神経ネットワークがアウエルバッハ神経叢またはマイスナー神経叢である、［３０］に記載の方法。
［３２］
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による臓器組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、得られた細胞画像に基づいて、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別する、［９］に記載の方法。
［３３］
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による消化管組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該消化管における５層構造（１．上皮と腺の層、２．粘膜筋板、３．粘膜下層、４．筋層、５．漿膜）について、正常組織とがん細胞の浸潤部の構造に関する画像の差異に基づいて、各層ごとに、がん浸潤の有無を判定する、［９］に記載の方法。
［３４］
［９］に記載の方法を用いることを特徴とする、個体におけるがんの検出方法であって、可視化画像に基づき、正常細胞と比較して、細胞が異型であると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程、または、正常細胞と比較して、腺構造・陰窩構造の分布パターンの規則性が失われると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程を含む、がんの検出方法。
［３５］
［１７］
に記載の方法を用いることを特徴とする、進行がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程、またはがんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程を含む、進行がんの診断方法。
［３６］
［１７］に記載の方法を用いることを特徴とする、早期がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定される工程を含む、早期がんの診断方法。
［３７］
［８］に記載の方法を使用する、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハン島の可視化方法。
［３８］
［８］に記載の方法を使用する、舌または軟口蓋に存在する味蕾の可視化方法。
［３９］
［８］に記載の方法を使用する、坐骨神経などの末梢神経の可視化方法。
［４０］
［８］に記載の方法を使用する、脳組織の可視化方法。
［４１］
前記脳組織が大脳皮質、海馬、扁桃体、視床下部または小脳である、［４０］
に記載の方法。
［４２］
［４０］または［４１］に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、脳疾患または脳症状の判定方法。
［４３］
前記脳疾患または脳症状が、アルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性硬化症および脊髄小脳変性症を含む、［４２］に記載の方法。
［４４］
［８］に記載の方法を使用する、眼組織の可視化方法。
［４５］前記眼組織が網膜である、［４４］に記載の方法。
［４６］
［４４］または［４５］に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、眼疾患または眼症状の判定方法。
［４７］
前記眼疾患または眼症状が、黄斑変性、網膜変性、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、増殖性硝子体網膜症、緑内障、網膜剥離および網膜浮腫を含む、［４６］
に記載の方法。
［４８］
［１０］に記載の方法を用いることを特徴とする、、腹腔鏡外科手術中に、当該リンパ節にがん細胞が存在するか否かを、リンパ節切除前に判定する方法。
［４９］
リンパ節に転移したがん細胞を、がん細胞だけを一個単位でレーザー蒸散で破壊して、がん細胞の死骸を免疫細胞に認識させて、活性化されたリンパ球に、がんの原発巣のがん細胞を攻撃させることを特徴とする、がん免疫療法。
［５０］
クルクミンの経口投与、腹腔内投与で、消化管、全身の脳と網膜の神経細胞の細胞体、味、匂いの感覚細胞、内分泌細胞、リンパ節、骨格筋、肺、膵臓、肝臓の細胞構造を可視化し、可視化した細胞構造をレーザー顕微内視鏡と蛍光顕微鏡で画像化することで、細胞の位置、数、形、大きさ、配列に異常をきたす全ての疾患を診断する方法。
［５１］
［５０］に記載の方法を用いることを特徴とする、レーザー照射で、問題のある細胞を、一個単位で破壊・除去する方法。
［５２］
再生医療で移植したiPS細胞が未分化細胞・がん細胞になったときには、それらの細胞のみを、レーザーで破壊する治療法。
［５３］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、子宮がん、卵巣がんのがん患者を治療する方法。
［５４］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、乳がんのがん患者を治療する方法。
［５５］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓がん、胆嚢がんのがん患者を治療する方法。
［５６］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、舌がん、咽喉がん、喉頭がん、甲状腺がんを治療する方法。
［５７］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、扁桃腺炎の原因を診断する方法。
［５８］
扁桃腺に浸潤している白血球において、好中球が多く浸潤する場合は細菌感染性扁桃腺炎、好酸球が多く浸潤する場合はアレルギー性扁桃腺炎、リンパ球が多く浸潤する場合はウイルス感染性扁桃腺炎と判断する工程を含む、［５７］に記載の方法。
［５９］
［９］～［２１］, ［３８］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、味蕾、嗅上皮の感覚細胞の形態を解析し、味覚異常および/または嗅覚異常を診断する方法。
［６０］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、骨格筋の形態を解析し、サルコペニアおよび/または重症筋無力症の病変を診断する方法。
［６１］
［９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓のランゲルハンス島および/または甲状腺の内分泌細胞細胞の形態を解析し、糖尿病および/またはバセドー病を診断する方法。
  本発明によれば、漿膜側から組織内部の細胞および組織の状態を確認することが可能となる。
  本発明の方法により、ヒト経口摂取認可済み可食性色素であるスルフレチン、クルクミン、赤色3号または赤色106号溶液を、内腔側または漿膜側組織から噴霧し約1～５分間静置後、またはクルクミン溶液を経口投与後、多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザーによって、漿膜側から細胞形態を画像化し識別することができる。なおクルクミンおよび赤色3号は、それぞれがん関連遺伝子産物のSTAT3およびRASを高発現した細胞を染色することができる。当該方法に従って色素を噴霧塗布した場合、画像取得までの時間は５分以内であり、外科医が注目する組織部位を複数箇所連続的に検索することができる。すなわち、本発明は、外科医が術中に即座に病理診断するために必要な、組織および細胞の識別方法を提供する。当該方法で得られる多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡画像は極めて鮮明であり、個々の細胞の核の形態が明瞭に可視化されるため、がんの細胞異型と構造異型を確実に判断することができる。
消化管内壁面における生体細胞群の段階的ながん化遺伝子の変異および活性化と、がんの発達、浸潤および転移の過程を示した模式図である。 ヒトのがん細胞の増殖曲線の一例を示す図である。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織およびがん腫瘍部）を、管腔側からクルクミン染色し、管腔側から多光子レーザー顕微鏡により撮影した写真である。（Ａ） 正常大腸粘膜（Ｂ）大腸がん腫瘍部 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンおよび赤色106号で生体染色し、管腔側から多光子レーザー顕微鏡により撮影した写真である。 正常大腸の組織構造について説明する図であり、食物が通過するルーメン（管腔）に面する表面から深部に向けて、（1）上皮と腺の層、（2）粘膜筋板、（3）粘膜下層、（4）筋層、（5）漿膜の５層を示す。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンで染色し、漿膜側から焦点距離を変えながら多光子レーザー顕微鏡により撮影した写真である。写真内の数値は、漿膜側からの焦点距離を示す。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）を、クルクミンによる漿膜側からの生体染色により、筋層内アウエルバッハ神経叢が陽性に染色された共焦点レーザー顕微鏡画像の弱拡大図である。本図は、（4）の筋層（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影したものである。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、クルクミンによる漿膜側からの生体染色による筋層内アウエルバッハ神経叢の共焦点レーザー顕微鏡による可視化の例を強拡大し、神経細胞体が識別できることを示す図である。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、クルクミンによる漿膜側からの生体染色により、筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化した、多光子レーザー顕微鏡画像を示す。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、赤色１０６号による生体染色および多光子レーザー顕微鏡による漿膜側からの画像化による、太い血管および平滑筋を可視化した図である。本図は、（4）筋層（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影したものであり、赤色１０６号により、平滑筋と血管壁が染色されていることを示す。 マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、赤色１０６号による生体染色および多光子レーザー顕微鏡による漿膜側からの画像化による、腺構造および陰窩構造を可視化した図である。 および マウス腹部を切開した後、大腸（正常組織）の漿膜側から大腸組織をクルクミンおよび赤色106号で二重生体染色し、共焦点レーザー顕微鏡により、漿膜側から、（1）上皮と腺の層（図５ａを参照）に焦点を当てて、撮影した写真である。（Ａ）本図により、クルクミンは、腺細胞を陽性に染色することから腺構造が可視化され、赤色106号は、結合組織および毛細血管を円周状構造として陽性に染色することから、陰窩構造が識別できることが示される。（Ｂ）（1）上皮と腺の層および（2）粘膜筋板（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影した写真である。本図により、クルクミンによって腺が染色され、赤色106号により結合組織および毛細血管が染色されることに加え、クルクミンにより平滑筋（粘膜筋板）が染色されることが示される。 マウス腹部を切開した後、大腸（正常組織）の管腔側から大腸組織をクルクミンおよび赤色106号で染色し、共焦点レーザー顕微鏡により漿膜側から、（1）上皮と腺の層および（2）粘膜筋板（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影した写真である。本図により、管腔側から染色した場合であっても、クルクミンにより平滑筋（粘膜筋板）が染色され、赤色106号により結合組織および毛細血管が染色されていることが示される。 がんの局所浸潤および転移による進行度判定ならびに治療方針を示す概略図である。 本図は、がんの細胞構築および進行がんの局所浸潤を図解する。 および 大腸がんマウス腹部を切開した後、大腸（がん腫瘍部）の漿膜側から大腸組織をクルクミンで染色し、共焦点レーザー顕微鏡により漿膜側から撮影した写真である。（Ａ）図中の２本の矢印は、それぞれ平滑筋層およびがん細胞を示す。（Ｂ）図中の３本の矢印は、それぞれ血管、平滑筋層およびがん細胞を示す。 および 大腸がんマウス腹部を切開した後、大腸（がん腫瘍部）の管腔側から大腸組織をクルクミンで染色し、多光子レーザー顕微鏡により管腔側から撮影した写真である。 大腸がんマウス腹部を切開した後、大腸（がん腫瘍部）の漿膜側から大腸組織を赤色106号で染色し、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から撮影した写真である。 マウス胸部を切開した後、胸膜臓側表面側から正常肺組織をクルクミン（Ａ）または赤色106号（Ｂ）により染色し、マウス胸部に挿入した共焦点レーザー顕微鏡により胸膜臓側表面側から撮影し、肺胞構造が明瞭に観察されることを示す写真である。 本実施の形態に係るがん検査装置２０１を示す図である。 本図は、がん検査を図解する。 クルクミンによる漿膜側からの生体染色を行った後、筋層内アウエルバッハ神経叢をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンによる漿膜側からの生体染色を行った後、筋層内自律神経叢（マイスナー神経叢）をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大することにより、神経細胞体を識別できることを示す図である。 がん細胞の浸潤の経過とがんのステージ分類を模式的に示す図である。 クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハンス島をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。さらに、膵臓組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す図である。 クルクミンを舌粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンを舌粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンを舌粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾の感覚神経細胞を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、により、網膜神経細胞群をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンを硝子体内注射することにより生体染色を行った後、網膜神経細胞群を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、嗅神経線維を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。本図により、クルクミンがミエリン髄鞘を染色することが示される。 クルクミンを鼻粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、匂いの感覚細胞である嗅覚受容神経細胞を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、甲状腺を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。さらに、甲状腺組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す図である。 クルクミンを筋膜上に塗布することにより生体染色を行った後、骨格筋のアクチン・ミオシン横紋、核および筋線維を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 クルクミンをリンパ節上に塗布することにより生体染色を行った後、リンパ節の二次小節の明中心と暗殻の構造を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。 マウス腹腔内にクルクミンを投与し、海馬の神経細胞の細胞体をレーザー顕微鏡により可視化した図である。 マウス腹腔内にクルクミンを投与し、大脳皮質をレーザー顕微鏡により可視化した図である。 マウス腹腔内にクルクミンを投与し、小脳の神経細胞の細胞体および血管を、レーザー顕微鏡により可視化した図である。
　次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。しかしながら本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。
  本発明で用いられる細胞染色剤としては、可食性の１種類以上の色素化合物を含んで成る生体染色剤が挙げられる。色素化合物は、タール系色素（赤色３号（エリスロシン）、赤色１０４号（フロキシン）、赤色１０５号、赤色１０６号、緑色３号（ファストグリーンFCF）、赤色２号、赤色１０２号、青色２号（インジゴカルミン）、黄色４号（タートラジン）、黄色５号（サンセットイエローFCF）等）、イリドイド系色素（ハイメロンＰ－２（クチナシ青：ゲニポシド）、ハイブルーＡＴ（クチナシ青色素：ゲニポシド）等）、カロテノイド系色素（ハイメロンＰ－２（黄色素：クロシン）、アナトール（アンナットーＮ2Ｒ25、紅の木の実：ビキシン、ノルビキシン）、ハイメロンＰ－２（クチナシ青：ゲニポシド）、クロシンＧ１５０（クチナシ黄色素）、クロシンＬ（クチナシ黄色素）、βカロテン、アンナットーＷＡ－２０（アナトール色素、べにの木の種子：ノルビキシン）等）、フラボノイド系色素（ハイレッドＧ１５０（ブドウ果皮色素、アントシアニン）、ハイレッドRA200(赤大根色素：ペラルゴニジンアシルグリコシド)、ハイレッドV80(紫芋色素：シアニジンアシルグルコシドおよびペオニジンアシルグルコシド)、アピゲニニジン（コウリャン色素）、シアニジン、デルフィニジン（ナス色素）、フィセチニジン（モリシマアカシア色素）、マルビジン（青いスイートピー色素）、ペラルゴニジン、ロビネチニジン（ニセアカシアの木色素）、トリセチニジン（紅茶色素）、ペツニジン（レッドベリー色素）、カプサンチン（トウガラシ色素）、エピガロカテキンガレート、緑茶、サフラワーＹ１５００（ベニバナ色素、サフロミンA+B)、クルクミン、スルフレチン、ミリセチン（ブドウ、玉ねぎ色素）またはクェルセチン（玉ねぎ、柑橘類色素））、キノイド系色素（コチニール（コチニールレッドＡＬ、カルミン酸）、ハイレッドＳ（ラック色素・ラッカイン酸）等）、ベタライン系色素（ハイレッドＢＬ（赤ビート色素：ベタニン、イソベタニン）等）、インドシアニングリーンおよびジンゲロール（ショウガ辛み成分）を含む蛍光色素群から選択される。
  本発明で用いられる細胞染色剤の好ましい例示としては、スルフレチン、クルクミン、赤色3号（エリスロシン）および赤色106号からなる群より選ばれる１種類以上の染色剤が挙げられる。
  細胞染色剤の投与方法は特に限定されない。例えば、本発明の細胞染色剤を臓器の管腔内に直接投与または粘膜下投与してもよく、臓器の漿膜側から投与してもよい。これらの投与方法としては、塗布、滴下または噴霧による投与が採用できる。さらには、細胞染色剤の投与方法として、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、胸腔内投与またはくも膜下投与することもできる。投与方法は、染色の対象となる臓器または臓器の部位によって選択することができる。染色剤の染色性が弱い場合、粘膜表面をプロナーゼで処理することにより粘液を除去し、細胞構造の視認性を向上させることができる。管腔内壁に直接染色剤を投与する場合（例えば塗布または噴霧）、染色剤の剤形は液体であることが好ましいが、顆粒、錠剤等の形態でも使用することができる。また、剤形等に応じて適宜必要な追加成分、例えば等張化剤、pH調節剤、安定化剤、増粘剤、防腐剤、香料または粘着剤等の添加物を染色剤に配合することができる。例えば、本発明の染色剤に予めプロナーゼを配合してもよい。
　図１は、消化管内壁面における生体細胞群の段階的がん化過程を示した模式図である。図１では、生体細胞群のがん化の過程が、第１段階、第２段階、第３段階および第４段階に順に分けて示されている。
　第１段階は、生体細胞群の一部においてがん化が開始される段階である。第１段階は、ＡＰＣ／β-ｃａｔｅｎｉｎ系のがん関連遺伝子の活性が弱まり、細胞の増殖を抑制する機能が低下することにより起こると考えられる。この段階では、細胞の増殖はやや亢進し、少なくとも、将来的にがん細胞となり得る前がん状態が発現していることを示している。
　第２段階は、第１段階よりもがん化が進んだ前がん状態である。第２段階は、ｒａｓ系のがん関連遺伝子の活性が強まり、細胞の増殖が亢進していると考えられる。また、ＳＴＡＴ３系のがん関連遺伝子もこの段階で活性化される可能性があると考えられる。がん細胞集団の大きさは小さく、その直径は、例えば0.1 mm以上0.4 mm以下である。がん細胞集団の直径とは、がん細胞集団を、がん細胞集団の面積と同じ面積を有する円とみなした場合の直径である。この段階は、患者の生命をすぐに脅かす段階ではないが、今後に備えて治療計画等を立てておくことが望ましい。
　第３段階は、生体細胞群の一部が浸潤状態となり、がん細胞が顕在化した段階である。第３段階は、ｐ５３系のがん関連遺伝子の活性が弱まり、細胞の増殖を抑制する機能が低下することにより起こると考えられる。この段階は、ｐ５３系およびＡＰＣ／β-ｃａｔｅｎｉｎ系の両方のがん抑制遺伝子産物の活性が弱まり、細胞の増殖を抑制する機能が大きく低下した状態にある。このため、がん細胞の増殖が加速的に進み、がん細胞は周囲組織に浸潤する。第３段階まで進むと、がん細胞集団の直径は0.5 mm以上に達し、そのまま放置すると個体の死を誘発するがんが完成する。
　第４段階は、第３段階で完成したがん細胞が、がんになった後、さらなる遺伝子変異を生じ、さらに細胞増殖、浸潤および転移が起こりやすい悪性のがんに進展した段階である。この段階は、消化管以外の他の遠隔臓器へのがん転移が始まる段階であり、患者の生命を脅かす危険な段階である。これら第１段階から第４段階への進行スピードは、がん関連遺伝子の活性状態により左右されると考えられる。
　図２は、人のがん細胞の増殖曲線の一例を示す図である。図２に示されるように、一般的に、がん細胞の数は所定の増殖曲線に従って増加する。例えば、がん化が始まろうとしている段階の３年間（がん細胞集団の直径が0.2 mm未満の時期）は増殖曲線の傾きが小さいが、４年以降（がん細胞集団の直径が0.5 mm以上の時期）では増殖曲線の傾きが大きくなる。そして、７年半以降になると増殖曲線の傾きはやや小さくなる。なお、一般的にがんが臨床的に発見され、治療が行われるのは７年以降の時期である。これは、がん細胞集団の直径が10 mm以上とならなければ検出できないからである。現在のがんの治療は、一般的に、がんが直径２０ｍｍを超えてから発見されることが多いため、外科的な切除によるがん細胞の除去が主流である。
　図２において注目すべきは、図２の増殖曲線の破線Ａで示される範囲では、がん細胞集団の大きさが指数関数的に増加している点である。この指数関数的な増加は、がん細胞集団のがん細胞で、起こるべき第１段階から第３段階までのがん性遺伝子変異が完了し、がん細胞が一定の均一な速度で分裂を繰り返していることを意味している。この指数関数的な増加の初期の段階、すなわち、がん関連遺伝子発現パターンは異常を生じているが、がん細胞集団自体は直径1 mm以下と小型である段階で、これらのがん細胞集団（超早期がん）を検出することができれば、これらの超早期がんは十分に小さいため、完全摘出が容易であるので、がんを根治できる。このように、超早期の段階で、がん化の悪性度レベルをがん関連遺伝子発現パターンの異常として把握することができれば、危険な段階となる前に、がんを根本治療することが可能となる。
　発明者らは、超早期がんの検出のため、生体細胞群のがん関連遺伝子発現パターンを多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で撮像し、がん関連遺伝子の活性状態を視覚化することで、がん化の悪性度レベルを把握することを試みた。
　発明者らは、生体細胞のがん関連遺伝子発現パターンを視覚化するにあたり、可食性の色素を含む染色剤を用いてがん関連遺伝子産物を有彩色に染色して撮像を行った。なお、可食性の色素とは、自然色素または人工合成色素のうち、ヒトへの投与が許可されている色素（例えば食品着色用の色素やサプリメントで服用可能な色素）である。
　具体的には、ＳＴＡＴ３系のがん関連遺伝子産物を選択的に染色する染色剤として、クルクミン類（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ、Ｃ２１Ｈ２０Ｏ６）を含む染色剤を用いることができる。また、ｒａｓ系のがん関連遺伝子発現パターンを選択的に染色する染色剤として、赤色3号（エリスロシン）を含む染色剤を用いることができる。
　より具体的には、クルクミン類を含む染色剤として、クルクミンを１重量％含むクルクミン含有溶液を準備し、赤色3号を含む染色剤として、フロキシンを１重量％含む赤色3号含有溶液を準備した。なお、クルクミン類を含む染色剤としては、クルクミン溶液（例えば、原液は、クルクミンを５％、４５％グリセロール、５０％エタノールを含む液体）を生理食塩水で１／５～１／１００希釈したものでもよい。１％赤色3号を含む染色剤としては、フロキシン溶液（原液 10 mg/mL）をそのままの濃度～１／１０希釈したものでもよい。
(i)０．４５％グリセリン、０．５％エタノールの溶液に、化学合成クルクミンを１ｍｇ/ｍｌ程度まで希釈したものを用いる。
(ii)沖縄クルクミン粉末１gを１０ｍｌのPBSで溶かして、１ｍｇ／ｍｌ程度までに希釈したものを用いる。
(i)、(ii)ともに、使用直前に、滅菌フィルターで無菌化したものを、生体に投与する。
　クルクミン類を含む染色剤を用いる場合、生体細胞内のＳＴＡＴ３系のがん関連遺伝子産物の発現を染色により視覚化することができる。また、赤色3号を含む染色剤を用いる場合、生体細胞内のｒａｓ系のがん関連遺伝子発現を染色により視覚化することができる。染色後、過剰な染色剤は洗浄することにより除去することができる。生理食塩水、りん酸緩衝生理食塩水などの細胞または生体組織に損傷を与えない生理的溶液で約１０秒間の洗浄を３回行うことにより、過剰な染色液を除去することができる。異なる染色剤により二重染色を行った場合、ＳＴＡＴ３系およびｒａｓ系のがん関連遺伝子産物の発現量の解析が、同時に可能となる。なお、各染色剤の染色時間はそれぞれ１～５分間でよい。上記した濃度においては、染色開始後から１０分以内であれば細胞質に浸透しても細胞内の核に浸透しないため、細胞質に囲まれている核を鮮明に視覚化できることにより、分析がより明瞭にできるようになる。
　観察までの染色時間は、粘膜表面または臓器表面に直接塗布する場合は投与後１～３０分間、経口投与する場合は投与後３０分～１時間、静脈内投与する場合は投与後３分～１時間、腹腔内投与する場合は投与後３分～１時間、皮下注射投与する場合は投与後３分～１時間、筋肉内注射投与する場合は投与後３分～１時間、臓器内注射投与する場合は投与後５分～３０分間、胸腔内投与またはくも膜下投与する場合は投与後３分～１時間とする。
　上記の細胞染色剤によるがん細胞の染色は、直接臓器に対して行うことができる。臓器はヒトまたは動物に由来するものを用いることができる。染色の対象とする臓器は摘出したものでも、生体内にあるものでもよい。臓器としては、大腸、肺、前立腺、胃、食道、膀胱、リンパ節などが挙げられるが、これらに限定されない。リンパ節を染色する場合、染色液の浸透性を上げるため、リンパ節組織を覆う表面組織を剥離した後、染色液を適用することが好ましい。細胞染色剤により染色された細胞は、多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像化することができる。多光子レーザーを用いる場合は、臓器表面からの十分な撮像可能深度および解像度を得るため、レーザー波長は600 nm～1600 nmが好ましい。共焦点レーザーを用いる場合は、400 nm～700 nmのレーザー波長が好ましい。
　臓器に対する染色液の適用は、臓器表面を覆う漿膜側から行うことができる。大腸、胃、食道などの管状の臓器では、管腔側から行うこともできる。適用とは、細胞染色液溶液を臓器に対して塗布、滴下または噴霧することを意味する。手術後に切除した臓器に対する病理診断を目的とする場合は、摘出臓器が管状である場合、管腔側から組織染色を行うことができる。しかしながら、手術中に切除部位またはがんの浸潤部位を特定するためには、臓器の漿膜側から組織染色を行うことが望ましい。これは、例えば腹腔等の内視鏡下手術用ロボット技術等は、基本的に臓器の漿膜側より手術を行うため、漿膜側の組織染色が必要となるためである。漿膜側から染色液を適用する場合、手術野にある臓器漿膜に無菌化した染色液を塗布、滴下または噴霧し、染色液の適用後１０分以内、好ましくは１～５分、さらに好ましくは１～３分で、臓器を生理食塩水等で洗浄し、染色液を除去する。この後、直ちに、多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で染色像を観察することができる。また、手術前に染色剤を全身に投与し、手術中にレーザー顕微鏡で組織を観察することもできる。投与方法としては、経口投与でもよく、静脈内投与でもよい。
　臓器組織の染色において、使用する染色剤により可視化される臓器内の対象物が異なる。例えば、クルクミンまたは赤色3号は、上皮および腺の細胞およびそれらからがん化したがん細胞の染色に適している。一方、赤色106号は、結合組織および毛細血管の染色に適している。レーザー照射により、クルクミンは緑色の蛍光色を与えるが、赤色3号および赤色106号は赤色の蛍光色を与える。したがって、クルクミンおよび赤色106号により二重染色を行うと、染色像を重ね合わせることにより、組織細胞構造の識別が容易となり、その結果、直径1 mm程度の微細ながん組織や浸潤しているがん細胞集団の検出が可能となる。
　図４は、マウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンおよび赤色106号で生体染色し、管腔側から多光子レーザー顕微鏡により撮影した結果を示す。ぞの結果、クルクミンは上皮細胞および腺細胞の細胞質を染色し、赤色106号は結合組織、毛細血管ならびに上皮細胞および腺細胞の細胞膜を染色することから、二重染色により組織細胞構造が明瞭に識別できることが示される。
　組織染色において、がん細胞が存在しない正常組織と、がん細胞の存在する腫瘍組織では、レーザー顕微鏡による観察像が異なることが分かった。例えば大腸粘膜をクルクミンにより染色した場合（図３参照）、正常な大腸の粘膜組織では、上皮細胞や腺細胞の細胞質が染色され、核は染色されない。このため、個々の細胞および核の形態が明瞭に視認される。一方、大腸がん腫瘍部の組織では、個々の細胞の大きさが不同であり、また核が大きく、細胞の配置または配列が不均一である。さらに細胞接着の解離が認められ、細胞異型と判断される。さらに、がん組織では、細胞集団が基底膜上に整列して配列されておらず、また腺構造を形成していないため、構造異型と判断される。本発明の方法によれば、正常組織とがん組織との上記の相違を示す画像に基づき、がん細胞の検出、すなわちがんの病理診断が可能となる。
また、がん細胞の浸潤は、正常大腸の５層構造との関連で検出できる。正常大腸の組織構造は図５ａに示され、５層構造は（1）～（5）として示される。すなわち、共焦点レーザーおよび多光子レーザー顕微内視鏡によって画像化すると、正常大腸は、食物が通過するルーメン（管腔）に面する表面から深部に向けて、（1）上皮と腺の層、（2）粘膜筋板、（3）粘膜下層、（4）筋層、および（5）漿膜の５層の構造からなる、極めて規則的な層状の構造を持つことが示される。
ルーメンに面する表面は、（1）上皮と腺の層が上皮細胞によってくまなく覆われ、また、上皮細胞は蛸壺状に表面から垂直に陥没した腺の構造（この垂直に陥没した構造を陰窩構造とも呼ぶ。）を一定間隔ごとに形成している。上皮は、図５ａの焦点面Pで示すように、上皮細胞が隙間なく集合した細胞のシート状に見える。一方、腺の構造は、図５ａの焦点面Cで示すように、約10個程度の腺細胞が中心の開口部に向かって同心円状に配列し、その外側を直径10μｍ程度の毛細血管が円周状に取り囲んだ形状をしている。腺の高さは約0.5～1.0 mmで、その深部側三分の一の部分は腺底部と呼ばれ、この部分の細胞が、細胞分裂し、腺細胞と上皮細胞を更新している。この腺底部の細胞の細胞分裂が異常に亢進することに起因して、がんが発生すると考えられている。（2）粘膜筋板は、腺構造の深部に存在する薄い平滑筋の層で、がんがこの粘膜筋板を超えて発達していない段階のものを早期がんという。（3）粘膜下層は、疎な結合組織の層である。（4）筋層は、厚い平滑筋の層であり、腸の蠕動運動を司る（焦点面Bで示すように、この層では、細長い平滑筋細胞の集団が認められる。）。この平滑筋層の内部には、この平滑筋の運動を制御する自律神経のネットワークが分布しており、これは、アウエルバッハの神経叢と呼ばれる。また、この筋層の内部には、上皮や腺の周囲の毛細血管に血液を供給する太い血管も存在する（焦点面Aで示すように、この層には、直径20μｍ以上の太い血管が認められる。）。（5）漿膜は、扁平な一層の細胞からなる層である。
上記の５層構造において、クルクミンは、（1）上皮と腺の層の腺細胞を強く陽性に、（2）粘膜筋板の平滑筋を強く陽性に、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に、また筋層内部のアウエルバッハ神経叢を強く陽性に染色することが判明し、赤色106号は、（1）上皮と腺の層の腺構造を取り囲む毛細血管の網の目構造を強く陽性に、（2）粘膜筋板の平滑筋を弱く陽性に、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に、また筋層内部の太い血管の壁を強く陽性に染色することが判明した。これらの生体染色剤による正常大腸の５層構造および主な細胞構築の可視化は、がんの浸潤範囲の判定において極めて有用な手がかりとなる。すなわち、上記の正常構造が、正常の分布パターンを持って正常の位置に存在しないという所見（がん部位において、赤色106号による腺底部における陰窩構造の規則的な分布の消失、図１２）と、正常の場合は存在するはずのない場所に、存在するはずのない細胞が存在するという所見（平滑筋層の内部に、クルクミン染色陽性の大型の細胞がび慢性に多数散在する。図１０ＡおよびＢを参照）の組み合わせによって、がんの浸潤の有無を正確に判断できる。
臓器組織の染色からレーザー顕微鏡による観察まで短時間で行うことができるため、がんの病理診断を手術中の体内迅速断探病理診断にも応用することができる。一般に、がんの病理組織診断は、細胞の大小不同や形の乱れ（細胞異型）と組織の構造の乱れ（構造異型）によって行われる。異型の強いものががん（悪性）であり、異型の弱いものが良性と判断される。
　レーザー顕微鏡による組織観察では、レーザー顕微鏡の対物レンズの位置を操作することにより、臓器に対する焦点面を変動させることができる。この操作により、臓器表面から0.05～1.0 mmの深さまでの細胞形態を断層画像として明瞭に観察することができる。例えば、大腸組織を漿膜側から観察する場合、漿膜から管腔方向に順次焦点深度を変動させた場合、漿膜に近い比較的太い血管、平滑筋層およびその内部に存在し、平滑筋の運動を制御しているアウエルバッハ神経叢、次に毛細血管を含む腺構造を観察することができる。平滑筋層が観察できることにより、平滑筋層の内部に浸潤したがん細胞であっても検出することができる。図５ｂは、マウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンで染色し、漿膜側から焦点距離を変えながら多光子レーザー顕微鏡により撮影した結果を示す。上記した大腸の組織構造において、焦点距離0μmでは（5）漿膜表面が、焦点距離50μm付近では（4）筋層の平滑筋が、焦点距離80～160μmでは（1）上皮と腺の層の腺構造（陰窩構造）が明瞭に認められる。
　一実施態様において、本発明の方法を用いることにより、神経叢を可視化することができる。図５ｃは、マウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、クルクミンにより漿膜側から生体染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察することにより得られた画像である。この図より、筋層内アウエルバッハ神経叢が陽性に染色されることが示される。すなわち、クルクミンは、神経細胞体を濃く、また神経線維を薄く染色することから、ネットワーク状構造としてアウエルバッハ神経叢を可視化していることが理解される。アウエルバッハ神経叢は自律神経系に属し、神経細胞体とそれらを結合する神経線維から成り立っている。
　上記した筋層内アウエルバッハ神経叢の共焦点レーザー顕微鏡観察画像を強拡大したものが図５ｄである。この図により、神経細胞体をも識別できることが示される。神経細胞体について、クルクミンは細胞質のみを染色し、核は染色しないため、細胞質は陽性画像として、核は陰性画像として認識される。このことにより、神経細胞体の形態を正確に判定することができる。がん細胞は、（1）上皮と腺の層（図５ａ参照）で発生した後、それ以外の層に拡大し、移動する（この現象をがん細胞の浸潤という。）。浸潤するがん細胞は、血管や末梢神経に沿って移動する傾向があることが知られているが、クルクミンの生体染色により筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化できるということは、がんの浸潤経路を可視化できるという結果を導き、がんの浸潤範囲の判断において有用である。
　本発明の一実施態様において、筋層内アウエルバッハ神経叢を多光子レーザー顕微鏡で観察することができる。図５ｅは、クルクミンにより染色して、筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化した図である。多光子レーザー顕微鏡画像では、多くの断層画像を重ね合わせできるため、アウエルバッハ神経叢のネットワーク構造をより広い範囲で可視化することができる。
　本発明の一実施態様において、赤色１０６号により生体染色することにより、太い血管および平滑筋を可視化することができる。染色したマウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から（4）筋層（図５ａ参照）に焦点を当てて撮影した場合、平滑筋および血管壁が染色されていることが示される。
　本発明の一実施態様において、赤色１０６号により染色した組織について、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から画像化し、腺構造および陰窩構造を可視化することができる。図５ｇは、（1）上皮と腺の層（図５ａ参照）に焦点を当てて撮影したものである。得られた画像より、結合組織および毛細血管が腺細胞の周囲を円周状に取り巻いて網の目状に走行していることから、規則的な腺構造および陰窩構造の分布パターンが可視化されている。この規則的な腺構造および陰窩構造の分布パターンは、正常な大腸の組織構造の大きな特徴であり、がんが発生すると、がんが存在する部位で、この腺構造および陰窩構造の形態における規則性が失われる。
　上記のように、本発明の方法によってマウス大腸の正常粘膜組織を共焦点レーザーおよび多光子レーザー顕微内視鏡によって画像化すると、正常大腸の（1）上皮と腺の層、（2）粘膜筋板、（3）粘膜下層、（4）筋層、（5）漿膜の５層の構造について、クルクミンは、（1）上皮と腺の層の腺細胞を強く陽性に染色し、（2）粘膜筋板の平滑筋を強く陽性に染色し、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に染色し、また筋層内部のアウエルバッハ神経叢を強く陽性に染色することが判明した。一方、赤色106号は、（1）上皮と腺の層の腺構造を取り囲む毛細血管の網の目構造を強く陽性に染色し、（2）粘膜筋板の平滑筋を弱く陽性に染色し、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に染色し、また筋層内部の太い血管の壁を強く陽性に染色することが判明した。これらの生体染色剤による正常大腸の５層構造および主な細胞構築の可視化は、以下に述べるがんの浸潤範囲の判定において極めて有用な手がかりを与える。すなわち、上記の正常構造が正常の部位に存在しないという所見および正常構造の場合には存在しない細胞が存在するという所見の組み合わせによって、がんの存在を判定することができる。
　図８を参照しながら、がんの局所浸潤および転移による進行度判定ならびに治療方針を説明する。がんは、一般的に、腺底部に存在する細胞で、正常であっても細胞分裂および増殖を行なう未分化な細胞が、図１に示される段階的な遺伝子変異を起こし、細胞分裂および増殖が異常に亢進することが原因で発生すると考えられている。がん細胞が上皮細胞の外に出ない段階は、上皮内がん０期、または超早期がんと定義される。がん細胞は、発生した局所において、上皮細胞が本来存する領域を超えて増殖するが、がん細胞が粘膜筋板を超えていない段階は、１期または早期がんと定義される。がん細胞が、粘膜筋板を超えて、粘膜下層および筋層に浸潤した段階は、２～３期と定義される。がん細胞が、発生した局所の組織や臓器を超えて、他の臓器に転移した段階は、４期と定義される。一般的に、治療法は、０～１期においては内視鏡によるがん組織の除去が、また２～３期においては外科手術によるがん組織の除去が、また４期では化学療法および放射線療法ならびに免疫療法が主体となる。ここで本発明の有用性は、２～３期のがんについて、外科手術によるがん組織の除去または切除を行なう場合、生体染色およびレーザー内視鏡を用いることにより、漿膜側から、がん細胞の浸潤範囲およびがん組織を除去または切除すべき領域を判定するための支援画像データを提示することにある。
　進行がんの局所浸潤において、がん細胞は、平滑筋層の内部または粘膜下層の結合組織において、血管や神経に沿って、び慢性に拡散する（図９を参照）。この現象を、がん細胞の局所浸潤という。この局所浸潤の範囲を正確に判定することは、現行の肉眼による精査や触診による組織の硬さの変化などの方法では、極めて困難である。
　しかしながら、大腸がんマウスのがん腫瘍部を、漿膜側からクルクミンで染色し、共焦点レーザー顕微鏡により漿膜側から観察することにより、がん細胞の存在を明瞭に視認することができる。図１０Ａを参照すると、平滑筋層の内部に、クルクミン染色陽性の大型の細胞が、び慢性に多数散在している。これらの細胞は、浸潤したがん細胞であると判断される。また、クルクミン染色により、これらの細胞の細胞質は周辺組織より濃く染色されて陽性画像として認識されるため、これらの細胞はがん細胞であると判断される。すなわち、正常の場合には存在するはずのない細胞が、存在するはずがない場所に存在するという所見によって、これらの細胞ががん細胞であると判断される。図１０Ｂを参照すると、血管ならびに平滑筋層およびその内部に浸潤したがん細胞が観察される。血管の周囲に一部のがん細胞が集合していることから、がん細胞は、血管に沿って移動し、浸潤する性質を持つことが示唆される。
　図１１Ａおよび図１１Ｂは、大腸がんマウスのがん腫瘍部を、管腔側からクルクミンで染色し、多光子レーザー顕微鏡により管腔側から撮影した写真である。これらの写真から、がん細胞は、細胞質が強く陽性に染色され、また核は陰性に染色されることが示された。この結果、がんの構造異型と細胞異型とを識別することができる。
　図１２は、大腸がんマウスのがん腫瘍部を、漿膜側から赤色106号で染色し、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から撮影した写真および進行がん浸潤の模式図である。正常組織では、陰窩構造が規則的に分布していることが確認できる。一方、がん組織では、陰窩構造の規則的な分布が消失しており、がんであると判定することができる。すなわち、正常構造が正常の場所にないという理由から、この部位にがん細胞が存在すると判断される。
　本発明の一実施態様において、クルクミンによる生体染色後、レーザー顕微鏡により筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化することができる。図１６は、マウス大腸を漿膜側からクルクミンにより生体染色を行った後、筋層内アウエルバッハ神経叢をレーザー顕微鏡により可視化した例である。図１６に基づけば、クルクミン染色により、神経細胞体を識別することができる。クルクミンは、神経細胞体において、細胞質のみを染色し、核は染色しないため、細胞質は陽性画像として、また核は陰性画像として視認され、神経細胞体の形態を正確に判定することができる。なお、がん細胞は、（1）上皮と腺の層（図５ａを参照）で発生した後、それ以外の層に拡大し、移動するが（これをがん細胞の浸潤という。）、その場合、血管や末梢神経に沿って移動する傾向があることが知られている。このため、クルクミンの生体染色により筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化できるということは、がんの浸潤経路を可視化できるということを示し、がんの浸潤範囲を判断する上で有用である。また、早期がんおよび進行がんの判定が可能となる。
　本発明の一実施態様において、クルクミンによる生体染色後、レーザー顕微鏡により筋層内自律神経叢（マイスナー神経叢）を可視化することができる。図１７は、マウス大腸を漿膜側からクルクミンにより生体染色を行った後、マイスナー神経叢をレーザー顕微鏡により可視化した例である。図１７に基づけば、クルクミン染色により、神経細胞体を識別することができる。マイスナー神経叢は粘膜下層に存在し、１個～数個の神経細胞が集団を形成する。クルクミンは、神経細胞体において、細胞質のみを染色し、核は染色しないため、細胞質は陽性画像として、また核は陰性画像として視認され、神経細胞体の形態を正確に判定することができる。
　図１８を参照して説明する。がんは、一般的に、粘膜上皮細胞から生じるので、原発巣は必然的に粘膜上皮内部にとどまっている。がん組織が発育すると、粘膜上皮内部から深部に向かってがん細胞が浸潤する。がん細胞が、粘膜筋板およびマイスナー神経叢にまだ浸潤または到達していない場合、がんは、早期がんと判定される。一方、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、がんは進行がんと判定される。
　本発明に基づいて、様々な生体組織を可視化することができる。図１９は、マウスにクルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハンス島をレーザー顕微鏡により可視化した図である。図１９は、さらに、膵臓組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す。その結果、細胞の大きさおよび配列により、外分泌細胞およびランゲルハンス島（破線内）の内分泌細胞を区別することができる。内分泌細胞は小型で、数十個がクス玉状に集合し、その内部は毛細血管に富むことが分かる。外分泌細胞は、内分泌細胞より大型で、細胞内に多数の分泌顆粒を持ち、数個ずつが房状に集合している。無菌化クルクミン溶液の腹腔投与により、膵臓のランゲルハンス島が可視化できることから、内分泌領域において、糖尿病やインスリノーマの診断に用いることができる。
　図２０～２２は、マウス舌粘膜上にクルクミンを塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾をレーザー顕微鏡により可視化した図である。図２０および２１は、さらに、味蕾のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す。感覚神経細胞の核はクルクミンで染色されないため、黒い陰性画像として認識される。クルクミンを口腔粘膜上に塗布することにより、味の感覚装置である味蕾の神経細胞を可視化することができることから、耳鼻科領域において、味覚障害の検査が可能になる。
　図２３および２４は、マウスにクルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、網膜神経細胞群をレーザー顕微鏡により可視化した図である。これらの図には、網膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色像が含まれる。図より、網膜神経細胞群およびシナプスを可視化できることが示された。クルクミンを、経口投与または硝子体内注射することによっても、膜神経細胞群およびシナプスの可視化が可能である。眼科領域において、例えば糖尿病性網膜症、黄斑変性、網膜変性、増殖性硝子体網膜症、緑内障および浮腫網膜芽細胞腫のステージ判断が可能になる。
　さらに、クルクミンにより、嗅神経線維（図２５）および匂いの感覚細胞である嗅覚受容神経細胞（図２６）の染色が可能であり、レーザー顕微鏡により可視化することができる。図２６には、ヘマトキシリン・エオジン染色像が含まれる。クルクミンにより、嗅覚受容神経細胞の細胞質および匂い受容体を持つ繊毛が陽性に染色され、核は無染色であるため黒い陰性画像として視認される。クルクミンを鼻腔粘膜上に塗布することにより、匂いの感覚細胞である嗅覚受容神経細胞を可視化することができるため、嗅覚障害の検査が可能になる。
　本発明の一実施態様において、クルクミンによる生体染色後、レーザー顕微鏡により甲状腺を可視化することができる（図２７）。甲状腺のクルクミン生体染色により、小胞の構造が染色される。甲状腺は種々の大きさの球形の小胞（follicles）によって形成されている。これらの小胞は、単層の扁平または立方上皮で縁取られ、ヘマトキシリン・エオジン染色により、内腔がエオジンにより均等に染まるコロイドで満たされている。小胞の周囲は密な毛細血管の網で取り囲まれていることが分かる。
　本発明の一実施態様において、クルクミンを筋膜上に塗布することにより生体染色を行った後、レーザー顕微鏡により、骨格筋のアクチン・ミオシン横紋、核および筋線維を可視化することができる（図２８）。無菌化クルクミン溶液を筋膜上に塗布することにより、骨格筋の筋線維およびアクチン分子を可視化することができるため、筋力低下・フレイル症候群の形態学的な光バイオプシ診断に応用することができる可能性が示される。
　本発明の一実施態様において、クルクミンをリンパ節上に塗布することにより生体染色を行った後、レーザー顕微鏡により、リンパ節の二次小節の明中心と暗殻の構造を可視化することができる（図２９）。明中心においては、大型の明るい核を持つ細胞が多数見られる。これらの細胞は、細網細胞および細胞分裂中の大型のリンパ球である。暗殻は、明中心で増殖した小リンパ球が明中心の周囲に集積した構造を持つ。無菌化クルクミン溶液の表面塗布により、リンパ節内部の細胞構造が可視化することができるため、泌尿器科領域および消化管外科領域において、腹腔鏡ロボット手術時に、がんのリンパ節転移の有無の判別が可能になる。
　本発明の一実施態様において、クルクミンを腹腔内投与した後、レーザー顕微鏡により、海馬ＣＡ３野において錐体細胞の細胞体を可視化することができる（図３０）。大脳皮質においては、血管および錐体細胞の細胞体を可視化することができる（図３１）。小脳においては、血管およびプルキン細胞の細胞体を可視化することができる（図３２）。本発明を用いることにより、脳組織の変性を伴うアルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、脊髄小脳変性症などの検査が可能になる。
　本発明により、すべての臓器において、組織における細胞の形態、相対的な位置および配列、ならびに組織内の細胞数が、正常組織との比較において、変化または変動する疾患を、判定または診断をすることができる。該疾患には、がん、糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性、網膜変性、味覚障害、嗅覚障害、アルツハイマー病、脳梗塞など、上記に例示される疾患が含まれるが、それらに限定されない。一方、細胞の機能のみが変化または変動する疾患、例えば統合失調症は、本発明によって判定または診断をすることができない。
　本発明の方法は、がんの存在が疑われる臓器の漿膜側から組織染色およびレーザー照射を行うことにより、手術前または手術中における患部切除前に、がん組織を視覚化できることが特徴である。実際の外科手術では、がん細胞の存在位置または浸潤範囲を視覚化した上で、臓器の切除部位、すなわちがん組織辺縁をマーキングすることが術者に対する大きな支援となる。このためには、がん細胞の存在位置または浸潤範囲を漿膜上に着色することが好ましい。かかる着色には、周知の手術用生体マーキングとして、手術用糸やテープを用いてもよく、マーキング色素を使用することもできる。手術用生体マーキング色素としては、例えば、スルホブロモフタレインナトリウム、インドシアニングリーン、フルオロレインナトリウム、メチレンブルー、インジゴカルミン、トルイジンブルー、ピオクタニンブルーなどが挙げられる。これらのマーキング色素は、増粘剤として、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、アラビアゴムなどと混合することにより、組織付着性を高めることができる。
　レーザー照射における先端プローブとしては、直径20 mm程度の通常の対物レンズに加えて、直径5 mm程度のスティック型対物レンズおよび直径0.3～2 mm程度のニードル型対物レンズを使用することができる。
　がん治療のための外科手術時において、がん細胞が検出されたことを術者に通知することは、術者に対してがん治療を成功に導く支援方法として有用である。かかる通知は、術者に対して音または光により行うことが可能である。特に、レーザー顕微鏡により撮像された画像を、予めデータベースに蓄えられたがん組織画像と照合することにより、がん組織の存在を通知するシステムは、がん組織の取り残しを防止する手段として好ましい。
上記の試験における試験条件、すなわち、細胞染色液の調製、使用動物、大腸がんモデルマウス作製法およびレーザー照射の条件は、下記のとおりである。
〔細胞染色液の調製〕
　クルクミン（東京化成、カタログ番号C2302、純度97.0％）100 mgをエタノール5 mLに懸濁し、さらにエタノールで10倍希釈した。これを同量のグリセリンと混合し、さらにグリセリンで10倍希釈した。この混合液を同量の精製水と混合し、クルクミン染色液とした。赤色１０６号については、その粉末を生理的食塩水で１mg/mLに溶解した溶液を、染色液とした。
〔動物〕
　試験には、日本エスエルシー株式会社から購入したC57BL/6Nマウスを用いた。性別は雄、８週齢、体重２０～２５グラムのマウスを用いてすべての試験を行った。
〔大腸がんモデルマウス作製法〕
大腸がんモデルマウスは、C57BL/6Nマウスに、生理食塩水で溶解したアゾキシメタン（azoxymethane, AOM）10 mg/kgを週１回間隔で４回腹腔投与して作製した。
〔レーザー照射の条件〕
　多光子レーザー顕微鏡はオリンパス社製FVMPE-RSを用い、照射波長は800 nmとした。レーザー照射は、フルパワー出力の5.8～48.2％の出力で行った。共焦点レーザー顕微鏡はオリンパス社製FV1000を用い、照射波長は488nmおよび594nmとした。488nmのレーザー照射は、フルパワー出力の15～29.4％の出力で、また594nmのレーザー照射は、フルパワー出力の13～13.5％の出力で行った。照射の方向および漿膜側または内腔側からの染色については、図中に記載した。
　本発明の一実施態様において、がん検査装置２０１は、図１４に示すように、レーザー発振器２１３と、ビーム径調節器２１５と、二次元走査器２１７と、ダイクロイックミラー２１９と、対物レンズ２２１と、集光深さ調節器２２３と、光検出器２２５と、蛍光画像生成部２２７と、モニター２２９と、制御部２３１とを備える。
　レーザー発振器２１３としては、パルス幅が数十～数百フェムト秒、パルスの繰り返し周波数が数十～数百ＭＨｚの範囲でパルスレーザー光の出力を調節できるものが用いられる。
　ビーム径調節器２１５は、制御部２３１からのビーム径調節信号に応じて、パルスレーザー光のビーム径を変化させるビームエクスパンダである。
　二次元走査器２１７は、例えば、２枚のガルバノミラーにより構成され、パルスレーザー光の集光位置を光軸に対して垂直な２軸方向に変化させる。
　ダイクロイックミラー２１９は、パルスレーザー光の照射により生体細胞のがん関連遺伝子産物において発生する蛍光を分離する。
　対物レンズ２２１は、レーザー発振器２１３から出射されたパルスレーザー光を生体細胞に集光させる一方、多光子吸収現象によりがん関連遺伝子産物において発生した蛍光を集光する。なお、対物レンズ２２１は、制御信号に基づいて集光深さ調節器２２３によって光軸方向へ移動可能となっており、集光位置を調節することができる。
　光検出器２２５は、がん関連遺伝子産物において発生した蛍光を検出し、蛍光強度に応じた電気信号に変換する。
　二次元走査器２１７の走査状態および集光深さ調節器２２３の調節位置(深さ方向の位置)は、集光位置の座標を表すパラメータとなり、蛍光画像生成部２２７は、これら座標を表すパラメータと光検出器２２５から送られた電気信号（すなわち蛍光強度）とを対応付けて記憶し、これらのデータを処理して、蛍光画像を生成する。生成された蛍光画像は、モニター２２９上に表示される。
　制御部２３１は、動作制御部２３３と、検査用パルス強度設定部２３５と、照射範囲設定部２３９と、照射時間設定部２４１とを含む。動作制御部２３３は、レーザー発振器２１３、ビーム径調節器２１５、二次元走査器２１７、集光深さ調節器２２３の動作を制御する。
　検査用パルス強度設定部２３５は、検査を行うために、がん関連遺伝子発現パターンの蛍光画像を取得するのに適した強度のパルスレーザー光強度を設定する。
　照射範囲設定部２３９は、生体細胞にパルスレーザー光を照射する範囲の設定を行う。そして、動作制御部２３３が、二次元走査器２１７や集光深さ調節器２２３の動作を制御することによって、設定された照射範囲および深さにパルスレーザー光を照射し、集光させる。照射時間設定部２４１は、生体細胞にパルスレーザー光を照射する時間の設定を行う。そして、動作制御部２３３がレーザー発振器２１３の出力を制御することによって、設定された時間だけ、パルスレーザー光を照射させる。
　一実施態様において、制御部２３１は、記憶部５１および判定部５２を有している。すなわち、がん検査装置２０１は、撮像で得られた画像の生体細胞群の染色状態に基づき、生体細胞群のがん化の悪性度レベルや予後をリアルタイムで判定する。
　このがん検査装置２０１では、生体細胞群のがん関連遺伝子発現パターンの染色状態に基づき、がん化の悪性度レベルを判定するので、生体細胞群のがん化を早い段階で把握することができる。また、がん化の悪性度レベルをがん関連遺伝子の発現状態で把握できるので、がん患者の予後を知ることができる。
　なお、このがん検査装置２０１は、治療用パルス強度設定部２３７を備え、治療を行うために生体細胞を破壊するに十分な強度のパルスレーザー光強度を設定することができる。これにより、発見したがん細胞集団に対して、早期にがん治療を行うことができる。
　その他、がん検査装置２０１は、様々な形態で使用することができる。
　例えば、図１５に示されるように、レーザー光照射ヘッド２４３内に、ビーム径調節器２１５、二次元走査器２１７、ダイクロイックミラー２１９と対物レンズ２２１とその間の光路から構成される光学系、集光深さ調節器２２３とを設けるとともに、患者を載せるための患者固定台２４５と移動装置２４７とをさらに設け、がん検査を行うことができる。
　また、例えば、患者から生体細胞群の一部を削り取り、削り取った生体細胞群をトレー（試料台）に入れた状態で、がん検査装置２０１を用いて撮像を行い、がん化の悪性度レベルを判定してもよい。この場合、生体細胞群への染色剤４５の塗布は、生体細胞群を削り取る前に行ってもよいし、生体細胞群を削り取った後、撮像する前に行ってもよい。さらに外科手術時にリアルタイムで正確にがん患部を切り取るため、または正確に切り取ったことを示す、切除後のがん検査装置としても活用することができる。外科手術用に用いる場合には、外科手術を行う部位を特定するために、予め通常の内視鏡、ＣＴ、Ｘ線撮像などでｃｍ単位での正確な位置が把握されている。外科手術時に本発明のがん検査装置を併用することで、正確にがん組織と正常組織との境界線を把握することができ、がんの根治的切除を可能としながら組織の摘出範囲を最小限にすることができるため、がん摘出手術を受ける患者負担は大幅に軽減される。
　具体的には、図８～図１３の模式図および撮像画を用いて説明されるように、予めクルクミン等により染色し、モニター２２９で確認することができるが、さらに警報部よりブザーなどの音、フラッシュおよびカラーライトなどの光で通知することもできる。この場合の効果は、進行がんの中心部より、正常細胞と早期がん部分の境界を、画像により明確に確定できることである。蛍光強度、蛍光色、細胞(核や陰窩等)の形状から早期がん細胞であるか、正常細胞であるか、神経細胞であるか、血管であるか、またはノイズであるかを、瞬時に判断できるため、前述したように、がん組織辺縁をマーキングすることによって、術者に対して大きな支援を与えることができる。この場合に、手術用生体マーキングとして、手術用糸またはテープを用いてもよいし、マーキング色素を使用してもよいが、図１４の２２１の対物レンズと連動したマーキング色素用ノズルを設けることは特に有用である。また、レーザー照射強度を上げて、がん組織周縁輪郭を部分的に焦がす、または破線状に蒸散させることも有効である。
　周縁部を決定するに際しては、がん検査装置２０１の対物レンズを含む可動部を、Ｘ－Ｙ方向にがん中心部周縁部を含む距離を移動させ、最も蛍光密度の低くなる点をマーキングする。その後、可動部の角度を例えば５度程度回転させて同様な移動掃引を繰り返し行うことにより、進行がん含む切除されるべき最外周の周縁部をマーキングすることができる。
上記した様に、本発明は、外科医が術中に即座に病理診断するために必要な、組織および細胞の識別方法を提供することにより、がんの根治的切除を可能としながら組織の摘出範囲を最小限にすることができる。その結果、がん摘出手術を受ける患者負担が大幅に軽減される。

Claims (61)

  1. レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法。
  2. 臓器の漿膜側から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、請求項１に記載の方法。
  3. 臓器の管腔内から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞染色剤が、スルフレチン、クルクミン、赤色3号（エリスロシン）および赤色106号からなる群より選ばれる１種類以上の染色剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 細胞染色剤の投与が、臓器の漿膜側からの塗布、滴下または噴霧により行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 細胞染色剤の投与が、臓器の管腔内からの塗布、滴下または噴霧により行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 細胞染色剤の投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下注射投与、筋肉内注射投与、臓器内注射投与、胸腔内投与またはくも膜下投与である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. レーザー照射が、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 請求項８に記載の方法を使用し、がん細胞を可視化することを特徴とする、がん細胞の検出方法。
  10. がんの存在が疑われる臓器において、がんが存在する場合に、所属リンパ節組織へのがんの浸潤を判定するための方法であって、リンパ節組織を覆う表面被膜の上から滴下、または、リンパ節内部に注射する方法でレーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を当該リンパ節組織に投与し、次に、当該リンパ節組織に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する細胞の細胞質および核の形態について得られた可視化画像に基づいて細胞の種類を同定することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  12. さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. がんの存在が疑われる臓器において、赤色106号染色により臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該臓器組織内に存在するがん細胞および正常細胞周囲の毛細血管の走行パターンを比較し、がん細胞周囲で見られる毛細血管の消失および／または変形に基づき、がん細胞を検出することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  14. さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 臓器表面から0.05～1.0 mmまでの深さの細胞形態を可視化することを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. さらに、がん組織の位置を、臓器におけるがん組織辺縁を蛍光染色することにより特定することを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在するマイスナー神経叢またはアウエルバッハ神経叢を可視化することを含む、請求項９に記載の方法。
  18. がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  19. がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  20. がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  21. さらに、がん細胞が検出されたことを音または光により通知することを含む、請求項９～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、漿膜側または管腔内からがん細胞を一個単位で除去し、がん患者を治療する方法。
  23. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、術後に漿膜側または管腔内から生体に残存するがん細胞を確認し、がん細胞一個単位で除去する方法。
  24. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、大腸がん患者を治療する方法。
  25. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、肺がん患者を治療する方法。
  26. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、前立腺がん患者を治療する方法。
  27. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、胃がん患者を治療する方法。
  28. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、食道がん患者を治療する方法。
  29. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膀胱がん患者を治療する方法。
  30. クルクミンまたはスルフレチンによる臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する神経細胞の細胞質および核ならびに神経線維の形態、および/または神経線維・軸索を囲む髄鞘の形態について得られた可視化画像に基づいて、神経細胞の種類および神経ネットワークを同定する、請求項８に記載の方法。
  31. 前記神経細胞が自律神経細胞であり、前記神経ネットワークがアウエルバッハ神経叢である、請求項３０に記載の方法。
  32. クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による臓器組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、得られた細胞画像に基づいて、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別する、請求項９に記載の方法。
  33. クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による消化管組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該消化管における５層構造（１．上皮と腺の層、２．粘膜筋板、３．粘膜下層、４．筋層、５．漿膜）について、正常組織とがん細胞の浸潤部の構造に関する画像の差異に基づいて、各層ごとに、がん浸潤の有無を判定する、請求項９に記載の方法。
  34. 請求項９に記載の方法を用いることを特徴とする、個体におけるがんの検出方法であって、可視化画像に基づき、正常細胞と比較して、細胞が異型であると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程、または、正常細胞と比較して、腺構造・陰窩構造の分布パターンの規則性が失われると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程を含む、がんの検出方法。
  35. 請求項１７に記載の方法を用いることを特徴とする、進行がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程、またはがんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程を含む、進行がんの診断方法。
  36. 請求項１７に記載の方法を用いることを特徴とする、早期がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定される工程を含む、早期がんの診断方法。
  37. 請求項８に記載の方法を使用する、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハン島の可視化方法。
  38. 請求項８に記載の方法を使用する、舌または軟口蓋に存在する味蕾の可視化方法。
  39. 請求項８に記載の方法を使用する、坐骨神経などの末梢神経の可視化方法。
  40. 請求項８に記載の方法を使用する、脳組織の可視化方法。
  41. 前記脳組織が大脳皮質、海馬、扁桃体、視床下部または小脳である、請求項４０に記載の方法。
  42. 請求項４０または４１に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、脳疾患または脳症状の判定方法。
  43. 前記脳疾患または脳症状が、アルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性硬化症および脊髄小脳変性症を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項８に記載の方法を使用する、眼組織の可視化方法。
  45. 前記眼組織が網膜である、請求項４４に記載の方法。
  46. 請求項４４または４５に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、眼疾患または眼症状の判定方法。
  47. 前記眼疾患または眼症状が、黄斑変性、網膜変性、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、増殖性硝子体網膜症、緑内障、網膜剥離および網膜浮腫を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 請求項１０に記載の方法を用いることを特徴とする、、腹腔鏡外科手術中に、当該リンパ節にがん細胞が存在するか否かを、リンパ節切除前に判定する方法。
  49. リンパ節に転移したがん細胞を、がん細胞だけを一個単位でレーザー蒸散で破壊して、がん細胞の死骸を免疫細胞に認識させて、活性化されたリンパ球に、がんの原発巣のがん細胞を攻撃させることを特徴とする、がん免疫療法。
  50. クルクミンの経口投与、腹腔内投与で、消化管、全身の脳と網膜の神経細胞の細胞体、味、匂いの感覚細胞、内分泌細胞、リンパ節、骨格筋、肺、膵臓、肝臓の細胞構造を可視化し、可視化した細胞構造をレーザー顕微内視鏡と蛍光顕微鏡で画像化することで、細胞の位置、数、形、大きさ、配列に異常をきたす全ての疾患を診断する方法。
  51. 請求項５０に記載の方法を用いることを特徴とする、レーザー照射で、問題のある細胞を、一個単位で破壊・除去する方法。
  52. 再生医療で移植したiPS細胞が未分化細胞・がん細胞になったときには、それらの細胞のみを、レーザーで破壊する治療法。
  53. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、子宮がん、卵巣がんのがん患者を治療する方法。
  54. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、乳がんのがん患者を治療する方法。
  55. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓がん、胆嚢がんのがん患者を治療する方法。
  56. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、舌がん、咽喉がん、喉頭がん、甲状腺がんを治療する方法。
  57. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、扁桃腺炎の原因を診断する方法。
  58. 扁桃腺に浸潤している白血球において、好中球が多く浸潤する場合は細菌感染性扁桃腺炎、好酸球が多く浸潤する場合はアレルギー性扁桃腺炎、リンパ球が多く浸潤する場合はウイルス感染性扁桃腺炎と判断する工程を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 請求項９～２１,３８のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、味蕾、嗅上皮の感覚細胞の形態を解析し、味覚異常および/または嗅覚異常を診断する方法。
  60. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、骨格筋の形態を解析し、サルコペニアおよび/または重症筋無力症の病変を診断する方法。
  61. 請求項９～２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓のランゲルハンス島および/または甲状腺の内分泌細胞細胞の形態を解析し、糖尿病および/またはバセドー病を診断する方法。
     
     
     
     
     
     
     

     
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