WO2005090578A1 - Gene de resistance a sclerotinia - Google Patents

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WO2005090578A1
WO2005090578A1 PCT/FR2005/000380 FR2005000380W WO2005090578A1 WO 2005090578 A1 WO2005090578 A1 WO 2005090578A1 FR 2005000380 W FR2005000380 W FR 2005000380W WO 2005090578 A1 WO2005090578 A1 WO 2005090578A1
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WO
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polynucleotide
plant
sclerotinia
polypeptide
resistance
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/000380
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English (en)
Inventor
Bruno Grezes-Besset
René GRISON
Paul Nicolas
Saïd MOUZEYAR
Original Assignee
Genoplante-Valor
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases

Definitions

  • the present invention relates to new polypeptides and polynucleotides which can be used to fight against plant pathogenic fungi, and in particular against Sclerotinia.
  • Sclerotinia sclerotiorum is a phytopathogenic fungus which can infect many cultures (PURDY, Phytopathology, 69, 875-880, 1979) including sunflower, rapeseed, cabbage, lettuce, soy, lemon, tomato, melon , cucumber, or field beans.
  • white rot also called sclerotiniosis or sclerotic rot, which is a major disease against which there is no effective chemical control.
  • Sclerotinia infection is visible from the formation of the flower bud until the end of flowering of the sunflower. From flowering, on the leaf, petiole and stem, discoloration and then softening of the affected organs appear; a dense white mycelium colonizes them, and is often observable outside the stem where it condenses at certain points before forming sclerotia; due to less resistance of the fabrics, the rod can break and pour. At maturity, translucent spots appear on the flowering side of the flower head; the dense white mycelium condenses here in a grid of sclerotia. All of the tissue in the head is broken down by the pathogen. Only the libero-wood fibers will remain from the top of the stem, giving it a whip-like appearance.
  • PK-P or Ha-lecRK codes for a lectin protein kinase protein. Comparing the deduced polypeptide sequence of this gene with those of known genes, we reveal a homology with two genes, LRK-1
  • At-LecRKl gene of A. thaliana is activated during natural senescence and in response to injuries and oligogalacturonides; it probably plays a role in the development program and the adaptive processes (HERVE et al., 1999, cited above).
  • Comparative analysis of polypeptide sequences deduced from the PK-P gene (Ha-lecRK) on sunflower genotypes with varying levels of sensitivity to Sclerotinia was carried out. Figure 1 shows the results of this comparison.
  • the positions of the lectin domain, the transmembrane domain, and the kinase domain are indicated above the sequence alignment. This analysis highlights, in genotypes sensitive to Sclerotinia, a significant modification of the 'kinase' part of the gene: interruption or shift in the reading frame. Differences also exist between wild disease resistant sunflower lines and cultivated sunflower lines expressing partial resistance. These differences relate to the modification of various amino acids on the protein. It is particularly interesting to isolate new polynucleotide sequences allowing resistance to infection to be obtained for cultures. sensitive and more particularly for sensitive or partially resistant cultivated sunflowers.
  • the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the wild sunflower PK-P protein ecotype 101 is shown below: ATGTCTCCTCATCCACCACCATGTCTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCCACCTCCACCTCCTCCCAATC CACCCCACTCTCTCCCAATCCTTCATCTACACCACCTTCAACCCCACCAACCTAACCACCAACGGC AACGCCACCATCACCACCACCGGCATCCTTAAACTCACCAACGTAAGCTCCCACACCATCGGTCAC GCTCTCTACCCACACCCCATCTGTTTCAAAACACCCCACACCAATACCACTCTCTCATTCTCCACC GCTTTTGTCTTCTCCATCGTCCCACGATACCGCAAACTCGGTGGTCATGGCCTTGCTTTCACCATC TCCGACCAAACACTTCATCGGAGCCCAACCTAGTCAATACCTCGGACTTGTCAACGTTACTTCA AACGGTAACTCATCAAACCATCTTTTTGCTATAGAGTTTGACACCGTTCAAGATCTTGAGTTTTC
  • the present invention relates to an isolated polypeptide involved in the resistance of a plant to Sclerotinia, characterized in that it has at least 40%, especially at least 45%, preferably at least 50% ", Very preferably at least 55%, and very advantageously, in order of increasing preference, at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or
  • said polypeptide is chosen from: the PK-P polypeptide from sunflower (SEQ ID NO: 2), and the PK-P polypeptide from rapeseed (SEQ ID NO: 24).
  • the expression “polypeptide involved in the resistance of a plant to Sclerotinia” is understood here to mean a polypeptide whose expression or activity is correlated with the level of resistance to Sclerotinia.
  • a plant is considered to be resistant to Sclerotinia if the onset of symptoms caused by the infection of the plant by the pathogen is delayed.
  • a plant will be said to be resistant (or tolerant) to Sclerotinia if the colonization of plant tissues by the fungus requires a longer duration compared to a sensitive plant.
  • the plant is also said to be resistant, according to the present invention, if the symptoms remain localized to a defined part of the plant.
  • the plant is said to be resistant when no symptom appears and / or when there is complete absence of said pathogen in plant tissues after infection by Sclerotinia.
  • the present invention also relates to an isolated polynucleotide chosen from: a) a polynucleotide coding for a polypeptide in accordance with the invention, as defined above; b) a polynucleotide complementary to polynucleotide a); c) a polynucleotide capable of hybridizing selectively, under stringent conditions, with the polynucleotide a); or polynucleotide b).
  • a polynucleotide "coding for" a given polypeptide is defined as any polynucleotide containing the genetic information allowing the synthesis of said polypeptide. It may, for example, be a coding sequence, a cDNA or an mRNA, or a fragment of genomic DNA.
  • Nonlimiting examples of polynucleotides in accordance with the invention coding for a polypeptide promoting resistance to Sclerotinia, is represented by the polynucleotide SEQ ID NO: 1, coding for the PK-P polypeptide of sunflower, or by the polynucleotide, whose partial sequence is indicated above (SEQ ID NO: 23), coding for the PK-P rapeseed polypeptide.
  • the present invention also includes any fragment of at least 10 bp, preferably at least 15 bp, advantageously at least 20 bp, and most preferably at least 50 bp of a polynucleotide a) or b) above , or capable of hybridizing selectively, under stringent conditions, with a polynucleotide a) or b) above.
  • Preferred fragments are those of the polynucleotide SEQ ID NO: 1 coding for the PK-P polypeptide of the sunflower, or of the polynucleotide coding for the rapeseed PK-P polypeptide, comprising the sequence (SEQ ID NO: 23) above, or those capable of hybridizing selectively under stringent conditions with one or other of these polynucleotides or their complement.
  • Stringent hybridization conditions, for a given polynucleotide can be identified by a person skilled in the art according to the size and the base composition of the polynucleotide concerned, as well as the composition of the hybridization mixture (in particular pH and ionic strength).
  • stringent conditions for a polynucleotide of given size and sequence, are obtained by operating at a temperature which is approximately 5 ° C. to 10 ° C. below the melting point (Tm) of the hybrid formed, in the same reaction mixture, by this polynucleotide and its complement.
  • Tm melting point
  • a polynucleotide capable of hybridizing selectively with a polynucleotide a) or b) according to the invention any polynucleotide which when hybridized under stringent conditions with a library of nucleic acids (for example a DNA library genomic or cDNA) produces a detectable hybridization signal (i.e.
  • the present invention also relates to polynucleotide probes or amplification primers obtained from polynucleotides a) or b) in accordance with the invention, or fragments thereof, as defined above.
  • amplification primers in accordance with the invention include those of the following pair: PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5 'ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3'
  • PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5 'TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' which amplify the entire sequence coding for PK-P from a sunflower DNA library, as well as those of the following pair: O210 LecRK / for (SEQ ID NO: 25): 5 '-GTTTGGAGATATTGA ⁇ GATAATC-3' O211 LecRK / rev (SEQ ID NO: 26): 5 '-TCTTCCATTAGGCATAGTCATA-3' which can be used to isolate orthologs of the PK-P gene from sunflower in other species, especially rapeseed.
  • the present invention also encompasses any polynucleotide coding for a polypeptide involved in resistance to Sclerotinia, and which can be obtained from a genomic DNA or plant cDNA library by screening said library using probes or primers according to the invention.
  • This notably includes the various alleles of the PK-P gene, sunflower and rapeseed, and in particular the alleles capable of increasing resistance to Sclerotinia, as well as orthologs of the PK-P gene, in plants other than sunflower or rapeseed.
  • the present invention also includes genetic markers allowing the detection of the presence or absence in a plant, of the allelic form of the PK-P gene present in said plant, and in particular the detection of the presence or absence of an allele of the PK-P gene favorable to resistance to Sclerotinia.
  • Genetic markers in accordance with the invention can, for example, be defined from the sequence SEQ ID NO: 1 or corresponding cDNA or genomic DNA sequences, by comparing these sequences with their homologs obtained from plants of different levels of resistance to Sclerotinia, in order to detect the polymorphisms existing between these sequences, and to determine the land associated with a determined level of resistance. These polymorphisms can be located in the coding regions of the gene.
  • these polymorphisms are polymorphisms resulting in modifications of the peptide sequence of the protein.
  • polymorphisms are those manifested by the peptide sequence modifications shown in FIG. 1. They may also be polymorphisms located in the 5 ′ non-coding region or in the introns of the gene, which may be reflected by a modification of the protein sequence, or by a modification of its level of expression.
  • a polymorphism has been thus identified, it is possible to use it as a genetic marker of resistance or sensitivity, and to define tools (nucleic acid probes, amplification primers, restriction enzymes) making it possible to distinguish its different forms.
  • Plants having an allele of the PK-P gene favorable to resistance to Sclerotinia thus identified can be used as a source of genetic material to improve resistance to Sclerotinia from non-resistant or weakly resistant plants, for example by introgression of said allele in said plants .
  • the present invention also encompasses the use of polynucleotides in accordance with the invention for the detection of the allelic form of the PK-P gene present in a plant and in particular for the detection of the presence or absence of alleles of the PK gene -P favorable to resistance to Sclerotinia.
  • the present invention relates in particular to a process for evaluating the level of resistance of a plant to Sclerotinia, characterized in that it comprises the determination of the allelic form of the PK-P gene present in said plant.
  • This method can in particular be implemented for the selection of plants resistant to Sclerotinia, by detection in said plants of an allele of the PK-P gene favorable to resistance to Sclerotinia.
  • Said plant may belong to any of the species susceptible to Sclerotinia.
  • it is sunflower and rapeseed.
  • the present invention also relates to oligonucleotide primers which can be used for the implementation of the detection methods defined above.
  • the present invention relates to any pair of primers allowing the specific amplification of a region of the PK-P gene comprising at least one polymorphism associated with the level of resistance to Sclerotinia.
  • the present invention also relates to kits for implementing a method according to the invention. These kits comprise at least one pair of primers in accordance with the invention, optionally associated with reagents allowing the implementation of an amplification reaction, with means for detecting the amplification product, with one or more enzymes. restriction, and / or positive controls and / or negative amplification controls.
  • Another subject of the present invention is: - a recombinant expression cassette comprising a polynucleotide in accordance with the invention, placed under transcriptional control of an appropriate promoter; a recombinant vector resulting from the insertion, in an appropriate host vector, of a polynucleotide or of an expression cassette in accordance with the invention.
  • the present invention also encompasses host cells genetically transformed by a polynucleotide according to the invention. Preferably, these are host cells comprising an expression cassette in accordance with the invention.
  • Host cells can be eukaryotic or prokaryotic cells.
  • the present invention also encompasses a process for the production of a recombinant polypeptide, characterized in that it comprises the transformation of a host cell, prokaryotic or eukaryotic, with a polynucleotide according to the invention, and the recovery of said polypeptide produced by said cell.
  • the choice of the host vector and of the expression regulation sequences is made as a function of the host cell or of the host organism chosen and of the envisaged application.
  • the present invention also relates to a method for increasing the resistance of a plant to Sclerotinia, characterized in that it comprises the transformation of said plant with a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention.
  • said plant is transformed by an expression cassette according to the invention.
  • the present invention also encompasses transgenic plants capable of being obtained by a process according to the invention, as well as the descendants of these plants and the hybrids obtained by crossing, containing a transgene comprising a polynucleotide according to the invention.
  • the invention further relates to the tissues or parts of plants, plants, or seeds transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a recombinant vector according to the invention.
  • plant tissue refers to any tissue of a plant, in a plant or in a crop. This term includes whole plants, plant cells, plant organs, plant seeds, protoplasts, calluses, cell cultures and all other plant cells organized as a functional and / or structural unit. Parts of regenerated plants such as flowers, seeds, leaves, stems, fruit, pollen, tubers, wood and the like are also within the scope of the invention.
  • Transgenic plants or parts of plants according to the invention can advantageously be obtained from plants of species sensitive to
  • Sclerotinia and in particular of species such as sunflower, rapeseed, cabbage, lettuce, soybean, lemon tree, tomato, melon, cucumber, or field beans.
  • the genetic transformation of plants can be carried out by conventional techniques, which are well known in themselves to those skilled in the art.
  • the polynucleotide which it is desired to express in the transformed plant is associated with appropriate expression regulation sequences including in particular a promoter.
  • These expression regulation sequences may be the endogenous sequences of the gene which it is desired to express, it may also be, in whole or in part, heterologous sequences.
  • an appropriate promoter among the very large variety available, will depend on the plant which one wishes to transform, as well as on the expression profile which one wishes to obtain (for example constitutive, inducible or tissue-specific).
  • promoters which can advantageously be used in the context of the present invention, mention may in particular be made of the promoters of the PR5-2 or BAP genes, inducible by Sclerotinia, which are described in US Patent 6667427.
  • a very large assortment methods for the introduction of polynucleotides into plant cells, plant tissue, or plants are also available. The choice of the most appropriate method generally depends on the plant you wish to transform.
  • EXAMPLE 1 ISOLATION OF THE PK-P GENE
  • the coding sequence of the PK-P gene is obtained from genomic sunflower DNA using the following primers: PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5 'ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3'
  • PCR amplification conditions are as follows:
  • EXAMPLE 2 CONSTRUCTION OF EXPRESSION VECTORS AND TRANSFORMATION OF SUNFLOWER
  • PK-P gene (ecotype 101, SEQ ID NO: 1) in sense orientation is cloned into the vector pGemT easy (Promega).
  • a BamHI site is inserted 5 'and a Pstl site is inserted 3' of the PK-P gene, using the pair of primers:> PKP Forward / Ba HI (SEQ ID NO: 5)
  • PCR-BluntlI-Topo (Invitrogen), to give the vector pkplOl.l-BluntlI-TOPO.
  • the insert BamHI / Pstl containing the PK-P sequence is excised from the vector pkp 101.1 -Blunt ⁇ -TOPO, and introduced into a host vector (pUCNveaupolylinker), previously linearized with BamHI and Pstl, between the 35S promoter and the Tnos terminator.
  • the vector obtained is called PucNveauPoly-P35S-PKPl 01.1.
  • the vector PucNveauPoly-P35S-PKP101.1 is digested with StuI and EcoRI.
  • the 35S-PKP-Tnos insert resulting from this digestion is introduced into the binary vector pBIN19 (BEVAN et al, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, 1984), previously opened by Hind III, provided with blunt ends per action. Klenow polymerase, then digested with EcoRI.
  • the resulting vector, called pkplOl.lpBIN is shown diagrammatically on the
  • antisense vectors pkpXantisenspBIN and pkpXantisenspBINGUS
  • SEQ ID NO: 7 A sequence of the 3 ′ region of the kinase domain of PK-P, represented below (SEQ ID NO: 7), is inserted in antisense orientation in the binary vector pBIN19.
  • PK-P with the reporter gene GUS.
  • the resulting vector, called pkpXantisenspBINGUS is shown diagrammatically in FIG. 3 B.
  • pkpantisens (Lect-Kin) pBIN A sequence of the Iectin kinase region of PK-P, represented below (SEQ ID NO: 8), is inserted in orientation antisense in the binary vector pBIN19.
  • the plasmid chosen for processing is introduced into the GV2260 strain (DEBLAERE et al Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788, 1985) of Agrobacterium tumefaciens.
  • the transformation of sunflower (NSU line) is carried out according to the protocol described in PCT Application WO 95/06741, with the following modifications: the seeds are sterilized for 30 minutes in bleach added with a few drops of detergent (Tween 20), then rinsed 3 times with sterile distilled water, and the film covering the seed is removed under aseptic conditions.
  • the seeds are sterilized as described above for 20 minutes, rinsed 3 times with sterile distilled water, and soaked overnight in sterile distilled water, at 25 ° C and in the dark.
  • the apices are immersed for 30 minutes in a suspension of the strain GV2260 containing the plasmid pkplOl.lpBIN or pkpXantisenspBin or the plasmid pkpantisens (Lect-Kin) pBin.
  • the apices are cultured, under the conditions described in PCT application WO 95/06741.
  • a check for the presence of the resistance gene to Sclerotinia PK-P was then carried out using the Southern technique. This control also makes it possible to identify the number of copies of the gene which has been inserted. Once the presence of the two genes is confirmed, the transgenic plants are then transferred to a serce and isolated to avoid any risk of cross-pollination.
  • the molecular characterizations (presence and number of copies of the gene) of the transformants are carried out by Southern for the primary transformants T0 and the progeny T 1.
  • the protocols used are described below: Sampling of biological material: Discs are taken with a punch from the leaves of primary transformants cultivated in sene, they are immediately frozen in liquid nitrogen. DNA extraction and quantification After grinding 50 mg of plant material in liquid nitrogen, the DNA is extracted according to the method of Fulton et al. (Fulton TM, Chunwongse J. and Tanksley SD, Plant Molecular Biology Reporter, 1995,13,207-209). The DNA obtained is then assayed by a fluorimetric method using the fluorochrome HOECHST 33258.
  • the genomic DNA (5 micrograms) is hydrolyzed by 100 units of the restriction enzyme EcoRI for about twenty hours at 37 ° C. in an appropriate buffer provided with the enzyme (Biolabs®). EcoRI cuts at a single site at the 3 ′ end of the expression cassette containing the Npt11 gene, that is to say on the left border of the T-DNA.
  • the hydrolyzed DNA is then separated by electrophoresis on a 1% agarose gel and then transferred by capillary action to a nylon membrane ((Nylon Membranes positively charged: Roche Diagnostics 2, avenue du Vercors BP 59 38242 Meylan Cedex).
  • nylon are then revealed with CDP star (Roche Diagnostics) after hybridization (overnight) with a cold probe according to the manufacturer's recommendations (Roche Diagnostics).
  • the cold probe is labeled with Ta digoxygenin by PCR according to the manufacturer's recommendations (Roche Diagnostics ) from plasmid DNA carrying the sequence of interest used for the transformation of sunflower (sense or antisense PKP), and the selection gene Npt11.
  • controls are used to validate the results: the genomic DNA extract of the untransformed genotype used for the transformation of sunflower serves as a negative control, plasmid DNA originating from the binary vector used Transformation Sunflower serves as a positive control.
  • a reference scale (DNA Molecular Weight III Dig labeled Roche Diagnostics) makes it possible to estimate the size of the fragments revealed by the cold probe. Transformations of sunflower plants (NSU genotype of intermediate resistance level) made it possible to obtain 2 T0 plants transformed with the construction pkpXantisenspBin from independent events and 2 T0 plants from independent events with the construction pkpantisens (Lect-Kin ) pBin. An event by construction was positive after analysis of the Tl plants. It is confirmed in Tl generation by Southern analyzes that a plant, hereinafter called plant 1023, has integrated the construction pkpXantisenspBin. In addition, Southern analyzes indicate that there are two insertions and that the transgene is expressed.
  • a plant hereinafter called plant 1210
  • Southern analyzes show a complex insertion of 5 copies.
  • the sense vector pkplOl.lpBIN
  • Sunflower plants T0, Tl, T2 were obtained with two different antisense constructs in order to analyze the effect of this PK-P gene and the phenotype of the plants after extinction of the expression of the PK-P gene.
  • primers 3end-pkp6f and ASpkp2f are specific for the endogenous gene. Their respective sequences are:
  • 3end-pkp6f (SEQ ID NO: 17): TTGTTGGAAGTGGTGTGTGGA
  • ASpkp2f (SEQ ID NO: 18): CCTGCTCGACGGCTCATCATTA
  • the two pairs of primers 3end-pkp5f / 3end-pkp5r and 3end- pkp7f / 3end-pkp7r make it possible to amplify both the endogenous PK-P gene and the transgene
  • PK-P -Antisens The respective sequences of the primers are:
  • 3end-pkp5r (SEQ ID NO: 20): GCCGATCAATCTCCATCACAA
  • 3end- ⁇ kp7f (SEQ ID NO: 21): CCGGAGGAGCTCATTTTGGTT 3end-pkp7r (SEQ ID NO: 22): GCTCGACGGCTCATCATTAGA RT-PCR analyzes with the primers 3end-pkp7f73end-pkp7r in T2-negative aggregants primary T0 and corresponding to self-fertilization of Tl plants having segregated the introduced gene, indicate that the endogenous PK-P gene is expressed following infection by Sclerotinia. Analysis of resistance to Sclerotinia from sunflower plants transformed with antisense vectors. The antisense transformation of sunflower plants increases the sensitivity of the sunflower during infection with Sclerotinia.
  • Resistance tests against infection by Sclerotinia are carried out on whole plants after inoculation with strain 55 of Sclerotinia sclerotiorum according to the following protocol:
  • the plants are inoculated with Sclerotinia sclerotiorum (strain 55) by depositing a piece of agar bearing mycelium in growth on the end of a leaf blade with insertion located in the middle of the main stem.
  • the ratings are made in kinetics: 3d, 5d, 7d, 10d, 12d, 14d and 17d after infection.
  • negative controls corresponding to negative plants resulting from transgene segregation are also infected.
  • FIG. 5 describes the evolution of the size of the necroses (size in centimeters), on average, for the transformed sunflower plants (T +, represented by the diamonds and the solid line) and for the control plants (T-, represented by the canes and the dashed line) according to the number of days after inoculation (3d, 5d, 7d, 10d, 12d, 14d and 17d).
  • necrosis measurements are carried out on a sheet according to the protocol described above.
  • the transformed plants show faster and greater necrosis than the control plants.
  • the difference between the average growth of necrosis in transformed plants and that of control plants is significant over time: the threshold varies from 0.1% to 1%.
  • the lecRKl gene includes, like the PK-P gene, a lectin domain and a kinase domain.
  • Primers drawn on the coding part of the At-lecRKl gene of Arabidopsis thaliana made it possible to amplify, from rapeseed DNA, a product whose size is approximately 850 bp.
  • the primers used for the amplification of the ortholog are respectively named O210 (forward) and 0211 (reverse) and have the following sequences:
  • 0211 LecRK / rev (SEQ ID NO: 26) 5'-TCTTCCATTAGGCATAGTCATA-3 '
  • the amplification product (approximately 850 bp) was cloned into the vector pkplOl.l-BluntlI-Topo (Invitrogen) and then sequenced.
  • the sequence thus obtained corresponds to SEQ ID N ° 23, also called BnLecRK (RV27) is represented in the list of sequences in the appendix under the number SEQ ID N ° 23. It corresponds to the incomplete ortholog in 5 'and 3' in rapeseed of the PK-P sequence of sunflower (SEQ ID No. 1).
  • RNAi vector The sequence BnLecRK (RV27) was introduced into a binary vector RNAi comparable to the vector PK-PlOl.lpBIN used for the transformation of sunflower.
  • the T-DNA of the binary vector comprises the following expression cassette:
  • EcNPTII Bevan, M., Et al. (1983), Nucleic Acids Res., 11 (2): 369-385)
  • terAtNOS Depicker A, et al. (1982) Mol. Appl. Genêt. 1: 561-573
  • proVir35S Franck, A., et al. (1980) DNA Cell 21 (1), 285-294
  • control plants are artificially inoculated on the 2nd leaf by a 3-day-old culture of mycelium (Sclerotinia sclerotinium).
  • the resistance of the seedlings is analyzed by estimating the level of necrosis on the leaf blade from the 2nd day after inoculation (LecJ2) then the third day (LecJ3), the fourth (LecJ4) and the 6th (LecJ6).
  • LecJ2 As in sunflower, resistance analyzes on rapeseed seedlings confirm the increase in the sensitivity of the transformed plants vis-à-vis the control plants.

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Abstract

L'invention concerne un polypeptide de la famille des lectine protéine-kinases, intervenant dans la résistance à Sclerotinia, ainsi qu'un polynucléotide codant pour ce polypeptide, et leurs utilisations pour obtenir et/ou sélectionner des plantes résistantes à Sclerotinia.

Description

GENE DE RESISTANCE A SCLEROTINIA La présente invention est relative à de nouveaux polypeptides et polynucléotides utilisables pour lutter contre des champignons pathogènes des plantes, et notamment contre Sclerotinia. Sclerotinia sclerotiorum est un champignon phytopathogène qui peut infecter de nombreuses cultures (PURDY, Phytopathology, 69, 875-880, 1979) parmi lesquelles le tournesol, le colza, le chou, la laitue, le soja, le citronnier, la tomate, le melon, le concombre, ou encore le haricot de grande culture. Chez le tournesol, il est l'agent de la pourriture blanche aussi appelée sclérotiniose ou pourriture sclérotique, qui constitue une maladie majeure contre laquelle il n'existe pas de lutte chimique efficace. L'infection par Sclerotinia est visible depuis la formation du bouton floral jusqu'à la fin de floraison du tournesol. A partir de la floraison, sur feuille, pétiole et tige apparaissent une décoloration puis un ramollissement des organes atteints ; un mycélium blanc et dense les colonise, et est souvent observable à l'extérieur de la tige où il se condense en certains points avant de former des sclérotes ; du fait d'une moindre résistance des tissus, la tige peut casser et verser. A maturité, sur la face fleurie du capitule apparaissent des taches translucides ; le mycélium blanc et dense se condense ici en grille de sclérotes. L'intégralité des tissus du capitule est désagrégée par l'agent pathogène. Ne vont subsister que les fibres libéro-ligneuses du sommet de la tige donnant à celui-ci un aspect de fouet. La culture du tournesol connaît par conséquent des irrégularités de rendement dues aux pertes de production causées par ce champignon. Parmi les stratégies de lutte actuellement proposées, on citera notamment la sélection de variétés résistantes, afin de les utiliser pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l'infection à Sclerotinia est une des voies actuelles majeures dans la recherche sur les interactions plantes-pathogènes. Cela inclut par exemple l'identification de facteurs pathogènes essentiels dans la virulence et le développement des moyens pour les inhiber ou encore le transfert de gènes de résistance dans les plantes sensibles, afin d'augmenter leur résistance. Par exemple, le gène de Poxalate oxydase, qui est une enzyme capable de détruire les phytotoxines produites par Sclerotinia, a été utilisé et décrit dans la demande PCT WO 92/1568. Actuellement, les stratégies et outils de l'art antérieur ne sont pas suffisants pour lutter contre l'infection ravageuse de ce champignon pythopathogène et il existe un besoin réel d'isoler de nouveaux outils afin de permettre l'obtention d'une résistance à Sclerotinia dans les espèces qui en subissent l'infection, et notamment les espèces cultivées sensibles et d'intérêt industriel. Il est donc important d'identifier d'autres gènes impliqués dans la résistance à Sclerotinia afin de pouvoir augmenter le niveau de résistance des plantes cultivées sensibles et améliorer le rendement des cultures d'intérêt. Les Inventeurs ont isolé, à partir àΗelianthus annuus un nouveau gène codant pour une protéine de la famille des kinases à serine et thréonine, et associé à la résistance du Tournesol à Sclerotinia. Ils ont aussi identifié chez le colza un orthologue de ce gène, et ont démontré qu'il intervenait également dans la résistance à Sclerotinia chez le colza. Ce gène, dénommé ci-après PK-P ou Ha-lecRK code pour une protéine de type lectine protéine-kinase. En comparant la séquence polypeptidique déduite de ce gène à celles de gènes connus, on révèle une homologie avec deux gènes, LRK-1
(SWARUP et al., Plant Physiol., 111, 347-347, 1996) et Lec-RKl (HERVE et al., Plant
Mol Biol., 39, 671-82, 1999) ά'Arabidopsis thaliana. Le gène At-LecRKl d'A. thaliana est activé au cours de la sénescence naturelle et en réponse aux blessures et aux oligogalacturonides ; il joue vraisemblablement un rôle dans le programme de développement et les processus adaptatifs (HERVE et al., 1999, précité). L'analyse comparative de séquences polypeptidiques déduites du gène PK-P (Ha-lecRK) sur des génotypes de tournesol présentant des niveaux de sensibilité variable à Sclerotinia a été réalisée. La Figure 1 représente les résultats de cette comparaison. Légende de la Figure 1 : Tournesols résistants sauvages : écotypes 101 et 103 (SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 9) ; tournesols cultivés (partiellement résistants) : lignées PAC1, PAC2, PSC8, et SD (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13) ; tournesols cultivés sensibles : lignées CP73, XRQ, et GH (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16) ; les acides aminés indiqués en gras et sur fond grisé dans les séquences des lignées partiellement résistantes PAC1, PAC2, PSC8, et SD correspondent aux principales mutations observées dans ces lignées par rapport aux plantes sauvages résistantes. Les positions du domaine lectine, du domaine transmembranaire, et du domaine kinase sont indiquées au dessus de l'alignement des séquences. Cette analyse met en évidence, chez les génotypes sensibles à Sclerotinia, une modification importante de la partie 'kinase' du gène : interruption ou décalage du cadre de lecture. Des différences existent en outre entre les lignées de tournesol sauvages résistantes à la maladie et les lignées de tournesol cultivées exprimant une résistance partielle. Ces différences portent sur la modification de divers acides aminés sur la protéine. Il est particulièrement intéressant d'isoler de nouvelles séquences polynucléotidiques permettant d'obtenir la résistance à l'infection pour les cultures sensibles et plus particulièrement pour les tournesols cultivés sensibles ou partiellement résistants. La séquence polynucléotidique (SEQ ID NO: 1) codant pour la protéine PK-P du tournesol sauvage écotype 101 est indiquée ci-dessous : ATGTCTCCTCATCCACCACCATGTCTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCCACCTCCACCTCCTCCCAATC CACCCCACTCTCTCCCAATCCTTCATCTACACCACCTTCAACCCCACCAACCTAACCACCAACGGC AACGCCACCATCACCACCACCGGCATCCTTAAACTCACCAACGTAAGCTCCCACACCATCGGTCAC GCTCTCTACCCACACCCCATCTGTTTCAAAACACCCCACACCAATACCACTCTCTCATTCTCCACC GCTTTTGTCTTCTCCATCGTCCCACGATACCGCAAACTCGGTGGTCATGGCCTTGCTTTCACCATC TCTCCGACCAAACACTTCATCGGAGCCCAACCTAGTCAATACCTCGGACTTGTCAACGTTACTTCA AACGGTAACTCATCAAACCATCTTTTTGCTATAGAGTTTGACACCGTTCAAGATCTTGAGTTTTCT GATATTAACGACAACCATGTTGGTGTTAACATTAACCATATGAAGTCGGTTAATTCGACGAAAGCC GGATTTTTCGTTGATGGGAATGTTACTAAACAGGATCTTTGTTTACATAGTGGGAAAAAGATTCAA GCTTGGGTTGATTATGATGCTGAAAAACATCAAGTTGATGTTTATCTTTCTTTATTTTCAAACAAA CCAAGAAAGGCGATCATGTCGGTTTTCGTCGATTTAACACCGGTTTTTCAAGAGTTTATGTACGTG GGGTTTTCTTCATCAACCGGTGTTCTTGCTAGCTCGCATTATGTGTTTGGTTGGAGCTTTAACATG AGTGGAAATGCAAGTTCTTTGAATGTGGATCAGTTTCCTGAACCTGTTCTGCCATTTAAAAAGAAC AATAATAAAGGTTTCGTGTTCCGGTTTGGTACTACTTTGTTTTTGGTTTTTTGTATTTTTGTGATA ATGGGTGGTGTTTATATTATCAAGAAGTTTAAGATAATTAAGAAGACAGAAGCGGTTGAAAGTTGG GAGCTTGATTTGGGCCCACATTCATATTGTTATAGAGAGTTGAAAGAGGGTACAAAGGGGTTTAAT GAGAAGTTTTTAATTGGGTTTGGTGGGTCGGGTAAGGTTTATAAAGGGGTGTTGCCGGATTCGGGG ATGGAAATCGCGGTGAAGCGGATTTCACGGCAGTCGAAACAAGGGCAGAAGGAGTTTTTGTCGGAG GTGTCGACGATTGGGCGGCTTCGGCACCGGAATTTGGTGCAGTTGTTGGGTTGGTCTAGGAATAAA GGTGAGTTGTTGTTGGTTTATGAGTTTATGGCTAATGGAAGTTTGGATAAGTGTATATATAGTGGT AATAAGCCTAAATTGGTTTTGAGTTGGGAACAAAGGTTTAAGGTTATAAAAGATGTGGCAAATGGG TTGCTTTATTTGCATGAAGGGTGGGAACAAACTGTGGTGCATAGAGATATTAAAGCAGGAAATGTG TTGTTGGATTCTGATTTGAATGGTAAGTTAGGCGATTTCGGGTTGGCTAAGTTGTATGAGCATGGG TCGAACCCGGTAACCACTAAAGTGGTGGGCACATTGGGTTACTTGGCTCCTGAGCTAACCCGAACG GGTAAGCCCACCACGGGTTCGGATGTGTATGCATTCGGGGCTCTTTTGTTGGAAGTGGTGTGTGGA CGGAGACCCGCTGAGCTCAAGGCGTCACCGGAGGAGCTCATTTTGGTTGATTGGGTTTGGGATAAG TGGCGAGAAGGGTGTTTACTTGATGTGGTGGATTCGCGGTTGAAGGGTGAGTTTAATGAGGTTGAA GTTACGATGGTTTTGAAGGTTGGGTTAATGTGTTCTAATGATGAGCCGTCGAGCAGGCCGAGTATG AGGCAGGTGATTCGGTACTTGGAGAGGGAGGCGCCCGTGCCGGAGATTGTAGGTCCGTCGTGTTAT GGTATTGTGATGGAGATTGATCGGCATGCACCTGCATTAGTGAAATTGAAGTCTTTGTGA La séquence polypeptidique de la protéine PK-P du tournesol
(SEQ ID NO: 2), déduite de cette séquence polynucléotidique, est indiquée ci-dessous (en code 1 -lettre) :
MSPHPPPCLLLLFLLHLHLLPIHPTLSQSFIYTTFNPTNLTTNGNATITTTGILKLTNVSSHTIGH ALYPHPICFKTPHTNTTLSFSTAFVFSIVPRYRKLGGHGLAFTISPTKHFIGAQPSQYLGLVNVTS NGNSSNHLFAIEFDTVQDLEFSDINDNHVGVNINHMKSVNSTKAGFFVDGNVTKQDLCLHSGKKIQ AWVDYDAEKHQVDVYLSLFSNKPRKAIMSVFVDLTPVFQEFMYVGFSSSTGVLASSHYVFGWSFNM SGNASSLNVDQFPEPVLPFKKNNNKGFVFRFGTTLFLVFCIFVIMGGVYIIKKFKIIKKTEAVESW ELDLGPHSYCYRELKEGTKGFNEKFLIGFGGSGKVY/KGVLPDSGMEIAVKRISRQSKQGQKEFLSE VSTIGRLRHRNLVQLLG SRNKGELLLVYEF ANGSLDKCIYSGNKPKLVLSWEQRFKVIKDVANG LLYLHEG EQTVVHRDIKAGNVLLDSDLNGKLGDFG AKLYEHGSNPVTTKVVGTLGYLAPELTRT GKPTTGSDVYAFGALLLEVVCGRRPAELKASPEELΓ VD VWDKWREGCLLDVVDSRLKGEFNEVE VTMVLKVGL CSNDEPSSRPSMRQVIRYLEREAPVPEIVGPSCYGIV EIDRHAPALVKLKSL La séquence polynucléotidique partielle (SEQ ID NO: 23) du gène codant pour la protéine PK-P du colza est indiquée ci-dessous :
GTTTGGAGATATTGATGATAATCATGTTGGGATTAACATCAATGATATGAGATCTGTTGTCTCTGC TTCTGCTGGTTACTATGATGATGAAGATGGACAGTΓTAAGA TCTTTCTTTGATTAGTAGAAATGT AATGAGGCTTTCTATAGTTTATAGTCAGCCTGATCAACAGCTTAΆTGTTACTCTCTTCCCTGCCGA GATCTCTGTTCCTCCTCGAAAACCGCTTTTGTCGTΓAAACCAAGATCTTTCTCCATATTTGCTTGA GGAAATGTATCTTGGATTCACTGCTTCAACTGGTTCAGTTGGTGCAGTTCATTACATGATGGGTTG GTTTATTGTTGGAGAGATCAGTTATCCGAGTTTGGA.GTTTGGTAGGCAACCAAACCTTCCTCCATA TCCAAAGAAAGCATCTCACAGAACAAGAACCGTTTTAGCGGTCTGCTTAACTGTATCCGTAATCGC TGCATTTATCGCCTTGTGGTTTGGTTTAGTCTTTTACTTGAGACACAAGAAAGTTAAAGAAGTTCT TGAGGAATGGGAGATACAATATGGACCTCATAGGTΓTGCTTACAAGGAGCTTTCCAATGCCACAAA GGGTTTCAAGGAGAAACAACTTCTTGGAAGAGGAGGTTTTGGTCAAGTCTATAGAGGCACACTTCC TGGTTCTGATGCAGAGATTGCTGTGAΆACGGACTTCTCATGATTCAAGGCAAGGGATGAGAGAGTT TCTAGCCGAGATATCGACAATTGGTCGGCTCAGACATCCAAATCTAGTCAGGCTTTTGGGGTATTG TAGGCATAAAGAACATCTCTACTTGGTTTATGACTATGCCTAATGGAAGA La séquence polypeptidique partielle (SEQ ID NO: 24) de la protéine PK-P du colza, déduite de cette séquence polynucléotidique, est indiquée ci-dessous (en code 1 -lettre) :
FGDIDDNHVGININDMRSVVSASAGYYDDEDGQFKMLSLISRNVMRLSIVYSQPDQQLNVTLFPAE ISVPPRKPLLSLNQDLSPYLLEEMYLGFTASTGSVGAVHYMMGWFIVGEISYPSLEFGRQPNLPPY PKKASHRTRTVLAVCLTVSVIAAFIALWFGLVFYLRHKKVKEVLEEWEIQYGPHRFAYKELSNATK GFKEKQLLGRGGFGQVYRGTLPGSDAEIAVKRTSHDSRQGMREFLAEISTIGRLRHPNLVRLLGYC RHKEHLYLVYDYA La présente invention a pour objet un polypeptide isolé intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il présente au moins 40%, en particulier au moins 45%, de préférence au moins 50%», de manière tout à fait préférée au moins 55%, et très avantageusement, par ordre de préférence croissante, au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité avec le polypeptide PK-P du tournesol (SEQ ID NO: 2). Avantageusement ledit polypeptide est choisi parmi : le polypeptide PK- P du tournesol (SEQ ID NO: 2), et le polypeptide PK-P du colza (SEQ ID NO: 24). On entend ici par «polypeptide intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia» un polypeptide dont l'expression ou l'activité sont corrélés au niveau de résistance à Sclerotinia. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques et les pourcentages d'identité ou de similarité indiqués pour les séquences peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en utilisant les paramètres par défaut. Selon la présente invention, une plante est considérée comme résistante à Sclerotinia si l'apparition des symptômes provoqués par l'infection de la plante par le pathogène est retardée. Par exemple, une plante sera dite résistante (ou tolérante) à Sclerotinia si la colonisation des tissus végétaux par le champignon nécessite une durée plus longue par rapport à une plante sensible. La plante est également dite résistante, selon la présente invention, si les symptômes restent localisés à une partie délimitée de la plante. La plante est dite résistante lorsqu'aucun symptôme n'apparaît et/ou lorsqu'il y a absence totale dudit pathogène dans les tissus végétaux après infection par Sclerotinia. La présente invention a également pour objet un polynucleotide isolé choisi parmi : a) un polynucleotide codant pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus ; b) un polynucleotide complémentaire du polynucleotide a) ; c) un polynucleotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucleotide a) ; ou le polynucleotide b). Selon la présente invention, on définit comme polynucleotide « codant pour » un polypeptide donné, tout polynucleotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide. Il peut s'agir par exemple d'une séquence codante, d'un ADNc ou d'un ARNm, ou d'un fragment d'ADN génomique. Des exemples non limitatifs de polynucléotides conformes à l'invention, codant pour un polypeptide favorisant la résistance à Sclerotinia, est représenté par le polynucleotide SEQ ID NO:l, codant pour le polypeptide PK-P du tournesol, ou par le polynucleotide, dont la séquence partielle est indiquée ci-dessus (SEQ ID NO: 23), codant pour le polypeptide PK-P du colza. La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 15 pb, avantageusement au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucleotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucleotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux du polynucleotide SEQ ID NO:l codant pour le polypeptide PK-P du tournesol, ou du polynucleotide codant pour le polypeptide PK-P du colza, comprenant la séquence (SEQ ID NO: 23) ci-dessus, ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un ou l'autre de ces polynucléotides ou de leurs complémentaires. Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucleotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucleotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucleotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucleotide et son complémentaire. On définit ici comme polynucleotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucleotide a) ou b) conforme à l'invention tout polynucleotide qui lorsqu'il est hybride en conditions stringentes avec une banque d'acides nucléiques (par exemple une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucleotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres kinases, ou des séquences codant pour des protéines, autres que les polypeptides conformes à l'invention, possédant un domaine lectine, ou un domaine GDI. La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention, ou de fragments de ceux-ci, tels que définis ci-dessus. A titre d'exemples d'amorces d'amplification conformes à l'invention, on peut citer celles du couple suivant : PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5' ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3'
PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5' TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' qui permettent d'amplifier la totalité de la séquence codant pour PK-P à partir d'une banque d'ADN de tournesol, ainsi que celles du couple suivant: O210 LecRK/for (SEQ ID NO: 25) : 5' -GTTTGGAGATATTGAΓGATAATC-3 ' O211 LecRK/rev (SEQ ID NO: 26) : 5' -TCTTCCATTAGGCATAGTCATA-3' qui sont utilisables pour isoler des orthologues du gène PK-P de tournesol chez d'autres espèces, notamment chez le colza. La présente invention englobe aussi tout polynucleotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance à Sclerotinia, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à l'invention. Ceci inclut notamment les différents allèles du gène PK-P, du tournesol et du colza, et notamment les allèles capables d'augmenter la résistance à Sclerotinia, ainsi que des orthologues du gène PK-P, chez des plantes autres que le tournesol ou le colza. La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante, et notamment la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia. Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, peuvent par exemple être définis à partir de la séquence SEQ ID NO : 1 ou des séquences d'ADNc ou d'ADN génomique conespondantes, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes de différents niveaux de résistance à Sclerotinia, afin de détecter les polymorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la fonrte associée à un niveau de résistance déterminé. Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène. De préférence, il s'agit de polymorphismes se traduisant par des modifications de la séquence peptidique de la protéine. Des exemples de polymorphismes de ce type sont ceux se traduisant par les modifications de séquence peptidique représentées sur la figure 1. Il peut également s'agir de polymorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène, qui peuvent se traduire par une modification de séquence de la protéine, ou par une modification de son niveau d'expression. Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes. Des plantes possédant un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia ainsi identifié peuvent être utilisées comme source de matériel génétique pour améliorer la résistance à Sclerotinia de plantes non-résistantes ou faiblement résistantes, par exemple par introgression dudit allèle dans lesdites plantes. La présente invention englobe également l'utilisation de polynucléotides conformes à l'invention pour la détection de la forme allélique du gène PK-P présente chez une plante et notamment pour la détection de la présence ou de l'absence d'allèles du gène PK-P favorables à la résistance à Sclerotinia. La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation du niveau de résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante. Ce procédé peut notamment être mis en œuvre pour la sélection de plantes résistantes à Sclerotinia, par détection chez lesdites plantes d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia. Ladite plante peut appartenir à une quelconque des espèces sensibles à Sclerotinia. Avantageusement, il s'agit du tournesol et du colza. La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en œuvre des méthodes de détection définies ci-dessus. En particulier la présente invention a pour objet tout couple d'amorces permettant l'amplification spécifique d'une région du gène PK-P comprenant au moins un polymorphisme associé au niveau de résistance à Sclerotinia. La présente invention a également pour objet des kits pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification. La présente invention a aussi pour objet : - une cassette d'expression recombinante comprenant un polynucleotide conforme à l'invention, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; - un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucleotide ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe aussi des cellules hôtes génétiquement transformées par un polynucleotide conforme à l'invention. De préférence, il s'agit de cellules hôtes comprenant une cassette d'expression conforme à l'invention. On définit comme « cellule hôte génétiquement transformée » toute cellule hôte dont le contenu génétique a été modifié par introduction d'une information génétique étrangère. Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales. La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucleotide conforme à l'invention, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule. Le choix du vecteur-hôte et des séquences de régulation de l'expression est effectué en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour augmenter la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucleotide codant pour un polypeptide conforme à l'invention. Selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé conforme à l'invention, ladite plante est transformée par une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe également des plantes transgéniques susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes et les hybrides obtenus par croisement, contenant un transgène comprenant un polynucleotide conforme à l'invention. L'invention concerne de plus les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines transformés par un polynucleotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, bois et analogues sont également dans le cadre de l'invention. Des plantes transgéniques ou parties de plantes conformes à l'invention peuvent avantageusement être obtenues à partir de plantes d'espèces sensibles à
Sclerotinia, et notamment d'espèces telles que le tournesol, le colza, le chou, la laitue, le soja, le citronnier, la tomate, le melon, le concombre, ou encore le haricot de grande culture. La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les techniques classiques, qui sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Classiquement, le polynucleotide que l'on souhaite exprimer dans la plante transformée est associé à des séquences de régulation de l'expression appropriées incluant notamment un promoteur. Ces séquences de régulation de l'expression peuvent être les séquences endogènes du gène que l'on souhaite exprimer, il peut s'agir également, en totalité ou en partie, de séquences hétérologues. Le choix d'un promoteur approprié, parmi la très grande variété disponible, dépendra de la plante que l'on souhaite transformer, ainsi que du profil d'expression que l'on souhaite obtenir (par exemple constitutif, inductible ou tissu- spécifique). A titre d'exemples de promoteurs pouvant avantageusement être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment les promoteurs des gènes PR5-2 ou BAP, inductibles par Sclerotinia, qui sont décrits dans le Brevet US 6667427. Un très grand assortiment de méthodes pour l'introduction de polynucléotides dans des cellules végétales, des tissus végétaux, ou des plantes est également disponible. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante que l'on souhaite transformer. A titre d'exemples non-limitatifs, pour la transformation du tournesol, on peut utiliser les techniques décrites dans la Demande PCT WO 95/06741. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'isolement de la séquence codant pour la protéine PK-P et sa fonction, l'utilisation de cette séquence pour la transformation de plantes.
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT DU GENE PK-P La séquence codante du gène PK-P est obtenue à partir d'ADN génomique de tournesol en utilisant les amorces suivantes : PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5' ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3'
PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5' TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' Les conditions d'amplification PCR sont les suivantes:
Mélange réactionnel :
Tampon "Advantage 2 PCR" 10X (BD BIOSCIENCES) 5μl
Mélange de dNTP lOmM 1.5 μl
Amorce PKP Forward (lOOng/μl) lμl
Amorce PKP Reverse (lOOng/μl) lμl
Polymérase Taq "Advantage 2 polymerase Mix" (BD
BIOSCIENCES) μl
ADN génomique 500 ng
Eau qsp 50μl
Conditions de réaction - 95°C 5mn
-(95°C, 30 s; 58 °C, 30s; 72°C 2 mn ) X 35 cycles
- 72°C 5 mn
- 4°C
EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION ET TRANSFORMATION DU TOURNESOL
Construction du plasmide pkplOl.lpBIN La séquence codante du gène PK-P, (écotype 101, SEQ ID NO: 1) en orientation sens est clonée dans le vecteur pGemT easy (Promega). Un site BamHI est inséré en 5' et un site Pstl est inséré en 3' du gène PK-P, en utilisant le couple d'amorces : >PKP Forward/Ba HI (SEQ ID NO: 5)
CGGGATCCC GAT CAC CGA CAA ATG TCT CCT
>PKP Reverse/Pstl (SEQ ID NO: 6)
AACTGCAGAACCAATGCATTTCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT , (les sites introduits sont soulignés). Le produit PCR à bouts francs obtenu est sous-cloné dans le vecteur
PCR-BluntlI-Topo (Invitrogen), pour donner le vecteur pkplOl.l-BluntlI-TOPO. L'insert BamHI/Pstl contenant la séquence PK-P est excisé du vecteur pkp 101.1 -Bluntïï-TOPO, et introduit dans un vecteur d'accueil (pUCNveaupolylinker), préalablement linéarisé par BamHI et Pstl, entre le promoteur 35S et le terminateur Tnos. Le vecteur obtenu est dénommé PucNveauPoly-P35S-PKPl 01.1. Le vecteur PucNveauPoly-P35S-PKP101.1 est digéré par StuI et EcoRI.
L'insert 35S-PKP-Tnos résultant de cette digestion est introduit dans le vecteur binaire pBIN19 (BEVAN et al, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, 1984), préalablement ouvert par Hind III, pourvu de bouts francs par action de la polymérase de Klenow, puis digéré par EcoRI. Le vecteur résultant, dénommé pkplOl.lpBIN est schématisé sur la
Figure 2. L'ensemble de ces constructions est réalisé dans E.coli DH5α.
Construction de vecteurs antisens : pkpXantisenspBIN et pkpXantisenspBINGUS Une séquence de la région 3' du domaine kinase de PK-P, représentée ci-dessous (SEQ ID NO: 7), est insérée en orientation antisens dans le vecteur binaire pBIN19.
CGTCACCGGAGGAGCTCATTTTGGTTGATTGGGTTTGGGATAAGTGGCGAGACGGGCGTTTACTTG ATGTGGTGGATTCGCGGTTGAAGGGTGAGTTTAATGAGGGTGAAGTTACGATGGTTTTGAAGGTTG GGTTAATGTGTTCTAATGATGAGCCGTCGAGCAGGCCGAGTATGAGGCAAGTGATTCGGTACTTGG AGAGGGAGGGGCCCGTGCCGGAGATTGTAGGTCCGTCGTGTAATGGTGTTGTGATGGAGATTGATC GGCATGCACTTGCATTAGTGAAATTGAAGTCTTTG Le vecteur résultant, dénommé pkpXantisenspBIN est schématisé sur la Figure 3 A. La même construction a été réalisée en associant la séquence antisens de
PK-P avec le gène rapporteur GUS. Le vecteur résultant, dénommé pkpXantisenspBINGUS est schématisé sur la Figure 3 B. pkpantisens(Lect-Kin) pBIN Une séquence de la région Iectine-kinase de PK-P, représentée ci- dessous (SEQ ID NO: 8), est insérée en orientation antisens dans le vecteur binaire pBIN19.
GATCCGAAATCCGCTTCACCGCTATTTCCACCCCCGAATCCGGCAACACCCCTTTGTAAACCTTAC CCGACCCACCAAACCCAATTAACAACTTCTCATTAAACCCCTTTGTACCCTCTTTCAGCTCTTTAT AACAATATGAATGTGGGCCCAAACCAAGCTCCCAACTTTCAACCGCTTCTGTCTTCTTAATTATCT TAAACTTCTTGATAATATAAACACCACCCATTATCACAAAAATACAAAAAACCAAAAACAAAGTAG TACCAAACCGGAACACGAAACCTTTATTATTGTTCTTTTTCAATGGCAGAACAGGTTCAGGAAACT GGTCCACATTCAAAGAACTTGCATTTCCACTCATGTTAAAGCTCCAACCAAACACATAATGCGAGC TAGCAAGAACACCGGTTGATGAAGAAAACCCCACGTACATAAACTCTTGAAAAACCGGTGTTAAAT CGAAGAAAACCGACATGATCGCCTTTCTTGGTTTGTTTGAAAATAAAGAAAGATAAACATCAACTT GATGGTTTTCACCATCATAATCAACCCAAGCTTGAATCTTTTTCCCACTATGTAAACAAAGATCCT GTTTAGTAACATTCCCATCGACGAAAAACCCGGCTTTCGTCGAATTAACCGACTTCATATGGTTAA TATTAACACCAACATGGTTGTCGTTAATATCAGAAAACTCAAAATCTTGAACGGTGTCAAACTCTA TAGCGAAAAGATGGTTTGATGAGTTACCGTTTGAAGTAACGTTGACAAGTCCGAGGTATTGACTAG GTTGTGCTCCGATGCTGCA Le vecteur résultant, dénommé pkpantisens(Lect-Kin) pBIN est schématisé sur la Figure 4. Transformation du tournesol : Le plasmide choisi pour la transformation est introduit dans la souche GV2260 (DEBLAERE et al. Nucleic Acids Res 13, 4777-4788, 1985) d' Agrobacterium tumefaciens. La transformation du tournesol (lignée NSU) est effectuée selon le protocole décrit dans la Demande PCT WO 95/06741, avec les modifications suivantes : les graines sont stérilisées pendant 30 minutes dans de l'eau de javel additionnée de quelques gouttes de détergent (Tween 20), puis rincées 3 fois à l'eau distillée stérile, et la pellicule recouvrant la graine est éliminée en conditions aseptiques. Les graines sont stérilisées comme décrit ci-dessus pendant 20 minutes, rincées 3 fois à l'eau distillée stérile, et mises à tremper pendant une nuit dans l'eau distillée stérile, à 25°C et à l'obscurité. Le lendemain, les cotylédons et les radicules sont éliminés, et les apex sont immergés pendant 30 minutes dans une suspension de la souche GV2260 contenant le plasmide pkplOl.lpBIN ou pkpXantisenspBin ou le plasmide pkpantisens(Lect-Kin)pBin. Après la transformation, les apex sont mis en culture, dans les conditions décrites dans la Demande PCT WO 95/06741. Un contrôle de la présence du gène de résistance au Sclerotinia PK-P a ensuite été effectué en utilisant la technique du Southern. Ce contrôle permet aussi d'identifier le nombre de copies du gène qui a été inséré. Une fois la présence des deux gènes confirmée, les plantes transgéniques sont ensuite transférées en serce et isolées pour éviter tout risque de pollinisation croisée.
Caractérisation des tournesol transformés Les caractérisations moléculaires (présence et nombre de copies du gène) des transformants sont effectuées par Southern pour les transformants primaires T0 et la descendance T 1. Les protocoles utilisés sont décrits ci-dessous : Prélèvements du matériel biologique : Des disques sont prélevés à l'emporte pièce sur des feuilles de transformants primaires cultivés en sene, ils sont immédiatement congelés dans l'azote liquide. Extraction et quantification de l'ADN Après broyage de 50 mg de matériel végétal dans l'azote liquide, l'ADN est extrait selon la méthode de Fulton et al. (Fulton T.M., Chunwongse J. et Tanksley S.D , Plant Molecular Biology Reporter, 1995,13,207-209). L'ADN obtenu est ensuite dosé par une méthode fluorimétrique utilisant le fluorochrome HOECHST 33258. Analyses par Southern L'ADN génomique (5 microgrammes) est hydrolyse par 100 Unités de l'enzyme de restriction EcoRI pendant une vingtaine d'heures à 37°C dans un tampon approprié fourni avec l'enzyme (Biolabs®). EcoRI coupe en un site unique à l'extrémité 3' de la cassette d'expression contenant le gène Nptll, c'est-à-dire en bordure gauche du T-DNA. L'ADN hydrolyse est ensuite séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% puis transféré par capillarité sur une membrane de nylon ((Nylon Membranes positively charged : Roche Diagnostics 2, avenue du Vercors BP 59 38242 Meylan Cedex). Les membranes de nylon sont ensuite révélées avec du CDP star (Roche Diagnostics) après hybridation (une nuit) avec une sonde froide selon les recommandations du fabricant (Roche Diagnostics). La sonde froide est marquée à Ta digoxygénine par PCR selon les recommandations du fabricant (Roche Diagnostics) à partir d'ADN plasmidique portant la séquence d'intérêt utilisée pour la transformation du tournesol (PKP sens ou antisens), et le gène de sélection Nptll. Pour chaque série d'analyses, des témoins sont utilisés pour valider les résultats : de l'extrait d'ADN génomique du génotype non transformé utilisé pour la transformation du tournesol sert de témoin négatif, de l'ADN plasmidique provenant du vecteur binaire utilisé pour la transformation du tournesol sert de témoin positif. Une échelle de référence (DNA Molecular Weight III Dig labelled Roche Diagnostics) permet d'estimer la taille des fragments révélés par la sonde froide. Les transformations de plantes de tournesol (génotype NSU de niveau de résistance intermédiaire) ont permis d'obtenir 2 plantes T0 transformées avec la construction pkpXantisenspBin issus d'événements indépendants et 2 plantes T0 issus d'événements indépendants avec la construction pkpantisens(Lect-Kin)pBin. Un événement par construction s'est montré positif après analyse des plantes Tl. Il est confirmé en génération Tl par analyses de Southern qu'une plante, dénommée ci-après plante 1023, a intégré la construction pkpXantisenspBin. De plus, Les analyses Southern indiquent qu'il y a deux insertions et que le transgène s'exprime. De façon identique, il est confirmé en génération Tl qu'une plante, dénommée ci-après plante 1210, a intégré la construction pkpantisens(Lect-Kin)pBin. Les analyses southern montrent une insertion complexe de 5 copies. Afin d'obtenir des plantes de tournesol transformées présentant une résistance ou une tolérance améliorée à Sclerotinia, il est possible de transformer du tournesol avec le vecteur sens (pkplOl.lpBIN) ce qui permet d'intégrer dans le génome desdites plantes le gène PK-P. Des plantes de tournesol T0, Tl, T2 ont été obtenues avec deux construits antisens différents afin d'analyser l'effet de ce gène PK-P et le phénotype des plantes après extinction de l'expression du gène PK-P.
Etude de l'expression du gène PK-P endogène
A partir de la lignée témoin non transformée NSU, plusieurs paires d'amorces ont été définies afin de pouvoir amplifier spécifiquement le gène endogène dans les plantes transformées. Les amorces 3end-pkp6f et ASpkp2f sont spécifiques du gène endogène. Leurs séquences respectives sont :
3end-pkp6f (SEQ ID NO: 17): TTGTTGGAAGTGGTGTGTGGA
ASpkp2f (SEQ ID NO : 18): CCTGCTCGACGGCTCATCATTA Les deux couples d'amorces 3end-pkp5f/ 3end-pkp5r et 3end- pkp7f/3end-pkp7r permettent d'amplifier à la fois le gène PK-P endogène et le transgène
(PK-P -Antisens). Les séquences respectives des amorces sont :
3end-pkp5f (SEQ ID NO : 19): TAATGATGAGCCGTCGAGCAG
3end-pkp5r (SEQ ID NO :20): GCCGATCAATCTCCATCACAA
3end-ρkp7f (SEQ ID NO :21): CCGGAGGAGCTCATTTTGGTT 3end-pkp7r (SEQ ID NO :22): GCTCGACGGCTCATCATTAGA Les analyses en RT-PCR avec les amorces 3end-pkp7f73end-pkp7r chez les plantes témoins négatives T2 issues de la ségrégation des transformants primaires T0 et conespondant à des autofécondations de plantes Tl ayant ségrégé le gène introduit, indiquent que le gène endogène PK-P s'exprime suite à l'infection par Sclerotinia. Analyse de résistance au Sclerotinia des plantes de tournesol transformées avec les vecteurs antisens. La transformation antisens des plantes de tournesol augmente la sensibilité du tournesol lors de l'infection à Sclerotinia. Les tests de résistance à l'infection par Sclerotinia sont réalisés sur plantes entières après inoculation avec la souche 55 de Sclerotinia sclerotiorum selon le protocole suivant : Les plantes sont inoculées par Sclerotinia sclerotiorum (souche 55) en déposant un morceau de gélose portant du mycélium en croissance sur l'extémité d'un limbe d'une feuille dont l'insertion est située au milieu de la tige principale. Les notations s'effectuent en cinétique: 3j, 5j, 7j, lOj, 12j, 14j et 17 j après infection. Parallèlement à l'infection des plantes transgéniques, des témoins négatifs conespondant à des plantes négatives issues de la ségrégation du transgène sont également infectés. Les symptômes, c'est-à-dire la taille des nécroses, sont mesurées sur feuilles de plantes entières après inoculation avec la souche 55 de Sclerotinia sclerotiorum. Les plantes de tournesol testées sont des plantes T2, toutes issues de la plante 1023. Les analyses de résistance sur des plantes adultes cultivées en serre confirment l'augmentation de la sensibilité des plantes transformées vis-à-vis des plantes témoins. La figure 5 décrit l'évolution de la taille des nécroses (taille en centimètres), en moyenne, pour les plantes de tournesol transformées (T+, représentées par les losanges et la ligne en trait plein) et pour les plantes témoins (T-, représentées par les canes et la ligne en traits intereompus) en fonction du nombre de jours après inoculation (3j, 5j, 7j, lOj, 12j, 14j et 17 j). Les mesures de nécrose sont effectuées sur feuille selon le protocole décrit ci-dessus. Les plantes transformées montrent une nécrose plus rapide et plus grande que les plantes témoins. La différence entre la moyenne de la croissance des nécroses chez les plantes transformées et celle des plantes témoins est significative au cours du temps: le seuil varie de 0,1% à 1%.
EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION ET TRANSFORMATION DU COLZA
Obtention de l'orthologue du gène PK-P de tournesol chez le colza, et analyse des séquences Une analyse par blast (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-
3402, 1997) de la séquence PK-P du tournesol contre les séquences du génome d'Arabidopsis thaliana ont pemiis d'identifier le gène At-LecRKl . Le gène lecRKl comprend comme le gène PK-P un domaine lectine et un domaine kinase. Des amorces dessinées sur la partie codante du gène At-lecRKl d'Arabidopsis thaliana ont permis d'amplifier, à partir d'ADN de colza, un produit dont la taille est environ 850 pb. Les amorces utilisées pour l'amplification de l'orthologue sont respectivement nommées O210 (forward) et 0211 (reverse) et ont les séquences suivantes :
0210 LecRK/for (SEQ ID NO : 25) 5'-GTTTGGAGATATTGATGATAATC-3'
0211 LecRK/rev (SEQ ID NO : 26) 5'-TCTTCCATTAGGCATAGTCATA-3' Le produit d'amplification (environ 850 pb) a été clone dans le vecteur pkplOl.l-BluntlI-Topo (Invitrogen) puis séquence. La séquence ainsi obtenue conespond à la SEQ ID N°23, dénommée aussi BnLecRK(RV27) est représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N° 23. Elle conespond à l'orthologue incomplet en 5' et 3' chez le colza de la séquence PK-P de tournesol (SEQ ID N°l). L'alignement de la région de la séquence BnLecRK(RV27) destinée à être clonée avec la région conespondante de la séquence PK-P tournesol est réalisé selon Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453. Le pourcentage d'identité entre ces deux séquences est de 54,7%. Afin de faciliter le clonage ultérieur dans le vecteur binaire utilisé pour la transformation du colza, les sites Notl et BamHI sont ajoutés à la séquence obtenue par mutagénèse PCR.
Construction du vecteur RNAi : La séquence BnLecRK(RV27) a été introduite dans un vecteur binaire RNAi comparable au vecteur PK-PlOl.lpBIN utilisé pour la transformation du tournesol.
Le T-DNA du vecteur binaire comprend la cassette d'expression suivante :
Bordure droite
ProAtNOS (Bevan,M., et al.(1983), Nucleic Acids Res., 11(2) : 369-385)
EcNPTII (Bevan,M., et al.(1983), Nucleic Acids Res., 11(2) : 369-385) terAtNOS (Depicker A, et al. (1982) Mol. Appl. Genêt.1 : 561-573) proVir35S (Franck,A., et al. (1980) DNA Cell 21 (1), 285-294)
BnLecRK(RV27) en orientation sens intHaGUbB2 (Binet,M.N.,et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17 (3), 395-407)
BnLecRK(RV27 en orientation antisens TerAtNos (Bevan,M., et al.(1983), Nucleic Acids Res., 11(2) : 369-385)
Transformation du colza : Les jeunes plantes de colza de la variété RV 27 ont été transformées par la méthode de transformation par Agrobacterium comme décrite dans Moloney et al. (Plant Cell Reports 8 :238-242, 1989) en utilisant la souche d Agrobacterium tumefaciens C58PMP90 contenant le plasmide PK-PlOl.lpBIN tel que décrit ci-dessus. Les plantules transformées sont régénérées dans un milieu de régénération MS (Murashige and Skoog) contenant 15 μg/ml de kanamycine. Seules celles contenant le gène Nptll (Bevan et al., 1983, déjà cité) survivent de part leur résistance à la kanamycine conférée par le gène Nptll. Un Southern est ensuite effectué pour confirmer la présence du gène
Nptll. Un contrôle de la présence du gène de résistance PK-P a ensuite été effectué en utilisant la technique de Southern. Ce contrôle permet aussi d'identifier le nombre de copies du gène qui ont été insérées. Une fois la présence des deux gènes confirmée, les plantes transgéniques sont ensuite transférées en sene et isolées pour éviter tout risque de pollinisation croisée.
Analyse de résistance au Sclerotinia des plantes de colza transformées avec les vecteurs antisens. Les plantules de colza RV27 de 28 jours (transfomiées par RNai ou non
(plantes témoins)) sont inoculées artificiellement sur la 2ème feuille par une culture de mycélium {Sclerotinia sclerotinium) âgée de 3 jours. La résistance des plantules est analysée en estimant le niveau de nécrose sur le limbe des feuilles à partir du 2ème jour après inoculation (LecJ2) puis le troisième jour (LecJ3), le quatrième (LecJ4) et le 6ème (LecJ6). Comme chez le tournesol, les analyses de résistance sur les plantules de colza confirment l'augmentation de la sensibilité des plantes transformées vis-à-vis des plantes témoins. La figure 6 décrit l'évolution de la taille des nécroses (taille en centimètres), pour une plantule de colza transfomiée (Col 819) et pour les plantes témoins (Col 795) en fonction du nombre de jours après inoculation (2j (LecJ2), 3j (LecJ3), 4j (LecJ4) et 6j (LecJ6)). Les mesures de nécrose sont effectuées sur feuille selon le protocole décrit ci-dessus. Les plantules transformées montrent une nécrose plus rapide et plus grande que les plantes témoins. La différence entre la moyenne de la croissance des nécroses chez les plantes transformées et celle des plantes témoins est significative au cours du temps : le seuil varie de 1 % à 2%.

Claims

REVENDICATIONS I) Polypeptide isolé, dénommé PK-P, intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il présente au moins 40% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2. 2) Polypeptide selon la revendication 1, choisi parmi le polypeptide défini par la séquence SEQ ID NO:2 et un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO:24. 3) Polynucleotide isolé choisi parmi : a) un polynucleotide codant pour un polypeptide selon une quelconque des revendications 1 ou 2; b) un polynucleotide complémentaire du polynucleotide a) ; c) un polynucleotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucleotide a) ; ou le polynucleotide b). 4) Polynucleotide selon la revendication 3, défini par la séquence SEQ ID NO: 1. 5) Polynucleotide selon la revendication 3, comprenant la séquence SEQ ID NO:23. 6) Polynucleotide isolé codant pour un polypeptide selon une quelconque des revendications 1 ou 2, susceptible d'être obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc d'une plante à l'aide d'au moins une sonde d'acide nucléique et/ou d'au moins un couple d'amorces d'amplification obtenus à partir d'un polynucleotide selon une quelconque des revendications 3 à 5. 7) Cassette d'expression recombinante comprenant un polynucleotide selon une quelconque des revendications 3 à 6, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 8) Vecteur recombinant comprenant un polynucleotide selon une quelconque des revendications 3 à 6. 9) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 8. 10) Cellule hôte génétiquement transformée par un polynucleotide selon une quelconque des revendications 3 à 6. I I) Utilisation d'au moins un polynucleotide selon une quelconque des revendications 3 à 6 pour détecter la forme allélique du gène PK-P présente chez une plante. 12) Procédé pour augmenter la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucleotide codant pour un polypeptide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 13) Plante transgénique susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 12. 14) Plante transgénique transformée par une cassette d'expression selon la revendication 7. 15) Plante transgénique selon une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi le tournesol et le colza. 16) Procédé d'évaluation du niveau de résistance d'une plante à
Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante. 17) Procédé de sélection d'une plante résistante à Sclerotinia comprenant la détection chez ladite plante d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia.
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