WO2004048565A1 - アポトーシス関連蛋白質およびその用途 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a functional fragment of a protein that binds to and activates ASK1, and various uses of the protein and the fragment, in particular, pharmaceutical uses.
  • Apoptosis plays a role in the removal of unnecessary and abnormal cells during development, homeostasis, and a host defense reaction to remove injured cells, and the mechanism at the molecular level is gradually increasing. It is becoming clear. Abnormality of these molecules and disruption of the control mechanism impair the physiological function of apoptosis, and may cause various diseases and exacerbate them. For example, if apoptosis is excessively suppressed, the cells that should be removed will proliferate abnormally and induce neoplastic diseases and autoimmune diseases, etc. Conversely, if apoptosis is abnormally enhanced, the cells that are essentially required It can lead to death and neurodegenerative diseases.
  • Mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade is a MAP kinase kinase that is activated by physiochemical stress and inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-T (TNF- ⁇ ) and inulin-leukin_1 (IL-1).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor-T
  • IL-1 inulin-leukin_1
  • MAKKK MAP kinase
  • MAPKK MAP kinase
  • apoptosis Indicates a phenotype such as C-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 MAP kinase (p38) are known as MAPKs that are part of the signaling pathway that induces apoptosis (for example, Science, 270, 1326 (1995) See). Furthermore, it is involved in inducing the inflammatory response by inducing the production of inflammatory site force-in.
  • JNK and p38 are derived from MAPKK MKK4 / 7 and MKK3Z6 Are activated respectively. These MAP KKs are activated by one MAP KKK called Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK 1) (JP 10-93A, Science, 275, 90-94 (1997)).
  • ASK1 Apoptosis signal-regulating kinase 1
  • MAPKKK has been reported in large numbers in addition to ASK1, ASK1 is characterized by its ability to induce apoptosis in cells through signaling through activation of JNK and Z or p38.
  • ASK 1 activation is involved in cell differentiation such as keratinocyte differentiation and neurite outgrowth of PC12 cells. It is becoming clear that it is playing a role. Furthermore, it has become clear that induction of the production of inflammatory cytokines is involved in inducing an inflammatory response.
  • ASK 1 is an important molecule that determines the future fate of cells, it is thought that various factors are involved in its activation and that it is under complex control. So far, it has been reported that activation of ASK 1 requires the formation of homo-oligomers between ASK 1 and subsequent phosphorylation of threonine in the activation loop. Although mainly due to autophosphorylation by ASK1, the existence of another kinase has also been suggested (Journal of Cellular Physiology, 191, 95-104 (2002)).
  • rotein phosphatase 5 (PP 5) is bonded directly to AS K 1 under H 2 0 2 stimulation, AS K 1 which is activated by dephosphorylation threonine believed to revert to the inactive state Yes (BO Journal, 20, 6028-6036 (2001)).
  • thioredoxin a redox regulator, constantly binds to the N-terminal domain of ASK 1 and acts as an ASK 1 activation inhibitor in the absence of oxidative stress.
  • ASK 1 activation (EMBO Journal, 17, 2596-2606 (1998)), and TNF receptor-associated activation of ASK 1 causes TNF receptor-associated factor 2 (T RAF 2 ) Binds to the C-terminal domain of ASK 1 to activate ASK 1 (Molecular Cell, 2, 389-395 (1998)); 14-3-3 proteins bind to the C-terminal domain Inhibits ASK 1 activation (Proceedings of National Academy of Sciencies, USA, 96, 8511-8515 (1999)).
  • ASK1 is closely related to ER stress-induced apoptosis because treatment of ASK1 knockout mouse cells with ER stress inducers significantly suppresses apoptosis compared to wild-type mouse cells. Therefore, ASK1 inhibitors such as thioredoxin and 14-3-3 protein, ASK1 dominant negative mutants, and ASK1 antisense oligonucleotides described above are neurodegenerative diseases (eg, polyglutamine). Disease has been suggested to be effective in the prevention and treatment of endoplasmic reticulum stress-related diseases (W002 / 38179).
  • an object of the present invention is to provide novel knowledge on the activation mechanism of ASK1 and the mechanism of induction of apoptosis-induced Z inflammatory response through it. That is, a first object of the present invention is to identify a novel ASK1 binding protein which has not been known so far and to clarify the mechanism of ASK1 activation control by the protein. Another object of the present invention is to provide a novel preventive and therapeutic means for various diseases involving ASK1, based on the interaction between the protein and ASK1. Disclosure of the invention
  • the present inventors considered that human ASK1 full-length cDNA was used as bait, and an expression library derived from human fetal brain was screened by yeast two-hybrid method.
  • an expression library derived from human fetal brain was screened by yeast two-hybrid method.
  • PGR1 an expression library derived from human fetal brain was screened by yeast two-hybrid method.
  • ABP 1 an ASK1-binding protein.
  • the present inventors have found that the protein not only binds to ASK1, but also activates ASK1 and its downstream JNK and p38, and induces caspase-dependent apoptosis. .
  • the present inventors have conducted further studies based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a peptide or a salt thereof which contains the same or substantially the same amino acid sequence as a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and is capable of activating ASK 1;
  • a method for producing a peptide or a salt thereof which comprises culturing the transformant according to the above [7] and collecting the peptide or a salt thereof according to the above [1] from the obtained culture.
  • [9] contains an amino acid sequence identical or substantially identical to a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and does not activate ASK 1; Or a peptide or a salt thereof which can be inactivated,
  • ASK 1 comprising a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, the peptide according to the above [1], or a salt thereof.
  • Activation accelerator
  • a medicine comprising the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the peptide according to the above [1], or a salt thereof,
  • the disease is selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, viral infection, endocrine disease, blood disease, organ hyperplasia, restenosis after angioplasty, and recurrence after cancer resection
  • the disease is selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, viral infection, endocrine disease, blood disease, organ hyperplasia, restenosis after angioplasty, and recurrence after cancer resection
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polypeptide containing the nucleotide sequence encoding the peptide described in [1] above ASK 1 activation promoter comprising nucleotides,
  • the disease is selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, viral infection, endocrine disease, blood disease, organ hyperplasia, restenosis after angioplasty, and recurrence after cancer resection [20]
  • An appointment comprising a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a part thereof Diagnostics for diseases associated with cis or inflammation,
  • Diseases include cancer, autoimmune disease, viral infection, endocrine disease, blood disease, organ dysplasia, restenosis after angioplasty, recurrence after cancer resection, transplant rejection, graft-versus-host disease, Immune deficiency, neurodegenerative disease, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet light disorder, toxic disease, nutritional disorder, inflammatory disease, ischemic neuropathy, diabetic neuropathy, vascular disease, respiratory disease and cartilage disease
  • [24] contains a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a part thereof
  • An ASK 1 activation inhibitor comprising a polynucleotide
  • a drug comprising a nucleotide
  • Diseases include viral infections, endocrine diseases, blood diseases, organ dysplasia, transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative diseases, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet damage, medium Selected from the group consisting of toxic diseases, nutritional disorders, inflammatory diseases, ischemic neuropathies, diabetic neuropathies, vascular diseases, respiratory diseases and cartilage diseases.
  • amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 characterized by being capable of specifically recognizing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6
  • a diagnostic agent for an apoptosis or inflammation-related disease comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a salt thereof,
  • the disease is cancer, autoimmune disease, viral infection, endocrine disease, blood disease, organ dysplasia, restenosis after angioplasty, recurrence after cancer resection, transplant rejection, graft-versus-host disease , Immunodeficiency, neurodegenerative disease, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet light disorder, toxic disease, nutritional disorder, inflammatory disease, ischemic neuropathy, diabetic neuropathy, vascular disease, respiratory disease and cartilage
  • the diagnostic agent of the above-mentioned [30] which is selected from the group consisting of diseases;
  • an ASK1 activation inhibitor comprising an antibody against a protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
  • a medicament comprising an antibody against a protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
  • Diseases include viral infection, endocrine disease, blood disease, organ dysplasia, transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet light damage, medium Selected from the group consisting of toxic diseases, nutritional disorders, inflammatory diseases, ischemic neuropathies, diabetic neuropathies, vascular diseases, respiratory diseases and cartilage diseases
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or the peptide or the salt thereof according to the above [1], and ASK 1 or N-terminal The method according to the above-mentioned [38], wherein binding to a partial peptide containing an activation control domain or a salt thereof is measured.
  • a kit for screening for an ASK 1 activation modulator comprising:
  • kit according to [40] further comprising a partial peptide thereof containing ASK 1 or an N-terminal activation control domain, a salt thereof, or a cell producing the same.
  • Activation of ASK1 or the partial peptide or a salt thereof in a cell producing ASK1 or a partial peptide thereof containing an N-terminal activation control domain and a kinase domain or a salt thereof is performed by: (1) SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: (2) SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the presence of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in 4, or the peptide of the above [1] or a salt thereof.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing the same, or SEQ ID NO: 2 or
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a polynucleotide containing a part thereof, or SEQ ID NO: 2 Or a screening kit for an ASK1 activation regulating substance, comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a salt thereof,
  • the disease is selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, viral infection, endocrine disease, blood disease, organ hyperplasia, restenosis after angioplasty, and recurrence after cancer resection [49] The medicine described.
  • an apoptotic or inflammatory cytokine comprising a substance having the same or substantially the same amino acid sequence as the SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a substance that reduces the expression or activity of a salt thereof Production inhibitor,
  • a medicament comprising a substance that decreases the expression or activity of a protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
  • Diseases include viral infection, endocrine disease, blood disease, organ dysplasia, transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet light damage, medium
  • the drug according to the above [53] which is selected from the group consisting of a toxic disease, a nutritional disorder, an inflammatory disease, an ischemic neuropathy, a diabetic neuropathy, a vascular disease, a respiratory disease, and a cartilage disease.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 comprising the ASK 1 partial peptide or a salt thereof, which contains the N-terminal activation control domain of ASK 1 and does not contain the kinase domain.
  • a pharmaceutical comprising an ASK 1 partial peptide or a salt thereof that does not contain
  • Diseases include viral infection, endocrine disease, blood disease, organ dysplasia, transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet light damage, medium 41.
  • the medicament according to claim 40 which is selected from the group consisting of a toxic disease, a nutritional disorder, an inflammatory disease, an ischemic neuropathy, a diabetic neuropathy, a vascular disease, a respiratory disease, and a cartilage disease.
  • An ASK1 activation inhibitor comprising the peptide of the above-mentioned [9] or a salt thereof,
  • a medicament comprising the peptide of the above-mentioned [9] or a salt thereof,
  • Diseases include viral infection, endocrine disease, blood disease, organ dysplasia, transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease, ischemic heart disease, radiation damage, ultraviolet light damage, medium
  • the present invention provides the medicament of the above-mentioned [63], which is selected from the group consisting of toxic diseases, nutritional disorders, inflammatory diseases, ischemic neuropathies, diabetic neuropathies, vascular diseases, respiratory diseases and cartilage diseases.
  • FIG. 1 shows the alignment of the human (top row) and mouse (bottom row) ABP 1 amino acid sequences.
  • the portion surrounded by a square indicates the partial amino acid sequence used as an antigen for producing an antibody.
  • the boxes show the partial sequences used as antigenic peptides for the production of the two antibodies of the present invention (the eight antibodies! ⁇ ⁇ 1 antibody).
  • FIG. 2A shows the tissue distribution of ABP 1 mRNA expression in mouse tissues.
  • FIG. 2B shows the daily change of ABP1 mRNA expression in mouse fetal tissues.
  • FIG. 3 shows the amount of plasmid-dependent increase in detection intensity when the ABP1 protein is overexpressed by transfecting HEK293 cells with a plasmid expressing untagged ABP1.
  • Cells were collected 24 hours after gene transfer, each cell extract was divided into two, SDS-PAGE was performed, and Imno plot (IB) was performed using the ELA antibody and the LVR antibody.
  • ABPl_pcDNA3 (-) indicates non-transformed HEK293 cells, and the gradient indicates that the amount of plasmid increases from left to right.
  • FIGS. 4A-B show the results of a binding test between ABP1 and ASK1.
  • Figure 4A Transfection of F1ag-ABP1 and Myc-ASK1 plasmids into HEK293 cells, harvested cells 24 hours later, immunoprecipitated with anti-F1ag antibody, Blot analysis was performed.
  • Fig. 4B Transfection of F1ag-ASK1 and CFP-ABP1 plasmids into HEK293 cells, harvested cells 24 hours later, immunoprecipitation with anti-Flag antibody, and immunoblot analysis with anti-GFP antibody was.
  • CFP is a mutant of GFP and can be recognized by an anti-GFP antibody.
  • FIG. 4A the right two lanes with B, H 2 0 2 treatment (0. 5 mM, 1 hour) was also performed.
  • the lower part shows a part of each cell lysate before immunoprecipitation, which was separately electrophoresed.
  • IP stands for immunoprecipitation
  • IB stands for immunoblot.
  • FIG. 5A shows a schematic diagram of the ASK1-deficient mutant.
  • An HA tag was added to the N-terminal of each plasmid containing the ASK1-deficient mutant.
  • Amino acid numbers 678-936 (shaded area) indicate a kinase domain.
  • FIG. 5B shows the results of a binding test between ABP1 and an ASK1-deficient mutant. The lower panel shows a portion of each cell lysate before immunoprecipitation, which was separately electrophoresed. IP represents immunoprecipitation, and IB represents immunoblot.
  • FIGS. 6A-B show cell death induction by ABP1 in HeLa cells.
  • Figure 6A Fluorescence microscope image (upper) and differential interference image (lower) of the same field of view 36 hours after transfection of CFP or CFP-ABP1 plasmid into HeLa cells.
  • Figure 6B Percentage of cell death (%) 36 hours after gene transfer.
  • FIG. 7A-B show ABP1-induced cell death in PAE-ABP1 cells.
  • Figure 7 A PAE-ABP1 cells in the presence (+) and absence (-) of tetracycline (Tet) Shows a phase-contrast microscope image 36 hours after culturing.
  • FIG. 7B Percentage of cell death (%) after culture in the presence of tetracycline (O h) and at 24 and 48 hours after tetracycline removal.
  • FIG. 8 shows ABP1-induced cell death (DNA fragmentation) in PAE-ABP1 cells.
  • DNA fragmentation DNA fragmentation
  • FIGS. 9A-B show the caspase dependence of cell death by ABP1.
  • Figure 9A PAE-ABP1 cells were cultured without tetracycline and caspase-3 activity was measured after 0, 12, 24, and 36 hours.
  • FIGS. 10A-B show cell death induction by ABP1-deficient mutants.
  • FIG. 10A shows a schematic diagram of an ABP1-deficient mutant. A CFP evening was added to the N-terminal side in the same manner as in the wild type.
  • Figure 10B The percentage (%) of cell death 36 hours after gene transfer in cells into which ABP1-deficient mutants have been introduced.
  • Figures 11A-B show the activation of 31 ⁇ 1, JNK :, p38 according to 88-1.
  • Fig. 11 A ⁇ _ ⁇ cells were cultured after removing tetracycline, and endogenous JNK and ⁇ 38 were activated by immunoblot analysis using each anti-phosphorylation protein antibody.
  • Fig. 11B PAE-ABP1 cells were cultured without tetracycline, and the activation of endogenous ASK1 was examined by immunoblot analysis using an anti-phosphorylation protein antibody. IB stands for immunoblot.
  • ABSP 1 of the present invention is a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the ABP 1 of the present invention can be prepared from warm-blooded animals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, puppies, higgs, goats, bushes, puppies, puppies, birds, cats, dogs, sal, chimpanzees).
  • warm-blooded animals eg, humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, puppies, higgs, goats, bushes, puppies, puppies, birds, cats, dogs, sal, chimpanzees.
  • Cells e.g., hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, splenic iS cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, Fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (e.g., macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes) , Megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells) Or any tissue where these cells are present, such as the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypo
  • substantially identical amino acid sequence to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, about 70% or more, preferably about 70% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Amino acid sequences having a homology of 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more.
  • proteins containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 include, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 described above. Containing substantially the same amino acid sequence as that of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; Proteins having activity are preferred.
  • substantially the same activity examples include, for example, ASK1 or a group of kinases located downstream thereof (eg, MKK4 / 7, MKK3 / 6, JNK, p38, etc.), the activity promoting activity, and the induction of cell apoptosis. Activity and the like. Substantially the same means that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Therefore, it is preferable that the activities such as promotion of ASK1 cascade activation are the same, but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different (for example, About 0.1 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, and more preferably 0.5 to 2 times).
  • the ASK 1 cascade activation promoting activity can be measured by a known method, for example, using a labeled phosphate group donor to ASK 1 or a kinase group located downstream thereof (eg, MKK4 / 7, MKK3 / 6, JM, p38, etc.), and apoptosis-inducing activity should be measured by measuring cell death induction rate, morphological observation of cells, detection of DNA fragmentation, etc. Can be.
  • a labeled phosphate group donor to ASK 1 or a kinase group located downstream thereof eg, MKK4 / 7, MKK3 / 6, JM, p38, etc.
  • apoptosis-inducing activity should be measured by measuring cell death induction rate, morphological observation of cells, detection of DNA fragmentation, etc. Can be.
  • ABP 1 of the present invention includes, for example, 1) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 1) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; An amino acid sequence in which about 0, more preferably a number (1 to 5) amino acids have been deleted; (2) one or two or more amino acids (preferably An amino acid sequence having about 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably a number of (1 to 5) amino acids; 3 1 or 2 amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence into which at least (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) amino acids have been inserted, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 1 or 2 or more of the amino acid sequences shown in More preferably, an amino acid sequence in which about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably a number (1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid, or
  • ABP 1 of the present invention is preferably human ABP 1 (ABP 1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or mouse ABP 1 (mABP 1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, Or its homologue in other warm-blooded animals (eg, rats, guinea pigs, hamsters, egrets, higgins, goats, bush, eel, poma, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • ABSP 1 human ABP 1
  • mABP 1 mouse ABP 1
  • hABPl is a protein consisting of 127 amino acids that is encoded by a known gene (GenBank accession number: AF116272) derived from a human T cell designated as PGR1, but its function has not been reported so far.
  • Mouse ABP1 is a 125 amino acid protein that is encoded in mouse brain-derived cDNA (GenBank accession number: AB041651) named clone MNCb-1039, but also reports on its function. There is no.
  • ABP 1 of the present invention including a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, has a C-terminal lipoxyl group (one CO ⁇ H), carboxylate (one CO O one) , Amide (—CONH 2 ) or ester (_CO ⁇ R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl, alkyl groups such as n- butyl; for example, cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl; e.g., phenyl, Facial C 6 _ 12 ⁇ Li Ichiru groups, such as single naphth le; for example, benzyl, phenylene root ⁇ preparative 2 alkyl group such as phenethyl; «- 7 _ such as ⁇ - Nafuchiru ( ⁇ _ 2 alkyl group such as naphthylmethyl 14 aralkyl group; pivaloxyloxymethyl group and the like are used.
  • ABP 1 has a carbonyl group (or carboxylate) other than at the C-terminus
  • ABP 1 in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in ABP 1 of the present invention.
  • the ester for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino groups protecting group eg, C WINCH such formyl group, such as Asechiru group ( ⁇ _ 6 Al force Noiru 6- Glycyl group)
  • N-terminal glutamine residue formed by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation
  • Substituent on the side chain of amino acid in the molecule eg, one SH, amino group, imidazo Ichiru group, I command Ichiru group, Guanijino group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, such as C E one 6 Ashiru groups such as 6 Arukanoiru groups such Asechi Le group
  • complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • the present invention provides a peptide having the partial amino acid sequence of ABP1 described above, and having substantially the same activity as ABP1.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide is hereinafter referred to as “activating peptide of the present invention”.
  • the activating peptide of the present invention is not particularly limited as long as it has the above properties.
  • the activating peptide of the present invention has about 60 amino acids or more, preferably about 60 to about 1 Peptides having the same or substantially the same amino acid sequence as the partial amino acid sequence consisting of 100 amino acids, more preferably about 60 to about 80 amino acids, and the like.
  • the partial amino acid sequence may be an N-terminal sequence of ABP1, a C-terminal sequence, or an internal sequence. Alternatively, a combination of these partial sequences may be used.
  • the activating peptide of the present invention comprises at least about 60 amino acids on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, more preferably about 60 to about 100 amino acids, particularly It preferably contains a partial amino acid sequence of about 60 to about 80 amino acids.
  • the activating peptide of the present invention may show higher activity (eg, ASK1 cascade activation promoting activity, apoptosis inducing activity, etc.) than the full-length protein in some cases.
  • partial peptides of ABP 1 include those that can function as (antagonistic) inhibitors of ABP 1 or the “activating peptide of the present invention”. Examples of such partial peptides include those which have binding activity to ASK1 but cannot activate the kinase. In the present specification, the partial peptide is hereinafter referred to as “the inhibitory peptide of the present invention”.
  • the inhibitory peptide of the present invention contains the same or substantially the same amino acid sequence as a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and does not activate or inhibit ASK1. It is a peptide that can be activated.
  • the inhibitory peptide include those containing a partial amino acid sequence consisting of about 35 amino acids or less in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and preferably containing a partial amino acid sequence on the N-terminal side.
  • the partial peptide of ABP1 of the present invention (including both the activating peptide of the present invention and the inhibitory peptide of the present invention; hereinafter may be simply abbreviated as “partial peptide of the present invention”) is a C-terminal. May be any of a carbonyl group (—COOH), a carboxylate (one COO—), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
  • R in the ester include the same as described above for ABP1.
  • these peptides have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carbonyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the partial peptides of the present invention include those in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and those in which the N-terminal side is cleaved in vivo to form G 1 Also includes those in which n is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, and those which are combined with a sugar chain such as a so-called glycopeptide. It is.
  • Examples of the salt of ABP1 or a partial peptide thereof of the present invention include physiologically acceptable salts with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, bromide water) Salts with organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzene) And sulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, bromide water
  • Salts with organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid
  • ABP1 or a salt thereof of the present invention can be prepared from a warm-blooded animal cell or tissue by the above-mentioned method for purifying a protein known per se. Specifically, the tissue or cells of a warm-blooded animal are homogenized, and the soluble fraction is separated and purified by chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. ABP1 or a salt thereof can be produced.
  • ABP1 of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting ABP 1 with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • condensation and the elimination of the protecting group are performed according to a method known per se, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the ABPs 1 thus obtained can be isolated and purified by a known purification method.
  • purification methods include, for example, solvent extraction, distillation, and column chromatography. Chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the protein (peptide) is converted into a salt.
  • the salt can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • commercially available resins for protein synthesis can be used for the synthesis of the ABP1s of the present invention.
  • Such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 41 Hydroxymethyl methylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,4, dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (24'dimethoxyphenyl Fmocaminoethyl) phenoxy resin, etc.
  • a resin an amino acid having an amino group and a side chain functional group appropriately protected can be converted into a target protein or peptide (hereinafter sometimes collectively referred to as “protein etc.”) by itself.
  • the resin is condensed on the resin according to various known condensation methods. At the end of the reaction, proteins and the like are cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or the like or an amide thereof.
  • the protected amino acids described above various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • carbopimides DCC, N, N, diisopropyl carbopimide, N-ethyl-N,-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like are used.
  • the protected amino acids may be added directly to the resin along with the racemization inhibitor additives (eg, H tBt, HOOBt), or symmetric anhydrides or HOBt esters or HOOBt esters. Can be added to the resin after the protected amino acid is activated in advance.
  • Solvents used to activate protected amino acids and condense with resins are used in protein condensation reactions. It can be appropriately selected from solvents known to be usable.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or esters thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 to 5 as appropriate.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, Yuichi Sharipentyloxycarbonyl, Isoporiloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br-Z, a Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl ester , Ben It can be protected by ziroxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • an alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopent
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarponyl group, and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - Bz l, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as data one tert-butyl is used.
  • the protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • the acid treatment for example, anisol, phenol, thioanisole, methacrylol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-1 It is effective to add a thione scavenger such as ethanedithiol, etc.
  • a thione scavenger such as ethanedithiol, etc.
  • the imidazole protecting group of histidine and The 2,4-dinitrophenyl group used in the reaction is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is an acid in the presence of the above-mentioned 1,2-ethanedithiol and 1,4-butanedithiol.
  • the activated carbonyl group of the raw material include, for example, the corresponding acid anhydride, azide, and active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenolimide, and esters with H ⁇ Bt).
  • alcohol eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenolimide, and esters with H ⁇ Bt.
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • an amide form of a protein or the like for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal, a peptide (protein) chain is added to the amino group side with a desired chain length. After that, a protein or the like from which only the protecting group of the amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a protein or the like from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus was removed were prepared.
  • the protein and the like are condensed in the above-mentioned mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or the like is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide such as a desired protein.
  • an ester such as a protein
  • the desired protein or the like can be obtained in the same manner as an amide such as a protein.
  • An ester form can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can also be produced by cleaving the peptide 1 or a salt thereof with an appropriate peptidase.
  • ABPs 1 of the present invention can be obtained by culturing a transformant containing DNA encoding ⁇ 1 or a partial peptide thereof, and isolating and purifying ⁇ ⁇ 1 from the resulting culture. It can also be manufactured.
  • Examples of the DNA encoding ABP 1 or a partial peptide thereof of the present invention include genomic DNA, genomic DNA library, human or other warm-blooded animals (for example, human, mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, sheep) , Goat, bush, Poma, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc., all cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, england
  • RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as "RT-PCR"). .
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding ABP 1 of the present invention include a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a high string An activity that is substantially the same as a protein that contains a nucleotide sequence that hybridizes under gentle conditions and that contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 (eg, ASK1 cascade activation promoting activity) , Apoptosis-inducing activity, etc.).
  • the DNA eg, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID Has a homology of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, and most preferably about 90% or more with the nucleotide sequence shown in No. 3
  • a DNA containing a base sequence or the like is used.
  • Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). And so on. When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be performed preferably under high stringent conditions. '
  • High stringency conditions refer to, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, it is preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65.
  • the DNA encoding ABP1 of the present invention is preferably a hABP1 DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a mABP1 DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, or other warm blood. And homologs thereof in animals (eg, rats, guinea pigs, hamsters, porcupines, sheep, goats, pigs, porcupines, pomas, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • animals eg, rats, guinea pigs, hamsters, porcupines, sheep, goats, pigs, porcupines, pomas, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes a base sequence encoding the same or substantially the same amino acid sequence as a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. If it is, any thing may be used. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, the mRNA can be directly amplified by RT-PCR using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above. Specifically, as the DNA encoding the partial peptide of the present invention, for example,
  • DNA encoding a peptide having an activity of inhibiting a protein containing an amino acid sequence encoded by the DNA is used. .
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, and preferably about 70% or more with the corresponding portion in the nucleotide sequence. More preferably, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having a homology of about 80% or more, most preferably about 90% or more is used.
  • the DNA encoding ABP1 of the present invention or a partial peptide thereof may be amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein or peptide, or may be appropriately expressed.
  • the DNA incorporated in the vector can be cloned by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the protein of the present invention or with a labeled synthetic DNA. it can. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (described above). When a commercially available library is used, hybridization can be carried out according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • the DNA base sequence can be determined using known kits, such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the like.
  • the conversion can be carried out according to a method known per se, such as the duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose, or after digestion with a restriction enzyme, if desired, or after adding a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation start codon and translation stop codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the DNA expression vector encoding ABP1 or a partial peptide thereof of the present invention can be obtained, for example, by cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding ABP1,
  • It can be produced by ligating a DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR
  • plasmid derived from Bacillus subtilis eg, pUBll0, TP5, pC194
  • plasmid derived from yeast eg, pSH19, pSHl
  • Bacteriophages such as ⁇ phage
  • Animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus
  • ZCMV ZCMV, pRcZRSV, pcDNAIZNeo, and the like are used.
  • Any promoter may be used as long as it is an appropriate promoter corresponding to the host used for gene expression.
  • SR promoter when the host is an animal cell, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, H
  • An SV-TK promoter or the like is used. Among them, CMV promoter, S
  • R promoter is preferred.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia;
  • re cA promoter Isseki one, AP L promoter one, lpp promoter, T7 flop Romo - evening - and the like are preferable. If the host is Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter First, pen P promoter is preferred.
  • PHO5 promoter When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferred.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired.
  • an enhancer e.g., a splicing signal
  • a polyA addition signal e.g., a polyA addition signal
  • a selection marker e.g., SV40 replication origin
  • SV40 ori SV40 replication origin
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1).
  • Amp ampicillin resistance gene
  • Ne of, G418 resistance neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an immediate A signal sequence, etc .; if the host is a bacillus, an a-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc .; If the host is yeast, MF signal sequence, SUC2 signal sequence, etc .; if the host is an animal cell, insulin 'signal sequence, human interferon. Signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. are used, respectively. .
  • the transformant containing "DNA encoding ABP 1 of the present invention or a partial peptide thereof" obtained as described above is transformed into a host with an expression vector containing the DNA according to a known method. It can be manufactured by doing.
  • the expression vectors include those described above.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus subtilis MI 114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry) 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NC YC2036 And Pichia pastoris K M71.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Esiigmena acrea and the like are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells include monkey cells C ⁇ S_7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dh fr gene-deficient chicks—zhamster cells CHO (hereinafter CH ⁇ (dh fr—) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloid cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, Proc. Transformation can be carried out according to the method described in 21 10 (1972) or Gene, 17, 107 (1982).
  • Bacillus spp. Can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) and the like.
  • Yeasts are described, for example, in Methods in Enzyniology, Vol. 194, 182—187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences, Ob. Transformation can be performed according to the method described in U.S.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978).
  • Insect cells and insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Animal cells can be transformed, for example, according to the method described in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). can do.
  • the transformant can be cultured according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferably used as the culture medium.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, etc. necessary for the growth of the transformant.
  • a carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • a nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn steep, liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Inorganic or organic substances such as potato extract; inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the H of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experimenin) Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972).
  • an agent such as, for example, 3; 3-indolylacrylic acid may be added to the medium to make the mouth motor work efficiently.
  • Culture of a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia is usually about 15 to 43, and is performed for about 3 to 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • Burkholder's minimal medium As a medium for culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Sciences] Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and 0.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8. Culture is usually about 2
  • the culture medium for culturing insect cells or insect transformants is, for example, Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature-(Nature), 195,788 (1962)). For example, those to which additives such as% P serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably between about 6.2 and 6.4. Culture is usually about 27, and is performed for about 3 to 5 days. Ventilation and stirring may be performed as necessary.
  • Examples of a medium for culturing a transformant in which the host is an animal cell include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical 'Associe (The Journal of the American Medical Association) Volume 199 , 519 (1967)], and 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)). Used.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours. Ventilation and stirring may be performed as necessary.
  • ABP1 of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced inside or outside the cells of the transformant.
  • the ABPs of the present invention can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasound, lysozyme and Z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by, for example, a method of obtaining a crude extract of a soluble protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • the isolation and purification of the ABPs 1 of the present invention contained in the soluble fraction thus obtained can be carried out according to a method known per se.
  • Such methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation; mainly using differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography; a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography; a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography.
  • the free form can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and when the ABP 1 is obtained as a salt, The salt can be converted into a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • ABP1s produced by the transformant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed before or after purification by the action of an appropriate protein modifying enzyme.
  • the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • the presence of the ABPs 1 of the present invention thus obtained can be confirmed by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the ABPs 1 of the present invention are characterized in that the RNA corresponding to the DNA encoding the above-mentioned ABP 1 or a partial peptide thereof is a type II, and that a heron reticulocyte lysate, a wheat germ lysate, and an Escherichia coli lysate are used.
  • DNA encoding ABP1 or a partial peptide thereof can also be synthesized as type III using a cell-free transcription Z translation system containing RNA polymerase.
  • an antibody against ABP 1 or a salt thereof of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize ABP 1 or a salt thereof. Any of null antibodies may be used.
  • ABP 1 or its An antibody against a salt can be produced by using the ABP 1s of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the ABP1s of the present invention used as an antigen any of the above-mentioned ABP1s or partial peptides thereof or salts thereof may be used.
  • a monoclonal antibody or a polyclonal antibody against ABP1 or a salt thereof can be produced, for example, as follows.
  • the ABP 1s of the present invention are administered to a mammal at a site where antibody production is possible upon administration, together with itself or a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the mammal used includes, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mammal immunized with an antigen, such as a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization, and the antibody-producing cells contained therein are collected.
  • an antigen such as a mouse
  • myeloma cells of the same or different species a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells include mammalian myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is 1: 1 to 20: about 1, PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%, and 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes By performing the incorporation, cell fusion can be carried out efficiently.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas are prepared, for example, by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then labeling with an immunoglobulin labeled with a radioactive substance or an enzyme.
  • a solid phase eg, microplate
  • Antibodies (anti-mouse immunoglobulin antibodies are used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected; anti-immunoglobulin antibody or protein Screening is performed by adding the hybridoma culture supernatant to the solid phase to which A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, and detecting the monoclonal antibody bound to the solid phase. be able to.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • the selection of monoclonal antibodies can usually be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow. Examples of such a medium include RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, and GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the cultivation temperature is usually 20 to 40 ° (preferably about 37 ° C.)
  • the cultivation time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks.
  • the antibody titer of the culture supernatant of the eight hybridomas can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the monoclonal antibody thus obtained can be obtained by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis, ion exchanger, (Eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration And a specific purification method in which only the antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody.
  • an immunoglobulin separation and purification method eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis, ion exchanger, (Eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration
  • a specific purification method in which only the antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein
  • a polyclonal antibody against ABP1 or a salt thereof can be produced according to a method known per se.
  • a immunizing antigen (ABPs 1) itself or a complex thereof with a carrier-protein is prepared, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting the contents and separating and purifying the antibody.
  • other than mammals, chickens and the like can be used.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio between carrier and hapten are determined by the antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier. Any material may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently used.For example, serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc., in a weight ratio of about 0.1 to 2 per hapten per hapten. A method of force-pulling at a rate of 0, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents for example, an active ester reagent containing a glutaldehyde aldehyde, a maleimide active ester, a thiol group or a dithiopyridyl group are used.
  • the condensation product is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of polyclonal antibodies can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as for monoclonal antibodies described above. You.
  • a partial peptide of ABP1 When a partial peptide of ABP1 is used as an antigen, its position on ABP1 is not particularly limited, and examples include an oligopeptide having a partial amino acid sequence in a region well conserved among various warm-blooded animals. Specifically, a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 which is completely conserved between human and mouse is preferably exemplified.
  • antisense polynucleotide of the present invention examples include: It has a nucleotide sequence completely complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence encoding ABP1, and has an effect of inhibiting the translation of the protein from RNA encoding ABP1. What is necessary is just to have.
  • nucleotide sequence a nucleotide sequence encoding ABP1 or a partial peptide thereof and a nucleotide sequence capable of hybridizing under physiological conditions of a cell expressing the protein, more specifically About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 90% or more with respect to the overlapping portion with the complementary strand of the nucleotide sequence encoding ABP1 or a partial peptide thereof.
  • a nucleotide sequence having about 95% or more homology is exemplified.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be designed and synthesized based on cloned or determined nucleotide sequence information of the polynucleotide of the present invention. Such a polynucleotide can inhibit the replication or expression of the gene encoding ABP1. That is, the antisense polynucleotide of the present invention can hybridize with RNA transcribed from the gene encoding ABP1, and inhibits mRNA synthesis (processing) or function (translation into protein). Can be.
  • the length of the target region of the antisense polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as the translation of ABP1 is inhibited by the hybridization of the antisense polynucleotide, and the ABP1 encodes ABP1.
  • the entire or partial sequence of the RNA may be short, about 15 bases long, long And the entire sequence of mRNA or early transcript. Considering the ease of synthesis and the problem of antigenicity, oligonucleotides consisting of about 15 to about 30 bases are preferred, but not limited thereto.
  • the 5 'end hairpin loop of the gene encoding ABP 1, the 5' end 6—base pair 'repeat, the 5' end untranslated region, the polypeptide translation start codon, the protein coding region, the ORF translation start Codons, 3 'untranslated regions, 3' palindrome regions, and 3 'end hairpin loops can be selected as target regions, but any region within the gene can be selected as a target. For example, it is also preferable to use the intron portion of the gene as a target region.
  • the antisense polynucleotide of the present invention not only inhibits translation into protein by hybridizing with mRNA or early transcript encoding ABP1, but also encodes ABP1, a double-stranded DNA. It may bind to a gene to form a triplex, thereby inhibiting RNA transcription.
  • Antisense polynucleotides may be deoxyliponucleotides containing 2-dexoxy-D-report, liponucleotides containing D-report, N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or other types of nucleosides.
  • polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids or nucleic acid polymers specific to synthetic sequences
  • polymers containing special bonds can be found in DNA or RNA
  • Pairing of bases as found contains nucleotides with a configuration that allows base attachment
  • They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known.
  • intramolecular nucleotides Modified, eg, having uncharged bonds (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate, Such as proteins (nucleases, nucleases, etc.) Nucleic acid inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (for example, monosaccharides), etc.
  • uncharged bonds eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.
  • sulfur-containing bonds eg, phosphorothioate
  • proteins nucleases, nucleases, etc.
  • sugars for example, monosaccharides
  • nucleic acid may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those containing other modified heterocyclic bases. Such modifications can include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens or aliphatic groups, or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may be converted.
  • Antisense polynucleotides are RNA, DNA, or modified nucleic acids (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • Antisense polynucleotides may contain altered or modified sugars, bases, or linkages, and are provided in specialized forms such as ribosomes and microspheres. Can be given, applied by gene therapy, or given in an added form. Such additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance the interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol) can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or the 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • a liposome capable of specifically cleaving mRNA or gene early transcript encoding ABP 1 within the coding region is also included in the antisense polynucleotide of the present invention. May be included.
  • the term "lipozyme” refers to an RNA having an enzymatic activity for cleaving a nucleic acid, but recently, it has been revealed that oligo DNA having the nucleotide sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleaving activity. However, in the present specification, the term is used as a concept including DNA as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity.
  • the most versatile liposomes include self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroid and willoid, and hammerhead and hairpin types are known.
  • the hammerhead type exerts enzymatic activity at about 40 bases, and the bases at both ends (approximately 10 bases in total) adjacent to the hammerhead structure take the desired cleavage site of mRNA.
  • By using a complementary sequence it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of lipozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA, as it uses only RNA as substrate You.
  • the lipozyme is used in the form of an expression vector containing the DNA encoding the liposome, a hybrid in which the tRNA-modified sequence is further ligated to promote the transfer of the transcript to the cytoplasm It can also be a lipozyme [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • Double-stranded oligo RNA complementary to the mRNA encoding ABP 1 or a partial sequence in the coding region of the gene early transcript (including the intron part in the case of the early transcript) is also used. It can be included in the antisense polynucleotide of the present invention.
  • RNAi RNA interference
  • the antisense oligonucleotide and lipozyme of the present invention determine the target region of mRNA or early transcript based on the cDNA or genomic DNA sequence information encoding the protein of the present invention, and a commercially available DNAZRNA automatic synthesizer (Applied Biosystems, Beckman, etc.) to synthesize a sequence complementary thereto.
  • a DNAZRNA automatic synthesizer Applied Biosystems, Beckman, etc.
  • the sense strand and the antisense strand were synthesized using a DNA / RNA automatic synthesizer, respectively, and denatured in an appropriate annealing buffer, for example, at about 90 to about 95 ° C for about 1 minute. Thereafter, it can be prepared by annealing at about 30 to about 70 ° C for about 1 to about 8 hours.
  • a longer double-stranded polynucleotide can be prepared by synthesizing complementary oligonucleotide chains so as to alternately overlap each other, annealing them, and ligating them with a ligase.
  • ABP 1 or the activation peptide of the present invention binds and activates ASK 1 Therefore, induction of apoptosis via the ASK1 kinase cascade can be promoted. Therefore, (1) ABP1 or the activation peptide of the present invention, (2) a polynucleotide encoding ABP1 or the activation peptide of the present invention, (3) a polynucleotide containing a base sequence encoding ABP1 or a part thereof, (4) the present invention
  • the antibody, the antisense polynucleotide of the present invention, and the inhibitory peptide of the present invention have the following uses.
  • ABP1 has a function of promoting Apotosis induction through the ASK1 kinase cascade by binding and activating ASK1. Therefore, ABP1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof is added to the cells, or a polynucleotide encoding ABP1 or the activating peptide of the present invention is introduced into the cells to express them, and intracellular By increasing the amount of ABP1, the activation of ASK1 in the cells can be promoted, or apoptosis can be induced in the cells. For example, it can be used as a reagent for studying apoptosis.
  • ABP 1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned ASK 1 activation promoter or apoptosis inducer
  • water or an appropriate buffer eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer
  • PBS phosphate buffer
  • Tris-HCl buffer Tris-HCl buffer
  • the polynucleotide when ABP1 or a polynucleotide encoding the activating peptide of the present invention is used as the above-mentioned ASK1 activation promoter or apoptosis inducer, the polynucleotide may be used alone or in a retrovirus vector or adenovirus vector. After insertion into an appropriate vector such as an adenovirus associated virus vector, the cells can be introduced into cells using the above-mentioned transformation methods (eg, ribosome method, electoporation method, etc.).
  • transformation methods eg, ribosome method, electoporation method, etc.
  • ABP 1 since ABP 1 has a function of activating ASK 1 to induce apoptosis in cells, ABP 1 or a nucleic acid encoding it in vivo (eg, Gene, mRNA, etc.) is abnormal or defective, or its expression level is abnormally decreased, and the induction of apoptosis in cells by some other factor.
  • various diseases such as cancer, autoimmune diseases, viral infections, endocrine diseases, blood diseases, and organ hyperplasia occur.
  • ABP 1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof may be used.
  • ABP 1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof may be used.
  • administering to the patient to supplement the amount of ABP 1, or b)
  • administering ABP 1 or the DNA encoding the activating peptide of the present invention to the patient and expressing them in target cells.
  • Apoptosis via ASK1 cascade can be induced in abnormal or unnecessary cells.
  • ABP1 or the activation peptide of the present invention or a salt thereof or b) a polynucleotide encoding ABP1 or the activation peptide of the present invention to induce apoptosis.
  • Effective diseases such as cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, kidney cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, melanoma, myeloma, osteosarcoma) , Brain tumors), autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma, rheumatoid arthritis, siedalen syndrome group, multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, psoriasis, ulcerative colitis, idiopathic small blood disease Platelet purpura, Crohn's disease, glomerulonephritis, etc., viral infections (eg, hemorrhagic fever, T-cell leukemia, cystic sarcoma, infectious mononucleosis, lymphoma, nasopharyngeal cancer, cervical cancer, Skin cancer, hepatitis, liver cancer, etc
  • the polynucleotide encoding ABP 1 or the activating peptide of the present invention when used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the polynucleotide may be used alone or in the form of a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus association. After introduction into a suitable vector such as a Ted virus vector, it can be formulated according to conventional means. The polynucleotide can be administered as it is or together with an auxiliary for promoting uptake by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • a) ABP 1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof, or b) a polynucleotide encoding ABP 1 or the activating peptide of the present invention may be a sugar-coated tablet or capsule, if necessary. It can be used orally as an elixir, microcapsule or the like, or parenterally in the form of an injection such as a sterile solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • ABP1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof, or b) a polynucleotide encoding ABP1 or the activating peptide of the present invention may be prepared by using a known physiologically acceptable carrier, flavoring agent, or excipient. It can be manufactured by mixing with excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in the unit dosage form generally accepted for the practice of formulations. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection are formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil.
  • vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • alcohols eg, ethanol
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene daricol
  • non-ionic surfactants eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agents examples include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum It may be combined with preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum It may be combined with preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be used, for example, in humans and other warm-blooded animals (eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, pigs, pigs, dogs, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.). '
  • the dosage of ABP 1 or the activating peptide of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration for example, a cancer patient (as 60 kg) is generally used.
  • the amount is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day.
  • the single dose varies depending on the subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, in the case of injection, it is usually used, for example, in cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg / day, preferably about 0.1 to 20 mg / day, more preferably about 0.1 to about 0 / L / day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • Administration of a polynucleotide encoding ABP 1 or an activated peptide of the invention varies depending on the administration target, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, in a cancer patient (as 60 kg), about 0.1 mg to 100 mg per day, Preferably it is about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, cancer patients (60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. In the case of other animals, a dose converted per 6 O kg can be administered.
  • a polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding ABP 1 or a part thereof (hereinafter, referred to as “sense polynucleotide of the present invention”) and the antisense polynucleotide of the present invention can be used as a probe to produce human or other DNA or mRNA encoding ABP 1 in warm-blooded animals (e.g., rat, mouse, eight-muster, rabbit, sheep, sheep, goat, pig, pig, pig, cat, dog, monkey, chimpanzee, bird, etc.) Since abnormalities (gene abnormalities) can be detected, for example, genetic diagnostic agents such as damage or mutation of the DNA, abnormal or reduced expression of mRNA splicing, or amplification of the DNA or excessive expression of mRNA.
  • genetic diagnostic agents such as damage or mutation of the DNA, abnormal or reduced expression of mRNA splicing, or amplification of the DNA or excessive expression of mRNA.
  • the polynucleotide containing a part of the nucleotide sequence encoding ABP1 is not particularly limited as long as it has a necessary length (for example, about 15 bases or more) as a probe, and encodes a partial peptide of ABP1. (It is in frame).
  • the above-described genetic diagnosis using the sense or antisense polynucleotide of the present invention includes, for example, known Northern hybridization, quantitative RT-PCR, PCR-SSCP method, allele-specific PCR, PCR- It can be performed by the SSOP method, DGGE method, RNase protection method, PCR-RFLP method, and the like.
  • RNA fraction extracted from the cells of the test warm-blooded animal Hybridization ⁇ Quantitative RT-PCR shows that ABP1 expression is reduced or that PCR-SSCP method is performed on RNA or genomic DNA fractions.
  • a disease associated with apoptosis or suppression of inflammatory site force-in production such as cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, stomach cancer, colorectal cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, kidney cancer, breast cancer) ) Insulin-dependent diabetes mellitus, psoriasis, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Crohn's disease, glomerulonephritis, etc., viral infections (eg, hemorrhagic fever, T-cell leukemia, lipopositive) Tumors, infectious mononucleosis, lymphoma, nasopharyngeal cancer, cervical cancer, skin cancer, hepatitis, liver
  • a disease associated with enhanced apoptosis or inflammation such as a viral infection (eg, AIDS, influenza, unknown fever) Etc.), endocrine disorders (eg, hormone deficiency, site force in deficiency, etc.), blood disorders (eg, cytopenia, renal anemia, etc.), dysplasia (eg, thyroid atrophy, cleft palate, etc.), transplant organ rejection , Graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease (eg, polyglutamine disease, Alfheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, cerebellar degeneration, etc.), ischemic heart disease (Eg, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), radiation damage, ultraviolet damage (eg, sunburn, etc.), toxic diseases (eg, renal tubular cell damage by heavy metals,
  • a viral infection eg, AIDS, influenza, unknown fever
  • endocrine disorders e
  • the antibody of the present invention can specifically recognize ABP1, it can be used for detecting ABP1 in a test solution.
  • the two kinds of antibodies recognize different portions of ABP1. For example, if one antibody recognizes the N-terminus of ABP 1 (eg, a portion having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5), the other antibody will recognize the C-terminus of ABP 1 (eg, And a portion having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6).
  • ABP 1 can be quantified using a monoclonal antibody against ABP 1, and can be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying ABP 1 or a salt thereof using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, ABP 1) in a test solution.
  • Any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, reluciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin- (strept) avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled antibody of the present invention (secondary reaction), followed by labeling on the insolubilized carrier.
  • primary reaction the insolubilized antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed with a time delay.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the immobilized antibody or the labeled antibody does not necessarily need to be one kind, and two or more kinds of antibodies are used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. A mixture may be used.
  • an antibody having a different ABP1 binding site is preferably used.
  • the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of ABP 1
  • the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal or less.
  • an antibody that recognizes the N-terminal portion is used.
  • the antibody of the present invention can also be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody. (BZF separation), the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • This reaction method uses a soluble antibody as an antibody, a liquid phase method in which BZF separation is performed using polyethylene glycol or a secondary antibody against the above-mentioned antibody (primary antibody), and an immobilized antibody as the primary antibody Alternatively, a solid-phase method using a soluble primary antibody and a solid-phased antibody as the secondary antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • ABP1 or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a biological sample eg, blood, plasma, urine, biopsy, etc.
  • concentration of ABP 1 or a salt thereof in the test sample is determined using the antibody of the present invention.
  • apoptosis suppression-related diseases such as cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, gastric cancer, ⁇ : bowel cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, Kidney cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, melanoma, myeloma, osteosarcoma, brain tumor, etc., autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma, rheumatoid arthritis, siddaren syndrome, multiple) Sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, psoriasis, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Crohn's disease, glomerulonephritis, etc., viral infections (eg, hemorrhagic fever, T-cell leukemia, lipopositive sarcoma, transmission) Gender Disease, lymphoma
  • cancer eg, leukemia, esoph
  • diseases associated with enhanced apoptosis or inflammation such as viral infections (eg, AIDS, influenza, unknown fever, etc.), endocrine diseases (eg, Hormone deficiency, site force in deficiency, etc.), blood disorders Disease (eg, cytopenia, renal anemia, etc.), organ dysplasia (eg, thyroid atrophy, cleft palate, etc.), transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease (eg, polyglutamine disease) , Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, cerebellar degeneration, etc.), ischemic heart disease (eg, angina, myocardial infarction, etc.), radiation damage, ultraviolet damage (eg, Toxic diseases (eg, renal tubular cell injury due to heavy metals, hepatocellular injury due to alcohol, etc.), nutritional disorders
  • viral infections eg, AIDS, influenza, unknown fever, etc
  • the antibody of the present invention inhibits the binding of ABP 1 to ASK 1 by specifically binding to ABP 1, and inactivates ASK1 activation and apoptosis / inflammatory cytokine production induction promoting action. (Ie, neutralize).
  • the antisense polynucleotide of the present invention inhibits the expression of ABP1 and decreases the production of the protein, resulting in ASK1 activation by ABP1 and apoptotic Z inflammatory cytokine production. The induction promoting action can be reduced.
  • the antibody of the present invention to cells to inactivate ABP 1, or introducing the antisense polynucleotide of the present invention into cells to reduce the amount of ABP 1 in the cells, It can inhibit ASK1 activation and suppress apoptosis and inflammatory cytokine production of the cells, and can be used, for example, as a reagent for studying apoptosis and inflammatory response.
  • water or an appropriate buffer eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer, etc.
  • an appropriate buffer eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer, etc.
  • PBS phosphate buffer
  • Tris-HCl buffer Tris-HCl buffer
  • the antisense polynucleotide of the present invention is the ASK1 activation inhibitor described above.
  • the polynucleotide is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a tedvirus vector, and then subjected to the above-mentioned transformation methods (eg, ribosome method, electro-volatilization method, etc.). It can be introduced into cells.
  • ABP 1 has a function of activating ASK 1 to induce apoptosis in cells or inducing inflammation. Therefore, ABP 1 or a nucleic acid encoding it in vivo (eg, a gene, mRNA, etc.) ) Is abnormal (expression of a highly active mutant), or its expression level is abnormally increased, and abnormal induction of cell apoptosis or inflammatory cytokine production is caused by some other factor.
  • a) the antibody of the present invention or b) a disease effective in preventing apoptosis or inflammation from preventing or treating apoptosis or inflammation for example, a disease caused by overexpression of ABP1, etc.
  • viral infections eg, AIDS, influenza, unknown fever, etc.
  • endocrine diseases eg, hormone deficiency, Blood illness (eg, cytopenia, renal anemia, etc.), dysplasia (eg, thyroid atrophy, cleft palate, etc.), transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, God Degenerative diseases (eg, polyglutamine disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, cerebellar degeneration), ischemic heart disease (eg, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), Radiation damage, UV damage (eg, sunburn, etc.) Toxic disease (eg, renal tubular cell injury
  • the antibody of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated in the same manner as the above-mentioned drug containing ABP1 or the activated peptide of the present invention or a salt thereof.
  • the antisense polynucleotide of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it may be formulated in the same manner as the above-mentioned drug containing ABP1 or a polynucleotide encoding the activating peptide of the present invention. Can be.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, such as, for example, humans and other warm-blooded animals (eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, bushes, dogs, dogs, It can be administered to cats, dogs, monkeys, chimpanzees, and birds.
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, bushes, dogs, dogs, dogs, It can be administered to cats, dogs, monkeys, chimpanzees, and birds.
  • the dose of the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. It is about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day.
  • the dose of the antisense polynucleotide of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, disease state, administration method, and the like.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, disease state, administration method, etc.
  • an injection it is usually used, for example, for patients with polyglutamine disease (6O). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg per day, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • 6O polyglutamine disease
  • the inhibitory peptide of the present invention can function as an (antagonist) inhibitor of ABP1, that is, it can bind to ASK1, but does not activate or inactivate it.
  • ABP1 an apoptosis Z inflammatory cytokine production inhibitor
  • prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with enhanced apoptosis or inflammation.
  • the inhibitory peptide of the present invention When the inhibitory peptide of the present invention is used as an inhibitor of ASK1 activation and as an inhibitor of apoptosis or inflammatory cytokine production, promotion of ASK1 activation containing the above-mentioned ABP1 or the activated peptide of the present invention or a salt thereof ⁇ Reagents can be prepared in the same manner as apoptosis inducers.
  • the inhibitory peptide of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated in the same manner as the above-mentioned drug containing ABP1, the activated peptide of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans and other warm-blooded animals (for example, rats, mice, hamsters, egrets, higgies, goats, bushes, dogs, dogs). , Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.).
  • warm-blooded animals for example, rats, mice, hamsters, egrets, higgies, goats, bushes, dogs, dogs).
  • the dosage of the inhibitory peptide of the present invention depends on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • Oral administration generally involves, for example, about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, and more in patients with polyglutamine disease (as 60 kg). Preferably it is about 1.0-20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with polyglutamine disease (60 kg ), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • ASK1 partial peptide having no phosphorylation activity or salt thereof is an N-terminal activation control domain.
  • a partial peptide of ASK1 having the activation control domain but lacking the kinase domain responsible for activating MAPKK located downstream of the cascade can function as a (antagonistic) inhibitor of ASK1. That is, since the peptide can bind to ABP1 but cannot be activated thereby, it can competitively inhibit the binding between ASK1 and ABP1 that are endogenous to cells and the activation of ASK1 thereby. Therefore, the partial peptide can be used as an ABP1 inhibitor, an apoptotic or inflammatory site force-in production inhibitor, or a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with enhanced apoptosis or inflammation.
  • kinase domain of ASK1 for example, in the case of human ASK1, the amino acid sequence represented by amino acid numbers 678 to 936 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of Patent Document 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 10-93) Is mentioned.
  • a partial peptide of ASK1 having an activation control domain on the N-terminal side and lacking a kinase domain includes: Amino acid sequence identical or substantially identical to all or a part of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 677 in the amino acid sequence of human ASK 1 (hereinafter, referred to collectively as “ASK1-N sequence”) And a peptide having the ability to bind to ABP1.
  • substantially identical amino acid sequence Is preferably about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 70% or more of all or a part of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 677 in the amino acid sequence of the human ASK1. Is an amino acid sequence having a homology of about 95% or more, most preferably about 98% or more.
  • the ASK1 partial peptide of the present invention includes, for example, 1) 1 or 2 or more in the ASK1-N sequence (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably Amino acid sequence in which the amino acid sequence has been deleted, (2) 1 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 10) in the ASKl_N sequence.
  • the ASK1 partial peptide of the present invention can be prepared by the same method as the above ABP1 partial peptide.
  • ASK1 activation containing the above-mentioned ABP1 or the activated peptide of the present invention or a salt thereof is used.
  • Acceleration ⁇ Reagents can be prepared in the same manner as the apoptosis-inducing agent.
  • the ASK1 partial peptide of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated in the same manner as the above-mentioned drug containing ABP1 or the activated peptide of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, such as, for example, humans and other warm-blooded animals (eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.).
  • the dose of the ASK1 partial peptide of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a polydaltamin disease patient (60 kg), About 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with polydaltamin disease (6 O kg ), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day.
  • the equivalent dose per 60 kg can be administered.
  • the present invention also provides a method of screening for an ASK1 activation-regulating substance by using ABP1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof, or a cell that produces it.
  • the screening method includes (A) a method using the binding property of ABP1 and ASK1, (B) a method using the activation of ASK1 as an index, and (C) a method using the expression level of ABP1 as an index. It is roughly divided.
  • a partial peptide thereof that retains binding to ASK1 or ABP1 that is, a partial peptide containing at least the N-terminal activation control domain
  • a salt thereof or a salt thereof is produced.
  • the cells used are further used.
  • ABP1 can bind to and activate ASK1, PINDIN using ABP1 or the activation peptide of the present invention and ASK1 or its partial peptide containing the N-terminal activation control domain is used. Screening of compounds having the same action as ABP1 or the activating peptide of the present invention by constructing a Guassy system, screening for compounds that inhibit the action of ABP1 or the activating peptide of the present invention It can be performed. That is, the present invention provides a method for screening an ASK1 activation regulator using ABP1 or the activation peptide of the present invention and ASK1 or a partial peptide thereof containing an N-terminal activation control domain. More specifically, the present invention provides
  • ASK1 or N-terminal activity ABP1 or an ASK1 or an N-terminal activation control domain thereof containing an N-terminal activation control domain, when a partial peptide containing the activation control domain is brought into contact with the ABP1 or the activated peptide of the present invention and a test substance.
  • a method for screening for an ASK 1 activation-regulating substance comprising comparing the amount of binding between a partial peptide and ABP 1 or the activated peptide of the present invention,
  • ABP1 or the activation peptide of the present invention is brought into contact with a cell producing ASK1 or a partial peptide thereof containing an N-terminal activation control domain; and (2) ASK1 or N Contains ASK 1 or N-terminal activation control domain when ABP 1 or the activation peptide of the present invention and a test substance are brought into contact with cells that produce the partial peptide containing the terminal activation control domain
  • a method for screening for an ASK1 activation-regulating substance comprising comparing the amount of binding between the partial peptide and ABP1 or the activation peptide of the present invention, and
  • ASK1 or its partial peptide containing the N-terminal activation control domain and ABP1 or the activation peptide of the present invention are produced, and when both bind, the transcription of the reporter gene is activated It is intended to provide a method for screening for an ASK1 activation modulator, which comprises comparing the expression level of the reporter gene in a cell in the presence and absence of a test substance.
  • ASK1 used in the above-mentioned screening method (a) or (b) is isolated from human or other warm-blooded animal cells using a method known per se (for example, the same method as described above for ABP1). It can be purified.
  • the partial peptide of ASK 1 containing the N-terminal activation control domain is not particularly limited as long as it has the amino acid sequence of the N-terminal activation control domain described above, and may be a part of the kinase domain or the C-terminal amino acid sequence. May be included.
  • the partial peptide can be obtained by digesting ASK1 with an appropriate protease.
  • ASK1 and its partial peptide containing the N-terminal activation control domain are genes known per se. After cloning the DNA encoding it according to engineering techniques,
  • ABP1 and the activating peptide of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as ABP1) can be prepared according to the above-mentioned method.
  • the cell that produces ASK1 is not particularly limited as long as it is a human or other warm-blooded animal cell that expresses ASK1, and examples include HeLa cells and HEK293 cells.
  • Cells that produce ASK1 or its partial peptide containing the N-terminal activation control domain include the transformant prepared by the above-described genetic method. Is exemplified.
  • Test substances include, for example, proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these substances are novel Or a known one.
  • the binding amount is measured by, for example, Western blot analysis using a labeled anti-ABP1 antibody and anti-ASK1 antibody, labeling either ABP1 or ASK1 (for example, [ 3 H], [ 125 I], 14 C], leaving in be carried out by such [35 S] binding, such as in) to Atsusi Ya Gerushi Futoatsusi or surface plasmon resonance, (SPR).
  • ABP1 or ASK1 for example, [ 3 H], [ 125 I], 14 C
  • SPR surface plasmon resonance
  • a compound that binds to ASK1 and inhibits the binding between ABP1 and ASK1 can be selected as an ASK1 activation modulator.
  • the reaction between ABP1 and ASK1 can usually be performed at about 37 ° C for about several hours.
  • ASK1 standard by suspending ASK1 or cells producing it in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between ABP1 and ASK1, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer.
  • CHAPS, T Surfactants such as we en-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can also be added to the buffer.
  • protease inhibitor such as PMSF, leptin, bacitracin, aprotinin, E-64 (manufactured by Protein Research Laboratories), or papstatin is added to reduce the degradation of ABP 1 and ASK 1 by proteases. You can also.
  • the ABP1 and ASK1 cells are left immobilized in the incubator, that is, while the cells are grown, or using cells fixed with daltaraldehyde / paraformaldehyde. Can be combined.
  • the buffer a medium / Hank's solution or the like is used.
  • a fixed amount for example, about 1000 cpm to l OOOOOO c pm for 20000 Ci / mmo 1
  • labeled ABP 1 for example, [ was added ABP 1) labeled with 125 1
  • NBS non-specific binding
  • the force (B.-NSB) is calculated by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B 0 ) when there is no antagonistic substance, and setting it to 100%.
  • a test substance having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less of the count (B-NSB) can be selected as an ASK1 activation modulator.
  • the screening kit of the present invention contains ABP1, preferably further contains ASK1 or a cell that produces it.
  • screening kit of the present invention examples include, but are not limited to, the following.
  • HeLa cells or HEK293 cells were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 holes, and cultured for 2 days in 37, 5% CO 2 , 95% air.
  • ABP 1 was dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (manufactured by Sigma) to a concentration of 0.1 mM and stored at 1-20.
  • test substance solution M After adding ⁇ 10_ 1G 5 1 a test substance solution M, 5 nM of labeled and AB P 1 5 l was added and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the nonspecific binding A supplementary ABP 1 to 5 1 of 10- 4 M in place of the test substance.
  • Cells used in the above screening method (c) include: (1) DNA binding of ASK1 or its partial peptide containing the N-terminal activation control domain to a transcription factor (eg, GAL4, VP16, etc.) DNA encoding a fusion protein with either the domain or the transcriptional activation domain, (2) DNA encoding a fusion protein between the ABPI or the activation peptide of the present invention and the other domain of the transcription factor, And (3) a cell containing a repo-one-gene under the control of a promoter activated by the transcription factor, preferably a yeast cell, a mammalian cell, and the like.
  • a transcription factor eg, GAL4, VP16, etc.
  • repo overnight gene examples include luciferase gene, iQ-galactosidase gene, alkaline phosphatase gene, peroxidase gene, chloramphenico-l-acetyltransferase gene, green fluorescent protein (GFP) gene and the like.
  • luciferase gene examples include luciferase gene, iQ-galactosidase gene, alkaline phosphatase gene, peroxidase gene, chloramphenico-l-acetyltransferase gene, green fluorescent protein (GFP) gene and the like.
  • GFP green fluorescent protein
  • the above cells are cultured for several hours to about one day under culture conditions suitable for the host cell to be used, and then a cell extract or supernatant is obtained. Perform detection.
  • a compound that inhibits reporter gene expression can be selected as an ASK1 activation modulator.
  • the effect of the test substance on the interaction between ABP1 and ASK1 can be determined by measuring the activation of ASK1 to determine whether the substance inhibits or promotes ASK1 activation. Can be evaluated. That is, the present invention provides activation of the protein or the peptide in a cell producing ASK1 or an N-terminal activation control domain and a partial peptide thereof containing a kinase domain, by (1) ABP1 or A method for screening for an ASK1 activation modulator by measuring and comparing in the presence of the activating peptide of the present invention and (2) in the presence of ABP1 or the activating peptide of the present invention and a test substance I will provide a.
  • ASK1 or N-terminal activation control domain examples include cells that endogenously produce ASK1 (eg, HeLa cells, HEK293 cells, etc.), Animal cells into which DNA encoding ASK1 or its N-terminal side activation control domain and its partial peptide containing a kinase domain have been introduced.
  • ASK1 producing cells include cells that endogenously produce ASK1 (eg, HeLa cells, HEK293 cells, etc.), Animal cells into which DNA encoding ASK1 or its N-terminal side activation control domain and its partial peptide containing a kinase domain have been introduced.
  • Partial peptides of ASK 1 containing an N-terminal activation control domain and a kinase domain include amino acid numbers 1 to 936 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of Patent Document 1 (JP-A-10-93). Contains the same or substantially the same amino acid sequence as all or part of the amino acid sequence shown (hereinafter, referred to as "ASK1-NK sequence"), and is activated by binding to ABP1 Peptides that can be used.
  • substantially identical amino acid sequence refers to about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, Preferably, an amino acid sequence having about 98% or more homology is exemplified.
  • the partial peptides include, for example, 1) 1 or 2 or more in the ASK1-NK sequence (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5) Amino acid sequence in which the amino acid sequence is deleted (2) 1 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the ASK1-NK sequence 3) ASK1— 1 or 2 or more amino acid sequences (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5)) 1 1 or 2 or more in the ASK1-NK sequence (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5) Amino acid sequence in which one amino acid has been replaced with another amino acid, or Mutant peptides containing the combined amino acid sequence are also included.
  • ABP1 or the activating peptide of the present invention may be added to cells from the outside, or may be produced by ASK1-producing cells themselves. In the latter case, ABP 1 may be produced endogenously,
  • the transformant may be a genetically engineered transformant using the ASK1-producing cell as a host according to the method for expressing ABP1 described above.
  • Test substances include, for example, proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these substances are novel Or a known one.
  • ASK 1 activation can be an autophosphorylation of ASK 1, a kinase located downstream of the ASK1 cascade (eg, MKK4 / 7, MK3 / 6, JN, p38, etc.) or a substrate for ASK1 It can be evaluated by measuring the phosphorylation of other proteins or synthetic peptides, the rate of inducing cell death, and the like.
  • a kinase located downstream of the ASK1 cascade eg, MKK4 / 7, MK3 / 6, JN, p38, etc.
  • a substrate for ASK1 It can be evaluated by measuring the phosphorylation of other proteins or synthetic peptides, the rate of inducing cell death, and the like.
  • ASK1-producing cells are cultured on a multiwell plate or the like. Before performing the screening, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to the cells in advance, and add the test substance (or ABP 1 if the cells do not produce ABP 1) etc. for a certain period of time. After incubation, cells are extracted or the supernatant is collected, and the products and phenomena generated are quantified according to each method.
  • Phosphorylation of ASK1 or other proteins or peptides can be detected by Western blot analysis using antibodies specific to phosphorylated proteins (peptides), or by incorporation of [ 32 P] -labeled ATP into substrate proteins (peptides). It can be performed by a method such as detection by electrophoresis and autoradiography.
  • a cell death assay can be performed using a system that can confirm the expression of ABP 1 (for example, a cell into which DNA encoding the fusion protein of ABP 1 and a fluorescent protein has been introduced, or an ABP 1 expression vector that further contains a selectable marker gene).
  • ABP 1 for example, a cell into which DNA encoding the fusion protein of ABP 1 and a fluorescent protein has been introduced, or an ABP 1 expression vector that further contains a selectable marker gene.
  • the percentage of dead cells in all ABP1-expressing cells using exfoliation from the plate and morphological observation (eg, membrane blebbing, fragmentation, etc.) as indicators. be able to.
  • the substance when ASK1 is activated when a test substance is added to an ASK1 producing cell, the substance can be selected as an ASK1 activation promoting substance.
  • the substance when ASK 1 was inactivated when the test substance was added, In this case, the substance can be selected as an ASK1 activation inhibitor.
  • the present invention relates to, for example, ABP contained in (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant.
  • ABP1 mRNA amount or protein amount is specifically performed as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.
  • drugs eg, TNF-a, After applying IL-1, Fas, anticancer drugs, etc., or physicochemical stress (eg, UV, reactive oxygen, ischemia, etc.), and after a certain period of time, blood or specific organs (eg, brain) , Liver, kidney, etc.) or tissues or cells isolated from organs.
  • ABP1 mRNA contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using a method such as RT-PCR, or It can also be quantified by Northern blot analysis known per se.
  • the amount of ABP1 protein can be quantified by extracting the protein from cells or the like by an ordinary method and performing, for example, Western blot analysis using a labeled anti-ABP1 antibody.
  • a transformant expressing ABP 1 or the activating peptide of the present invention is prepared according to the above-described method, and ABP 1 or the activating peptide of the present invention or the mRNA thereof contained in the transformant is prepared. It can be quantified and analyzed in the same way.
  • test substance is administered, and after a lapse of a certain time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the ABP 1 contained in the cells It can be performed by quantifying and analyzing the amount of mRNA or the amount of protein.
  • test substance When the transformant is cultured according to a conventional method, the test substance is mixed into the medium, and after culturing for a certain period of time (from 1 day to 7 days, preferably from 1 day to 3 days, more preferably after 2 days) 3 days later), by quantifying and analyzing the mRNA amount or protein amount of ABP1 or the activating peptide of the present invention contained in the transformant.
  • Test substances include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These substances may be novel substances or known substances.
  • a substance that increases the expression level of ABP1 can be selected as an ASK1 activation promoting substance, and a substance that decreases the expression level of ABP1 can be selected as an ASK1 activation inhibitor.
  • ASK1 activation promoting substance (hereinafter, used synonymously in the present specification))
  • ASK1 activation promoter When the ASK1 activation promoter is used as an apoptosis-inducing agent, dissolve it in water or an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer, etc.) to an appropriate concentration. Can be prepared. If necessary, commonly used preservatives, stabilizers, reducing agents, tonicity agents and the like may be added. As described above, since the ASK-1 activation promoting substance has the function of inducing apoptosis in cells, patients who cannot expect removal of unnecessary cells or abnormal cells by apoptosis due to a decrease in ABP1 or other factors are considered. ASK 1 activation enhancer is administered to the patient to activate ASK 1 to induce apoptosis via ASK 1 cascade in abnormal or unnecessary cells in the patient's body. can do.
  • an appropriate buffer eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer, etc.
  • inducing apoptosis of ASK1 activation promoting substance is a prophylactic and therapeutically effective disease, such as cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, stomach cancer, colorectal cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, kidney) Cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, melanoma, bone myeloma, osteosarcoma, brain tumor, etc., autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma, rheumatoid arthritis, Shederdalen syndrome, multiple occurrence Sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, psoriasis, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Crohn's disease, glomerulonephritis, etc., viral infections (eg, hemorrhagic fever, T-cell leukemia, lipopositive sarcoma, Infectious mono
  • the ASK1 activation inhibitor When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated in the same manner as the above-mentioned drug containing ABP1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be used, for example, in humans and other warm-blooded animals (eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, pigs, pigs, dogs, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, pigs, pigs, dogs, cats.
  • the dose of the ASK-1 activation promoting substance varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. Is about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 mg 5050 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • ASK1 activation inhibitor (hereinafter synonymous in the present specification) Can be used to inhibit signal transduction by the ASK1 cascade to suppress cell apoptosis and inflammatory cytokine production. Therefore, by adding an ASK 1 activation inhibitor to cells, apoptosis / inflammatory site force-in production of the cells can be suppressed.
  • reagents for research on apoptosis, inflammatory reaction, etc. Can be used as
  • an ASK1 activation inhibitor When used as an inhibitor of apoptosis or inflammatory cytokine production, make it to an appropriate concentration in water or an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer). It can be prepared by dissolving in water. If necessary, commonly used preservatives, stabilizers, reducing agents, tonicity agents and the like may be added.
  • an appropriate buffer eg, phosphate buffer, PBS, Tris-HCl buffer.
  • ASK1 activation inhibitors have the function of suppressing cell apoptosis and the production of inflammatory cytokines, so that apoptosis causes loss of cells necessary for the living body due to an increase in ABP1, etc. If an ASK1 activation inhibitor is administered to the patient to inhibit the activation of ASK1 in patients with known or developing inflammatory diseases, Can suppress cis death and inflammatory response.
  • Treatmentally effective diseases such as viral infections (eg, AIDS, influenza, unknown fever, etc.), endocrine diseases (Eg, hormone deficiency, cytokine deficiency, etc.), blood diseases (eg, cytopenia, renal anemia, etc.), organ dysplasia (eg, thyroid atrophy) Congenital, cleft palate, etc.), transplanted organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease (eg, polyglutamine disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, cerebellar degeneration) Etc.), ischemic heart disease (eg, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), radiation damage, UV damage (eg, sunburn, etc.) Toxic disease (eg, renal tubular cell damage by heavy metals, liver cell
  • the ASK1 activation inhibitor When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated in the same manner as the above-mentioned medicament containing ABP1 or the activating peptide of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, such as, for example, humans and other warm-blooded animals (eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, hamsters, egrets, sheep, sheep, goats, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.
  • the dose of the ASK1 activation inhibitor varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in polyglutamine disease patients (60 kg) Is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with polyglutamine disease (6 O kg ), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day.
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the present invention relates to an exogenous DNA encoding ABP 1 (hereinafter, exogenous DN of the present invention).
  • exogenous DN of the present invention A) or a mutant DNA thereof (may be abbreviated as the foreign mutant DNA of the present invention).
  • Non-human mammal used in the present invention is not limited to,
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the ribofusion It can be produced by transferring the desired DNA by a method such as a coagulation method, a coagulation method, a microinjection method, a particle gun method, or a DEAE-dextran method.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like can be transferred and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • non-human mammals for example, porcupines, pigs, higgins, goats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • a hybrid line a Be CS Fi line, a BDF line, a B6D2Fi line, a BALBZc line, an ICR line, etc.
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to ABP1 once isolated and extracted from a mammal, not DNA encoding ABP1 originally possessed by a non-human mammal. Refers to the DNA to be loaded.
  • mutant DNA of the present invention DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original ABP1-encoding DNA, specifically, base addition, deletion, substitution with another base DNA that has been used is used, and abnormal DNA is also included.
  • mutation for example, mutation
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses abnormal ABP1, and for example, a DNA that expresses abnormal ABP1 that suppresses the function of normal ABP1 is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal which is the same or different from the target animal.
  • DNA construct eg, vector
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses DNA encoding ABP1 can be produced.
  • ABP1 expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Morrovirus 21 leukemia virus, vaccinia virus and baculovirus, etc. Animal viruses and the like are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include: (1) Promoters of DNA derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) , (2) Promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, perolabrakin II, Eras Yuichi, erythropoietin, endothelin, muscle Creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dalyuthion S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, K10 and K14, collagen type I and II, Cyclic AMP-dependent protein kinase j8 I subunit, dysto-oral fin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endot
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target mRNA in a DNA-transferring mammal (generally referred to as Yuichi Mineta-1).
  • a DNA-transferring mammal generally referred to as Yuichi Mineta-1
  • An animal-derived sequence of each DNA can be used, and preferably, Simian virus SV40 or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region in order to further express the target foreign DNA. Alternatively, it can be linked to the 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal ABP1 translation region is derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast DNA from humans or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNA. All or part of genomic DNA can be obtained from various genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts, etc. can be used as a raw material. I can do it.
  • a translation region in which a normal ABP1 translation region obtained from the above-described cells or tissue is mutated by a point mutagenesis method can be prepared from the exogenous abnormal DNA.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the DNA transfer indicates that all the progeny of the transgenic animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means to do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and can be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer is a result of the excess.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of endogenous normal DNA is ultimately enhanced by promoting the function of endogenous normal DNA.
  • the disease may develop and can be used as a model animal for the disease.
  • using the normal DNA-transferred animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of ABP1 hyperfunction and diseases associated with ABP1, and to examine treatment methods for these diseases.
  • diseases associated with hyperactivity of ABP1 for example, viral infection (eg, AIDS, Influenza, unknown fever, etc., endocrine disorders (eg, hormone deficiency, cytotoxic deficiency, etc.), blood disorders (eg, cytopenia, renal anemia, etc.), dysgenesis (eg, thyroid atrophy, cleft palate) Etc.), transplant organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative diseases (eg, polyglutamine disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, cerebellar degeneration, etc.) , Ischemic heart disease (eg, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), radiation damage, UV damage (eg, sunburn, etc.) Toxic disease (eg, renal tubular cell damage by heavy metals,
  • non-human mammals having the exogenous abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal carrying the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Can be done.
  • the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Germ cells from the animal after DNA transfer The presence of the abnormal DNA of the present invention means that the offspring of the produced animal have the foreign abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention.
  • Refractory eg, cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, stomach cancer, colorectal cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, kidney cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, melanoma, myeloma, osteosarcoma) , Brain tumors, etc.
  • autoimmune diseases eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma, rheumatoid arthritis, Shederdalen syndrome, multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, psoriasis, ulcerative colitis, idiopathic
  • Thrombocytopenic purpura Crohn's disease, glomerulonephritis, etc.
  • viral infections eg, hemorrhagic fever, T-cell leukemia
  • the animal with high expression of abnormal DNA of the present invention is capable of inhibiting abnormal ABP1 function (dominant negative action) by abnormal ABP1 in ABP1 inactive type refractory disease.
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has abnormal ABP1 increasing symptoms, it can also be used in a therapeutic drug screening test for ABP1 function inactive refractory disease.
  • the above-mentioned test was conducted. It is possible to provide an effective and rapid screening method for the disease preventive / therapeutic agent by using an inspection method and a quantitative method. Further, using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a gene therapy method for ABP1-related diseases.
  • ABP1 DNA-deficient non-human mammalian embryonic stem cells and ABP1 DNA-deficient non-human mammal used in the present invention are ABP1 DNA-deficient non-human mammalian embryonic stem cells and ABP1 DNA-deficient non-human mammal used in the present invention.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA encoding ABP 1 is inactivated [2] the DNA introduces a reporter gene (eg, an i3-galactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli)
  • a reporter gene eg, an i3-galactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and a promoter for a DNA encoding the reporter gene ABP1 is deleted.
  • a reporter gene eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA encoding ABP 1 has been inactivated is an artificially mutated ABP 1 DNA possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression ability of the DNA, Alternatively, by substantially losing the activity of ABP1 encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express ABP1 (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • ES cells human mammalian embryonic stem cells
  • the method of artificially mutating the DNA encoding ABP 1 can be performed, for example, by deleting part or all of the DNA sequence by genetic engineering techniques, and inserting or substituting another DNA.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA encoding ABP 1 has been inactivated include: ABP1 DNA of the target non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or 1acZ (] S-galactosidase gene)
  • the exon function is destroyed by inserting a repo allele gene, such as cat (chloramphenicol acetyltransferase gene), or the gene is transcribed into the intron between exons.
  • a DNA sequence such as a polyA addition signal
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to be ruptured (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, a homologous recombination method, and the obtained ES cell is subjected to AB P1 DNA DNA sequence in the vicinity region other than the ABP 1 DNA used for Southern hybridization analysis or the targeting vector and the DNA sequence on the targeting vector using the DNA sequence on or near the probe as a probe Can be obtained by analyzing the primers by a PCR method and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA encoding ABP 1 is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above, and the known Evans and Kaufman method may be used. It may be newly established according to. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background. For example, to obtain ES cells in which C57BL / 6 BDFi mice in which the number of eggs collected by mice and C57BLZ6 has been reduced by crossing with DBAZ2 (such as those established using F of C57B LZ6 and DBA / 2) can also be used successfully.
  • DBAZ2 such as those established using F of C57B LZ6 and DBA / 2
  • the C57BL / 6 mouse has a background, so that ES cells obtained using this can It can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but in addition to this, a large number of cells can be efficiently collected by collecting 8-cell embryos and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. With this method, the number of ES cells in a colony was about 1 (about 50), compared to about 10 6 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor required in the initial culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth potential, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ability to generate individuals.
  • LIF (1-1000) on a suitable feeder cell such as STO fibroblasts OU / ml
  • a CO2 incubator preferably 5% CO2, 95% air or 5% oxygen, 5% CO2, 90% air
  • the cells are treated with a trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin 0.1--5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsino, ImM EDTA) to obtain single cells.
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. It is possible to differentiate [MJ Evans and MH Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences, USA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal 'Ob. Embriologi. And Xperimental' Morphology, Vol. 87, 27, 1985.
  • the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is useful in the cell biological examination of ABP1 in the in vivo mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be obtained, for example, by introducing the evening getter vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the ABP of the evening getter vector into the mouse.
  • Cells in which the DNA encoding ABP 1 was knocked out were analyzed by Southern hybridization analysis using DNA sequences on or near ABP 1 DNA as a probe, or DNA sequences on a targeting vector and a targeting vector.
  • chimeric embryo is injected into a non-human mammal embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the animals produced are chimeric animals composed of both cells with a normal ABP1 locus and cells with an artificially mutated ABP1 DNA locus.
  • all the tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added ABP1 DNA locus, for example, by judging the color. The individuals obtained in this manner are usually individuals with ABP1 heterozygous expression deficiency. Can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having the targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by the microinjection method. It can be obtained by selecting a gene having a mutation in the ABP1 DNA locus by homologous recombination with a gene, as compared to an non-human mammal.
  • the individual in which ABP1 DNA has been knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal obtained by mating. .
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, the inactivated DNA is A homozygous animal having both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygote animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygotes are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which ABP1 DNA has been inactivated is very useful for producing a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
  • non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by ABP1, it can serve as a model for a disease caused by inactivation of the biological activity of ABP1. However, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be a disease caused by ABP1 DNA deficiency or damage, such as cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectum cancer, lung cancer, liver cancer, Kidney cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, melanoma, myeloma, osteosarcoma, brain tumor, etc., autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma, rheumatoid arthritis, siedalen syndrome, polymorphism) Sclerosis, insulin-dependent diabetes, psoriasis, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Crohn's disease, glomerulonephritis, etc., inflammation (eg, arthritis, nephritis, etc.), viral infection (eg, hemorrhagic fever) , T-cell
  • the present invention relates to a disease caused by ABP1 DNA deficiency or damage, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention and observing and measuring a change in the animal. Or a compound that has a therapeutic or preventive effect on And a method for screening for a salt.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the symptom of the test animal is, for example, about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • Compounds obtained by the screening method are compounds selected from the test compounds described above, and are used as pharmaceuticals such as safe and low toxic therapeutic and prophylactic agents for the above-mentioned diseases caused by ABP1 deficiency or damage. Can be used. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, Salts with on-acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, Salts with on-acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced and used in the same manner as the drug containing ABP1 or the activating peptide of the present invention.
  • the present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for ABP1 DNA, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene.
  • a salt screening method Provided is a salt screening method.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein ABP1 DNA is introduced by introducing a repo overnight gene. Those inactivated and capable of expressing the reporter gene under the control of a promoter for ABP1 DNA are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same one as described above is used, and a 3-galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is suitable.
  • the reporter gene is coded because the repo overnight gene is under the control of a promoter for ABP1 DNA.
  • ABP 1-expressing tissue should be replaced with / BP instead of ABP 1.
  • 3-galactosidase is expressed. So, for example, By staining with a reagent that serves as a substrate for jS_galactosidase, such as 5-bromo-4-chloro-1-3-indolyl_jS-galactopyranoside (X-ga1), ABP can be easily performed. It is possible to observe the expression state of one animal in vivo.
  • jS_galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-1-3-indolyl_jS-galactopyranoside (X-ga1)
  • an ABP1-deficient mouse or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour in the vicinity of C, the jS-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTAZPBS solution, and the coloration may be observed.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds and a compound that promotes or inhibits the activity of promoter to ABP1 DNA.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). Are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, cit
  • a compound or a salt thereof that promotes promoter A activity against ABP 1 DNA can promote ABP 1 expression and promote ABP 1 function.
  • prevention of a disease associated with ABP 1 dysfunction It can be used as a medicament such as a therapeutic agent.
  • the compound includes, for example, cancer (eg, leukemia, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, kidney cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, melanoma, Myeloma, osteosarcoma, brain tumor, etc.), autoimmune disease (eg, systemic:
  • Viral infections eg, hemorrhagic fever, T-cell leukemia, Tumors, infectious mononucleosis, lymphoma, nasopharyngeal cancer, uterine face cancer, skin cancer, hepatitis, liver cancer, etc.
  • endocrine diseases eg, hyperhormoneism, site hyperintensity, etc.
  • blood diseases eg, Polycythemia, B-cell lymphoma, polycythemia, etc., organ hyperplasia (eg, semi-yin-yang, stagnant testicles, teratoma, nephroblastoma, polycystic kidney disease, cardiac and aortic malformations, syndactyly, etc.) It can be used as a low-toxicity and safe drug such as an agent for prevention and treatment of restenosis after angioplasty and recurrence after resection of cancer.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a promoter against ABP 1 DNA can inhibit the expression of ABP 1 and the function of ABP 1; for example, a disease associated with overexpression of ABP 1 It is useful as a drug for preventive and therapeutic agents.
  • the compound may be, for example, a viral infection (eg, AIDS, influenza, unknown fever, etc.), an endocrine disease (eg, hormone deficiency, cytotoxic deficiency, etc.), a blood disease (eg, cytopenia, Renal anemia, etc.), organ dysplasia (eg, thyroid atrophy, cleft palate, etc.), transplant organ rejection, graft-versus-host disease, immunodeficiency, neurodegenerative disease (eg, polyglutamine disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, muscle) Amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, cerebellar degeneration, etc.), ischemic heart disease (eg, angina, myocardial infarction, etc.), radiation damage, UV damage (eg, sunburn, etc.) Toxic disease (eg, heavy metal) Renal tubular cell injury due to alcohol, liver cell injury due to alcohol, etc.), nutritional disorders (eg, atrophy of the thymus due to vitamin and
  • a medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced and used in the same manner as the medicament containing ABP1 or the activating peptide of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention It is extremely useful in screening for compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of promoters against them, and greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by insufficient expression of ABP1 DNA or the development of therapeutic drugs. Can be.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene).
  • transgenic animal gene
  • ABP1 has a function to specifically promote or suppress the production ability of ABP1 itself in the body. It can be used as a search system for molecular compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the I UPAC-I UB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • HONB 1-hydroxy-5-norporene-2,3-dicarpoxyimide
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the amino acid coding region of human ABP1 cDNA.
  • [SEQ ID NO: 3] 2 shows the nucleotide sequence of the amino acid coding region of mouse ABP1c DNA.
  • the amino acid sequence of a peptide used as an antigen for producing an anti-ABP1 antibody is shown.
  • ASK1-KR in which lysine (K) at the ATP-binding site (position 709) in the kinase domain of human ASK1 was replaced with arginine (R) as a bait.
  • K lysine
  • R arginine
  • a polyclonal antibody of Egret against ABP1 was prepared. Based on the amino acid sequence information obtained from the nucleotide sequence of ABP 1 cDNA, two types of peptide antibodies with ABP 1 specific peptides (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) as antigens were prepared, each of which was an ELA antibody, LVR It was named Fold. Both antibodies were purified using the affinity of the antigen peptide.
  • HeLa cells and HEK293 cells high glucose Modified Eagle Medium Dulbecco containing (4. 5mg / m 1); a (DMEM SIGMA) and culture was incubated in the presence of 5% C_ ⁇ 2.
  • the culture medium was supplemented with 10% fetal calf serum (FBS) and 100 units of Zml lnicillin.
  • FBS fetal calf serum
  • PEE bush aortic endothelial
  • Each cell was treated with a lysis buffer [1 50 mM NaCl, 2 OmM Tris—HC1 (pH 7.5), 1 OmM EDTA, 1% Triton X-100, 1% dexcholate, 1.5% aprotinin, ImM PMS F]
  • the lysate is centrifuged, and the supernatant is taken.
  • Add SDS sample buffer [lO OmM Tris-HC1 (pH8.8), 0.01% bromophenol blue, 36% glycerol, 4% SDS].
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE
  • Two fusion proteins, F1ag-ABP1 and Myc_ASK1 were co-expressed in HEK293 cells.
  • the cells are lysed using a lysis buffer (described above), the lysate is centrifuged, and the supernatant is collected. After reaction with an anti-F1ag antibody (Clone M2; SIGMA), Protein A-sepharose4B (Zyied Laboratories) is added. Incubate for 30 minutes, wash three times with lysis buffer, add SDS sample buffer (described above), and confirm binding of both proteins by the same procedure as in the immunoblotting method. ( Figure 4A).
  • Antibodies used were an anti-F1ag antibody (described above) and an anti-Myc antibody (Clone 9E10, Calbiochem). This binding was more enhanced H 2 0 2 treatment an activator of ASK 1.
  • Antibodies used were an anti-F1ag antibody (described above) and an anti-GFP antibody (Medical & Biological Laboratories CO.). The binding was also enhanced with H 2 ⁇ 2 process. Therefore, ABP 1 and ASK1 engages binding even in mammalian cells, the binding was found to be enhanced in H 2 0 2 treatment.
  • Example 5 Identification of ASK 1 binding site for ABP 1
  • Binding of various ASK1 deficient mutants with HA tag shown in Fig. 5A to ABP1 was co-expressed with F1ag-ABP1, as in Example 3, and then immunoprecipitated with anti-F1ag antibody.
  • Antibodies used were an anti-HA antibody (Clone 3F10, Roche Diagnostics K.K) and an anti-F1ag antibody (Clone M2, SIGMA).
  • the expression vector for AS Kl used was that described in Saitoh et al. (Supra).
  • ABP 1 co-precipitated with ASK 1-NT, ASK 1- ⁇ (3, but did not show co-precipitation with ASK 1-AN and ASK 1-K (FIG. 5B).
  • P1 was found to bind to the N-terminal domain of ASK 1.
  • Example 6 Induction of Cell Death by AB P1
  • ABP 1 was considered to be a protein having cell death inducing ability.
  • a cell line 0PAE-ABP1 cell capable of inducing ABP1 expression in PAE cells in a tetracycline-dependent manner was established.
  • the production of PAE- ⁇ cells was performed by partially modifying the method of Takeda et al. (J. Biol. Chem., 275, 9805-9913, 2000).
  • the entire length of the Myc-tagged ⁇ ⁇ 1 cDNA was subcloned into the pTet-Splice-neo vector, and this and the pTet-tTAk-hyg plasmid were simultaneously transfected into PAE cells, unlike the method of Takeda et al.
  • the cells were cultured in a culture medium supplemented with 500 ng / m 1 tetracycline (Sigma), 400 units Zm 1 hygromycin B (Wako), and 240 mg / m 1 neomycin (Geneticin, Life Technologies, Inc.). Cells that survived and formed colonies were designated as PAE-ABP1 cells.
  • the cells were cultured for maintenance by adding 500 ng / m 1 tetracycline, 200 units 71111 hygromycin B, and 3 Omg / m 1 neomycin to the culture solution for maintaining the PAE cells described above.
  • PAE-ABP1 cells do not express ABP1 when cultured in the presence of tetracycline, but in the absence of tetracycline, expression of Myc-tagged ABP1 protein by immunoblot analysis after about 6 hours. ABP1 expression can be confirmed stably thereafter. Immunostaining with anti-Myc antibody (Clone 9E10, Calbiochem) showed stable expression of Myc—ABP1 in most cells. I did. When these cells were cultured in the absence of tetracycline, cell death was induced with the expression of ABP1 protein as in the case where ABP1 protein was transiently expressed in HeLa cells (FIG. 7A).
  • the percentage of dead cells in all cells was calculated. The results are shown as the average of three visual fields) was determined. The time reached about 55% (Fig. 7B). Also in this experimental system, it was confirmed that ABP1 induced cell death.
  • the DNA was purified by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. After redissolving in (A), the mixture was electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide, and the migration pattern was photographed.
  • the PAE-ABP1 cells formed a DNA ladder with the expression of ABP1 protein at the same time as the appearance of cell death when observed under a microscope (FIG. 8). This indicated that cell death due to ABP 1 was so-called apoptosis accompanied by DNA fragmentation. This was also confirmed by TUNEL staining of PAE-ABP1 cells.
  • DNA fragmentation during apoptosis usually follows caspase activation. Therefore, caspase-3 activity was measured during induction of ABP1 protein expression using PAE-ABP1 cells.
  • the measurement was performed using the synthetic fluorescent peptide DEVD-7-amino-4-trifluororaethyl coumarine (AFC) as a substrate using a CPP32 / caspase-3 fluorometric protease assay kit (MBL).
  • the released AFC was measured for fluorescence intensity at an excitation wavelength of 360 nm and an emission wavelength of 530 nm using a fluorescence spectrophotometer. The degree was measured. Each sample was measured twice. The results are shown as relative values, where 1 is the value when tetracycline is not removed.
  • ABP 1 does not have a functional domain of an existing apoptosis-related factor. Therefore, in order to examine the domains required for ABP 1-induced apoptosis, plasmids expressing fusion proteins of various ABP1-deficient mutants and CFP shown in Fig. 10A were constructed, and HeLa was used in the same manner as in Example 6 (1). It was expressed in cells and examined for cell death.
  • ABP1 expression vectors were prepared by subcloning ABP1 cDNA or ABP1-deficient mutant cDNA A obtained by PCR into pECFP-CI (Clontech). Gene transfer of each plasmid into cells was carried out using FuGENE6 (Roche Diagnostics I. II) as described in the instruction manual.
  • the ABP1 of the present invention has an action of activating the ASK1 cascade to induce apoptosis in cells or inducing the production of inflammatory site force. Therefore, the ABP1, the polynucleotide encoding the same, and the like of the present invention are useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases that can be expected to have a preventive / therapeutic effect by inducing apoptosis in cells.
  • the ABP 1 inhibitor of the present invention for example, anti-ABP 1 antibody, ABP 1 antisense polynucleotide, etc.
  • suppresses apoptosis and production of inflammatory cytokines suppresses apoptosis and production of inflammatory cytokines. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for promising diseases or inflammatory diseases.
  • the use of ABP1 and ASK1 of the present invention provides a means for screening a novel preventive / therapeutic agent for apocysis or inflammation-related disease.

Abstract

本発明は、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の機能的ドメインを含む部分ペプチド；該蛋白質もしくは該部分ペプチドまたはそれを産生する細胞、および必要に応じてＡＳＫ１もしくはその部分ペプチドまたはそれを産生する細胞を用いることによる、ＡＳＫ１活性化調節物質、アポトーシスまたは炎症関連疾患予防・治療物質のスクリーニング方法およびそのためのキット；並びに配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の活性を調節する物質を含有する、アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生調節剤、アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療剤を提供する。

Description

アポトーシス関連蛋白質およびその用途 技術分野
本発明は、 AS K1と結合してこれを活性化する蛋白質の機能的フラグメント、 並びに該蛋白質および該フラグメントの種々の用途、 特に医薬用途に関する。 明
背景技術
アポトーシスは、 発生過程で不要とな田った細胞や異常細胞の除去、 ホメォスタ 一シス、 傷害を受けた細胞を除去する生体防御反応の機能を担っており、 その分 子レベルでのメカニズムも次第に明らかになってきている。 それら分子の異常や 制御メカニズムの破綻はアポ卜一シスの生理的機能を障害し、 様々な疾患の発症 原因や増悪因子となる。 例えば、 アポトーシスが過度に抑制されれぱ、 本来除去 されるべき細胞が異常に増殖して腫瘍性疾患や自己免疫疾患などを誘発し、 逆に アポトーシスが異常に亢進すると本来なくてはならない細胞が死に至って神経変 性疾患などの原因となる。
Mitogen- activated protein (MAP) キナーゼカスケードは物理化学的スト レスや腫瘍壊死因子—ひ （TNF— α)、 イン夕一ロイキン _ 1 ( I L— 1) な どの炎症性サイトカインによって活性化された MAPキナーゼキナ一ゼキナーゼ (MAPKKK) が、 MAPキナーゼキナーゼ (MAPKK)、 MAPキナーゼ (MAPK) を逐次活性化するシグナル伝達機構であり、 細胞はこれらの刺激に 応じて生存、 増殖、 分化、 死 （アポト一シス） などの表現型を示す。 C- Jun N- terminal kinase ( J NK) および p38 MAP kinase (p 38) は、 アポトーシス を誘導するシグナル伝達経路の一部を担う M A P Kとして知られている (例えば、 Science, 270, 1326 (1995)を参照）。 さらには炎症性サイト力インの産生を誘導 することにより炎症反応の惹起にも関与している。
J NKおよび p 38は MAPKKである MKK4/7および MKK3Z6によ つてそれぞれ活性化される。 これらの M A P KKは Apoptosis signal- regulating kinase 1 (ASK 1) と呼ばれる 1つの MAP KKKによって活性 化される （JP 10-93 A、 Science, 275, 90-94 (1997))。 MAPKKKは ASK 1以外にも多数報告されているが、 ASK1は、 J NKおよび Zまたは p 38の 活性化を介したシグナル伝達を通じて、 細胞にアポトーシスを誘導する能力を有 することにより特徴づけられる。 最近、 ASK 1の活性化がケラチノサイトの分 化や PC 12細胞の神経突起伸張などの細胞分化にも関与することが示唆されて おり、 A S K 1はアポトーシスに限らず細胞の運命のコントロールに重要な役割 を果たしていることが明らかになってきている。 さらには炎症性サイトカインの 産生を誘導することによって、 炎症反応の惹起にも関与することも明らかとなつ てきている。
このように、 ASK 1は細胞の以後の運命を左右する重要な分子であるが故に、 その活性化には様々な因子が関与し、 複雑な制御を受けていると考えられる。 こ れまでに、 ASK 1の活性化には ASK 1同士のホモオリゴマ一形成とそれに続 く活性化ループ内にあるスレオニンのリン酸化が必須であることが報告されてお り、 また該リン酸化は主に ASK 1による自己リン酸化によっているが、 別のキ ナーゼの存在も示唆されている (Journal of Cellular Physiology, 191, 95- 104 (2002))。 一方、 rotein phosphatase 5 (P P 5) は H202刺激下で AS K 1に直接結合し、 スレオニンを脱リン酸化することで活性化された AS K 1を 不活性状態に戻すと考えられている ( BO Journal, 20, 6028-6036 (2001))。 さらに、 レドックス制御因子であるチォレドキシンは、 酸化ストレスのないとき には A S K 1の N末端側ドメインと恒常的に結合して A S K 1の活性化ィンヒビ ターとして働いており、 酸化ストレスを与えると ASK1から離れ、 それにより ASK 1の活性化が起こること (EMBO Journal, 17, 2596-2606 (1998))、 TN F—ひによる ASK 1活性化の際には、 TNF receptor-associated factor 2 (T RAF 2) が A S K 1の C末端側ドメインに結合することで A S K 1の活性化が 起こること (Molecular Cell, 2, 389-395 (1998))、 14一 3— 3タンパク質は C末端側ドメインに結合することにより AS K 1の活性化を阻害すること ( Proceedings of National Academy of Sciencies, USA, 96, 8511-8515 (1999)) なども報告されている。
ASK 1ノックァゥトマウスの細胞を小胞体ストレス誘発剤で処理すると、 野 生型マウスの細胞に比べてアポトーシスが有意に抑制されることから、 ASK1 は小胞体ストレスによるアポト一シス誘導に密接に関連しており、 従って、 上記 のチォレドキシンや 14— 3— 3蛋白質等の ASK 1阻害物質や、 ASK 1ドミ ナントネガティブ変異体、 A S K 1ァンチセンスオリゴヌクレオチドなどは、 神 経変性疾患 （例、 ポリグルタミン病等） などの小胞体ストレス関連疾患の予防 - 治療に有効であることが示唆されている （W0 02/38179)。 西頭らは、 ポリグルタ ミン病における異常蛋白質の蓄積が小胞体ストレスを誘発し、 その結果ストレス センサ一分子である I RE 1と TRAF 2、 ASK 1が三者複合体を形成して A SKIが活性化され、 J NKの活性化を介してアポト一シス （=神経細胞死） が 誘導されることを示した (Genes Development, 16, 1345-1355 (2002))。
上述のように、 A S K 1の生理的重要性や疾患との関わりが次第に明らかにな つてきてはいるが、 ASK 1の活性化制御と ASK 1を介するアポトーシス誘導 Z炎症反応惹起のメカニズムについては、 その複雑さもあって未だに不明な点が 多く、 さらなる研究の進展が望まれるところである。
したがって、 本発明は、 ASK1の活性化機構とそれを介したアポトーシス誘 導 Z炎症反応惹起のメカニズムに関する新規な知見を提供することを目的とする。 即ち、 本発明の第一の目的は、 これまで知られていない新規な ASK 1結合蛋白 質を同定するとともに、 該蛋白質による ASK 1活性化制御のしくみを明らかに することである。 また、 本発明の別の目的は、 該蛋白質と ASK 1との相互作用 に基づいて、 A S K 1が関与する各種疾患に対する新規な予防 ·治療手段を提供 することである。 発明の開示
本発明者等は、 上記の目的を達成すべく、 ヒト ASK1全長 cDNAを baitと して、 ヒト胎児脳由来の発現ライブラリ一を酵母 two- hybrid法によりスクリー二 ングした結果、 PGR 1と命名された既知遺伝子にコードされる 127アミノ酸 からなる機能未知の蛋白質を、 新たに A S K 1結合蛋白質としてクローニングす ることに成功し、 旦 inding £rotein丄 （以下、 「ABP 1」 と略記する） と 命名した。 さらに、 本発明者等は、 該蛋白質が ASK 1と結合するのみでなく、 ASK 1とその下流の J NKおよび p 38を活性化するとともに、 カスパーゼ依 存性のアポトーシスを誘導することを見出した。 本発明者等は、 これらの知見に 基づいてさらに研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[ 1 ] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列の一部と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 且つ ASK 1を活性化し得るぺプチ ドまたはその塩、
[2] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列中約 60アミノ酸 以上からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有する上記 [1] 記載のペプチドまたはその塩、
[3] 部分アミノ酸配列が N末端側の配列である上記 [2] 記載のペプチドま たはその塩、
[4] 上記 [1] 記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレ ォチド、
[ 5 ] 配列番号 1または配列番号 3に示される塩基配列の一部と同一もしくは 実質的に同一の塩基配列を含有する上記 [4] 記載のポリヌクレオチド、
[6] 上記 [4] 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
[7] 上記 [6] 記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転 換体、
[83 上記 [7] 記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から上記 [1] 記載のペプチドまたはその塩を採取することを特徴とする該ペプチドまたはその 塩の製造方法、
[ 9 ] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列の一部と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 且つ ASK 1を活性化しないか、 も しくは不活性化し得るペプチドまたはその塩、
[10] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列中約 35ァミノ 酸以下からなる部分ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を 含有する上記 [9] 記載のペプチドまたはその塩、
[1 1] 部分アミノ酸配列が N末端側の配列である上記 [10] 記載のぺプチ ドまたはその塩、
[12] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ド、 またはその塩を含有してなる A S K 1活性化促進剤、
[13] アポト一シス誘発剤である上記 [12] 記載の剤、
[14] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ド、 またはその塩を含有してなる医薬、
[1 5] アポト一シスを誘発することが予防 ·治療上有効な疾患の予防 ·治療 剤である上記 [14] 記載の医薬、
[16] 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器過形成、 血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択さ れる上記 [15] 記載の医薬、
[17] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ドをコ一ドする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる A S K 1活 性化促進剤、
[18] アポトーシス誘発剤である上記 [17] 記載の剤、
[19] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
[20] アポトーシスを誘発することが予防 ·治療上有効な疾患の予防 ·治療 剤である上記 [19] 記載の医薬、 [21] 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器過形成、 血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択さ れる上記 [20] 記載の医薬、
C2 2] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはそ の一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなるアポト一シスまたは炎症関連 疾患の診断薬、
[23] 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成異常、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発、 移植臓器拒絶、 移植片 対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管 系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記 [22] 記 載の診断薬、
[24] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコ一ドする塩基配列と相補的な 塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなる A S K 1 活性化阻害剤、
[2 5] アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である上記 [2 4] 記載の剤、
[26] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコ一ドする塩基配列と相補的な 塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
[27] アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の 予防 ·治療剤である上記 [26] 記載の医薬、
[28] 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移 植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線 障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿 病性神経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択さ れる上記 [27] 記載の医薬、
[29] 配列番号 5または配列番号 6に示されるアミノ酸配列を特異的に認識 し得ることを特徴とする、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対 する抗体、
[30] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有 してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断薬、
[3 1] 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成異常、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発、 移植臓器拒絶、 移植片 対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管 系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記 [30] 記 載の診断薬、
[32] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有 してなる A S K 1活性化阻害剤、
[3 3] アポトーシスまたは炎症性サイト力イン産生抑制剤である上記 [3 2] 記載の剤、
[34] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有 してなる医薬、
[35] アポト一シスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の 予防 ·治療剤である上記 [34] 記載の医薬、
[36] 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移 植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線 障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿 病性神経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択さ れる上記 [3 5] 記載の医薬、
[37] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を用いることを特徴とする、 ASK 1活性化調節物質のスクリーニング方法、
[38] ASK1もしくは N末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチド またはその塩あるいはそれを産生する細胞をさらに用いることを特徴とする、 上 記 [37] 記載の方法、
[39] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ドまたはその塩と、 AS K 1もしくは N末端活性化制御ドメインを含むその部分 ペプチドまたはその塩との結合性を測定することを特徴とする、 上記 [38] 記 載の方法、
[40] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、 ASK 1活性化調節 物質のスクリーニング用キッ卜、
[413 さらに、 ASK 1もしくは N末端活性化制御ドメインを含むその部分 ペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、 上記 [40] 記載のキット、
[42] ASK1もしくは N末端活性化制御ドメインおよびキナーゼドメイン を含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞における A S K 1もしくは 該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、 （1)配列番号 2または配列番号 4に示 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白 質もしくは上記 [1] 記載のペプチドまたはその塩の存在下と、 （2)配列番号 2 または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のペプチドまたはその塩および 被験物質の存在下で比較することを特徴とする、 上記 [38] 記載の方法、 [43] (1)配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺ プチドまたはその塩、 および（2) A S K 1もしくは N末端活性化制御ドメインお よびキナ一ゼドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞にお ける ASK 1もしくは該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、 被験物質の存在 下と非存在下で比較することを特徴とする上記 [38] 記載の方法、
[44] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記 [1] 記載のぺプチ ドまたはその塩を産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドまたはその 塩の発現を、 被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、 ASK 1活性化調節物質のスクリーニング方法、
[45] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはそ の一部を含有するポリヌクレオチド、 あるいは配列番号 2または配列番号 4に示 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする、 上記 [44] 記載の方 法、
[46] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはそ の一部を含有するポリヌクレオチド、 あるいは配列番号 2または配列番号 4に示 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩に対する抗体を含んでなる A S K 1活性化調節物質のスクリ一二 ング用キッ卜、
[47] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を 増大させる物質を含有してなるアポト一シス誘発剤、
[48] 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を 増大させる物質を含有してなる医薬、
[49] アポトーシスを誘発することが予防 ·治療上有効な疾患の予防 ·治療 剤である上記 [48] 記載の医薬、
[50] 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器過形成、 血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択さ れる上記 [49] 記載の医薬、 .
[51] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を 減少させる物質を含有してなるアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制 剤、
[52] 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を 減少させる物質を含有してなる医薬、
[53] アポト一シスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の 予防 ·治療剤である上記 [52] 記載の医薬、 および
[54] 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移 植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線 障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿 病性神経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択さ れる上記 [53] 記載の医薬を提供する。
さらに、 本発明は、
[55] ASK 1の N末端活性化制御ドメインを含み、 且つキナーゼドメイン を含まない A S K 1部分べプチドまたはその塩を含有してなる、 配列番号 2また は配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質またはその塩の阻害剤、
[56] アポトーシスまたは炎症性サイト力イン産生抑制剤である上記 [5 5] 記載の剤、
[57] ASK 1の N末端活性化制御ドメインを含み、 且つキナーゼドメイン を含まない A S K 1部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
[58] アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の 予防 ·治療剤である上記 [57] 記載の医薬、
[59] 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移 植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線 障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿 病性神経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択さ れる請求項 40記載の医薬、
[60] 上記 [9] 記載のペプチドまたはその塩を含有してなる ASK 1活性 化阻害剤、
[6 1] アポト一シスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である上記 [6 0] 記載の剤、
[62] 上記 [9] 記載のペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
[63] アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の 予防 ·治療剤である上記 [62] 記載の医薬、 および
[64] 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移 植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線 障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿 病性神経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択さ れる上記 [63] 記載の医薬を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト （上列） およびマウス （下列） の ABP 1アミノ酸配列のァライ ンメントを示す。 四角で囲まれた部分は抗体作製のための抗原として用いた部分 アミノ酸配列を示す。 本発明の 2種の抗体 （£ 八抗体ぉょび!^¥1抗体） 作製 のための抗原ペプチドとして用いた部分配列をボックスで示している。
図 2Aは、 マウス組織における ABP 1 mRNA発現の組織分布を示す。 図 2Bは、 マウス胎仔組織における ABP 1 mRNA発現の経日変化を示す。 図 3は、 HEK293細胞にタグの付加されていない AB P 1を発現するプラスミド を遺伝子導入して ABP 1蛋白質を過剰発現させた場合の、 プラスミド量依存的 な検出強度の増加を示す。 遺伝子導入 24時間後に細胞を回収し、 各細胞抽出液 を 2つに分けて SDS— PAGEを行い、 E L A抗体および L V R抗体でィムノ プロット （I B) を行った。 ABPl_pcDNA3 (—） は非形質転換 HEK293細胞を示し、 また、 勾配は左から右へプラスミド量が増加していることを示す。
図 4A— Bは、 ABP 1と ASK 1の結合試験の結果を示す。 図 4A :HEK293 細胞に F 1 a g-ABP 1、 My c -ASK 1プラスミドを遺伝子導入し、 24 時間後に細胞を回収して、 抗 F 1 a g抗体で免疫沈降後、 抗 My c抗体でィムノ ブロット解析を行った。 図 4B： HEK293細胞に F 1 a g— ASK1、 CFP— A BP 1プラスミドを遺伝子導入し、 24時間後に細胞を回収して、 抗 F l a g抗 体で免疫沈降後、 抗 GFP抗体でィムノブロット解析を行った。 尚、 CFPは G FPの変異体で、 抗 GFP抗体により認識可能である。 図 4A、 Bとも右側の 2 レーンでは、 H202処理 （0. 5mM， 1時間） も行った。 下段は免疫沈降す る前の各細胞溶解液の一部を別に泳動したものである。 I Pは免疫沈降、 I Bは ィムノブロットを表す。
図 5 Aは、 ASK 1欠損変異体の模式図を示す。 ASK 1欠損変異体を含む各 プラスミドには、 それぞれ N末端側に HAタグを付加してある。 アミノ酸番号 6 78〜936 (斜線部） はキナ一ゼドメインを示す。 図 5Bは、 ABP 1と AS K 1欠損変異体との結合試験の結果を示す。 下段は免疫沈降する前の各細胞溶解 液の一部を別に泳動したものである。 I Pは免疫沈降、 I Bはィムノブロットを 表す。
図 6 A— Bは、 HeLa細胞における ABP 1による細胞死誘導を示す。 図 6A : HeLa細胞に CFPまたは CFP— ABP 1プラスミドを遺伝子導入後 36時間の 蛍光顕微鏡像 （上段） および同じ視野の微分干渉像 （下段） を示す。 図 6B ：遺 伝子導入 36時間後における細胞死の割合 （％) を示す。
図 7A— Bは、 PAE- ABP1細胞における ABP 1による細胞死誘導を示す。 図 7 A : PAE- ABP1細胞をテトラサイクリン （Te t) 存在下 （+ ) 、 非存在下 （―） に培養後 36時間の位相差顕微鏡像を示す。 図 7B :テトラサイクリン存在下で の培養 （O h) 、 テトラサイクリン除去 24時間および 48後における細胞死の 割合 （％) を示す。
図 8は、 PAE- ABP1細胞における ABP 1による細胞死誘導 （DNA断片化） を 示す。 PAE- ABP1細胞をテトラサイクリン除去後、 それぞれの時間での DN A断片 ' 化をァガロースゲル電気泳動により調べた（上段）。 両端は分子量マーカーを示し (M) 、 右端にはサイズを示してある。 下段は各細胞における My c— ABP 1 蛋白質発現を抗 My c抗体によるィムノブロット解析で確認したものである。 図 9A— Bは、 AB P 1による細胞死のカスパーゼ依存性を示す。 図 9A : PAE- ABP1細胞をテトラサイクリン除去下に培養し、 0, 12, 24, 36時間後 にカスパーゼ— 3活性を測定した。 結果はテトラサイクリンを除去していない時 の値を 1とする相対値で示した。 図 9 B ： PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン除去 するのと同時に z VAD_ f mk (50 M) で処理し、 死細胞の割合 （％) を 定量化した。 ただし細胞死のアツセィはテトラサイクリン除去後 18時間で行つ た。 Te tはテトラサイクリンを表す。
図 10A— Bは、 ABP 1欠損変異体による細胞死誘導を示す。 図 10A : A BP 1欠損変異体の模式図を示す。 それぞれ野生型と同様に N末端側に CFP夕 グを付加した。 図 10 B： AB P 1欠損変異体を導入した細胞における遺伝子導 入 36時間後における細胞死の割合 （％) を示す。
図 1 1A— Bは、 八8? 1にょる八31^1、 J NK：、 p 38の活性化を示す。 図 1 1 A :ΡΑΕ_ΑΒΠ細胞をテトラサイクリン除去して培養し、 内在性 JNKおよ び ρ 38の活性化を各抗リン酸化蛋白質抗体によるィムノブロット解析にて行つ た。 図 1 1 B ： PAE- ABP1細胞をテトラサイクリン除去下で培養し、 内在性 ASK 1の活性化を抗リン酸化蛋白質抗体によるィムノブロット解析にて検討した。 I Bはィムノブロットを表す。 発明を実施するための最良の形態
本発明において用いられる蛋白質 （以下、 「本発明の ABP 1」 もしくは単に 「A B P 1」 という） は、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
本発明の A B P 1は、 温血動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 モルモット、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サ ル、 チンパンジーなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細 胞、 塍臓 iS細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂 肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細 胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球)、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細 胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 または これら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれらの細胞が 存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底 球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳）、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 (例、 大腸、 小腸）、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来する蛋白質であってよく、 また、 化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であつてもよい。 あるいは上 記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入された形 質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。
配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と 「実質的に同一のアミ ノ酸配列」 としては、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 特に好 ましくは約 9 5 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と 「実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質」 としては、 例えば、 前記の配列番号 2または配列番 号 4に示されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の 活性を有する蛋白質などが好ましい。
「実質的に同質の活性」 としては、 例えば、 A S K 1またはその下流に位置す るキナーゼ群 （例、 MKK4/7、 MKK3/6, JNK, p38など） の活性化促進活性、 細胞の アポトーシス誘導活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性 質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがつ て、 A S K 1カスケード活性化促進等の活性が同等であることが好ましいが、 こ れらの活性の程度、 蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい （例え ば、 活性については、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 よ り好ましくは 0 . 5〜2倍の範囲内が挙げられる）。
A S K 1カスケ一ド活性化促進活性の測定は、 公知の方法、 例えば、 標識した リン酸基供与体を用いて A S K 1またはその下流に位置するキナーゼ群 （例、 MKK4/7, MKK3/6, JM、 p38など） のリン酸化を検出すること等によって、 また、 アポト一シス誘導活性の測定は、 細胞死誘導率の測定、 細胞の形態学的観察、 D NA断片化の検出等によって行うことができる。
また、 本発明の A B P 1には、 例えば、 ①配列番号 2または配列番号 4に示さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好まし くは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失した アミノ酸配列、 ②配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列に 1また は 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号 2 または配列番号 4に示されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1 〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④配列番号 2または配列番号 4に示され るアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましく は 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたアミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミノ酸配列を含 有する蛋白質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その揷入、 欠失または置換の位置は、 蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。 本発明の ABP 1は、 好ましくは、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有す るヒト ABP 1 ( ABP 1) または配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有す るマウス ABP 1 (mABP l)、 あるいは他の温血動物 （例えば、 ラット、 モ ルモット、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） におけるそのホモログである。 hABP lは P G R 1 と命名されたヒト T細胞由来の既知遺伝子 （GenBank登録番号 ： AF116272) にコードされる 127アミノ酸からなる蛋白質であるが、 その機能に 関する報告はこれまでになされていない。 また、 マウス AB P 1は clone MNCb- 1039と命名されたマウス脳由来の c DN A (GenBank登録番号： AB041651) にコ ードされる 125アミノ酸からなる蛋白質であるが、 やはりその機能に関する報 告はない。
本明細書に記載される蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端）、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号 2または 配列番号 4に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、 本発明の ABP 1は、 C末端が力ルポキシル基 （一 CO〇H)、 カルポキシレート（一 CO O一）、 アミド （—CONH2) またはエステル （_CO〇R) の何れであっても よい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの アルキル基；例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基；例えば、 フエニル、 ひ一ナフチ ルなどの C 6 _ 12ァリ一ル基；例えば、 ベンジル、 フェネチルなどのフエ二ルー 〇ト2アルキル基； «—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー（^_2アルキル基 などの 7_14ァラルキル基； ピバロィルォキシメチル基などが用いられる。
ABP 1が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有して いる場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明 の ABP 1に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端の エステルなどが用いられる。 さらに、 本発明の A B P 1には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの（^ _ 6アル力 ノィルなどの C卜 6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて 生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミ ノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一 O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 ィ ンド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの 6アルカノィル基などの Cェ一 6ァシル基など） で保護されている もの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれ る。
本発明は、 上記した A B P 1の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、 且 つ A B P 1と実質的に同質の活性を有するペプチドを提供する。 ここで 「実質的 に同質の活性」 とは上記と同意義を示す。 また、 「実質的に同質の活性」 の測定 は上記と同様にして行うことができる。 本明細書においては、 当該部分ペプチド を、 以下 「本発明の活性化ペプチド」 と称することとする。
本発明の活性化ペプチドは、 上記の性質を有する限り特に制限されないが、 例 えば、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列中約 6 0アミノ酸以 上、 好ましくは約 6 0〜約 1 0 0アミノ酸、 より好ましくは約 6 0〜約 8 0アミ ノ酸からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドなどが挙げられる。 該部分アミノ酸配列は A B P 1の N末端側配 列であっても、 C末端側配列であってもよいし、 内部配列であってもよい。 ある いは、 それらの部分配列同士の組み合わせであってもよい。
好ましくは、 本発明の活性化ペプチドは、 配列番号 2または配列番号 4に示さ れるァミノ酸配列の N末端側の約 6 0ァミノ酸以上、 より好ましくは約 6 0〜約 1 0 0アミノ酸、 特に好ましくは約 6 0〜約 8 0アミノ酸の部分アミノ酸配列を 含有する。
特に好ましい範囲においては、 本発明の活性化ペプチドは、 全長蛋白質よりも さらに高い活性 （例、 A S K 1カスケード活性化促進活性、 アポトーシス誘導活 性等） を示す場合がある。 "^方、 ABP 1の部分ペプチドの中には、 ABP 1もしくは 「本発明の活性化 ペプチド」 の （拮抗） 阻害物質として機能し得るものが含まれる。 かかる部分べ プチドとしては、 AS K1に対する結合活性を有するが、 該キナーゼを活性化し 得ないものが挙げられる。 本明細書においては、 当該部分ペプチドを以下 「本発 明の阻害ペプチド」 と称することとする。
すなわち、 本発明の阻害ペプチドは、 配列番号 2または配列番号 4に示される ァミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 且つ ASK 1を活性しないか、 もしくは不活性化し得るぺプチドである。 該阻害ぺプ チドとしては、 例えば、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列中 約 35アミノ酸以下からなる部分アミノ酸配列、 好ましくは N末端側の部分アミ ノ酸配列を含有するものが挙げられる。
本発明の A BP 1の部分ペプチド （本発明の活性化ペプチドおよび本発明の阻 害ペプチドの両者を包含する；以下、 単に 「本発明の部分ペプチド」 と略記する 場合がある) は、 C末端が力ルポキシル基 (― COOH)、 カルボキシレート (一 COO— )、 アミド （― CONH2 ) またはエステル （—COOR) の何れ であってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 ABP 1について前記し たと同様のものが挙げられる。 これらのぺプチドが C末端以外にカルポキシル基 (またはカルポキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化また はエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のェ ステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した ABP 1と同様に、 N末端のメ チォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断 され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上 の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆ る糖ペプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明の ABP 1またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩基との生 理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好 ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水 素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フ マル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の ABP 1またはその塩は、 前述した温血動物の細胞または組織から自 体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。 具体的には、 温血動 物の組織または細胞をホモジナイズし、 可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどのクロ マトグラフィ一等で分離精製することによって、 ABP 1またはその塩を製造す ることができる。
本発明の ABP 1もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「本発明の ABP 1類」 と包括的にいう場合がある） は、 公知のペプチド合成法に従って製 造することもできる。
ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであってもよい。 ABP 1を構成し得る部分べプチドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合し、 生 成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製 造することができる。
ここで、 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の①〜⑤に記 載された方法に従って行われる。
① M. Bodanszky および M.A. Ondetti、 ペプチド · シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ 'ペプチド（The Pept ide)， Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977 年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
このようにして得られた ABP 1類は、 公知の精製法により単離 ·精製するこ とができる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマ トグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶、 これらの組み合わせなどが挙 げられる。
上記方法で得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体である場合には、 該遊離体を 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができる し、 逆に蛋白質 （ペプチド） が塩として得られた場合には、 該塩を公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 本発明の A B P 1類の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることが できる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチ ル榭脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシべ ンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4一 ヒドロキシメチルメチルフエ二ルァセ卜アミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド 樹脂、 4— ( 2，， 4， ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル) フエノキシ 樹脂、 4一 ( 2 4 ' ージメトキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ 樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 —ァミノ基と側鎖官 能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質もしくはペプチド （以下、 「蛋白質等」 と総称する場合もある） の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に 従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に 各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を 実施し、 目的の蛋白質等またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化 試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N， N， ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチルー N， ― ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t、 H O O B t)ととも に保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または H O B t エステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮合反応に 使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジ メチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンな どの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 ト リフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホ キシド類、 ピリジンなどのアミン類, ジォキサン， テトラヒドロフランなどのェ 一テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0で〜 5 の範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕一シャリーペンチ ルォキシカルポニル、 ィソポル二ルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルボニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シク口へキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化）、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ ル、 4一二トロベンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化）、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 ターシャリーブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t—プチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12 - Bz l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 タ一シャリーブチルなどが用いられる。 ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 ？€1_黒ぁるぃは？（1_炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイド、 1, 4一ブタンジチオール、 1, 2一エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2 一エタンジチオール、 1, 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。 原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2， 4 , 5 -トリクロ口フエノール、 2 , 4ージニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 H〇B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
蛋白質等のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端 アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプチ ド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端のひ—アミ ノ基の保護基のみを除いた蛋白質等と C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除 去した蛋白質等とを製造し、 この両蛋白質等を上記したような混合溶媒中で縮合 させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護 蛋白質等を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白 質等を得ることができる。 この粗蛋白質等は既知の各種精製手段を駆使して精製 し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質等のアミド体を得ることができ る。
蛋白質等のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸のひ—力 ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白質 等のアミド体と同様にして、 所望の蛋白質等のエステル体を得ることができる。 本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 Α Β Ρ 1またはその塩を適当なぺプチ ダーゼで切断することによつても製造することができる。
さらに、 本発明の A B P 1類は、 Α Β Ρ 1またはその部分ペプチドをコードす る D NAを含有する形質転換体を培養し、 得られる培養物から Α Β Ρ 1類を分離 精製することによって製造することもできる。
本発明の A B P 1またはその部分ペプチドをコードする D N Aとしては、 ゲノ ム D NA、 ゲノム D NAライブラリ一、 ヒトまたは他の温血動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 モルモット、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジ一など） のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 |3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ラ ンゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋 細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラル キラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球）、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅 球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質）、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸）、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血 球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳 や脳の各部位） 由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリ 一、 合成 D N Aなどが挙げられる。 ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテ リオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より total R N Aまたは mR N A画分を調製したもの を用レ て直接 Reverse Transcr iptase Polymerase Chain React ion (以下、 「R T - P C R法」 と略称する） によって増幅することもできる。
本発明の A B P 1をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号 1または配 列番号 3に示される塩基配列を含有する D NA、 あるいは配列番号 1または配列 番号 3に示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズす る塩基配列を含有し、 前記した配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸 配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 A S K 1カスケード活性化促 進活性、 アポトーシス誘導活性など） を有する蛋白質をコ一ドする D NAなどが 挙げられる。
配列番号 1または配列番号 3に示される塩基配列とハイストリンジェントな条
5きる D N Aとしては、 例えば、 配列番号 1または配列番 号 3に示される塩基配列と約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 さらに好ま しくは約 70%以上、 特に好ましくは約 80%以上、 最も好ましくは約 90%以 上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クローニング （Molecular Cloning) 第 2版 （J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼ ーシヨンは、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 ハイ ブリダィゼーシヨンは、 好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行な うことができる。 '
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60 〜 65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65 の 場合が好ましい。
, 本発明の ABP 1をコードする DNAは、 好ましくは配列番号 1に示される塩 基配列を含有する hABP 1 DNAまたは配列番号 3に示される塩基配列を含 有する mABP l DNA、 あるいは他の温血動物 （例えば、 ラット、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) におけるそのホモログなどである。
本発明の部分べプチドをコ一ドする DNAは、 配列番号 2または配列番号 4に 示されるァミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列をコー ドする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 上記した細胞 ·組織由来の c DNA、 上記 した細胞 '組織由来の c DN Aライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ラ イブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より mRN A画分を調製したものを用いて直接 RT-PCR法によって増幅することもでき る。 具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、
( 1 ) 配列番号 1または配列番号 3に示される塩基配列を有する DNAの部分塩 基配列を有する DNA、 または ，
(2) 配列番号 1または配列番号 3に示される塩基配列を有する DNAとハイス トリンジエンドな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 且つ
(2a) 該 DNAにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活 性 （例、 AS K1カスケード活性化促進活性、 アポ卜一シス誘導活性など）、 ま たは
(2b) 該 DNAにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質の活性を阻害する活 性 （例、 ASK 1カスケ一ド活性化阻害活性、 アポトーシス抑制活性など） を有するペプチドをコードする DNAなどが用いられる。
配列番号 1または配列番号 3に示される塩基配列とハイストリンジェン卜な条 件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 該塩基配列中の対応する 部分と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 最も好ましくは約 90%以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオ チドなどが用いられる。
本発明の ABP 1またはその部分ペプチドをコードする DNAは、 該蛋白質ま たはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成 DN Aプライマ一を用 いて P CR法によって増幅するか、 または適当な発現べクタ一に組み込んだ DN Aを、 本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合 成 DN Aを標識したものとハイブリダィゼーション.することによってクロ一ニン グすることができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 モレキュラー ·クロ —ニング （Molecular Cloning) 第 2版 （前述） に記載の方法などに従って行う ことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼ一シ ョンは、 該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うこと ができる。
DNAの塩基配列は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝 酒造 （株））、 Mutan™- K (宝酒造 （株）） 等を用いて、 0DA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変 換することができる。
クローン化された DNAは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素 で消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使用することができる。 該 DNAはそ の 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳 終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの 翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DN Aアダプターを用いて付加 することができる。
本発明の A B P 1またはその部分ペプチドをコ一ドする DN A発現べクタ一は、 例えば、 ABP 1をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 該
DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。
発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR
325, pUC 12, pUC 13) ；枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB l l 0, TP 5, p C 194) ；酵母由来プラスミド （例、 pSH19， p SHl
5) ； λファージなどのバクテリオファ一ジ； レトロウイルス， ワクシニアウイ ルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルス； p A 1— 11、 pXTl、 Rc
ZCMV、 pRcZRSV、 p c DNA I ZN e oなどが用いられる。
プロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー ターであればいかなるものでもよい。
例えば、 宿主が動物細胞である場合、 SRひプロモータ一、 SV40プロモ一 夕一、 LTRプロモータ一、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモータ一、 H
SV-TKプロモータ一などが用いられる。 なかでも、 CMVプロモーター、 S
Rひプロモーターなどが好ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 t r pプロモ一夕一、 l a cプロモー夕
―、 r e cAプロモ一夕一、 APLプロモータ一、 l p pプロモーター、 T7プ ロモ—夕—などが好ましい。 宿主がバチルス属菌である場合、 SP01プロモーター、 SP02プロモータ 一、 p e n Pプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモー夕一、 GAP プロモーター、 ADHプロモ一夕一などが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリンプロモータ一、 P 10プロモータ一 などが好ましい。
発現べクタ一としては、 上記の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシン グシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン (以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることが できる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕、 アンピ シリン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある）、 ネオマイシン耐性 遺伝子 （以下、 Ne o fと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、 dh f r遺伝子 を選択マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つて選択することもできる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端末 側に付加してもよい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合、 PhoA ·シグナル配 列、 0即 A ·シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、 a—アミラ ーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが；宿主が酵母である場 合、 MF ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列などが；宿主が動物細胞で ある場合、 インシュリン 'シグナル配列、 ひ—インターフェロン .シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
上記のようにして得られる 「本発明の ABP 1またはその部分ペプチドをコー ドする DNA」 を含有する形質転換体は、 公知の方法に従い、 該 DNAを含有す る発現ベクターで、 宿主を形質転換することによって製造することができる。 ここで、 発現ベクターとしては、 前記したものが挙げられる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。 ェシエリヒア属菌としては、 例えば、 ェシエリヒア . コリ （Escherichia coli) K 12 . DH1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル .ァカデミ 一'ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60巻, 160 (1968)〕, J M 103 〔ヌクイレック ·ァシッズ · リ サ一チ （Nucleic Acids Research), 9巻， 309 (1981)〕， JA221 〔ジ ヤーナル · ォブ · モレキュラー · バイオロジー ( Journal of Molecular Biology), 120巻， 517 (1978)〕， HB 101 〔ジャーナル .ォブ.モ レキユラ一 'バイオロジー， 41巻, 459 (1969)〕， C 600 〔ジエネテ イツクス （Genetics), 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス · サブチルス (Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 25 5 ( 1 983)], 207 - 2 1 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリ一 (Journal of Biochemistry), 95巻, 87 (1984)] などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R―， NA 87 - 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N C YC 1913, NC YC 2036、 ピキア パストリス (Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞）、 Trichoplusia niの中腸由 来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞、 Esiigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルス が BmNPVの場合、 昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞 （Bombyx niori 細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711), S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン .ヴィポ （In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature), 315巻， 592 (1985)〕。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 C〇S_7， Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記）， dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CH〇 （dh f r— ) 細胞と略記）， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエ口一マ細胞， ラット GH3， ヒト FL 細胞などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することができる。 ェシエリヒア属菌は、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ 力デミ一'ォブ 'サイェンジィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69巻， 21 10 (1972)やジーン （Gene), 17巻， 107 (1 982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、 例えば、 モレキュラー 'アンド 'ジェネラル ·ジエネティッ クス （Molecular & General Genetics), 168巻， 11 1 (1979)などに記 載の方法に従つて形質転換することができる。
酵母は、 例えば、 メソッズ · イン · ェンザィモロジ一 （Methods in Enzyniology), 194巻， 182— 187 ( 1991 )、 プロシ一ジングズ ·ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス ェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75巻， 1929 (1978)などに記載 の方法に従つて形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、 例えば、 バイオ/テクノロジー （Bio/Technology) ，6， 47- 55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 263 - 267 ( 1995) (秀潤社発行）、 ヴィロロジ一 （Virology), 52巻， 45 6 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することが できる。
例えば、 宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養 する場合、 培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。 また、 培地は、 形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物などを含有することが好まし い。 ここで、 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが；窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーン スチープ， リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液 などの無機または有機物質が；無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。 また、 培地 には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の Hは、 好ましくは約 5〜8である。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller), ジャ一ナ ル · ォブ · ェクスペリメンッ · ィン · モレキュラー · ジエネティックス uournal of Experiments in Molecular Genetics; , 43 1— 43 3, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 必要により、 プ 口モーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 ;3—インドリルアクリル酸の ような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、 通常約 15〜43 で、 約 3〜24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、 通常約 30〜40°Cで、 約 6
〜24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。 .
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 バーク ホールダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77卷， 4505 (1 980)〕 や 0.
5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシージングズ -ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 8 1卷， 5330 ( 1984 )〕 など が挙げられる。 培地の pHは、 好ましくは約 5〜8である。 培養は、 通常約 2
0° (：〜 35°Cで、 約 24〜72時間行なわれる。 必要に応じて、 通気や撹拌を行 つてもよい。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 え ば Grace's Insect Medium ( Grace, T. C. C. , ネ ィ チ ャ ― (Nature) , 195,788 (1962)) に非働化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加え たものなどが用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6. 2〜6. 4である。 培養は、 通常約 27 で、 約 3〜5日間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌を 行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science), 122卷， 501 (1 952)〕， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology), 8巻， 396 (1959)〕, RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メ ティカ レ ' ァソシェ——シヨ ン ( The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕， 199培地 〔プロシ一ジング ·ォ ブ ·ザ ·ソサイエティ 'フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73巻， 1 (1950)〕 など が用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6〜 8である。 培養は、 通常約 3 0°C〜40°Cで、 約 15〜60時間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌を行つ てもよい。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内または細胞外に本発明の ABP 1もし くはその部分ペプチドまたはその塩 （ABP 1類） を生成させることができる。 前記形質転換体を培養して得られる培養物から、 本発明の ABP 1類を自体公 知の方法に従つて分離精製することができる。
例えば、 本発明の ABP 1類を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、 培養 物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、 遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 100 TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれる本発明の A B P 1類の単離精 製は、 自体公知の方法に従って行うことができる。 このような方法としては、 塩 析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を 利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法； ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高 速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法 などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。 これらの方法は、 適宜組 み合わせることもできる。
かくして得られる ABP 1類が遊離体である場合には、 自体公知の方法あるい はそれに準じる方法によって、 該遊離体を塩に変換することができ、 ABP 1類 が塩として得られた場合には、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 形質転換体が産生する ABP 1類を、 精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分 的に除去することもできる。 該蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キ モトリプシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシ ダーゼなどが用いられる。
かくして得られる本発明の ABP 1類の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウエスタンブロッテイングなどにより確認することができる。 さらに、 本発明の ABP 1類は、 上記の ABP 1またはその部分ペプチドをコ 一ドする DN Aに対応する RN Aを铸型として、 ゥサギ網状赤血球ライセ一ト、 コムギ胚芽ライセート、 大腸菌ライセ一トなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用 いてインピトロ翻訳することによつても合成することができる。 あるいは、 さら に RN Aポリメラーゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用いて、 ABP 1またはその 部分ペプチドをコードする DN Aを铸型としても合成することができる。
本発明の ABP 1またはその塩に対する抗体 （以下、 「本発明の抗体」 と略記 する場合がある） は、 ABP 1またはその塩を認識し得る抗体であれば、 ポリク 口一ナル抗体、 モノクロ一ナル抗体の何れであってもよい。 ABP 1またはその 塩に対する抗体は、 本発明の ABP 1類を抗原として用い、 自体公知の抗体また は抗血清の製造法に従って製造することができる。 抗原として用いられる本発明 の A BP 1類としては、 上記の ABP 1もしくはその部分ペプチドまたはその塩 であればいずれのものを用いてもよい。
ABP 1またはその塩に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体 は、 例えば以下のようにして製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の ABP 1類を、 哺乳動物に対して、 投与により抗体産生が可能な部位 に、 それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与する。 投与に際して抗体産生能 を高めるため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを 投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行われる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ましく用い られる。
例えば、 抗原で免疫された哺乳動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個 体を選択し、 最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含 まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。 抗血清中の抗 体価の測定は、 例えば、 後記の標識化蛋白質と抗血清とを反応させた後、 抗体に 結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。 融合操作は、 既 知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 (Nature), 256、 495 (1975)〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリ エチレングリコール (PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好まし くは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1な どの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG600 0 ) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 3 7 °Cで 1〜 10分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施でき る。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、 例えば、 抗原を直接あるいは担体 とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレー卜) にハイプリドーマ培養上清を 添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合 に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロティン Aを加え、 固相に結合したモノク口一ナル抗体を検出する方 法；抗免疫グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリド一 マ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した蛋白質を加え、 固相に結 合したモノク口一ナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングすること ができる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 モノクローナル抗体の選別は、 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行うことができる。 モ ノクローナル抗体の選別および育種用培地は、 ハイプリドーマが生育できるもの ならばどのような培地を用いても良い。 このような培地としては、 例えば、 1〜 20%、 好ましくは 10〜20 %の牛胎児血清を含む RPM I 1640培地、 1-10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株)） あるいはハイ プリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株）） などを用いる ことができる。 培養温度は、 通常 20〜40° (、 好ましくは約 37°Cである。 培 養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行うことができる。 八イブリドーマ培養上清の抗体価は、 上記 の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、 自体公知の方法、 例えば、 免 疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電 気泳動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過 法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤 により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って 分離精製することができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
A B P 1またはその塩に対するポリクローナル抗体は、 自体公知の方法に従つ て製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （A B P 1類） 自体、 あるいはそれ とキャリア一蛋白質との複合体を作製し、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に哺乳動物に免疫を行い、 該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。 また、 哺乳動物以外に ニヮトリなども用いることができる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合で力プリングさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤、 例えばグルタ ルアルデヒドゃカルポジィミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチォ ピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 哺乳動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができ る。
ABP 1の部分ペプチドを抗原として用いる場合、 その ABP 1上の位置は特 に限定されないが、 例えば、 各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ 酸配列を有するオリゴペプチドが挙げられる。 具体的には、 ヒトおよびマウス間 で完全に保存されている配列番号 5または配列番号 6に示されるアミノ酸配列を 有するペプチドなどが好ましく例示される。
本発明の AB P 1をコ一ドする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を 含有するポリヌクレオチド （以下、 「本発明のアンチセンスポリヌクレオチド」 と略記する場合がある） としては、 ABP 1をコードする塩基配列と完全に相補 的な塩基配列もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 AB P 1をコードする RNAからの該蛋白質の翻訳を抑制する作用を有するものであれ ばよい。 「実質的に相補的な塩基配列」 としては、 ABP 1またはその部分ぺプ チドをコードする塩基配列と、 該蛋白質を発現する細胞の生理学的条件下でハイ ブリダィズし得る塩基配列、 より具体的には、 ABP 1またはその部分ペプチド をコードする塩基配列の相補鎖との間で、 オーバーラップする部分に関して約 7 0%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好まし くは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 クロ一ン化した、 あるいは決定さ れた本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そ うしたポリヌクレオチドは、 ABP 1をコードする遺伝子の複製または発現を阻 害することができる。 即ち、 本発明のアンチセン'スポリヌクレオチドは、 ABP 1をコードする遺伝子から転写される RN Aとハイブリダィズすることができ、 mRNAの合成 (プロセッシング) または機能 （蛋白質への翻訳） を阻害するこ とができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの標的領域は、 アンチセンスポリヌク レオチドがハイブリダィズすることにより、 結果として A B P 1の翻訳が阻害さ れるものであればその長さに特に制限はなく、 ABP 1をコードする RNAの全 配列であっても部分配列であってもよく、 短いもので約 15塩基程度、 長いもの で mRN Aまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。 合成の容易さや抗原性の 問題を考慮すれば、 約 15〜約 30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい がそれに限定されない。 具体的には、 例えば、 ABP 1をコードする遺伝子の 5' 端ヘアピンループ、 5' 端 6—ベースペア ' リピート、 5' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 ORF翻訳開始コドン、 3' 端非翻訳領域、 3' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループが標的 領域として選択しうるが、 該遺伝子内部の如何なる領域も標的として選択しうる。 例えば、 該遺伝子のィントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 ABP 1をコードする m RN Aもしくは初期転写産物とハイブリダィズして蛋白質への翻訳を阻害するだ けでなく、 二本鎖 DNAである ABP 1をコードする遺伝子と結合して三重鎖 (トリプレックス） を形成し、 RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D—リポースを含有してい るデォキシリポヌクレオチド、 D—リポースを含有しているリポヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのヌクレオ チド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の 蛋白質核酸おょぴ合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有する その他のポリマー （但し、 該ポリマーは DNAや RNA中に見出されるような塩 基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） な どが挙げられる。 それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1本 鎖 RNA、 さらに DNA： RNAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾 ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド）、 さらには公知の修飾の 付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いた もの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した もの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチ ルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートな ど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォ エート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L— リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有している もの、 インタ一カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つ もの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の 金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持 つもの （例えば、 ひァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオ シド」、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含 有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んで いてもよい。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシ ル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであつ てよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が 修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンや脂肪族基などで置 換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてもよ い。
アンチセンスポリヌクレオチドは、 R N A、 D N A、 あるいは修飾された核酸 ( R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体 ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシ ドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されう る。 すなわち、 細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにす る、 アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 目標とするセン ス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチ センスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。 こうした修飾は当該分 野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami e t al . , Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vo l . 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al . ed.， Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していてよく、 リボソーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供 与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられること ができる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロ一ルなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に 特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどの ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ 用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
A B P 1をコードする mR NAもしくは遺伝子初期転写産物を、 コード領域の 内部 （初期転写産物の場合はイントロン部分を含む） で特異的に切断し得るリポ ザィムもまた、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。 「リポ ザィム」 とは核酸を切断する酵素活性を有する R NAをいうが、 最近では当該酵 素活性部位の塩基配列を有するオリゴ D N Aも同様に核酸切断活性を有すること が明らかになっているので、 本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限 り D N Aをも包含する概念として用いるものとする。 リポザィムとして最も汎用 性の高いものとしては、 ウイロイドゃウィルソィド等の感染性 R N Aに見られる セルフスプライシング R N Aがあり、 ハンマーへッド型ゃヘアピン型等が知られ ている。 ハンマーヘッド型は約 4 0塩基程度で酵素活性を発揮し、 ハンマーへッ ド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ （合わせて約 1 0塩基程度） を m R N Aの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、 標的 mR NAのみを 特異的に切断することが可能である。 このタイプのリポザィムは、 R NAのみを 基質とするので、 ゲノム D NAを攻撃することがないというさらなる利点を有す る。 ABP 1をコードする mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、 RNA ヘリ力一ゼと特異的に結合し得るウィルス核酸由来の RN Aモチーフを連結した ハイプリッドリポザィムを用いることにより、 標的配列を一本鎖にすることがで きる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10)： 5572-5577 (2001)]。 さらに、 リ ポザィムを、 それをコードする DNAを含む発現べクタ一の形態で使用する場合 には、 転写産物の細胞質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列を さらに連結したハイブリッドリポザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res., 29(13)： 2780-2788 (2001)]。 1
ABP 1をコードする mRNAもしくは遺伝子初期転写産物のコード領域内の 部分配列 （初期転写産物の場合はイントロン部分を含む） に相補的な二本鎖オリ ゴ RNA (small interfering RNA； s i RNA) もまた、 本発明のアンチセン スポリヌクレオチドに包含され得る。 短い二本鎖 RN Aを細胞内に導入するとそ の RNAに相補的な mRNAが分解される、 いわゆる RNA干渉 （RNA i) と 呼ばれる現象は、 以前から線虫、 昆虫、 植物等で知られていたが、 最近、 この現 象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されたことから [Nature, 411 (6836)： 494-498 (2001)]、 リポザィムの代替技術として注目されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリポザィムは、 本発明の蛋白 質をコードする cDN A配列もしくはゲノミック DN A配列情報に基づいて m R N Aもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、 市販の DNAZRNA自動合成 機 （アプライド ·バイオシステムズ社、 ベックマン社等） を用いて、 これに相補 的な配列を合成することにより調製することができる。 s i RNAは、 センス鎖 及びアンチセンス鎖を DNA/RN A自動合成機でそれぞれ合成し、 適当なァニ —リング緩衝液中で、 例えば、 約 90〜約 95 °Cで約 1分程度変性させた後、 約 30〜約 70 °Cで約 1〜約 8時間ァニ一リングさせることにより調製することが できる。 また、 相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするよう に合成して、 これらをァニーリングさせた後リガーゼでライゲ一シヨンすること により、 より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
ABP 1または本発明の活性化ペプチドは、 ASK 1と結合してこれを活性化 することから、 ASK 1キナーゼカスケードを介したアポトーシス誘導を促進し 得る。 従って、 ① ABP 1または本発明の活性化ペプチド、 ② ABP 1または本 発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチド、 ③ ABP 1をコードする 塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、 ④本発明の抗体、 ⑤本発 明のアンチセンスポリヌクレオチド、 ⑥本発明の阻害ペプチドは以下の用途を有 する。
(1) ASK 1活性化促進剤 ·アポトーシス誘発剤
ABP 1は ASK 1と結合してこれを活性化することにより、 ASK 1キナー ゼカスケードを介したアポト一シス誘導を促進する機能を有する。 従って、 細胞 に ABP 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を添加したり、 ABP 1または本発明の活性化べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを細胞に導入し て発現させ、 細胞内の ABP 1量を増加させることにより、 該細胞内 ASK 1の 活性化を促進したり、 該細胞にアポトーシスを誘導したりすることができ、 例え ば、 アポトーシス研究用試薬として用いることができる。
ABP 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を上記の ASK 1活性 化促進剤、 アポトーシス誘発剤として使用する場合、 水もしくは適当な緩衝液 (例、 リン酸緩衝液、 PBS、 トリス塩酸緩衝液など） 中に適当な濃度となるよ うに溶解することにより調製することができる。 また、 必要に応じて、 通常使用 される保存剤、 安定剤、 還元剤、 等張化剤等を配合させてもよい。
一方、 ABP 1または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチド を上記の ASK 1活性化促進剤、 アポトーシス誘発剤として使用する場合は、 該 ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスべク タ一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクター に挿入した後、 上記の形質転換法 （例、 リボソーム法、 エレクト口ポレーシヨン 法など） を用いて細胞に導入することができる。
(2) アポ卜一シス抑制が関連する疾患の予防 ·治療剤
上記のように、 ABP 1は ASK 1を活性化して細胞にアポ卜一シスを誘導す る機能を有するので、 生体内において ABP 1またはそれをコードする核酸 （例、 遺伝子、 mR N A等） に異常があったり、 これを欠損している場合、 あるいはそ の発現量が異常に減少している場合、 さらには、 他の何らかの要因で細胞のアポ ト一シス誘導が過度に抑制されている場合、 例えば、 癌、 自己免疫疾患、 ウィル ス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器過形成などの種々の疾病を発症する。 したがって、 A B P 1の減少もしくは他の要因により不要な細胞や異常細胞の アポ卜一シスによる除去が期待できない患者がいる場合に、 a) A B P 1もしく は本発明の活性化ペプチドまたはその塩を該患者に投与して A B P 1の量を補充 したり、 b) (i ) A B P 1または本発明の活性化ペプチドをコードする D NAを 該患者に投与して標的細胞内で発現させることによって、 あるいは （i i) 単離し た標的細胞に A B P 1または本発明の活性化ペプチドをコードする D NAを導入 し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内に おける A B P 1の量を増加させ、 異常細胞や不要となった細胞に A S K 1カスケ 一ドを介するアポト一シスを誘導することができる。
したがって、 a) A B P 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩、 あ るいは b) A B P 1または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチ ドを、 アポト一シスを誘発することが予防 ·治療上有効な疾患、 例えば、 癌 （例、 白血病、 食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸癌、 肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 メラノーマ、 骨髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 (例、 全身性エリテマト一デス、 強皮症、 慢性関節リウマチ、 シエーダレン症候 群、 多発性硬化症、 インスリン依存性糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小 板減少性紫斑病、 クローン病、 糸球体腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞白血病、 力ポジ肉腫、 伝染性単核症、 リンパ腫、 上咽頭癌、 子宮頸癌、 皮 膚癌、 肝炎、 肝癌等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモン過剰症、 サイト力イン過剰症 等)、 血液疾患 （例、 血球増加症、 B細胞リンパ腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰陽、 停留睾丸、 奇形腫、 腎芽細胞癌、 多発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指 症等）、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発などの予防 ·治療剤として使用 することができる。
A B P 1もしくは本発明の活性化べプチドまたはその塩を上記予防 ·治療剤と して使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができる。
一方、 A B P 1または本発明の活性化ペプチドをコ一ドするポリヌクレオチド を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 該ポリヌクレオチドを単独あるいは レトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエー テッドウィルスベクタ一などの適当なベクターに揷入した後、 常套手段に従って 製剤化することができる。 該ポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促 進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテー テルによって投与することができる。
例えば、 a) A B P 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩、 あるい は b) A B P 1または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル 剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と の無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例え ば、 a) A B P 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩、 あるいは b) A B P 1または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、 生理学 的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合 剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和する ことによつて製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ぺパ一ミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば； アルコール （例、 エタノール）、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール）、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 80T M、 HCO- 5 0) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用 いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液）、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど）、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど）、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど）、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジ一、 トリなど） に対して投与するこ とができる。 '
ABP 1または本発明の活性化ペプチドの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症 状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患 者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好ま しくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口 的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜 20 m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜； L 0 m g程度を投与するのが好都 合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することがで きる。
ABP 1または本発明の活性化べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの投与 量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与 の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1mg〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 ' 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通 常例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30 mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換 算した量を投与することができる。
(2) 遺伝子診断剤
ABP 1をコードする塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド (以下、 「本発明のセンスポリヌクレオチド」という） および本発明のアンチセン スポリヌクレオチドは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは他の温 血動物 (例えば、 ラット、 マウス、 八ムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 トリなど） における ABP 1を コードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができる ので、 例えば、 該 DN Aの損傷もしくは突然変異や mRNAのスプライシング異 常あるいは発現低下、 あるいは該 DN Aの増幅や mRNAの発現過多などの遺伝 子診断剤として有用である。 ABP 1をコードする塩基配列の一部を含有するポ リヌクレオチドは、 プローブとして必要な長さ （例えば、 約 15塩基以上） を有 する限り特に制限されず、 また、 ABP 1の部分ペプチドをコードしている （即 ち、 in frameである） 必要もない。
本発明のセンスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診 断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼ一シヨン、 定量的 RT— PC R、 PCR—SSCP法、 アレル特異的 PCR、 PCR— S SOP法、 DGGE 法、 RNa s eプロテクション法、 P C R— R F L P法などにより実施すること ができる。
例えば、 被検温血動物の細胞から抽出した RNA画分についてのノー- ブリダイゼーションゃ定量的 R T— P C Rの結果、 A B P 1の発現低下が検出さ れた場合や、 R NA画分もしくはゲノミック D NA画分について P C R— S S C P法を実施した結果、 A B P 1遺伝子の突然変異が検出された場合は、 アポトー シスまたは炎症性サイト力イン産生抑制が関連する疾患、 例えば、 癌 （例、 白血 病、 食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸癌、 肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵 巣癌、 前立腺癌、 メラノーマ、 骨髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 （例、 全身性エリテマトーデス、 強皮症、 慢性関節リウマチ、 シエーダレン症候群、 多 発性硬化症、 インスリン依存性糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小板減少 性紫斑病、 クローン病、 糸球体腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞 白血病、 力ポジ肉腫、 伝染性単核症、 リンパ腫、 上咽頭癌、 子宮頸癌、 皮膚癌、 肝炎、 肝癌等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモン過剰症、 サイト力イン過剰症等）、 血 液疾患 （例、 血球増加症、 B細胞リンパ腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰 陽、 停留睾丸、 奇形腫、 腎芽細胞癌、 多発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指症 等）、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発などの疾患に罹患しているか、 あ るいは将来罹患する可能性が高レ ^と診断することができる。
一方、 ノーザンハイブリダィゼーションゃ定量的 R T— P C Rにより A B P 1 の発現過多が検出された場合は、 アポトーシス宂進または炎症が関連する疾患、 例えば、 ウィルス感染症 （例、 A I D S、 インフルエンザ、 不明熱等）、 内分泌 疾患 （例、 ホルモン欠乏症、 サイト力イン欠乏症等）、 血液疾患 （例、 血球減少 症、 腎性貧血等)、 臓器形成不全 （例、 甲状腺萎縮、 口蓋裂等)、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患 （例、 ポリグルタミン病、 アルッ八ィ マー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 小脳変性症等）、 虚血性心疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞等）、 放射線障害、 紫外線障害 （例、 日焼 け等）、 中毒性疾患 （例、 重金属による腎尿細管細胞傷害、 アルコールによる肝 細胞傷害等)、 栄養障害 （例、 ビタミン、 微量元素欠乏による胸腺の萎縮等)、 炎 症性疾患 （例、 急性塍炎、 関節炎、 歯周病、 大腸炎等）、 虚血性神経障害、 糖尿 病性神経障害、 血管系疾患 （例、 動脈硬化等）、 呼吸器系疾患 （例、 間質性肺炎、 肺繊維症等）、 軟骨疾患 （例、 変形性関節炎等） などの疾患に罹患しているか、 あるいは将来罹患する可能性が高レ ^と診断することができる。
(3) 本発明の抗体を用いる診断方法
本発明の抗体は、 ABP 1を特異的に認識することができるので、 被検液中の ABP 1の検出に使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された ABP 1とを競合的に反応さ せ、 該抗体に結合した標識化された ABP 1の割合を測定することを特徴とする 被検液中の ABP 1またはその塩の定量法、 および
(ii) 被検液と、 担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発 明の抗体とを、 同時あるいは連続的に反応させた後、 不溶化担体上の標識剤の量
(活性） を測定することを特徴とする被検液中の ABP 1またはその塩の定量法 を提供する。
上記 （ii) の定量法においては、 2種の抗体は ABP 1の異なる部分を認識す るものであることが望ましい。 例えば、 一方の抗体が AB P 1の N端部 （例、 配 列番号 5に示されるアミノ酸配列を有する部分など） を認識する抗体であれば、 他方の抗体として ABP 1の C端部 （例、 配列番号 6に示されるアミノ酸配列を 有する部分など） と反応するものを用いることができる。
また、 ABP 1に対するモノクローナル抗体を用いて ABP 1の定量を行うこ とができるほか、 組織染色等による検出を行うこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (a b')2、 F ab'、 あ るいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる ABP 1またはその塩の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被検液中の抗原量 （例えば、 ABP 1量） に対応した抗体、 抗原 もしくは抗体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを 既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれ ば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノ メトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕、 〔1 3 1 I〕、 〔3 H〕、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素として は、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 jS—ガラクトシダーゼ、 β —ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リンゴ酸脱 水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フ ルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 リレシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン— （ストレブト） ァビジ ン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 蛋白質あるいは酵素等を不溶化 ·固定化するのに用いられる化学結合を用いても よい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖 類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラ ス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明の抗体に被検液を反応させ （ 1次 反応）、 さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ （2次反応） た後、 不溶 化担体上の標識剤の量 （活性） を測定することにより被検液中の A B P 1量を定 量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序で行っても、 また、 同時に 行ってもよいし、 時間をずらして行ってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は 前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法に おいて、 固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類であ る必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用 いてもよい。
サンドイッチ法による A B P 1の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用 いられる本発明の抗体は、 A B P 1の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用 いられる。 例えば、 上述のように、 2次反応で用いられる抗体が、 A B P 1の C 端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体としては、 好ましくは C端部以 外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明の抗体は、 サンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィム ノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F)と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離）、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 ポリエチレングリコールや前記抗 体 ( 1次抗体) に対する 2次抗体などを用いて B Z F分離を行う液相法、 および、 1次抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは 1次抗体は可溶性のものを用い、 2次抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ一ネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて A B P 1の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することが できる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行）、 入 江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行)、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行)、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定 法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行）、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行）、 rMethods in ENZYM0L0GY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D ： Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I ： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以 上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 ABP 1またはその 塩を感度よく定量することができる。
したがって、 被検温血動物由来の生体試料 （例、 血液、 血漿、 尿、 生検等） を 被検体とし、 本発明の抗体を用いて該検体中の ABP 1またはその塩の濃度を定 量することによって、 ABP 1濃度の減少が検出された場合、 アポト一シス抑制 が関連する疾患、 例えば、 癌 （例、 白血病、 食道癌、 胃癌、 ^：腸癌、 直腸癌、 肺 癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 メラノーマ、 骨髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 （例、 全身性エリテマトーデス、 強皮症、 慢 性関節リウマチ、 シヱーダレン症候群、 多発性硬化症、 インスリン依存性糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小板減少性紫斑病、 クローン病、 糸球体腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞白血病、 力ポジ肉腫、 伝染性単核症、 リン パ腫、 上咽頭癌、 子宮類癌、 皮膚癌、 肝炎、 肝癌等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモ ン過剰症、 サイト力イン過剰症等）、 血液疾患 （例、 血球増加症、 B細胞リンパ 腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰陽、 停留睾丸、 奇形腫、 腎芽細胞癌、 多 発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指症等）、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の 再発などの疾患に罹患している力、 あるいは将来罹患する可能性が高いと診断す ることができる。
一方、 ABP 1濃度の増加が検出された場合には、 アポト一シス亢進または炎 症が関連する疾患、 例えば、 ウィルス感染症 （例、 A I DS、 インフルエンザ、 不明熱等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモン欠乏症、 サイト力イン欠乏症等）、 血液疾 患 （例、 血球減少症、 腎性貧血等)、 臓器形成不全 （例、 甲状腺萎縮、 口蓋裂等）、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患 （例、 ポリグルタミン 病、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 小 脳変性症等)、 虚血性心疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞等)、 放射線障害、 紫外線障 害 （例、 日焼け等） 中毒性疾患 （例、 重金属による腎尿細管細胞傷害、 アルコー ルによる肝細胞傷害等）、 栄養障害 （例、 ビタミン、 微量元素欠乏による胸腺の 萎縮等)、 炎症性疾患 （例、 急性塍炎、 関節炎、 歯周病、 大腸炎等)、 虚血性神経 障害、 糖尿病性神経障害、 血管系疾患 （例、，動脈硬化等）、 呼吸器系疾患 （例、 間質性肺炎、 肺繊維症等）、 軟骨疾患 （例、 変形性関節炎等） などの疾患に罹患 しているか、 あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
(4) ASK1活性化阻害剤 ·アポトーシス抑制剤
本発明の抗体は、 ABP 1と特異的に結合することにより、 ABP 1の ASK 1への結合を阻害し、 AS K1活性化およびアポ卜一シス/炎症性サイトカイン 産生誘導促進作用を不活性化 （すなわち、 中和） することができる。 一方、 本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドは ABP 1の発現を阻害して、 該蛋白質の産 生量を減少させるので、 結果的に AB P 1による ASK 1活性化およびアポトー シス Z炎症性サイトカイン産生誘導促進作用を低減させることができる。
したがって、 細胞に本発明の抗体を添加して ABP 1を不活性化したり、 本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドを細胞に導入して細胞内の ABP 1量を減少 させることにより、 該細胞内における ASK 1の活性化を阻害したり、 該細胞の アポトーシス 炎症性サイトカイン産生を抑制したりすることができ、 例えば、 アポトーシス、 炎症反応研究用の試薬として用いることができる。
本発明の抗体を上記の ASK 1活性化阻害剤、 アポトーシス/炎症性サイトカ イン産生抑制剤として使用する場合、 水もしくは適当な緩衝液 （例、 リン酸緩衝 液、 PBS、 トリス塩酸緩衝液など） 中に適当な濃度となるように溶解すること により調製することができる。 また、 必要に応じて、 通常使用される保存剤、 安 定剤、 還元剤、 等張化剤等を配合させてもよい。
一方、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の A S K 1活性化阻害剤、 アポトーシス抑制剤として使用する場合は、 該ポリヌクレオチドを単独あるいは テツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 上記の形質転換法 (例、 リボソーム法、 エレクトロボレ一シヨン法など） を用いて細胞に導入する ことができる。
(5) アポトーシス亢進または炎症が関連する疾患の予防 ·治療剤
上記のように、 AB P 1は ASK 1を活性化して細胞にアポトーシスを誘導し たり、 炎症を惹起する機能を有するので、 生体内において ABP 1またはそれを コードする核酸 （例、 遺伝子、 mRNA等） に異常がある （高活性変異体の出 現） 場合、 あるいはその発現量が異常に増加している場合、 さらには、 他の何ら かの要因で細胞のアポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生が異常亢進し ている場合、 例えば、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射 線障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症、 虚血性神経障害 （脳虚血）、 糖尿病性末梢神経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患、 軟骨疾患などの種々の疾病 を発症する。
したがって、 ABP 1の増加等により生体にとって必要な細胞までがアポトー シスによって失われている、 あるいは炎症性疾患を発病している患者がいる場合 に、 a) 本発明の抗体を該患者に投与して ABP 1を不活性化したり、 b) (i) 本 発明のアンチセンスポリヌクレオチドを該患者に投与して標的細胞内に導入する (および発現させる） ことによって、 あるいは （ii) 単離した標的細胞に本発明 のアンチセンスポリヌクレオチドを導入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移 植することなどによって、 患者の体内における ABP 1の量を減少させ、 本来必 要な細胞のアポトーシス死や炎症反応を抑制することができる。
したがって、 a) 本発明の抗体または b) 本発明のアンチセンスポリヌクレオチ ドを、 アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防，治療上有効な疾患、 例え ば ABP 1の過剰発現などに起因する疾患、 具体的には、 ウィルス感染症 （例、 A I DS, インフルエンザ、 不明熱等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモン欠乏症、 サ ィ卜カイン欠乏症等）、 血液疾患 （例、 血球減少症、 腎性貧血等）、 臓器形成不全 (例、 甲状腺萎縮、 口蓋裂等）、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神 経変性疾患 （例、 ポリグルタミン病、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎 縮性側索硬化症、 プリオン病、 小脳変性症 ）、 虚血性心疾患 （例、 狭心症、 心 筋梗塞等）、 放射線障害、 紫外線障害 （例、 日焼け等） 中毒性疾患 （例、 重金属 による腎尿細管細胞傷害、 アルコールによる肝細胞傷害等）、 栄養障害 （例、 ビ 夕ミン、 微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、 炎症性疾患 （例、 急性塍炎、 関節 炎、 歯周病、 大腸炎等）、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管系疾患 （例、 動脈硬化等)、 呼吸器系疾患 （例、 間質性肺炎、 肺繊維症等)、 軟骨疾患 （例、 変 形性関節炎等） などの疾患の予防，治療剤として用いることができる。
本発明の抗体を上記予防 ·治療剤として使用する場合、 前記した AB P 1もし くは本発明の活性化べプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化す ることができる。 また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記予防 ·治 療剤として使用する場合、 前記した ABP 1または本発明の活性化ペプチドをコ —ドするポリヌクレオチドを含有する医薬と同様にして製剤化することができる。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 卜リなど) に対して投与するこ とができる。
本発明の抗体の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差 異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 ポリグルタミン病患者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 ポリグルタミン病患者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都 合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することがで きる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症 状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 ポリ グルタミン病患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜 1 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症 状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 ポ リグルタミン病患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに 換算した量を投与することができる。
(6) 本発明の阻害ペプチドの用途
上記のように、 本発明の阻害ペプチドは ABP 1の （拮抗） 阻害物質として機 能し得る、 すなわち、 ASK 1に結合し得るがそれを活性しないか、 もしくは不 活性化し得るので、 本発明の抗体と同様に、 ASK 1活性化阻害剤、 アポトーシ ス Z炎症性サイトカイン産生抑制剤、 あるいはアポト一シス亢進または炎症が関 連する疾患の予防 ·治療剤に用いることができる。
本発明の阻害ペプチドを A S K 1活性化阻害 ·アポトーシスまたは炎症性サイ トカイン産生抑制剤として使用する場合、 前記した ABP 1もしくは本発明の活 性化べプチドまたはその塩を含有する A S K 1活性化促進 ·アポトーシス誘発剤 と同様にして試薬調製することができる。 また、 本発明の阻害ペプチドを上記予 防 ·治療剤として使用する場合、 前記した ABP 1もしくは本発明の活性化ぺプ チドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜ゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 トリなど） に対して投与するこ とができる。
本発明の阻害ペプチドの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 ポリグルタミン病患者 (60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好まし くは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 ポリグルタミン病患 者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ま しくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与 することができる。
(7) リン酸化活性を有しない ASK 1部分ペプチドまたはその塩の用途 後記実施例において実証される通り、 ASK1の ABP 1との結合に関与する 部位は N末端側の活性化制御ドメインであることから、 該活性化制御ドメインを 有するが、 カスケ一ドの下流に位置する MAP KKの活性化を担うキナーゼドメ インを欠失した ASK1の部分ペプチドは、 ASK1の （拮抗） 阻害物質として 機能し得る。 すなわち、 該ペプチドは ABP 1に結合し得るがそれによって活性 化され得ないので、 細胞に内在する ASK 1と AB P 1との結合およびそれによ る ASK1の活性化を競合的に阻害し得る。 したがって、 該部分ペプチドは、 A BP 1阻害剤、 アポト一シスまたは炎症性サイト力イン産生抑制剤、 あるいはァ ポトーシス亢進または炎症が関連する疾患の予防 ·治療剤に用いることができる。
AS K1のキナーゼドメインとしては、 例えばヒト ASK 1の場合、 前記特許 文献 1 (特開平 10— 93) の配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列中アミ ノ酸番号 678〜936で示されるアミノ酸配列が挙げられる。 従って、 N末端 側の活性化制御ドメインを有し、 且つキナーゼドメインを欠失した AS K 1の部 分ペプチド （以下、 「本発明の ASK 1部分ペプチド」 と略記する場合がある） としては、 上記ヒト ASK 1のアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜677で示され るアミノ酸配列の全部もしくは一部 （以下、 包括的に 「ASK1— N配列」 と称 する） と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 且つ ABP 1との 結合能を有するペプチドが挙げられる。 ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 上記ヒト ASK 1のアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜677で示され るアミノ酸配列の全部もしくは一部と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以上、 特に好ましくは約 95%以上、 最も好ましくは 約 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
また、 本発明の ASK 1部分ペプチドには、 例えば、 ① ASK1— N配列中の 1または 2偭以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ② AS Kl _N配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1 〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加したァミノ 酸配列、 ③ A S K 1— N配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が揷 入されたアミノ酸配列、 ④ ASK1— N配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または⑤それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有する変異ペプチドも含まれる。
本発明の ASK 1部分ペプチドは、 上記の ABP 1の部分ペプチドと同様の方 法により調製することができる。
本発明の ASK 1部分ペプチドを ABP 1阻害剤、 特にアポトーシスまたは炎 症性サイトカイン産生抑制剤として使用する場合、 前記した ABP 1もしくは本 発明の活性化べプチドまたはその塩を含有する A S K 1活性化促進 ·アポト一シ ス誘発剤と同様にして試薬調製することができる。 また、 本発明の ASK 1部分 ペプチドを上記予防 ·治療剤として使用する場合、 前記した ABP 1もしくは本 発明の活性化べプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化すること ができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 トリなど） に対して投与するこ とができる。 本発明の ASK 1部分ペプチドの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 ポリダルタミ ン病患者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 00mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非 経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方 法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 ポリダルタミ ン病患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を 投与することができる。
(4) ASK1活性化調節物質のスクリーニング
本発明はまた、 ABP 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩あるい はそれを産生する細胞を用いることによる、 ASK1活性化調節物質のスクリー ニング方法を提供する。 該スクリーニング方法は、 (A) AB P 1と ASK 1の 結合性を利用する方法、 （B) AS K1の活性化を指標とする方法および （C) ABP 1の発現量を指標とする方法に大別される。 （A) および （B) の方法に おいては、 ASK1もしくは ABP 1との結合性を保持するその部分ペプチド (即ち、 少なくとも N末端活性化制御ドメインを含む部分ペプチド） またはその 塩あるいはそれを産生する細胞がさらに用いられる。
(A) ABP 1と ASK 1の結合性を利用するスクリーニング方法
ABP 1は ASK1と結合してこれを活性化することができるので、 ABP 1 または本発明の活性化べプチドと A S K 1または N末端側活性化制御ドメインを 含むその部分べプチドを用いたパインディングァッセィ系を構築することによつ て、 ABP 1または本発明の活性化ペプチドと同様の作用を有する化合物のスク リーニングゃ、 ABP 1または本発明の活性化ペプチドの作用を阻害する化合物 のスクリーニングを行うことができる。 すなわち、 本発明は、 ABP 1または本 発明の活性化べプチドと A S K 1または N末端側活性化制御ドメインを含むその 部分ペプチドを用いる ASK 1活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。 より具体的には、 本発明は、
(a) (1) AS K1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べプチ ドに、 ABP 1または本発明の活性化ペプチドを接触させた場合と （2) ASK 1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べプチドに、 AB P 1また は本発明の活性化べプチドおよび被検物質を接触させた場合との、 AS K 1また は N末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドと ABP 1または本発明 の活性化べプチドとの結合量の比較を行うことを特徴とする A S K 1活性化調節 物質のスクリーニング方法、
(b) (1) AS K1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べプチ ドを産生する細胞に、 ABP 1または本発明の活性化ペプチドを接触させた場合 と （2) ASK1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドを 産生する細胞に、 ABP 1または本発明の活性化ペプチドおよび被検物質を接触 させた場合との、 A S K 1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べ プチドと ABP 1または本発明の活性化ペプチドとの結合量の比較を行うことを 特徴とする ASK1活性化調節物質のスクリーニング方法、 および
( c ) ASK1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べプチドおよ び ABP 1または本発明の活性化ペプチドを産生し、 且つ両者が結合した場合に レポーター遺伝子の転写が活性化される細胞における該レポーター遺伝子の発現 量を、 被検物質の存在下と非存在下とで比較することを特徴とする AS K 1活性 化調節物質のスクリーニング方法を提供する。
上記 （a) または （b) のスクリーニング方法において用いられる ASK 1は、 ヒトまたは他の温血動物の細胞から自体公知の方法 （例えば、 ABP 1について 上記したと同様の方法） を用いて単離精製することができる。 N末端側活性化制 御ドメインを含む A S K 1の部分べプチドは、 上記した N末端側活性化制御ドメ インのアミノ酸配列を有する限り特に制限されず、 キナーゼドメインや C末端側 アミノ酸配列の一部を含んでいてもよい。 該部分ペプチドは ASK 1を適当な蛋 白質分解酵素を用いて消化することにより得ることができる。 また、 ASK1お よび N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べプチドは、 自体公知の遺伝子 工学的手法に従ってそれをコードする DNAをクローニングした後、 前記した A
BP 1の発現方法に従って組換え生産することもできる。
ABP 1および本発明の活性化ペプチド （以下、 単に ABP 1という場合があ る） は、 上記の方法に従って調製することができる。
ASK 1を産生する細胞としては、 それを発現するヒトまたは他の温血動物細 胞であれば特に制限はないが、 例えば、 HeLa細胞、 HEK293細胞等が挙げられる。 また、 ASK 1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチド （以 下、 単に ASK1という場合がある） を産生する細胞としては、 上記の遺伝子ェ 学的手法により作製された形質転換体が例示される。
被検物質としては、 例えば蛋白質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 こ れらの物質は新規なものであってもよいし、 公知のものであってもよい。
結合量の測定は、 例えば、 標識した抗 ABP 1抗体および抗 ASK1抗体を用 いたウエスタンプロット解析、 AB P 1または ASK1のいずれかを標識 （例え ば、 〔3H〕、 〔125 I〕、 〔14C〕、 〔35S〕 などで） しての結合アツセィゃゲルシ フトアツセィ、 あるいは表面プラズモン共鳴 （SPR) などにより行うことがで さる。
上記のスクリーニング方法において、 ASK 1と結合して ABP 1と ASK 1 との結合を阻害する化合物を A S K 1活性化調節物質として選択することができ る。
本スクリーニング方法において、 AB P 1と AS K 1との反応は、 通常約 3 7 °Cで数時間程度行うことができる。
例えば、 標識 ABP 1を用いた結合アツセィにより上記のスクリーニング方法 を実施するには、 まず、 ASK1またはそれを産生する細胞をスクリーニングに 適したバッファ一に懸濁することにより ASK 1標品を調製する。 バッファ一は、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩 酸バッファーなどの、 ABP 1と ASK1との結合を阻害しないバッファーであ ればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 T we e n-80™ (花王—アトラス社）、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの 界面活性剤をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる A B P 1や ASK 1の分解を抑える目的で、 PMSF、 ロイぺプチン、 バシトラシ ン、 ァプロチニン、 E—64 (タンパク質研究所製）、 ぺプスタチンなどのプロ テア一ゼ阻害剤を添加することもできる。
一方、 細胞が固定化細胞の場合、 培養器に固定化させたまま、 つまり細胞を生 育させた状態で、 あるいはダルタルアルデヒドゃパラホルムアルデヒドで固定し た細胞を用いて、 ABP 1と ASK 1を結合させることができる。 この場合、 該 緩衝液は培地ゃハンクス液などが用いられる。
そして、 0.0 lml〜10mlの該 ASK 1標品に、 一定量 （例えば、 20 00 C i /mmo 1の場合、 約 1000ひ c pm〜 l O O O O O O c pm) の標 識した ABP 1 (例えば、 〔1251〕 で標識した ABP 1) を添加し、 同時に 1 0一4 M〜l 0— 1QMの被検物質を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知る ために大過剰の未標識の ABP 1を加えた反応チューブも用意する。 反応は 0°C 〜50° (、 望ましくは 4°C〜37°Cで 20分〜 24時間、 望ましくは 30分〜 3 時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過 （AS K1産生細胞を用いる場合） または BZF分離 （精製 ASK 1を用いる場合） し、 適量の同バッファ一で洗浄 した後、 ガラス繊維濾紙または固相に残存する放射活性 （例えば、 〔1251〕 の 量） を液体シンチレ一ションカウンターまたはァ一カウン夕一で測定する。 拮抗 する物質がない場合のカウント（B0)から非特異的結合量 （NSB) を引いた力 ゥント （B。一 NSB) を 100 %とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が、 例えばカウント （B。一 NSB) の 50%以下になる被検物質を ASK 1活性化 調節物質として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 ABP 1、 好ましくはさらに ASK 1ま たはそれを産生する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては次のものが挙げられるが、 これ に限定されるものではない。
〔スクリーニング用試薬〕 ①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 mのフィル夕一で濾過滅菌 し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
② A S K 1標品
HeLa細胞または HEK293細胞を 12穴プレートに 5X 105個 Z穴で継代し、 3 7 、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの。
③標識した ABP 1標品
ABP 1を 〔3H〕、 〔125 I〕、 〔14C〕、 〔35S〕 などで標識したもの。
④ ABP 1標準液
ABP 1を 0.1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで 0.1m Mとなるように溶解し、 一 20 で保存したもの。
〔測定法〕
① 12穴組織培養用プレートにて培養した ASK 1産生細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 ^ 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
② 10— 3〜10_1GMの被検物質溶液を 5 1加えた後、 5 nMの標識した AB P 1を 5 l加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには 被検物質のかわりに 10— 4Mの ABP 1を 5 1加えておく。
③皮応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 ABP 1を 0. 5m 1の 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体 シンチレ一ター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。 なお、 〔1251〕 で標 識されている場合は、 液体シンチレ一夕一と混合することなしに直接ガンマ一力 ゥンタ一で測定できる。
PMB= 100 X (B-NS B) / (B。一 NSB)
PMB ： Percent Ma imum Binding
B ：検体を加えた時の結合量 NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B 0 ：取大 ?p口口里
上記 （c) のスクリーニング法において用いられる細胞としては、 （1) AS K 1または N末端側活性化制御ドメインを含むその部分べプチドと転写因子 （例 えば、 GAL4、 VP16等） の DN A結合ドメインもしくは転写活性化ドメインのいず れか一方との融合蛋白質をコードする DNA、 (2) AB P Iまたは本発明の活 性化ペプチドと転写因子の他方のドメインとの融合蛋白質をコードする DNA、 および （3) 該転写因子により活性化されるプロモータ一の制御下にあるレポ一 夕一遺伝子を含有する細胞、 好ましくは酵母細胞、 哺乳動物細胞等が挙げられる。 レポ一夕一遺伝子としては、 例えば、 ルシフェラーゼ遺伝子、 iQ—ガラクトシダ ーゼ遺伝子、 アルカリフォスファターゼ遺伝子、 ペルォキシダーゼ遺伝子、 クロ ラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子、 グリーンフルオレセント プロテイン （GFP) 遺伝子などが挙げられる。
本スクリーニング方法において、 上記の細胞を、 使用する宿主細胞に適合した 培養条件下で数時間〜 1日程度培養した後、 細胞抽出液または上清液を得て、 常 法によりレポ一ター遺伝子の検出を行う。
上記のスクリーニング方法において、 レポーター遺伝子の発現を阻害する化合 物を A S K 1活性化調節物質として選択することができる。
(B) ASK1の活性化を指標とするスクリ一ニング方法
ABP 1と ASK1との相互作用に及ぼす被検物質の効果を A SKIの活性化 を測定することにより調べれば、 該物質が ASK 1の活性化を阻害するか、 ある いは促進するかを直接評価することができる。 すなわち、 本発明は、 ASK1ま たは N末端側活性化制御ドメインおよびキナ一ゼドメインを含むその部分べプチ ドを産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドの活性化を、 （1) AB P 1または本発明の活性化ペプチドの存在下と、 （2) ABP 1または本発明の 活性化ペプチドおよぴ被検物質の存在下とで、 測定 ·比較することによる ASK 1活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング法において、 AS K 1または N末端側活性化制御ドメインぉ よびキナ一ゼドメインを含むその部分ペプチドを産生する細胞 （以下、 単に AS K1産生細胞という場合がある） としては、 ASK 1を内因的に産生する細胞 (例、 HeLa細胞、 HEK293細胞等） や、 A S K 1または N末端側活性化制御ドメィ ンおよびキナーゼドメインを含むその部分べプチドをコードする DNAを導入さ れた動物細胞などが挙げられる。 N末端側活性化制御ドメインおよびキナーゼド メインを含む A S K 1の部分べプチドとしては、 前記特許文献 1 (特開平 10— 93) の配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜936で 示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部 （以下、 包括的に 「ASK1— NK配 列」 と称する） と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 且つ AB P 1と結合することにより活性化され得るペプチドが挙げられる。 ここで 「実質 的に同一のアミノ酸配列」 としては、 上記ヒト ASK1 _NK配列と約 70%以 上、 好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 特に好ましくは 約 95%以上、 最も好ましくは約 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列など が挙げられる。
また、 上記部分ペプチドには、 例えば、 ① ASK1— NK配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ま しくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ② ASK1— NK 配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個 程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③ ASK1— NK配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ま しくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が挿入さ れたアミノ酸配列、 ④ ASK 1—NK配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または⑤それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有する変異ペプチドも含まれる。
ABP 1または本発明の活性化ペプチド （以下、 単に ABP 1という場合があ る） は外部から細胞に添加してもよいし、 あるいは ASK 1産生細胞自体が産生 するものであってもよい。 後者の場合、 ABP 1は内因的に産生されてもよいし、 ASK 1産生細胞を宿主として上記 A BP 1の発現方法に従って遺伝子工学的に 作製された形質転換体であってもよい。
被検物質としては、 例えば蛋白質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 こ れらの物質は新規なものであってもよいし、 公知のものであってもよい。
ASK 1の活性化は、 ASK 1の自己リン酸化、 AS K1カスケードの下流に 位置するキナ一ゼ （例えば、 MKK4/7、 M K3/6, JN , p38等） や ASK 1の基質と なり得る他の蛋白質もしくは合成べプチドのリン酸化、 細胞死誘導率などを測定 することにより評価することができる。
具体的には、 まず ASK 1産生細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 ス クリーニングを行うにあたっては、 前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示 さない適当なバッファーに交換し、 被検物質 （細胞が ABP 1を産生しない場合 はさらに ABP 1) などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出 あるいは上清液を回収して、 生成した産物や現象をそれぞれの方法に従って定量 する。
ASK1や他の蛋白質もしくはべプチドのリン酸化の検出は、 リン酸化蛋白質 (ペプチド） 特異的抗体を用いたウェスタンプロット解析や、 基質蛋白質 （ぺプ チド） における [32P] 標識 ATPの取込みをゲル電気泳動およびオートラジオ グラフィ一により検出する等の方法により行うことができる。
細胞死アツセィは、 ABP 1の発現を確認できる系 （例えば、 ABP 1と蛍光 蛋白質との融合蛋白質をコードする DNAを導入した細胞、 あるいは選択マーカ 一遺伝子をさらに含む ABP 1発現べクタ一を導入した細胞） において、 プレー 卜からの剥離や形態学的観察 （例、 膜のブレツビング、 断片化等） などを指標と して、 全 ABP 1発現細胞中の死細胞の割合を算出することにより行うことがで きる。
上記のスクリーニング方法において、 AS K1産生細胞に被検物質を添加した 際に A S K 1が活性化された場合、 該物質を A S K 1活性化促進物質として選択 することができる。 一方、 被検物質を添加した際に ASK 1が不活性化された場 合、 該物質を A S K 1活性化阻害物質として選択することができる。
(C) ABP 1の発現量を変化させる物質のスクリーニング方法
本発明のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドをプローブとして用いる ことにより、 あるいは本発明の抗体を用いることにより、 ABP 1の発現量を変 化させる物質をスクリーニングすることができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （ i) 非ヒト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定の臓 器、 c) 臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等に含ま れる ABP 1の mRNA量または ABP 1蛋白質量を測定することによる、 AB P 1の発現量を変化させる物質、 従って A S K 1活性化調節物質のスクリ一ニン グ方法を提供する。
例えば、 AB P 1の mRNA量または蛋白質量の測定は具体的には以下のよう にして行う。
( i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して、 薬剤 (例えば、 T NF— a、 I L— 1、 F a s、 抗癌剤など） あるいは物理化学的ストレス （例え ば、 UV、 活性酸素、 虚血など） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あ るいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など）、 または臓器から単離した組 織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる AB P 1の mRNAは、 例えば、 通常の方法により細 胞等から mRNAを抽出し、 例えば、 RT— P C Rなどの手法を用いることによ り定量することができ、 あるいは自体公知のノザンブロット解析により定量する こともできる。 一方、 ABP 1蛋白質量は、 通常の方法により細胞等から蛋白質 を抽出し、 例えば、 標識した抗 ABP 1抗体を用いたウエスタンプロット解析に より定量することができる。
(ii) ABP 1または本発明の活性化ペプチドを発現する形質転換体を上記の方 法に従って作製し、 該形質転換体に含まれる ABP 1または本発明の活性化ぺプ チド、 あるいはその mRNAを同様にして定量、 解析することができる。
AB P 1の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、 (i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理化学 的ス卜レスなどを与える一定時間前 （30分前〜 24時間前、 好ましくは 30分 前〜 12時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 24 時間後)、 または薬剤あるいは物理化学的ストレスと同時に被検物質を投与し、 投与後一定時間経過後 （30分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より 好ましくは 1時間後〜 24時間後）、 細胞に含まれる ABP 1の mRNA量、 ま たは蛋白質量を定量、 解析することにより行うことができ、
(Π) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検物質を培地中に混合させ、 一定 時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましくは 2日 後〜 3日後）、 該形質転換体に含まれる ABP 1または本発明の活性化ペプチド の mRNA量または蛋白質量を定量、 解析することにより行うことができる。 被検物質としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物などが挙げられ、 これら物質は新規な物質であってもよいし、 公知の物 質であってもよい。
上記のスクリーニング法において、 ABP 1の発現量を増加させる物質を AS K1活性化促進物質、 ABP 1の発現量を減少させる物質を ASK 1活性化阻害 物質として選択することができる。
上記 （A) 〜 （C) のスクリーニング方法を用いて得られる AB P 1またはそ の塩の発現または活性を増大させる物質 （ = ASK1活性化促進物質 （以下、 本 明細書においては同義で用いる）） は、 A S K 1カスケードによるシグナル伝達 を活性化して細胞にアポトーシスを誘導し得る。 従って、 細胞に ASK 1活性化 促進物質を添加することにより、 該細胞にアポトーシスを誘導することができ、 例えば、 アポ] ^一シス研究用の試薬として用いることができる。
ASK1活性化促進物質をアポト一シス誘発剤として使用する場合、 水もしく は適当な緩衝液 （例、 リン酸緩衝液、 PBS、 トリス塩酸緩衝液など） 中に適当 な濃度となるように溶解することにより調製することができる。 また、 必要に応 じて、 通常使用される保存剤、 安定剤、 還元剤、 等張化剤等を配合させてもよい。 上記のように、 A S K 1活性化促進物質は細胞にアポ卜一シスを誘導する機能 を有するので、 A B P 1の減少もしくは他の要因により不要な細胞や異常細胞の アポトーシスによる除去が期待できない患者がいる場合に、 A S K 1活性化促進 物質を該患者に投与して A S K 1を活性化することによって、 患者の体内におけ る異常細胞や不要となった細胞に A S K 1カスケードを介するアポトーシスを誘 導することができる。
したがって、 A S K 1活性化促進物質を、 アポトーシスを誘発することが予 防 ·治療上有効な疾患、 例えば、 癌 （例、 白血病、 食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸 癌、 肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 メラノーマ、 骨 髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 （例、 全身性エリテマトーデス、 強皮 症、 慢性関節リウマチ、 シェ一ダレン症候群、 多発性硬化症、 インスリン依存性 糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小板減少性紫斑病、 クローン病、 糸球体 腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞白血病、 力ポジ肉腫、 伝染性単 核症、 リンパ腫、 上咽頭癌、 子宮顏癌、 皮膚癌、 肝炎、 肝癌等）、 内分泌疾患 (例、 ホルモン過剰症、 サイト力イン過剰症等）、 血液疾患 （例、 血球増加症、 B細胞リンパ腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰陽、 停留睾丸、 奇形腫、 腎 芽細胞癌、 多発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指症等）、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発などの予防 ·治療剤として使用することができる。
A S K 1活性化阻害物質を上記予防 ·治療剤として使用する場合、 前記した A B P 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にし て製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 トリなど） に対して投与するこ とができる。
A S K 1活性化促進物質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 0 k gと して） においては、 一日につき約 0 . l m g〜 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） におい ては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程 度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
一方、 上記 （A) 〜 （C) のスクリーニング方法を用いて得られる ABP 1ま たはその塩の発現または活性を減少させる物質 （ = ASK1活性化阻害物質 （以 下、 本明細書においては同義で用いる）） は、 ASK 1カスケードによるシグナ ル伝達を阻害して細胞のアポトーシスや炎症性サイトカインの産生を抑制し得る。 従って、 細胞に ASK 1活性化阻害物質を添加することにより、 該細胞のアポト 一シス/炎症性サイト力イン産生を抑制することができ、 例えば、 アポ卜一シス、 炎症反応などの研究用試薬として用いることができる。
ASK1活性化阻害物質をアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤 として使用する場合、 水もしくは適当な緩衝液 （例、 リン酸緩衝液、 PBS、 ト リス塩酸緩衝液など） 中に適当な濃度となるように溶解することにより調製する ことができる。 また、 必要に応じて、 通常使用される保存剤、 安定剤、 還元剤、 等張化剤等を配合させてもよい。
上記のように、 ASK 1活性化阻害物質は細胞のアポトーシスや炎症性サイト 力インの産生を抑制する機能を有するので、 ABP 1の増加等により生体にとつ て必要な細胞までがアポトーシスによって失われている、 あるいは炎症性疾患を 発病している患者がいる場合に、 ASK 1活性化阻害物質を該患者に投与して A SKIの活性化を阻害することにより、 本来必要な細胞のアポト一シス死や炎症 反応を抑制することができる。
したがって、 ASK1活性化阻害物質を、 アポ] ^一シスまたは炎症を抑制する ことが予防 ·治療上有効な疾患、 例えば、 ウィルス感染症 （例、 A I DS、 イン フルェンザ、 不明熱等）、 内分泌疾患 (例、 ホルモン欠乏症、 サイトカイン欠乏 症等）、 血液疾患 （例、 血球減少症、 腎性貧血等)、 臓器形成不全 （例、 甲状腺萎 縮、 口蓋裂等）、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患 （例、 ポリグルタミン病、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 小脳変性症等)、 虚血性心疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞等）、 放射線 障害、 紫外線障害 （例、 日焼け等） 中毒性疾患 （例、 重金属による腎尿細管細胞 傷害、 アルコールによる肝細胞傷害等）、 栄養障害 （例、 ビタミン、 微量元素欠 乏による胸腺の萎縮等）、 炎症性疾患 （例、 急性塍炎、 関節炎、 歯周病、 大腸炎 等)、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管系疾患 （例、 動脈硬化等)、 呼吸 器系疾患 （例、 間質性肺炎、 肺繊維症等）、 軟骨疾患 （例、 変形性関節炎等） な どの疾患の予防 ·治療剤として用いることができる。
ASK 1活性化阻害物質を上記予防 ·治療剤として使用する場合、 前記した A BP 1もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にし て製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジー、 トリなど） に対して投与するこ とができる。
ASK 1活性化阻害物質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 ポリグルタミン病患 者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜100mg、 好ま しくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜 20 mgである。 非経口 的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 ポリグルタミン病 患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好 ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投 与することができる。
(8) ABP 1をコードする DNAを導入した動物およびその用途
本発明は、 ABP 1をコードする外来性の DNA (以下、 本発明の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場 合がある） を有する非ヒ卜哺乳動物の新規用途を提供する。
本発明で使用される非ヒト哺乳動物は、
〔1〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 〔2〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 記載の動物、
〔3〕 ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 〔2〕 記載の動物である。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病態動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57B LZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B e C S Fi系統， BDF 系 統， B 6 D 2 F i系統, BALBZc系統， I CR系統など) またはラッ卜 (例 えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒ卜哺乳動物が本来有している ABP 1をコー ドする DNAではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された ABP 1をコ一 ドする DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の ABP 1をコードする DNAの塩基配列に 変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含ま れる。
該異常 DNAとしては、 異常な ABP 1を発現させる DNAを意味し、 例えば、 正常な ABP 1の機能を抑制する異常 ABP 1を発現させる DNAなどが用いら れる。
本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の外来性 DN Aを対象動物に転移させる にあたっては、 該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 ヒト AB P 1をコードする DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い ABP 1の DN Aを有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕 ―、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモータ一の下流 に、 ヒト ABP 1をコードする DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 ベ クタ一など) を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジ ェクションすることによって A BP 1をコードする DNAを高発現する DNA転 移哺乳動物を作出することができる。
ABP 1の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプ ラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファージ、 モロ 二一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまたはバキュ口 ウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラス ミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用い られる。
上記の DNA発現調節を行うプロモーターとしては、 例えば、 ①ウィルス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウイ ルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモ一夕一、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロ ブラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチン キナ一ゼ、 グリァ線維性酸性夕ンパク質、 ダル夕チオン S—トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K l , K 1 0および K 1 4、 コラーゲン I型お よび I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ j8 Iサブユニット、 ジ スト口フィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性 因子、 内皮レセプ夕一チロシンキナーゼ （一般に T i e 2と略される）、 ナトリ ゥムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K— ATP a s e)、 ニューロ フィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1 組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L)、 H— r a s、 レニン、 ド ーパミン /3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TP〇）、 ペプチド鎖延長 因子 l a (EF— 1 ο 、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1 および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブ リン、 H鎖可変部 （VNP；)、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 a;ァクチン、 プレブ口エンケフアリン A、 バソプレシンな どのプロモータ一などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能な サイトメガロウィルスプロモータ一、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a; (EF— 1 ) のプロモ一ター、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロモ一夕一などが好適で ある。
上記べクタ一は、 DN A転移哺乳動物において目的とする mRN Aの転写を終 結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有していることが好ましく、 例 えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの配列を用いることがで き、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネタ一などが用いられる。 その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5 ' 上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流 に連結することも目的により可能である。 正常な A B P 1の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D N Aおよび市販の各種ゲノム D N Aライブラリー よりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞等由来の R N Aより公知の方法により調製された相補 D N Aを原料と して取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D N Aは、 上記の細胞または組 織より得られた正常な A B P 1の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻 訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D N Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 . 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D NAを過剰に有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の外来性正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが 高発現させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終的 に A BP 1の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として利用 することができる。 例えば、 本発明の正常 DNA転移動物を用いて、 ABP 1の 機能亢進症や、 ABP 1が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の 治療方法の検討を行うことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 ABP 1の増加症 状を有することから、 ABP 1の機能亢進に関連する疾患、 例えば、 ウィルス感 染症 （例、 A I DS、 インフルエンザ、 不明熱等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモン 欠乏症、 サイ卜力イン欠乏症等)、 血液疾患 （例、 血球減少症、 腎性貧血等)、 臓 器形成不全 （例、 甲状腺萎縮、 口蓋裂等）、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免 疫不全、 神経変性疾患 （例、 ポリグルタミン病、 アルツハイマー病、 パーキンソ ン病、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 小脳変性症等）、 虚血性心疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞等）、 放射線障害、 紫外線障害 （例、 日焼け等） 中毒性疾患 (例、 重金属による腎尿細管細胞傷害、 アルコールによる肝細胞傷害等）、 栄養 障害 （例、 ビタミン、 微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、 炎症性疾患 （例、 急 性塍炎、 関節炎、 歯周病、 大腸炎等）、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血 管系疾患 （例、 動脈硬化等）、 呼吸器系疾患 （例、 間質性肺炎、 肺繊維症等）、 軟 骨疾患 （例、 変形性関節炎等） などの疾患に対する予防 ·治療薬のスクリーニン グ試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの DNAコン ストラク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 DNAが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の外来性異常 DN Aを有することを意味する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の 動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを有するように繁殖継代する ことができる。
本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 DNAが 高発現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的 に ABP 1の機能不活性型不応症 （例えば、 癌 （例、 白血病、 食道癌、 胃癌、 大 腸癌、 直腸癌、 肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 メラ ノーマ、 骨髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 （例、 全身性エリテマト一 デス、 強皮症、 慢性関節リウマチ、 シェ一ダレン症候群、 多発性硬化症、 インス リン依存性糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小板減少性紫斑病、 クローン 病、 糸球体腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞白血病、 力ポジ肉腫、 伝染性単核症、 リンパ腫、 上咽頭癌、 子宮頸癌、 皮膚癌、 肝炎、 肝癌等）、 内分 泌疾患 （例、 ホルモン過剰症、 サイト力イン過剰症等）、 血液疾患 （例、 血球増 加症、 B細胞リンパ腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰陽、 停留睾丸、 奇形 腫、 腎芽細胞癌、 多発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指症等） など） となること があり、 その病態モデル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異 常 DNA転移動物を用いて、 ABP 1の機能不活性型不応症の病態機序の解明お よびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DNA高発現動物は、 AB P 1の機能不活性型不応症における異常 AB P 1による正常 AB P 1の機能阻害 (dominant negative作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、 異常 ABP 1の増加 症状を有することから、 ABP 1の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリ一 エング試験にも利用可能である。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 ABP 1の機能不活性型不応症を 含む、 ABP 1に関連する疾患の予防 ·治療薬の開発を行なうために、 上述の検 査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患予防 ·治療薬のスクリー二 ング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物または本発 明の外来性 DNA発現ベクターを用いて、 ABP 1が関連する疾患の遺伝子治療 法を検討、 開発することが可能である。
(9) ノックアウト動物
本発明で用いられる ABP 1 DNA発現不全非ヒト哺乳動物胚幹細胞および ABP 1 DN A発現不全非ヒ卜哺乳動物は、
〔1〕 ABP 1をコードする DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、 〔2〕 該 DNAがレポ一タ一遺伝子 （例、 大腸菌由来の i3—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔3〕 ネオマイシン耐性である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔4〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔5〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔4〕 項記載の胚幹細胞、
〔6〕 ABP 1をコードする DN Aが不活性化された該 DN A発現不全非ヒト哺 乳動物、
〔7〕 該 DNAがレポ一ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一ター遺伝子 ABP 1をコ ードする DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 〔6〕 項記載の非 ヒ卜哺乳動物、
〔8〕 非ヒ卜哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔6〕 項記載の非ヒ卜哺乳動物、 〔9〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔8〕 項記載の非ヒト哺乳動物である。
ABP 1をコードする DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳動物が有する ABP 1 DNAに人為的に変異を加えることにより、 該 DNAの発現能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている ABP 1の 活性を実質的に喪失させることにより、 該 DNAが実質的に ABP 1の発現能を 有しない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト哺乳 動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。 ABP 1をコードする DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入ま たは置換させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊 することにより本発明のノックアウト DN Aを作製すればよい。
ABP 1をコードする DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記す る） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する ABP 1 DNAを単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシ ン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (]S—ガラクトシ ダ一ゼ遺伝子）、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遗 伝子） を代表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を 破壊するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 （例えば、 polyA付加シグナルなど） を挿入し、 完全な mRNAを合 成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壌するように構築した DNA 配列を有する DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例え ば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について AB P 1 DN A上あるいはその近傍の DN A配列をプローブとしたサザンハイブリ ダイゼ—ション解析あるいはタ一ゲッティングベクタ一上の DNA配列とターゲ ッティングベクター作製に使用した AB P 1 DNA以外の近傍領域の DNA配 列をプライマ一とした P C R法により解析し、 本発明のノッ^アウト E S細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により ABP 1をコードする DNAを不活化させる元の ES細胞としては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されてい るが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に 遺伝的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BL/6 マウスや C 57 BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 B LZ6と DB A/2との F を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であ るという利点に加えて、 C 57 BL/ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて 得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57BLZ6マウスと バッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代えることが 可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で きる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1- 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 で培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001— 0. 5 %トリプシンノ 0.1— 5 mM EDTA、 好ましくは約 0. 1 %トリづシノ、 / ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に 播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜3日毎に行うが、 こ の際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細 胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロ シーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ユーエス ェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ) 第 78巻、 7634頁、 1981年 ； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル 'ォブ .ェンブリオロジ一.アンド .ェクスぺリメ ンタル 'モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁、 1985年〕、 本発明の ES細胞を分化さ せて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、 インビト口における ABP 1の細 胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し た夕一ゲッティングベクタ一をマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕一ゲッティングベクタ一の ABP 1 DNAが不活性化された D N A 配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上 の ABP 1 DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 ABP 1をコ ードする DNAをノックアウトさせることができる。 ABP 1をコードする DNAがノックアウトされた細胞は、 ABP 1 DNA 上またはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼ一シヨン 解析または夕一ゲッティングベクター上の DN A配列と、 ターゲッティングべク ターに使用したマウス由来の AB P 1 D N A以外の近傍領域の DN A配列とを プライマーとした PCR法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物 胚幹細胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 ABP 1をコードする DN Aが不活性化された細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠 させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な ABP 1遺 伝子座をもつ細胞と人為的に変異した ABP 1 DNA座をもつ細胞との両者か ら構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した ABP 1 DNA座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全て の組織が人為的に変異を加えた ABP 1 DNA座をもつ細胞で構成された個体 を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等により選別することにより得られる。 このよ うにして得られた個体は、 通常、 ABP 1のへテロ発現不全個体であり、 ABP 1のへテロ発現不全個体同士を交配し、 それらの産仔から ABP 1のホモ発現不 全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で DN A溶液を注入することによりターゲッティングベクタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより ABP 1 DNA座 に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして ABP 1 DNAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 DNAがノックアウトされていることを確認して通常の 飼育環境で飼育継代を行うことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 DN Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 DN Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴ一ト複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一トおよびへテ ロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
ABP 1 DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の DN A発現不全非ヒ卜哺乳動物を作出する上で非常に有用である。
また、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 ABP 1により誘導され得 る種々の生物活性を欠失するため、 ABP 1の生物活性の不活性化を原因とする 疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用 である。
(9 a) ABP 1 DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 '予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 ABP 1 DNAの欠損や損傷な どに起因する疾病、 例えば、 癌 （例、 白血病、 食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸癌、 肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 メラノーマ、 骨髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 （例、 全身性エリテマトーデス、 強皮症、 慢 性関節リウマチ、 シエーダレン症候群、 多発性硬化症、 インスリン依存性糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小板減少性紫斑病、 クローン病、 糸球体腎炎等）、 炎症 （例、 関節炎、 腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞白血病、 力 ポジ肉腫、 伝染性単核症、 リンパ腫、 上咽頭癌、 子宮顏癌、 皮膚癌、 肝炎、 肝癌 等)、 内分泌疾患 （例、 ホルモン過剰症、 サイ卜力イン過剰症等）、 血液疾患 （例、 血球増加症、 B細胞リンパ腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰陽、 停留睾丸、 奇形腫、 腎芽細胞癌、 多発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指症等） などに対して 治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 ABP 1 DNAの 欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などがあ げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であって もよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、 試験動物 （例えば、 担癌動物など） に試験化 合物を投与した場合、 例えば、 該試験動物の症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の 疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 A B P 1の欠損や損傷などによって引き起こされる上記疾 患に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用 いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した ABP 1または本発明の活性化ペプチドを含有する医薬と同様にして製造し、 使用することができる。
(9 b) ABP 1 DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする ABP 1 DNAに対する プロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング 方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 ABP 1 DN Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一ター遺 伝子が A BP 1 DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用い られる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 3—ガラクトシダ —ゼ遺伝子 （ 1 a c Z)、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ エラ一ゼ遺伝子などが好適である。
ABP 1 DN Aをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が ABP 1 DNAに対するプロモーター の支配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレース することにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 ABP 1をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の i3—ガラクト シダーゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 ABP 1の発現する組 織で、 ABP 1の代わりに /3—ガラクトシダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ一4—クロ口一 3—インドリル _jS—ガラクトピラノシド （X—g a 1 ) のような jS _ガラクトシダ一ゼの基質となる試薬を用いて染色することによ り、 簡便に ABP 1の動物生体内における発現状態を観察することができる。 具 体的には、 ABP 1欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで 固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 37 °C付近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を 1 m M EDTAZPB S溶液で洗浄することによって、 jS—ガラクトシダ一ゼ反応 を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 ABP 1 DNAに対するプロモータ一活 性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし い。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 (例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
ABP 1 DNAに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は、 ABP 1の発現を促進し、 ABP 1の機能を促進することができるので、 例えば、 ABP 1の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤などの医薬として使用するこ とができる。 具体的には、 該化合物は、 例えば、 癌 （例、 白血病、 食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸癌、 肺癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 メ ラノーマ、 骨髄腫、 骨肉腫、 脳腫瘍等）、 自己免疫疾患 （例、 全身性：
一デス、 強皮症、 慢性関節リウマチ、 シェ一ダレン症候群、 多発性硬化症、 スリン依存性糖尿病、 乾癬、 潰瘍性大腸炎、 特発性血小板減少性紫斑病、 クロ一 ン病、 糸球体腎炎等）、 ウィルス感染症 （例、 出血熱、 T細胞白血病、 力ポジ肉 腫、 伝染性単核症、 リンパ腫、 上咽頭癌、 子宮顏癌、 皮膚癌、 肝炎、 肝癌等）、 内分泌疾患 （例、 ホルモン過剰症、 サイ卜力イン過剰症等）、 血液疾患 （例、 血 球増加症、 B細胞リンパ腫、 多血症等）、 臓器過形成 （例、 半陰陽、 停留睾丸、 奇形腫、 腎芽細胞癌、 多発性嚢胞腎、 心 ·大動脈奇形、 合指症等）、 血管形成術 後再狭窄、 癌切除術後の再発などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬とし て使用することができる。
一方、 A B P 1 D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはそ の塩は、 A B P 1の発現を阻害し、 A B P 1の機能を阻害することができるので、 例えば、 A B P 1の発現過多に関連する疾患などの予防 ·治療剤などの医薬とし て有用である。 具体的には、 該化合物は、 例えば、 ウィルス感染症 （例、 A I D S、 インフルエンザ、 不明熱等）、 内分泌疾患 (例、 ホルモン欠乏症、 サイト力 イン欠乏症等)、 血液疾患 （例、 血球減少症、 腎性貧血等)、 臓器形成不全 （例、 甲状腺萎縮、 口蓋裂等）、 移植臓器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性 疾患 (例、 ポリグルタミン病、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側 索硬化症、 プリオン病、 小脳変性症等）、 虚血性心疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞 等）、 放射線障害、 紫外線障害 （例、 日焼け等） 中毒性疾患 （例、 重金属による 腎尿細管細胞傷害、 アルコールによる肝細胞傷害等）、 栄養障害 （例、 ビタミン、 微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、 炎症性疾患 （例、 急性塍炎、 関節炎、 歯周 病、 大腸炎等）、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管系疾患 （例、 動脈硬 化等)、 呼吸器系疾患 （例、 間質性肺炎、 肺繊維症等)、 軟骨疾患 （例、 変形性関 節炎等) などの疾患の予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用するこ とができる。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した A B P 1または本発明の活性化ペプチドを含有する医薬と同様にして製造し、 使用することができる。
このように、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 A B P 1 D N Aに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー ニングする上で極めて有用であり、 ABP 1 DNAの発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 AB P 1遺伝子のプロモ一ター領域を含有する DNAを使って、 その下 流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注入して いわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作製すれば、 組織および Zまたは時期特異的に該蛋白質を合成させ、 その生体での作用を検討することも 可能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポ一夕一遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 ABP 1そのものの体内での産生能 力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用 できる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号ある いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグァノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u
I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u ダル夕ミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
終止コドンに対応する
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基 P h ：フエニル基
TC ：チアゾリジン—4 (R) —カルポキサミド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s ： p―トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1
C12B z 1 2， 6—ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル
ZZ ：ベンジルォキシカルボニル
C 1一 z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r— Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t一ブトキシカルポニル
DNP ジニ卜口フエノール
TT rr tt ： トリチル
Bum t一ブトキシメチル
Fm o c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t 3， 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシー 4一ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2， 3-ジカルポキシイミド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号 1 ]
ヒト ABP 1 cDNAのアミノ酸コード領域の塩基配列を示す。
[配列番号 2]
ヒ卜 ABP 1のアミノ酸配列を示す。
[配列番号 3] マウス ABP 1 c DNAのアミノ酸コード領域の塩基配列を示す。
[配列番号 4]
マウス AB P 1のアミノ酸配列を示す。
[配列番号 5]
抗 ABP 1抗体 （ELA抗体） 作製用の抗原として用いたペプチドのアミノ酸 配列を示す。
[配列番号 6 ]
抗 ABP 1抗体 （LVR抗体） 作製用の抗原として用いたペプチドのアミノ酸 配列を示す。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明の範囲はそれ らによって何ら限定されるものではない。 実施例 1 ABP 1 cDNAのクローニング
ASK 1結合タンパク質を同定するために、 baitとしてヒト ASK 1のキナ一 ゼドメイン内の ATP結合部位 （709位） のリシン （K) をアルギニン （R) に置換した ASK1-KRを用い、 ヒト胎児脳由来の発現ライブラリ一を preyとして、 Brentのシステム [Zervosら， セル （Cell), 第 72巻， p.223_232， 1993； Gyuris ら， セル (Cell), 第 75巻， .791-803, 1993] を用いた酵母 two- hybrid法にてス クリーニングした。 その結果、 約 1200個の陽性クローンが得られた。 そのう ちの 1つは、 得られた塩基配列に基づいてデータベース検索を行うと、 "PGR 1" と命名された遺伝子の蛋白質コード領域の一部 （アミノ酸にすると 35〜1 27位に相当する部分） であった。 この遺伝子がコードしている蛋白質は 127 アミノ酸からなるが、 データべ一ス上の情報は遺伝子の構造に関するもののみで、 機能に関する報告はなかった。 そこでこの遺伝子の蛋白質をコードしている cD NA全長を PC R法によりクローニングした。 この蛋白質は ASK 1結合蛋白質 として同定されたことから、 ASK1 binding protein 1 (ABP 1) と命名した。 ホモロジ一検索により、 ABP 1にはマウスなどの哺乳類に類似分子が存在する ことが判明したが、 ハエや線虫などには高い相同性を持つ分子は見いだせなかつ た。 また、 モチーフ検索やドメイン検索を行っても、 既存のモチーフ、 機能ドメ インなどは存在しなかった。 図 1にヒトとマウスの ABP 1アミノ酸配列のァラ インメントを示す。 実施例 2 ABP 1 mRNAの発現分布
Multiple Tissue Northern Blot (CLONTECH) の Mouse (#7762-1) および Mouse Embryo (#7763-1) を使用し、 ヒト ABP 1 c D N Aの全長をプローブとして、 上記製品の使用書に従ってノザンプロットを行った。 その結果、 ABP 1の mR N Aの長さは約 1. 7 kbであり、 組織全体にュビキタスに発現していた （図 2 A)。 また、 マウス胎児プロットでも AB P 1の mRNAは胎生 7日という比較 的早期から発現が認められ、 胎生経過中に大きな変化は見られなかった （図 2 B)。 実施例 3 種々の動物細胞における ABP 1蛋白質の産生
次に、 AB P 1に対するゥサギのポリクローナル抗体を作製した。 ABP 1 cDNAの塩基配列から得られたアミノ酸配列情報をもとに、 ABP 1特異的べ プチド （配列番号 5および配列番号 6) を抗原とするペプチド抗体を 2種類作り、 それぞれを ELA抗体、 LVR折体と命名した。 抗体はどちらも抗原ペプチドに よるァフィ二ティーを利用して精製したものを使用した。
HeLa細胞と HEK293細胞は、 高濃度グルコース （4. 5mg/m 1 ) を含むダル ベッコの改変イーグル培地 （DMEM ; SIGMA) を培養液とし、 5 %C〇2存在 下に培養した。 培養液には 1 0%ゥシ胎仔血清 （FB S) と 100単位 Zm lぺ ニシリンを添加した。 ブ夕大動脈内皮 （PAE) 細胞培養は F 1 2培養液 (Invitrogen) に 1 0 %FB S、 1 OmM HEP E S 1 00単位/ m lぺニ シリンを添加して培養した。
各細胞は溶解バッファ一 [1 50mM NaC l， 2 OmM T r i s— HC 1 (pH7. 5), 1 OmM EDTA, 1 % T r i t on X - 1 00， 1 % デ ォキシコレート， 1. 5% ァプロチニン， ImM PMS F] を用いて溶解し、 溶解液を遠心して上清をとり、 SDSサンプルバッファ一 [l O OmM T r i s— HC 1 (pH8. 8)， 0. 01 % ブロモフエノールブルー， 36% グリ セロール， 4% SDS] を添加して SD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を行った。 ゲルから蛋白質を PVDF膜に転写し、 5% スキムミルク含有 TBS—T [15 OmM NaC 1, 5 OmM T r i s -HC 1 , (pH8. 0), 0. 05% Twe e n 20] で室温、 3時間のブロッキン グを行った後に、 各抗体と反応させた。 検出は ECL system (Amersham Pharmacia Biotech) を用いて行った。
HEK293細胞の培養細胞抽出液を E L A抗体および L V R抗体を用いてィムノブ ロット解析すると、 両抗体で同定されるバンドが約 17 kD aに認められた。 こ のバンドの検出位置は 2つの抗体で完全に一致していた。 また、 HEK293細胞に夕 グの付加されていない ABP 1を発現するプラスミド [?じ尺にて得た八：6？ 1 cDNAを pcDNA3 (Invitrogen, Inc.) にサブクローニングして作製] を遺伝子 導入して [FuGENE6 (Roche Diagnostics K.K) を使用書の通りに用いて行った] ABP 1蛋白質を過剰発現させると、 プラスミド量依存的に検出強度が増加した (図 3)。 一次抗体処理の際に抗原ペプチドを添加することによるペプチドプロ ックを行うとこのバンドは消失した。
このことから、 これらの抗体は ΑΒ Ρ 1を認識しており、 内在性の ABP 1蛋 白質を検出することができた。 HeLa細胞や ΡΑΕ細胞においても同様の結果が得ら れた。 実施例 4 ABP 1と ASK1との細胞内相互作用
F 1 a g-ABP 1および My c _ A S K 1の 2つの融合蛋白質を HEK293細胞 'で共発現させた。 細胞は溶解バッファ一 （上述） を用いて溶解し、 溶解液を遠心 後上清をとり、 抗 F 1 a g抗体 （Clone M2； SIGMA) と反応後、 Protein A - sepharose4B (Zyied Laboratories) を加えて 30分間インキュベーションし、 溶解バッファ一で 3回洗浄してから、 SDSサンプルバッファー （上述） を添加 し、 以下ィムノブロッテイング法と同様の手順で、 両蛋白質の結合を確認した (図 4 A)。 抗体は、 抗 F 1 a g抗体 （上述）、 抗 My c抗体 （Clone 9E10, Calbiochem) を用いた。 この結合は A S K 1の活性化因子である H202処理に より増強した。次に、 CFP—ABP 1および My c -ASK 1プラスミドを同 じく HEK293細胞に共発現させ、 抗 F 1 a g抗体により免疫沈降させた場合にも、 両者の結合が確認できた （図 4B)。 抗体は、 抗 F 1 ag抗体 （上述）、 抗 GFP 抗体 （Medical & Biological Laboratories CO.) を用いた。 この結合も H2〇2 処理により増強した。 このことから、 哺乳類細胞内でも ABP 1と ASK1が結 合し、 その結合は H202処理で増強することが判明した。 実施例 5 ABP 1に対する ASK 1の結合部位の同定
図 5 Aに示す HAタグ付きの各種 ASK 1欠損変異体と ABP 1との結合を、 実施例 3と同様に F 1 ag-ABP 1との共発現後に、 抗 F 1 a g抗体による免 疫沈降法にて検索した。 抗体は、 抗 HA抗体 （Clone 3F10, Roche Diagnostics K.K)、 抗 F 1 a g抗体 （Clone M2, SIGMA) を用いた。 AS Klの発現べクタ一 は Saitohら （上述） に記載されたものを使用した。 その結果、 ABP 1は、 AS K 1 -NT, ASK 1— Δ(3とは共沈したが、 ASK1—AN、 ASK1— Kと は共沈を示さなかった （図 5B)。 これにより、 AB P 1は ASK 1の N末端ド メインに結合することが判明した。 実施例 6 AB P 1による細胞死誘導
(1) ABP 1の細胞内局在や機能を調べるため、 HeLa細胞に免疫沈降実験でも 使用した AB P 1の N末端に C F Pを融合させた夕ンパク質を発現する C F P— AB P 1プラスミ ド [P C Rにて得た AB P 1 c DNAを、 pECFP-Cl (Clontech) にサブクローニングして作製] を遺伝子導入 [FuGENE6 (Roche Diagnostics K.K) を使用書の通りに用いて行った] により一過性に発現させて、 CFPの蛍光を蛍光顕微鏡で経時的に観察した。 蛍光顕微鏡下に C F Ρの蛍光を 示す細胞 （500個） のうち、 細胞がプレートから剥がれたり、 膜のブレツビン グ （blebbing) や断片化などの細胞死の形態を示すものの割合を計算した。 CF P陽性細胞につき計算した。
その結果、 CFP— ABP 1融合蛋白質による蛍光は、 CFP蛋白質のみを発 現させた場合と同様に、 細胞質と核の両方を含む細胞全体に存在していた。 さら に観察を続けると、 遺伝子導入後 24時間頃から CFP— ABP 1融合蛋白質を 発現している細胞は、 培養プレートから剥がれたり、 膜のブレツビングを認める など細胞死の所見を次々と示すようになった （図 6A)。 この細胞死を定量化す ると、 遺伝子導入後 36時間には、 CFP— ABP 1融合蛋白質を発現している 細胞の約 70 %にまで達した （図 6B)。 CFP蛋白質を単独で発現させてもこ のような現象はみられなかった。 また、 細胞内局在や細胞死誘導は、 ABP 1の C末端に CFPを融合させた蛋白質を発現させても同様であった。
•このことから、 ABP 1は細胞死誘導能を有する蛋白質であると考えられた。 (2) ABP 1による細胞死のメカニズムを明らかにする目的で、 PAE細胞にテ トラサイクリン依存的に ABP 1を発現誘導できる細胞系 0PAE-ABP1細胞） を確 立した。 PAE- ΑΒΠ細胞の作製は、 Takedaらの方法 (J. Biol. Chem. , 275, 9805- 9813, 2000) を一部改変して行った。 My cタグを付加した ΑΒ Ρ 1 cDNA 全長を pTet- Splice- neoベクターにサブクロ一ニングし、 これと pTet- tTAk- hygプ ラスミドを、 Takedaらの方法とは異なり PAE細胞に同時に遺伝子導入し、 500 n g/m 1 テトラサイクリン（Sigma)、 400単位 Zm 1 ハイグロマイシン B (Wako)、 240 m g/m 1 ネオマイシン （Geneticin, Life Technologies, Inc.) を添加した培養液中で培養して選択をかけ、 生き残ってコロニー形成した 細胞を PAE-ABP1細胞とした。 細胞の維持培養は前述の PAE細胞維持用の培養液に、 500 n g/m 1 テトラサイクリン、 200単位71111 ハイグロマイシン B、 3 Omg /m 1 ネオマイシンを添加して行った。
この PAE- ABP1細胞はテトラサイクリン存在下で培養すると AB P 1を発現しな いが、 テトラサイクリン非存在下におくことで約 6時間後にはィムノブロット解 析で My cタグ付きの ABP 1蛋白質の発現を確認できるようになり、 以後安定 して ABP 1の発現が認められる。 抗 My c抗体 （Clone 9E10, Calbiochem) に よる免疫染色を行うと、 ほとんどの細胞に安定して My c— AB P 1の発現を認 めた。 この細胞をテトラサイクリン除去下で培養すると、 HeLa細胞に ABP 1蛋 白質を一過性に発現させたときと同様に、 ABP 1蛋白質の発現に伴って細胞死 が誘導された （図 7A)。 全細胞中の死細胞の割合 （顕微鏡下に全細胞のうち細 胞死の形態を示す細胞の割合を計算した。 結果は 3視野の平均値で示した） を定 量すると、 テトラサイクリン除去後 48時間で約 55%に達した （図 7 B)。 こ の実験系においても AB P 1は細胞死を誘導することが確認できた。
(3) 上記 （1) および （2) の ABP 1による細胞死の形態学的特徴である膜 のブレツビングや細胞断片化などはアポト一シスの際にみられることが多い。 そ こで、 PAE-AB 細胞における細胞死がアポトーシスかどうかを、 DNA断片化の 有無で検討した。
ME- ABP1細胞 （2 X 106個） を 200m lの溶解バッファ一 [2 OmM T r i s一 HC 1 (pH 7. 5), 1 OmM EDTA, 0. 5 % T r i t on X 一 100] で溶解した。 溶解液を遠心して上清をとり、 0. 2mgZmlのプロ ティン Kで 42° C， 1時間処理した。 次に、 DNAをフエノールークロロフォ ルム抽出法とエタノール沈殿法で精製し、 これを 0. 2mg/m l リポヌクレ ァ一ゼ Aを含む T Eバッファ一 ( 1 OmM T r i s - HC 1 , 1 mM EDT A) に再度溶解して、 2 %ァガロースゲルで電気泳動後、 ェチジゥムブロマイド で染色して泳動パターンを撮影した。
その結果、 PAE- ABP1細胞は、 顕微鏡で観察した際の細胞死出現の時期と一致し て、 ABP 1蛋白質発現に伴って DNAラダ一を形成した （図 8)。 このことか ら、 ABP 1による細胞死は、 DNA断片化を伴ういわゆるアポトーシスである ことがわかった。このことは、 ；PAE-ABP1細胞のTUNEL染色でも確認できた。
(4) アポト一シスの際の DNA断片化は、 通常はカスパーゼの活性化に引き続 いて起こる。 そこで、 PAE- ABP1細胞を用いて ABP 1蛋白質発現誘導時における カスパーゼー 3活性測定を行った。 測定は、 CPP32/caspase- 3 fluorometric protease assay kit (MBL) を用いて、 合成蛍光ペプチド DEVD-7- amino - 4- trifluororaethyl coumarine (AFC) を基質として行った。 遊離した AFCは 蛍光分光光度計を用いて、 励起波長 360 n.m、 蛍光波長 530 nmにて蛍光強 度を測定した。 各サンプルについて 2回測定した。 結果はテトラサイクリンを除 去していない時の値を 1とする相対値で示した。
その結果、 細胞死と前後してカスパーゼー 3活性は上昇していた （図 9A)。 ABP 1による細胞死がカスパーゼ依存性であるかを検討するために、 同じ PAE- ABP1細胞を用いて、 テトラサイクリン除去と同時にカスパーゼ阻害剤である zVAD-fmk (Peptide Institute, Inc.) で処理すると、 テトラサイクリン除去後 18時間という早い時間帯では細胞死がほとんど抑えられた （図 9B)。 これに より、 ABP 1による細胞死はカスパーゼ依存性アポト一シスであると結論した。 実施例 7 ABP 1の細胞死誘導領域の同定
前述の通り、 ABP 1は既存のアポトーシス関連因子の機能ドメインを持たな い。 そこで、 ABP 1によるアポトーシスに必要なドメインを調べるため、 図 1 0 Aに示す各種 A B P 1欠損変異体と C F Pとの融合蛋白質を発現するプラスミ ドを作り、 実施例 6 (1) と同様に HeLa細胞に発現させて細胞死の有無を検討し た。 AB P 1の発現べクタ一は、 PCRにて得た AB P 1 cDNAあるいは ABP 1欠損変異体 c DNAAを、 pECFP- CI (Clontech) にサブクローニングして作製 した。 各プラスミドの細胞への遺伝子導入は、 FuGENE6 (Roche Diagnostics Κ. Κ) を使用書の通りに用いて行った。
その結果、 AC (1-72)は野生型よりむしろ強い細胞死誘導能を示すが、 N末端 を欠損させて行くにつれて、 ΔΝ(34- 127)、 △ Ν (65-127)と細胞死誘導能は低下 していた （図 10Β)。 このことから、 細胞死誘導能に関しては AB Ρ 1の Ν末 端側が重要であると考えられた。 実施例 8 ABP 1の ASK1シグナル伝達系への影響
1^£- 8?1細胞を用ぃて八8？ 1発現誘導時の J ΝΚと ρ 38の活性化をそれぞ れの抗リン酸化蛋白質抗体を用いて検討した。 抗体は、 抗リン酸化 J NK抗体 (Cell Signaling), 抗リン酸化 p 38抗体 (Cell Signaling), 抗リン酸化 AS K1抗体 （Tobiumeら， EMB0 Rep.， 2, 222 - 228, 2001) を使用した。 細胞は、 実施例 4と同様に溶解バッファ一 （上述） を用いて溶解し、 溶解液を遠心後上清 をとり、 抗 My c抗体 （Clone 9E10, Calbiochem) と反応後、 Protein A- sep arose4B (Zyied Laboratories) を加えて 30分間インキュベーションし、 溶解バッファーで 3回洗浄してから、 SDSサンプルバッファー （上述） を添加 し、 以下ィムノブロッテイング法と同様の手順で行った。
テトラサイクリン除去により、 ABP 1蛋白質の発現に伴う細胞死が著明にな るのに先んじて、 12時間後には JNKと p 38の活性化が認められ、 これが以 後も持続していた （図 1 1A)。 そこで、 ASK 1の活性化を同じく PAE- ABP1細 胞を用いて検討したところ、 J NKと p 38と同様に、 テトラサイクリン除去後 12時間で ASK 1の活性化も認められた （図 1 1 B)。 このことから、 ABP 1の過剰発現により A S K 1シグナル伝達系が活性化されると考えられた。 産業上の利用可能性
本発明の A B P 1は、 A S K 1カスケ一ドを活性化して細胞にアポト一シスを 誘導したり、 炎症性サイト力インの産生を誘導する作用を有する。 従って、 本発 明の ABP 1、 それをコードするポリヌクレオチド等は、 細胞にアポトーシスを 誘導することにより予防 ·治療効果が期待できる疾患の予防 ·治療剤として有用 である。 一方、 本発明の ABP 1抑制薬 （例えば、 抗 ABP 1抗体、 ABP 1ァ ンチセンスポリヌクレオチド等) は、 アポトーシスや炎症性サイトカインの産生 を抑制するので、 アポトーシスを抑制することにより予防 ·治療効果が期待でき る疾患、 あるいは炎症性疾患の予防 ·治療剤として有用である。 さらに、 本発明 の ABP 1および ASK 1を用いることにより、 アポ] シスまたは炎症関連疾 患の新規予防 ·治療薬のスクリーニング手段が提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは 実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 且つ A S K 1を活性化し得るぺプチドま たはその塩。
2 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列中約 6 0アミノ酸以上 からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す る請求項 1記載のぺプチドまたはその塩。
3 . 部分ァミノ酸配列が N末端側の配列である請求項 2記載のぺプチドまたはそ の塩。
4 . 請求項 1記載のぺプチドをコ一ドする塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
5 . 配列番号 1または配列番号 3に示される塩基配列の一部と同一もしくは実質 的に同一の塩基配列を含有する請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一。
7 . 請求項 6記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
8 . 請求項 7記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から請求項 1記載のぺ プチドまたはその塩を採取することを特徴とする該ペプチドまたはその塩の製造 方法。
9 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 且つ A S K 1を活性化しないか、 もしく は不活性化し得るペプチドまたはその塩。
1 0 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列中約 3 5アミノ酸以 下からなる部分ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する請求項 9記載のぺプチドまたはその塩。
1 1 . 部分アミノ酸配列が N末端側の配列である請求項 1 0記載のペプチドまた はその塩。
1 2 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチド、 ま たはその塩を含有してなる A S K 1活性化促進剤。
1 3 . アポト一シス誘発剤である請求項 1 2記載の剤。
1 4 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチド、 ま たはその塩を含有してなる医薬。
1 5 . アポト一シスを誘発することが予防. ·治療上有効な疾患の予防 ·治療剤で ある請求項 1 4記載の医薬。
1 6 . 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓 器過形成、 血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択され る請求項 1 5記載の医薬。
1 7 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のペプチドをコ ―ドする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる A S K 1活性化促 進剤。
1 8 . アポトーシス誘発剤である請求項 1 7記載の剤。
1 9 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチドをコ ―ドする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
2 0 . アポトーシスを誘発することが予防 ·治療上有効な疾患の予防 ·治療剤で ある請求項 1 9記載の医薬。
2 1 . 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓 器過形成、 血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択され る請求項 2 0記載の医薬。
2 2 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコ一ドする塩基配列もしくはその一 部を含有するポリヌクレオチドを含有してなるアポト一シスまたは炎症関連疾患 の診断薬。
2 3 . 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓 器形成異常、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発、 移植臓器拒絶、 移植片対 宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中 毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管系 疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項 2 2記載の 診断薬。
2 4 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコ一ドする塩基配列と相補的な塩基 配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなる A S K 1活性 化阻害剤。
2 5 . アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である請求項 2 4記載 の剤。
2 6 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基 配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
2 7 . アポ卜一シスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の予 防 ·治療剤である請求項 2 6記載の医薬。
2 8 . 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移植臓 器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神 経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請 求項 2 7記載の医薬。
2 9 . 配列番号 5または配列番号 6に示されるアミノ酸配列を特異的に認識し得 ることを特徴とする、 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する 抗体。
3 0 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有して なるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断薬。
3 1 . 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓 器形成異常、 血管形成術後再狭窄、 癌切除術後の再発、 移植臓器拒絶、 移植片対 宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中 毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神経障害、 血管系 疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項 3 0記載の
3 2 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有して なる A S K 1活性化阻害剤。
3 3 . アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である請求項 3 2記載 の剤。
3 4 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有して なる医薬。
3 5 . アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の予 防 ·治療剤である請求項 3 4記載の医薬。
3 6 . 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移植臓 器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神 経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請 求項 3 5記載の医薬。
37. 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチドまた はその塩あるいはそれを産生する細胞を用いることを特徴とする、 ASK 1活性 化調節物質のスクリーニング方法。
38. ASK1もしくは N末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまた はその塩あるいはそれを産生する細胞をさらに用いることを特徴とする、 請求項 37記載の方法。
39. 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチドまた はその塩と、 ASK1もしくは N末端活性化制御ドメインを含むその部分べプチ ドまたはその塩との結合性を測定することを特徴とする、 請求項 38記載の方法。
40. 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチドまた はその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、 ASK 1活性化調節物質の スクリーニング用キッ卜。
41. さらに、 ASK1もしくは N末端活性化制御ドメインを含むその部分ぺプ チドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、 請求項 40記載の キット。
42. ASK1もしくは N末端活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含 むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞における A S K 1もしくは該部 分べプチドまたはその塩の活性化を、 （1 )配列番号 2または配列番号 4に示され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質も しくは請求項 1記載のペプチドまたはその塩の存在下と、 （2)配列番号 2または 配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列 を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチドまたはその塩および被験物質 の存在下で比較することを特徴とする、 請求項 3 8記載の方法。
4 3 . ( 1 )配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチド またはその塩、 および（2) A S K 1もしくは N末端活性化制御ドメインおよびキ ナ一ゼドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞における A S K Iもしくは該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、 被験物質の存在下と非 存在下で比較することを特徴とする請求項 3 8記載の方法。
4 4 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項 1記載のぺプチドまた はその塩を産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドまたはその塩の発 現を、 被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、 A S K 1活性 化調節物質のスクリーニング方法。
4 5 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるァミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一 部を含有するポリヌクレオチド、 あるいは配列番号 2または配列番号 4に示され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質ま たはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする、 請求項 4 4記載の方法。
4 6 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一 部を含有するポリヌクレオチド、 あるいは配列番号 2または配列番号 4に示され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質ま たはその塩に対する抗体を含んでなる A S K 1活性化調節物質のスクリーニング 用キッ卜。
4 7 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を増大 させる物質を含有してなるアポト一シス誘発剤。
4 8 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を増大 させる物質を含有してなる医薬。
4 9 . アポト一シスを誘発することが予防 ·治療上有効な疾患の予防 ·治療剤で ある請求項 4 8記載の医薬。
5 0 . 疾患が、 癌、 自己免疫疾患、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓 器過形成、 血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択され る請求項 4 9記載の医薬。
5 1 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を減少 させる物質を含有してなるアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤。
5 2 . 配列番号 2または配列番号 4に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を減少 させる物質を含有してなる医薬。
5 3 . アポト一シスまたは炎症を抑制することが予防 ·治療上有効な疾患の予 防 ·治療剤である請求項 5 2記載の医薬。
5 4 . 疾患が、 ウィルス感染症、 内分泌疾患、 血液疾患、 臓器形成不全、 移植臓 器拒絶、 移植片対宿主病、 免疫不全、 神経変性疾患、 虚血性心疾患、 放射線障害、 紫外線障害、 中毒性疾患、 栄養障害、 炎症性疾患、 虚血性神経障害、 糖尿病性神 経障害、 血管系疾患、 呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請 求項 5 3記載の医薬。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012080735A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Convergence Pharmaceuticals Limited Ask1 inhibiting pyrrolopyrimidine derivatives
WO2019012284A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 Galapagos Nv PYRROLOPYRIMIDINE AND ASK1 INHIBITING PYRROLOPYRIDINE DERIVATIVES

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100029619A1 (en) * 2006-08-04 2010-02-04 Takeda Pharmaceutical Company Limted Fused heterocyclic compound
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
WO2012068464A2 (en) * 2010-11-18 2012-05-24 University Of Delaware Methods of treating and preventing thrombotic diseases using ask1 inhibitors
US9327009B2 (en) * 2012-03-02 2016-05-03 Council Of Scientific And Industrial Research Peptide inhibitors as novel anti-HIV therapeutics

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040143A1 (fr) * 1996-04-19 1997-10-30 Japanese Foundation For Cancer Research Proteine inductrice de l'apoptose et gene codant pour elle
WO1999057144A2 (en) * 1998-05-05 1999-11-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human transcriptional regulator molecules
EP1130094A2 (en) * 1999-07-08 2001-09-05 Helix Research Institute Primers for synthesizing full length cDNA clones and their use
WO2002018632A2 (de) * 2000-09-01 2002-03-07 Epigenomics Ag Verfahren zur bestimmung des methylierungsgrades von bestimmten cytosinen in genomischer dna im sequenzkontext 5'-cpg-3'
WO2002038179A1 (fr) * 2000-11-10 2002-05-16 Kissei Pharmaceutical Co., Ltd. Preventifs ou remedes de maladies du reticulum endoblastique liees au stress

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003063905A1 (fr) 2002-01-31 2003-08-07 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Medicaments preventifs ou remedes pour maladies immunologiques
US7485414B2 (en) * 2002-08-30 2009-02-03 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Modulators of angiogenesis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040143A1 (fr) * 1996-04-19 1997-10-30 Japanese Foundation For Cancer Research Proteine inductrice de l'apoptose et gene codant pour elle
JPH1093A (ja) 1996-04-19 1998-01-06 Japan Found Cancer Res アポトーシス誘導タンパク質およびそれをコードする遺伝子
WO1999057144A2 (en) * 1998-05-05 1999-11-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human transcriptional regulator molecules
EP1130094A2 (en) * 1999-07-08 2001-09-05 Helix Research Institute Primers for synthesizing full length cDNA clones and their use
WO2002018632A2 (de) * 2000-09-01 2002-03-07 Epigenomics Ag Verfahren zur bestimmung des methylierungsgrades von bestimmten cytosinen in genomischer dna im sequenzkontext 5'-cpg-3'
WO2002038179A1 (fr) * 2000-11-10 2002-05-16 Kissei Pharmaceutical Co., Ltd. Preventifs ou remedes de maladies du reticulum endoblastique liees au stress

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antisense Research and " Applications", 1993, CRC PRESS
DATABASE GENSEQ [online] Database accession no. AK015523 *
DATABASE GENSEQ [online] Database accession no. AK087716 *
GYURIS ET AL., CELL, vol. 75, 1993, pages 791 - 803
HARUAKI YAJIMA: "Peptide Synthesis", vol. 14, HIROKAWA SHOTEN
HARUAKI YAJIMA; SHUNPEI SAKAKIBARA; SEIKAGAKU JIKKEN, KOZA 1, TANPAKUSHITSU NO KAGAKU IV, vol. 205, 1977
J. KAWAKAMI ET AL., PHARM TECH JAPAN, vol. 8, 1992, pages 247
KOHLER; MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
LEUNG ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 42, 2001, pages 39171 - 39178
NOBUO IZUMIYA ET AL.: "Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken", 1975, MARUZEN CO.
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 29, no. 13, 2001, pages 2780 - 2788
PHARM TECH JAPAN, vol. 8, 1992, pages 395
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 10, 2001, pages 5572 - 5577
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS
See also references of EP1582586A4
THE FANTOM CONSORTIUM AND THE RIKEN GENOME EXPLORATION RESEARCH GROUP PHASE I & II TEAM: "ANALYSIS OF THE MOUSE TRANSCRIPTOME BASED ON FUNCTIONAL ANNOTATION OF 60,770 FULL-LENGTH CDNAS", NATURE, vol. 420, 2002, pages 563 - 573, XP002252038 *
THE RIKEN GENOME EXPLORATION RESEARCH GROUP PHASE II TEAM AND THE FANTOM CONSORTIUM: "FUNCTIONAL ANNOTATION OF FULL-LENGTH MOUSE CDNA COLLECTION", NATURE, vol. 409, 2001, pages 685 - 690, XP002176449 *
TOBIUME ET AL., EMBO REP., vol. 2, 2001, pages 222 - 228
ZERVOS ET AL., CELL, vol. 72, 1993, pages 223 - 232

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012080735A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Convergence Pharmaceuticals Limited Ask1 inhibiting pyrrolopyrimidine derivatives
US9045485B2 (en) 2010-12-16 2015-06-02 Convergence Pharmaceuticals Limited ASK 1 inhibiting pyrrolopyrimidine derivatives
US9585886B2 (en) 2010-12-16 2017-03-07 Calchan Limited ASK1 inhibiting pyrrolopyrimidine derivatives
WO2019012284A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 Galapagos Nv PYRROLOPYRIMIDINE AND ASK1 INHIBITING PYRROLOPYRIDINE DERIVATIVES
US11136325B2 (en) 2017-07-12 2021-10-05 Galapagos Nv Pyrrolopyrimidine and pyrrolopyridine derivatives

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