WO2004047805A1

WO2004047805A1 - Obtencion de estructuras cocleares, composiciones vacunales, adyuvantes y sus intermediarios.

Info

Publication number: WO2004047805A1
Application number: PCT/CU2003/000016
Authority: WO
Inventors: Oliver Germán PEREZ MARTIN; Gustavo Rafael Bracho Grando; Miriam De San Juan Bosco Lastre Gonzalez; Victoriano Gustavo Sierra Gonzalez; Concepción CAMPA HUERGO; Nestor Mora Gonzalez; Ramón Faustino BARBERA MORALES; Judith Mónica DEL CAMPO ALONSO; Tamara RODRÍGUEZ RAMÍREZ; Caridad Zayas Vignier; Danay GIL MARTÍNEZ; Carlos Taboada Suarez
Original assignee: Instituto Finlay. Centro De Investigacion-Produccion De Vacunas Y Sueros.
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2004-06-10
Also published as: CU23313A1; US20060134134A1; CN1744883B; HK1088827A1; AR042237A1; EP2347764A2; EP2347764A3; BR0316687A; CN1744883A; ZA200504729B; EP1602360B1; EP1602360A1; ES2376227T3; CA2518906A1; AU2003281911A1; DK1602360T3; ATE530166T1

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología, específicamente con la rama de los adyuvantes y las vacunas. El objetivo técnico que se persigue es obtener estructuras cocleares a partir de vesículas de membrana externa (ampollas) de microorganismos, con el fin de emplearlas como adyuvantes o como vacunas en sí. La invención también se relaciona con el método de obtención de las estructuras cocleares.

Description

OBTENCIÓN DE ESTRUCTURAS COCLEARES, COMPOSICIONES VACUNALES, ADYUVANTES Y SUS INTERMEDIARIOS Sector Técnico La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología, específicamente con la rama de los adyuvantes y las vacunas. Técnica Anterior

En la búsqueda de vacunas eficientes, encontrar los antígenos adecuados, ha sido un reto a varias esferas del conocimiento que desbordan la Vaccinología. Después que se cuenta con el antígeno apropiado, este muchas veces no es suficientemente inmunogénico o no induce la respuesta deseada para lo cual es necesario el uso de adyuvantes apropiados. Sigue siendo una necesidad, en estos días, encontrar nuevas vacunas para las enfermedades no protegidas, mejorar las existentes, así como contar con potentes adyuvantes para su uso en vacunas de nueva generación y múltiples. La obtención de vacunas que admitan la inclusión de varios antígenos y que sean efectivas tanto en adultos como en niños, y más aún, en recién nacidos y la búsqueda de adyuvantes funcionales a nivel mucosal con capacidad de resistir el pH ácido del estomago, continúa siendo un reto para los vaccinóiogos La inmunización mucosal cada día cobra más auge pues muchos microorganismos entran por esta vía. La vía mucosal presenta varias particularidades entre las que se encuentran: la existencia de un sistema mucoso común (capacidad de inducir respuestas locales y a distancia, por aplicación mucosal) y el hecho de que la Ig (inmunoglobulina) A es el principal anticuerpo asociado con su protección. Entre las ventajas de la inmunización mucosal se encuentran su fácil administración, se evita el uso de jeringuillas, menor costo de producción; es menos reactógenica y por ello, más segura con respecto a las vacunas parenterales y la inducción de respuestas tanto mucosales como sistémicas.

La inmunización mucosal, sin embargo, tiene que atravesar varias barreras. Entre ellas se encuentran: la acidez del estómago que alcanza pH ácidos extremos; la basicidad del duodeno y el peristaltismo del tubo digestivo, que junto a lo localizado de los órganos inductores a nivel mucosal con sus células M, especializadas en el muestreo de los antígenos, disminuye la posibilidad de encuentro con los antígenos vacunales. Los cilios y la formación de mucos en los órganos mucosales respiratorios también interfieren con el muestreo de los antígenos vacunales por las células M.

Las estrategias actuales para evitar el contacto del antígeno con un pH ácido son la aplicación de las vacunas en soluciones acuosas bicarbonatadas alejados de los alimentos, para disminuir la acidez del estómago y producir un transito rápido por el estómago (Benitez JA et al., Infecí and Immun 1999,67(2):539-545) o el recubrimiento del antígeno con agentes resistentes a los ácidos, como puede ser el caso de los liposomas. En la actualidad son bien conocidos los métodos para preparar liposomas y encapsular materiales liposolubles y sólidos (Schneider U. S. Pat. No. 4, 089, 801 , Ash ΘÍ al., U. S. Pat. No. 4, 448, 765 y Miller eí al, U. S. Patent No. 4, 133, 874). Entre los principales problemas que presenta la encapsulación de fármacos en liposomas se encuentran: su poca estabilidad en pruebas de estante; la liberación del material encapsulado; la reducción de la eficacia de las drogas; la susceptibilidad a las condiciones ambientales adversas, la digestión en el tracto gastrointestinal y la no fusión directa con las membranas celulares (http://www.BDSiAdvantages.htlm). Por otra parte, los liposomas son estructuras poco estables y generalmente no pueden ser liofilizados, aspecto éste, que ha sido resuelto por la formación de estructuras cocleares. Los cocleatos son estructuras multilaminares lipídicas enrolladas sobre sí mismas en formas de caracol. La obtención de cocleatos a partir de la fusión de liposomas unilaminares y empleando cationes divalentes es bien conocido (D. Papahadjopoulos et al, Biochem. Biophys. Acta, 1975; 394:483). Este procedimiento ha sido modificado para la formación de una suspensión de vesículas lipídicas multilaminares conteniendo y rodeadas por el antígeno. Este es convertido en vesículas lipídicas proteicas unilaminares pequeñas por sonicación bajo nitrógeno, para en presencia de iones divalentes formar los cocleatos (Gould-Fogerite eí al. U. S. Pat. No 5, 643, 574, July 1 , 1997). Estos métodos se encuentran resumidos en la Fig. 1. Los cocleatos y otras microestructuras autoensambladas se han empleado para la administración de agentes terapéuticos (Yager, eí al. U. S. Pat. No. 5, 851 , 536, December 22, 1998, Gould-Fogerite, eí al. U. S. Pat. No. 5, 994, 318, November 30, 1999 y Yager, eí al. U. S. Pat. No. 6,180,114, January 30, 2001 ) incluyendo formulaciones de cocleatos conteniendo adyuvantes, (Gould-Fogerite, eí al. U. S. Pat. No. 5, 994, 318, November 30, 1999). No obstante, tanto los liposomas como los cocleatos requieren partir obligatoriamente de lípidos negativos y en ocasiones de colesterol, ambos generalmente de procedencia animal y de alto costo (Mannino, eí al. U. S. Pat. No 4, 663, 161. May 5, 1987), que cada vez son menos aceptados por las regulaciones farmacéuticas y preferentemente incluyen una proteína purificada de microorganismos o un péptido para el caso vacunal. Además, vale la pena señalar que el empleo de cocleatos como adyuvantes por sí solos o la inclusión en ellos de otros activadores de señales importantes en la inducción de la respuesta inmune, tales como patrones moleculares asociados a patógenos (estructuras conservadas filogenéticamente para las cuales existen receptores en los hospederos y que son reconocidas como señales de peligro por la respuesta innata del mismo) no han sido previamente considerados. Divulgación de la Invención El objeto de la presente invención es la obtención de una nueva estructura coclear a partir de vesículas de membrana externa (ampollas) provenientes de organismos vivos, la cual presenta propiedades adyuvantes y vacunales debido a sus características proteicas y lipídicas particulares, así como por los patrones moleculares asociados a patógenos incluidos. Las estructuras cocleares una vez formadas son homogenizadas en su tamaño para hacerlas más efectivas inmunológicamente.

Las estructuras cocleares de la presente invención se diferencian, en tanto que, a pesar de su composición proteolipídica hasta el momento no ensayado por otros autores, logran autoensamblarse y dar lugar a estructuras enrolladas en sí mismas en forma de caracol. La composición proteica y lipídica de las estructuras cocleares dependerán del microorganismo de donde procedan las vesículas de membrana externa, es decir, dependerá de las características de las proteínas de su membrana. De igual forma, las mencionadas estructuras contienen concentraciones de patrones moleculares asociados a patógenos, entre el 1-7% con relación a la concentración de proteínas, provenientes de la membrana del microorganismo en cuestión, insertados y no libres en las mismas. Estos patrones, además pueden ser purificados de otros microorganismos y adicionados para constar con varios patrones en una misma estructura. Los patrones adicionados más los existentes tienen que encontrarse, con respecto a las proteínas, en una relación total entre el 1- 30% en relación a la concentración de proteínas. Uno de los patrones moleculares asociados a patógenos incorporados durante la formación de las estructuras cocleares fue el lipopolisacárido de Vibrio cholerae o de N. meningitidis (ejemplo 20). Las estructuras cocleares de la invención permitieron la inducción de una respuesta preferentemente celular y por ello efectiva en lactantes, mostraron propiedades de termo resistencia, así como de ácido y básico resistencia y por tanto fueron efectivos por vía mucosal (ejemplos 2, 4, 6, 8 y 10). Estas propiedades fueron útiles para el diseño de adyuvantes heterólogos (adyuvantes empleados para potenciar vacunas diferentes a las que dieron origen a las vesículas de membrana externa) y vacunas homologas (vacunas contra el microorganismo de donde provienen las vesículas de membrana externa) empleando las mencionadas estructuras. Con relación a la composición vacunal ensayada con dicha estructura es importante señalar que las respuestas séricas fueron superiores a las obtenidas empleando la vacuna basada en vesículas de membrana externa adyuvada en alúmina conocida en el mercado, VA-MENGOC-BC^®, en varios tiempos, e indujeron además, IgA específica al ser aplicadas por vía mucosal. Así mismo, las estructuras cocleares estimularon los linfocitos CD8, una parte importante de la respuesta inmune frente a organismos intracelulares. La acción adyuvante de las estructuras cocleares fue evaluada a través de varios ensayos. Entre ellos se encuentran: la producción de IL12 en la línea histiocitaria humana U937 (ejemplo 11 ) y la producción de óxido nítrico en la línea macrofágica murina J774, en ausencia de otros estímulos (ejemplos 13); la estimulación de células dendríticas humanas (ejemplo 15) y la reducción de las induraciones de las lesiones del reto con Leishmania major en ratones inmunizados con las estructuras cocleares conteniendo antígenos de este protozoo (ejemplo 16). Las estructuras cocleares de la invención hacen a la vacuna final o al adyuvante inducir "in vivo" respuestas más tempranas, potentes y duraderas, mientras que "in vitro" se observa la inducción eficiente de mediadores involucradas con la inducción de un patrón celular y buena estimulación de células presentadoras de antígenos profesionales (células dendríticas) (ejemplos 11 , 13 y 15).

Otro objeto de esta invención es el empleo de las vesículas de membrana externa, que constituyen el punto de partida para la obtención de las estructuras cocleares, como vacunas en sí mismas o como adyuvantes heterólogos, de esta manera que la eliminación de la adsorción en hidróxido de aluminio no limite la capacidad ¡nmunogénica de las mismas, considerando que no se ha explorado suficientemente la capacidad de las vesículas de membrana externa por sí solas para inducir respuestas parenterales.

Dichas vesículas se definen como nanoesferas autoensambladas, constituidas por una bicapa lipidíca con proteínas y polisacáridos insertados en la misma. Estas pueden extraerse de cualquier patógeno y presentar diferentes patrones moleculares asociados a los mismos (particularmente lipopolisacárido, peptidoglicano, lipoproteína, ácido teicoico, flagelina o lipofosfoglicano). El Lipofosfoglicano y el lipolisacárido fueron obtenidos de Leishmania major y N. meningitidis o Salmonella tiphy, respectivamente, durante el proceso de obtención de las vesículas de membrana externa donde quedan insertados en las mismas y nunca libres en proporciones entre 1 y 7% del peso proteico. Como vacuna, las vesículas de membrana externa extraídas de Salmonella tiphy o de N. Meningitidis B indujeron respuesta de IgA por vía nasal y buena respuesta inmunológica por vía parenteral. (ejemplos 3, 5, 7, 12 y 14).

La acción adyuvante de las vesículas de membrana externa fue evaluada a través de varios ensayos. Entre ellos se encuentran: la producción de IL12 en la línea hitiocitaria humana U937 (ejemplos 12) y la producción de óxido nítrico en la línea macrofágica murina J774 en ausencia de otros estímulos (ejemplos 14); la potenciación de la respuesta celular (incremento de lgG2a) por la conjugación de polisacáridos a vesículas de membrana externa de N. meningitidis en comparación con su unión a toxoide tetánico (ejemplo 18) y la potenciación de la respuesta de anticuerpos anti polisacárido Vi de S. tiphy por conjugación con vesículas de membrana externa procedente de la misma bacteria (ejemplo 19). El empleo de estructuras cocleares y vesículas de membrana externa como adyuvantes o vacunas logró inesperadamente la potenciación de la respuesta inmune inducida por dosis previas de vacunas o por contacto con el germen natural. Es importante señalar que estas últimas ocurrieron por vías diferentes con respecto a la empleada para la administración de las estructuras cocleares o vesículas (ejemplo 22). La invención también incluye el método de obtención de las estructuras cocleares a partir de vesículas de membrana externa de organismos vivos. Para ello se realiza la siguiente secuencia de pasos: En primer lugar se purifica la membrana externa estructurada en forma de vesículas a partir de microorganismos o células vivas, por cualquiera de los métodos bien conocidos por una persona experta. Preferiblemente los métodos revelados en EP 301992, US 5,597,572, EP 11243 o US 4,271 ,147, Zollinger eí al. (J. Clin. Invest. 1979, 63:836-848), Frederikson eí al. (NIPH Annals 1991 , 14:67-80), Sauders eí al. (Infecí. Immun. 1999, 67:113-119), Drabick eí al. (Vaccine 2000, 18:160-172), WO 01/09350 o EP 885900077.8 y US 5,597,572 son usados. De manera tal que finalmeníe las vesículas de membrana exíerna confengan eníre un 1 % y un 7% de lipopolisacárido compleíamente insertado en las vesículas. A partir de esías se prepara una solución con una concentración de proteínas íoíales preseníes en la vesícula eníre 3 y 6 mg/mL; pero incremeníando la conceníración de deíergente (no iónico) hasta 8-12 veces la concentración de proteínas para la compleía disolución de dichas vesículas. Esía solución es posteriormente esíerilizada por filtración a través de una membrana con íamaño de poro de 0,2 μm, donde íambién se eliminan los agregados de vesículas de membrana exíerna no disuelíos. Luego se realiza una diálisis roíacional o filíración íangencial. La diálisis se realiza duraníe 24 h coníra una solución que coníiene conceníraciones adecuadas de un ion mulíivaleníe (particularmeníe, Ca²⁺, Zn²⁺ o Mg²⁺ en conceníraciones eníre 2,5 y 6,5 mM) en condiciones famponadas a pH 7,4 ± 0,2. Finalmeníe, a las esírucíuras cocleares obíenidas se les realiza un íraíamienío mecánico (particularmente, sonicación en baño de agua lemperada a eníre 15 °C y 25°C duraníe 45 min.) para homogeneizar el íamaño de las partículas. Esía metodología permiíe la obfención de esírucíuras cocleares de forma efecíiva y rápida, las cuales coníienen múlíiples proíeínas y lípidos de la membrana exferna del microorganismo empleado, así como paírones moleculares asociados a patógenos obíenidos de forma natural. Esfas estrucíuras muesíran una elevada esíabilidad e inmunogenicidad. Por oíro lado, es posible la incorporación de nuevos aníígenos en la mencionada esírucíura duranfe su proceso de obíención de forma sencilla y eficiente. Los nuevos aníígenos son adicionados a la suspensión de vesículas de membrana exíerna preparada para la obíención de esías esírucluras, luego de incremeníar la conceníración de detergentes y previo a la adición de los iones mulíivaleníes duraníe el proceso de diálisis. Eníre los aníígenos posibles a adicionar se encueníran sacáridos, lipoproíeínas, glicoproíeínas, pépíidos, conjugados y ácidos nucleicos. Estos íienen que encontrarse en una proporción de 0,2-2,7 μg por cada 3-9 μg de proteínas. Por otro lado es íambién posible la incorporación de oíros paírones moleculares asociados a patógenos para esíimular eficientemente la respuesía innaía y adquirida, lo que permite su uíilización eficiente como adyuvante heíerólogo. Particularmente se incluyó lipopolisacárido de Vibrio cholerae, amasíigoíes o promasíigoíes de Leishmania mayor, los que permiíieron inducir respuesías celulares y de aníicuerpos coníra ellos. También, se incorporó DNA plasmídico conteniendo proíeína verde fluorescente y se enfrentó a líneas macrofágicas evaluando posteriormente su presencia iníracelular por fluorescencia. Particularmente íambién, se incorporó un alérgeno proveniente a Dermatophagoides siboney y se determinó la inducción de respuesta celular contra el mismo (ejemplos 16 y 17).

El empleo de organismos vivos como fuente de materia prima para la obíención de esírucíuras cocleares no había sido descrito previamente. De igual manera no se conocía el procedimiento para lograr incorporar en las esírucíuras cocleares uno o varios paírones moleculares asociados a patógenos como en el caso de la presente invención.

Ejemplos de Realización

Ejemplo 1. Obíención de las esírucíuras cocleares.

Se partió de las vesículas de membrana externa obtenidas por los métodos descritos en EP 885900077.8 o US 5,597,572. Esías son resuspendidas en solución buffer de Tris-EDTA con 0.5% de desoxicolaío de sodio. La conceníración de proteínas de la suspensión se determinó usado la metodología de Lowry modificado según Peíerson (Analyf. Biochem. 83, 346, 1977). El contenido de fosfolípidos que forman las vesículas fue determinado mediante la determinación de fósforo inorgánico (Bartleíl, J Biol. Chem. 234, 466, 1959). Tanto la conceníración de proteínas como la conceníración de fosfolípidos fue empleada para esíablecer las condiciones ópíimas y las cantidades de detergentes necesarios para la formación de las eslrucíuras cocleares. Se preparó una solución con las vesículas ajusfada a una concenfración final proteica de 5-6 mg/mL en íampón Tris-EDTA conteniendo desoxicolaío de sodio en una canfidad de 6 a 15 veces la caníidad íoíal de proteínas. Esfa solución fue filírada direcíameníe en el disposiíivo de diálisis a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 μm. La diálisis fue realizada por agiíación roíacional duraníe 24 h con cambio coníinuo y lento del íampón de diálisis. Esía úlíima solución consisíió en NaCI 50-150 mM, Imidazol 1-4 mM, HEPES 3-5 mM y CaCI 2-7 mM en H₂0 preparada bajo condiciones de esterilidad que fueron conservadas duraníe iodos los pasos. La formación de esírucluras cocleares fue comprobada por la formación de un precipiíado blanco y posterior observación microscópica íanío ópíica como elecírónica. La conceníración de proteínas y fosfolípidos fue nuevamente esfimada y ajusfada para los posíeriores ensayos. Las propiedades físico-químicas de las proteínas incluidas en las esfrucíuras cocleares fueron chequeadas y comparadas con las vesículas mediante elecíroforesis en geles de poliacrilamida teñidos con Azul de Coomassie. Adicionalmeníe la integridad esírucíural de esías fue chequeada y comprobada por medio de la metodología de Western Blof (Fig. 2-4).

Ejemplo 2. Respuesías inducidas en ratones por las esírucíuras cocleares en comparación con la vacuna, VA-MENGOC-BC^®.

Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía iníramuscular con 12 μg de proteínas por ratón en 2 dosis espaciadas 21 días de VA-MENGOC-BC^® o esírucíuras cocleares. Los animales fueron sangrados en los íiempos represeníados después de la 2^da dosis y las respuesfas séricas de IgG aníi vesículas de membrana exíerna fueron evaluadas por ELISA. Se observaron diferencias significaíivas (p<0.05) eníre las respuesías inducidas por las esírucíuras cocleares y la vacuna, siempre a favor del primero, en los íiempos 17, 27 y 180 días después de la 2^da dosis (Fig. 5).

Ejemplo 3. Respuesías inducidas en ratones por las vesículas de membrana exíerna en comparación con la vacuna, VA-MENGOC-BC^®, por vía pareníeral. Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía iníramuscular con 12 μg de proteínas por ratón en 2 dosis espaciadas 21 días de VA-MENGOC-BC^® o vesículas de membrana exíerna. Los animales fueron sangrados en los íiempos represenfados después de la 2^da dosis y las respuesías séricas de IgG aníi vesículas fueron evaluadas por ELISA No se observaron diferencias significaíivas (p<0.05) eníre las respuesías inducidas por las vesículas y la vacuna. Estos resulfados apoyan la uíilidad de las vesículas de membrana exíerna como vacunas por sí solas (Fig. 6). Ejemplo 4. Efectividad de la inmunización nasal (IN) o qásírica (IG) con esirucíuras cocleares.

Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía infranasal (IN) o iníragásírica (IG) con 100 ó 12 μg de proteínas por ratón en 2 dosis espaciadas 21 días, respectivamente. Los animales fueron sangrados en los íiempos indicados después de la 2 dosis y las respuesías séricas de IgG anti vesículas fueron evaluadas por ELISA. Se indujeron buenas respuesta de IgG anti vesículas de membrana externa con ambas conceníraciones de esírucíuras cocleares por vía IG e IN, lo que implica la inducción de buenas respuesías sisíémicas por inoculación mucosal (Fig. 7).

Ejemplo 5. Efectividad de la inmunización nasal (IN) con vesículas de membrana externa.

Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía IN 12 μg de proteínas por ratón en 2 dosis espaciadas 21 días. Los animales fueron sangrados en los íiempos indicados después de la 2 dosis y las respuesías séricas de IgG anfi vesículas fueron evaluadas por ELISA. Se indujeron buenas respuesías de IgG aníi vesículas por vía

IN, lo que implica la inducción de buenas respuesías sisíémicas por inoculación nasal (Fig. 8).

Ejemplo 6. Efectividad de estrucíuras cocleares aplicados por vía nasal (IN) o gásírica (IG) en inducir IgA en saliva.

Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía IN o IG con 100 ó 12 μg de proteínas por ratón, respectivamente, en 2 dosis espaciadas 21 días. En los animales se tomó la saliva 9 días después de la ulíima dosis y las respuesías de IgA aníi vesículas de membrana exíerna fueron evaluadas por ELISA. Se indujeron significaíivas respuesías de IgA aníi vesículas por vía IN y un se indujo un ligero pero importante incremento de IgA aníi vesículas por vía IG (Fig. 9).

Ejemplo 7. Efectividad de las vesículas de membrana externa aplicados por vía nasal (IN) en inducir IgA en saliva.

Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía IN con 12 μg de proteínas por ratón en 2 dosis espaciadas 21 días. En los animales se tomó la saliva 9 días después de la ultima dosis y las respuesías de IgA aníi vesículas fueron evaluadas por ELISA. Se indujo significativa respuesfa de IgA aníi vesículas por vía IN (Fig. 10).

Ejemplo 8. Subclases de IgG aníi vesículas de membrana exíerna en suero inducidas por la inmunización con las esírucíuras cocleares.

Ratones Balb/c fueron inmunizados por las vías iníranasal (IN), iníragásírica (IG) o ¡níamuscular (IM). IN fue con 100 y el resto con 12 μg de proteínas ratón de esírucíuras coleares en dos dosis espaciadas 21 días. Se empleó VA-MENGOC-BC^® como conírol positivo IM con 12 μg. Los animales fueron sangrados a los 21 días después de la segunda dosis y los fííulos de lgG1 e lgG2a en suero fueron analizados por ELISA. En lodos los casos (excepto en los coníroles negativos) se indujeron fííulos significativos (p<0,05) de lgG2a siendo estos más elevados cuando las esírucíuras cocleares se adminisíraron por vía nasal. Esto indica la inducción de un paírón de aníicuerpos IgG de tipo celular Th1 y sobre iodo por vía nasal (Fig. 11 ).

Ejemplo 9. Subclases de IgG en suero inducidas por la inmunización con las vesículas de membrana exíerna (VME).

Ratones Balb/c fueron inmunizados por diferentes vías con 12 μg de proteínas por ratón de vesículas de membrana exíerna, en dos dosis espaciadas 21 días, por vía iníranasal (IN) o iníramuscular (IM). Se aplicó la vacuna VA-MENGOC-BC^® IM en igual conceníración como conírol positivo. Los animales fueron sangrados a los 21 días después de la segunda dosis y los íííulos de lgG1 e lgG2a aníi VME en suero fueron analizados por ELISA. En iodos los casos se indujeron íííulos significativos de lgG2a por las vesículas de membrana externa indicando la inducción de un paírón de aníicuerpos IgG de íipo celular Th1. No fue así en los coníroles negaíivos IM o IN. Una íoíal inversión del paírón se observó por vía IN donde casi toda la respuesía fue a base de lgG2a (Fig. 12).

Ejemplo 10. Termo y ácido resistencia de las esírucíuras cocleares formados a partir de vesículas de membrana externa.

La termo resisíencia fue evaluada a íravés de la exposición a 60 °C por 7 días de las muesíras. La ácido resisíencia se evaluó a íravés de la exposición de las esírucíuras cocleares a pH 1 por 45 min. Posteriormente, las muesíras íraíadas y el conírol fueron empleados para inmunizar ratones Balb/c con 2 dosis de 12 μg de proteínas por ratón cada una, espaciadas 14 días, por vía iníramuscular. Los ratones fueron sagrados a los 28 días de iniciado el experimento y los sueros mantenidos individualmente a -20 °C hasía su uso. Como puede observarse no hubo diferencias significaíivas (p>0,5) eníre las respuesías de IgG aníi vesículas de membrana exíerna inducidas en cada animal y grupo (Fig. 13).

Ejemplo 11. Producción de IL12 por la línea celular U937 estimulada con esírucíuras cocleares en ausencia de oíro esíímulo.

Las células U937 fueron culíivadas en RPMI 1640 suplemeníados con geníamicina a 50 μg/mL, L-gluíamina (2 mM), piruvaío de sodio (1 mM), HEPES [4-(2-hidroxieíil)-1- piperazineíanosulfónico ácido)] (15 mM) y con 10% de suero bovino feíal (Sigma). Esías fueron diferenciadas a macrófagos pon íraíamienío con PMA (forbol mirisíaío aceíaío) y se sembraron en placas de cultivo de fondo plano de 24 pozos a razón de 5 x 10⁵ células / pozo. Luego de 24 h se les añadió las esírucíuras cocleares a razón de 250 ng/mL en medio de cultivo. Luego de 24 h de estimulación los sobrenadantes fueron recolecíados y se determinó la presencia de IL12 mediante un ELISA de íipo sandwich. Se observó la producción de IL12 por las células U937 estimuladas con las esírucíuras cocleares (Fig. 14).

Ejemplo 12. Producción de IL12 por la línea celular U937 estimulada con vesículas de membrana exíerna (VME) en ausencia de oíro estimulo.

Las células U937 fueron culíivadas en RPMI 1640 suplemeníados con geníamicina a 50 μg/mL, L-gluíamina (2 mM piruvafo de sodio (1 mM), HEPES [4-(2-hidroxiefil)-1- piperazinetanosulfónico ácido)] (15 mM) y con 10% de suero bovino feíal (Sigma).

Esías fueron diferenciadas a macrófagos con íraíamienío con PMA (forbol mirisíafo acefafo) y se sembraron en placas de cultivo de fondo plano de 24 pozos a razón de

5 x 10⁵ células / pozo. Luego de 24 h se les añadió las vesículas de membrana exíerna a razón de 250 ng/mL en medio de cultivo. Luego de 24 h de estimulación los sobrenadantes fueron ensayados para la presencia de IL12 mediante un ELISA de íipo sandwich. Se observó la producción de IL12 por las células U937 estimuladas con las vesículas de membrana exíerna (Fig. 15). Ejemplo 13. Producción de óxido níírico por la línea macrofágica rnurina J774 estimuladas con esirucíuras cocleares en ausencia de oiro esíímulo. Las células J774 fueron cultivadas en medio DMEN suplemeníado con geníamicina a 50 μg/mL, L-gluíamina (2 mM), piruvaío de Sodio (1 mM), HEPES (15 mM) y con 10% de suero bovino feíal (Sigma), previamente inacíivado a 56 °C duraníe 30 min. Se sembraron en placas de cultivo de fondo plano de 96 pozos a razón de 1 x 10⁵ células / pozo y se incubaron por 24 horas a 37 °Cy 5% de C0₂. Posíeriormeníe, las células adhereníes fueron incubadas con 200 L de DMEN y las eslrucíuras cocleares a 250 ng/mL. Se incluyeron íambién varianíes incubadas con L-NMMA (1 μM), inhibidor de la mía de producción del oxido níírico. A las 24 y 48 h se colecíaron los sobrenadantes los cuales fueron analizados para el contenido de niíriíos mediante la reacción de Greiss (Rockelí, KA eí al., Infecí. Immun., 1992, 60:3725-3730). Se observó una significaíiva producción de oxido níírico por las células incubadas con las esírucíuras cocleares. Esfa producción fue inhibida empleando el L-NMMA (Fig. 16).

Ejemplo 14. Producción de óxido níirico por la línea macrofágica murina J774 estimuladas con vesículas de membrana exíerna (VME) en ausencia de oíro estimulo.

Las células J774 fueron culíivadas en DMEN suplemeníado con geníamicina a 50 μg/mL, L-gluíamina (2 mM), piruvaío de (1 mM), HEPES (15 mM) y con 10% de suero bovino feíal (Sigma), previamente inacíivado a 56 °C durante 30 min. Se sembraron en placas de cultivo de fondo plano de 96 pozos a razón de 1 x 10⁵ células / pozo y se incubaron por 24 h a 37 °C y 5% de C0₂. Posteriormente, las células adherentes fueron incubadas con 200 μL de DMEN y las vesículas de membrana externa a 250 ng/mL. Se incluyo íambién varianíes incubadas con L- NMMA (1 μM), inhibidor de la rufa de producción del oxido níírico. A las 24 y 48 h se colecíaron los sobrenadantes, los cuales fueron analizados para el contenido de niíriíos mediante la reacción de Greiss (Rockeíl, K. A eí al., Infecí. Immun., 1992, 60:3725-3730). Se observó una significaíiva producción de oxido níírico por las células incubadas con las vesículas de membrana externa, superior a al inducida por el LPS empleado como conírol. Esía producción fue inhibida por el L-NMMA (Fig. 17).

Ejemplo 15. Estimulación de células dendríticas humanas por las esírucíuras cocleares. La sangre fue exíraída y las células mononucleares periféricas fueron purificadas por ficoll. Las células fueron cultivadas razón de 10 x 10⁶ células por mL en presencia de LPS o esírucfuras cocleares y se determinó la activación de las células dendrííicas por Ciíomeíría de Flujo. Como puede observarse en la Fig. 18, se activaron las células dendríticas medido a íravés de la expresión de moléculas coeslimulaforios (CD40, CD80 y CD86) y se incrementó la expresión de moléculas MHC. Esto demuesíra el carácter adyuvante de esías esírucíuras.

Ejemplo 16. Reducción de las induraciones en Balb/c inmunizados con esírucíuras cocleares conteniendo amasíigoíes de Leishmania major y reíados con el mismo proíozoo.

La inclusión de amasfigoíes de L. major se realizó incluyendo los aníígenos semipurificados en los primeros pasos de formación de las esfrucíuras cocleares. La caníidad de detergentes fue ajusfada de acuerdo a la cantidad de proíeínas íoíales y la conceníración de proíeínas foíales fue ajusfada para mantenerla en un rango de 5-6 mg/mL. La relación eníre proíeínas vesiculares y de los nuevos aníígenos incluidos fue de 12/1. La formación de las esírucíuras cocleares fue chequeada por microscopia óptica y electrónica. La inclusión de proteínas de L. major fue también verificada mediante elecíroforesis en geles de poliacrilamida teñidos con Azul Coomassie. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 12 μg de las estrucíuras cocleares con 2 dosis espaciadas 21 días por vía iníramuscular en la paía de la exíremidad posterior izquierda. A los 21 días de la segunda dosis los ratones fueron infecíados con 3 x 10⁶ promasíigoíes en la misma exíremidad de la inmunización. Los promasíigoíes fueron obtenidos de la fase esíacionaria de cultivos realizados en medio DMEN sobre medio sólido agar-sangre. El volumen de las lesiones fue estimado semanalmeníe a partir de la 4^ta semana luego de la infección. Se observó una reducción significaíiva del íamaño de las lesiones en el grupo inmunizado con las esírucíuras cocleares conteniendo anfígenos de L. major. Esto demuesíra el carácter adyuvante de esía esírucíura (Fig. 19). Ejemplo 17. Inclusión de DNA plásmidico con la proíeína verde fluorescente. Plásmidos conteniendo el gen de la proíeína verde fluorescente bajo el promotor CMV purificados fueron incluidos en la solución inicial de obtención de las eslrucíuras cocleares siguiendo los mismos pasos de obtención que en el ejemplo 1. La relación plásmido / proíeínas vesiculares fue ajusfada a 1/100. La inclusión de los plásmidos fue chequeada mediante elecíroforesis en agarosa al 1 % de las esírucíuras cocleares previamente incubados a 37 °C por 30 min. luego de agregar EDTA hasía 2 mM para provocar la liberación del plásmido del inferior de estos. Los geles fueron teñidos con Bromuro de Eíidio y fueron observados bajo luz ultravioleía. Sólo se observaron presencia de plásmido en las esírucíuras cocleares que los contenían luego de ser íraíadas con EDTA. Posíeriormeníe se desarrolló un ensayo de íransfección en la línea celular J774 con estas estrucíuras. Luego de 2 h de incubación las esírucíuras cocleares fueron eliminadas del medio de cultivo. La observación bajo fluorescencia de las células 24 h más tarde arrojó la presencia de numerosas células con señales fluorescentes en el citoplasma. Ejemplo 18. Potenciación de respuesía celular por conjugación a vesículas de membrana externa. El polisacárido (PsC) del serogrupo C de Neisseria meningitidis fue conjugado al íóxoide íeíánico (TT) o a vesículas de membrana exíerna (VME) de N. meningitidis serogrupo B. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 3 dosis iníraperiíoneales (0, 14 y 28 días) que contenía 10 μg de PsC conjugados. Los animales fueron sangrados antes y a los 42 días de iniciado la inmunización. En el suero se determinaron las respuestas de IgG y sus subclases. La mayor respuesta de lgG2a enconfrada en el grupo conjugado a vesículas de membrana externa es indicativo de una mejor respuesía celular inducida que cuando se conjugó con íoxoide íeíánico (TT) (Fig. 20).

Ejemplo 19. Potenciación de respuesía de anticuerpos aníi polisacárido Vi por conjugación. El polisacárido Vi de Salmonella tiphy fue conjugado vesículas de membrana externa (VME) de S. tiphy. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis intraperitoneales (0 y 28 días) que contenía 10 μg de Vi. Los animales fueron sangrados antes y a los 42 días. En el suero se determinaron las respuestas de IgG y sus subclases. La conjugación incrementa y posifiviza la respuesía confra el Vi y se delecía respuesía de lgG2a (Fig. 21).

Ejemplo 20. Posibilidad de inclusión de difereníes conceníraciones de paírones moleculares asociados a patógenos en las esírucíuras cocleares. Para la inclusión en las esírucluras cocleares de difereníes concenlraciones de paírones moleculares asociados a patógenos se ensayaron difereníes cantidades de LPS de Neissería meningitidis B. Las relaciones LPS / proíeínas que se emplearon para la inmunización de los ratones fueron: 0.05/12; 0.5/12; 1/12 y 2/12. La formación de las estructuras cocleares fue chequeada por microscopia óptica determinándose la relación 1/12 como la máxima relación en la que se puede incluir el LPS sin afectar la formación de las estrucfuras cocleares. Cantidades mayores afectan visiblemente la formación de las eslrucíuras conduciendo a la formación de agregados. Todas las variantes obtenidas fueron inmunizadas en ratones Balb/c con dos dosis, espaciadas 21 días, de 12 μg de proteínas por ratón. Los íííulos de IgG aníi vesículas de membrana exíerna (VME) fueron determinados no enconírándose diferencias eníre los íííulos inducidos por las difereníes varianíes, pero garantiza la posibilidad de incorporar difereníes LPS en eslas esírucíura (Fig. 22).

Ejemplo 21. Efectividad del método propuesto para los pasos finales en la producción de las esírucíuras cocleares. Esírucíuras cocleares íraíadas por sonicación (Tío) suave en baño de agua durante

45 min. a 20 °C y no traíadas fueron empleadas. Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía iníranasal con 100 μg de proíeínas por ratón en 2 dosis espaciadas 21 días.

En los animales se tomó la saliva 9 días después de la ulíima dosis y las respuesías de IgA aníi vesículas de membrana exíerna (VME) fueron evaluadas por ELISA. La repuesía inmunológica fueron significativamente más íempranas u duraderas en los animales inmunizados con las esírucíuras íraíadas según muesíra la figura 23. Ejemplo 22. Respuesía de IgA aníi vesículas de membrana externa en suero, saliva y vagina inducida por inmunización parenteral y mucosal de animales, evaluada por ELISA.

Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 ó 3 dosis de vesículas de membrana externa (VME) por vía nasal (IN), 3 dosis de vacuna (VA-MENGOC-BC^®) iníramuscular (IM) como conírol y la combinación de 1 dosis de vacuna IM y 2 dosis IN. Cada ratón recibió 12 μg de proteínas en los tiempos 0, 21 y 42. Los sueros fueron tomados a 15 días y la saliva y el fluido vaginal a 9 días de la última dosis. Los resulíados fueron evaluados por ELISA. Como puede observarse la inmunización nasal induce ligeros incrementos de IgA a nivel sérico no siendo así por la inmunización IM con la vacuna. La respuesía mucosal fue dependiente del número de dosis, es decir 2 dosis no indujeron y 3 dosis si indujeron respuesía de IgA anli vesículas de membrana externa. Por último 2 dosis nasales si fueron efectivas en animales que recibieron un esíímulo (una dosis) IM con vacuna (Fig. 24).

Ejemplo 23. Acción adyuvante de las esírucíuras cocleares (AFCoP sobre las proíeínas incorporadas en las vesículas de membrana externa (VME). Ratones Balb/c (n = 7) fueron inmunizados con 2 dosis iníramuscularmeníe de 12.5 g/raíón de VME, AFCol o vacuna (VA-MENGOC-BC^®). Los sueros fueron tomados antes y en varios íiempos posteriores a la última dosis. La respuesía de IgG aníi VME fue determinada por ELISA. Como puede observarse en la Fig. 25 la preseníación a íravés de los AFCol indujo respuesfa significaíivameníe superiores a la de las VME y la vacuna. Esía además, coníinuó elevada a los 180 días cuando las oirás descendían significativamente.

Ejemplo 24. Capacidad adyuvante de las vesículas de membrana externa (VME) frente a aníígenos heteólogos (Qvalbúmina, Ova).

Para determinar la función adyuvante primeramente se incorporó Ovalbúmina (Ova) como antígeno heíerólogo. Luego se determinó la preseníación a TCD4⁺ y finalmente se determinó la respuesía de IgG aníi Ova y sus subclases in vivo.

Incorporación de Ova en VME. Ova fue incorporada en VME mediante el empleo de detergentes, particularmente desoxicolato, el cual permitió el desensamblaje de su esíructura vesicular. La eliminación del detergente y el re-ensamblaje de la esírucíura en presencia de Ova permitieron su incorporación en las VME. La proporción final de VME:Ova fue de 100:11 ,2. La esírucíura vesicular fue comprobada mediante cromatografía de exclusión molecular rindiendo perfiles similares a los de las VME solas. La presencia de Ova fue comprobada por SDS- PAGE y su posterior Western Bloí revelado con un policlonal aníi-Ova el cual demosíró la presencia de una banda correspondiente a Ova deníro del perfil proteico de las VME.

Preseníación de Ova incorporada en las VME a TCD4⁺ y activación de las mismas: Fue empleado el hibridoma de células T CD4⁺ resíringidas para MHC clase II específico para el pépíidos Ova (257-264). Células Dedrííicas (CD) fueron incubadas por 2 h con VME-Ova o Ova soluble y luego co-culíivadas con el hibridoma de células T. Los sobrenadantes fueron coleclados luego de 24 h y fesíados para detectar producción de IL2 a través de la incorporación de [³H] timidina por la línea celular CTLL dependiente de IL2. La producción de IL2 brinda una medida de la activación de los hibridomas de células T específicos para péptidos de Ova. La Figura 26 muestra que las CD incubadas con VME-Ova pueden presenfar los pépíidos de Ova al hibridoma de células T CD4⁺. El hibridoma de células T produjo niveles de IL2 significativamente mayores cuando fue estimulado con CD que habían sido previamente incubadas con VME-Ova en comparación con CD incubadas solo con Ova. Las diferencias significaíivas eníre los niveles de preseníación del pépíido específico de Ova en MHC-II por CD incubadas con PL-Ova o Ova fueron determinadas usando la Prueba de comparación múltiple de Duncan con un rango de confianza del 95%. De esta forma, el Proteoliposoma puede liberar aníígenos a CD y propiciar una eficiente presentación aníigénica a células TCD4⁺. Respuesla de IgG aníi-Ova en ratones C3H/HeN inmunizados con VME-Ova: Ratones C3H/HeN fueron inmunizados intramuscularmeníe con dos dosis de 5 mg/ml de VME-Ova o solución salina íamponada de fosfato (SSTF) como control negativo o una dosis de la emulsión Titermax-Ova como conírol positivo. El adyuvante comercial Tifermax (Sigma, UK) fue emulsionado con Ova y adminisírado siguiendo las indicaciones del proveedor. Todos los sueros se obíuvieron 21 días después de la primera dosis y fueron evaluados por ELISA para determinar los niveles de IgG aníi-Ova presentes en cada grupo. Alias conceníraciones de IgG aníi- Ova fueron deíecíadas en el suero de ratones inmunizados con VME-Ova y que con Tifermax-Ova (Fig. 27). Este resulíado evidencia la capacidad adyuvante de las VME a través de su habilidad para inducir una respuesta de IgG elevada coníra el aníígeno heíerólogo incorporado en su esírucíura.

Respuesía de subclases IgG aníi-Ova en ratones C3H/HeN inmunizados con VME- Ova: La subclase lgG2a es característica del paírón Th1 en murinos. Determinar la composición de subclases de la respuesía IgG evidenciada en ratones C3H/HeN inmunizados con VME-Ova era crucial para esclarecer la capacidad adyuvante de las VME. En ratones C3H/HeN inmunizados con VME-Ova se obfuvo un mayor título de lgG2a que de lgG1 anti-Ova. Sin embargo, en los ratones inmunizados con Titermax-Ova se indujo una mayor respuesía de lgG1 que de lgG2a (Fig. 28). Esíe resulfado evidenció que las VME son capaces de polarizar la respuesía inducida coníra el aníígeno heferólogo incluido en su estrucíura hacia un paírón de respuesía Th1.

Ejemplo 25. Potenciación de la respuesta anti Core y aníi Cápside del Virus de la Hepatitis C (VHC) por su incorporación en esírucíuras cocleares (AFCol ). Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía intramuscular (IM) en las semanas 0, 3 y 7. Siete grupos, de 10 animales, fueron inmunizados con uno de los siguientes inmunógenos: 50 g del plasmidio plDKE2 (Dueñas-Carrera S, Alvarez-Lajonchere L, Alvarez- Obregón JC, Pérez A, Acosía-Rivero N, Vázquez DM, Martínez G, Viña A, Pichardo D, Morales J. Enhancemení of íhe immune response generaíed againsí íhe hepatitis C virus envelope proteins after DNA vaccinaíion wiíh polyproíein-encoding plasmids. Biotechnol Appl Biochem. 2002;35:205-212), contiene la secuencia codificante para los antígenos Core, E1 y E2 del VHC;

50 g de plDKE2 VHC incorporados en 12 g de estrucluras cocleares (AFCol); 10 g de proíeína Core del VHC, (Alvarez-Obregon JC, Dueñas-Carrera S, Valenzuela C , Morales J. A íruncaíed HCV core profein eliciís a poíení immune response wiíh a sfrong participaíion of cellular immuniíy componenís in mice. Vaccine 2001 ; 19:3940-3946) comprende los primeros 120 aa de la proíeína de la cápsida del VHC;

10 g de profeína Core del VHC incorporados en 12 g de AFCol ; 12 g de AFCol ; 50 g del plasmidio pAEC-K6 (Herrera AM, Rodríguez EG, Hernández T, Sandez B y Duarte CA. A family of compací plasmid vectors for DNA immunization in humans. Biochem Biophys Res Commun. 2000;279(2):548-551 ) que no contiene secuencias codificantes para antígenos del VHC; 50 g de pAEC-K6 incorporados en AFCol ; Solución salina.

Los plasmidios y la proteína Core fueron adminisírados en solución salina. La figura 29 muestra la respuesta de IgG contra la proteína Core, 2 semanas después de la última inmunización. El uso del AFCol potenció la respuesta de anticuerpos inducida coníra la profeína de la cápsida inducida por el plasmidio plDKE2 (p<0.01). Adicionalmente, la incorporación de la proíeína Core en el AFCol indujo niveles de aníicuerpos significativamente superiores a los inducidos por la proleína Core sola (p<0.05). Veníajas de la solución propuesía Las vesículas de membrana exíerna son exíraídas de organismos vivieníes lo que permite la selección de constifuyentes duranle el proceso exíractivo de las membranas externas, que son la primera barrera de contacto huésped-patógeno, por lo que estos constiíuyeníes tienen amplias posibilidades de ser protectores en animales y humanos; Durante el proceso exlracfivo es posible la inclusión de oirás proíeínas de interés ya sean naturales o recombinaníes;

Las vesículas de membrana exíerna exíraídos de organismos vivieníes son más esíables que los liposomas formados artificialmente, pudiendo mantenerse por varios meses y hasfa años sin alteraciones significaíivas que afecten la formación de fuíuras esírucíuras cocleares;

La preferente inducción de respuesía celular, Th1 en animales y humanos, convierte a estos adyuvantes o vacunas en efecíivos, además de en adultos y niños, duraníe la Lacíancia; La esírucíura coclear formada es termo resistente, por lo que puede ser una buena opción para resolver los problemas de la cadena de frío de varias vacunas, por su formulación en este adyuvante o su desarrollo a partir de vesículas de membrana exíerna y esfrucíuras cocleares; La estrucíura coclear formada es ácido y básico resistentes, por lo que es una opción importante a tener en cuanta en las vacunas orales;

Los anfígenos son incorporados duraníe el proceso productivo, lo que hace al producto final termo resistente, acidorresisteníe y básico resistente; La versatilidad de anfígenos a incluir, solubles y particulados, incluyendo ácidos nucleicos, permite producir gran número de vacunas e incluso ser múltiples; Contiene paírones moleculares asociados a patógenos y se les pueden incorporar oíros a voluníad para incremeníar su poder adyuvante e inmunogénico, logrando reducir la posible toxicidad de algunos de estos patrones y por ello su respuesta inflamatoria;

Estas estrucíuras cocleares logran inducir respuesfas mas íempranas, potentes y duraderas in vivo;

Esfas esfrucíuras cocleares logran inducir, in vitro, mejores respueslas a nivel de ciíocinas inducíoras de paírones de respuesía inmune celulares; Conserva las propiedades de los cocleaíos artificiales (eficiente incorporación de antígenos hidrofóbicos, sistema de liberación lenfa, contenido de calcio como mineral esencial, reducción de oxidación lipídica, liofilización, efe.); pero supera a estos en inmunogenicidad, por la inclusión de paírones moleculares asociados a patógenos y su capacidad de inducción de un pafrón Th1 , incluyendo la inducción de respuesía T ciíoíóxica y

Se evifa la procedencia de animales superiores de los lípidos y colesíerol.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Métodos para la producción de cocleaíos descrito en Gould-Fogeriíe eí al.

U. S. Paí. No 5,643,574, July 1 , 1997. Figura 2. Método simplificado de la forma de obtención de las esfrucíuras cocleares objetos de la presente invención.

Figura 3. Microscopía elecírónica de una esírucíura coclear.

Figura 4. A, eleefroforesis en gel de acrilamida al 12.5% teñida con Azul Coomassie de las proteínas presentes en las vesículas de membrana externa y las estrucíuras cocleares y B,

Western BIoí de las proíeínas presentes en las vesículas de membrana exíerna y las esírucíuras cocleares usando un suero humano de alio íiíulo coníra las vesículas de membrana exíerna. Figura 5. Respuesías séricas de IgG aníi vesículas de membrana exíerna en raíones inmunizados por vía pareníeral con VA-MENGOC-BC^® o con estrucíuras cocleares evaluados por ELISA.

Figura 6. Respuesías séricas de IgG aníi vesículas de membrana externa (VME) en ratones inmunizados por vía intramuscular con VA-MENGOC-BC^® o vesículas de membrana externa evaluados por ELISA.

Figura 7. Respuestas séricas de IgG anti vesículas de membrana externa (VME) en ratones inmunizados por vía intragástica (IG) o intranasal (IN) con vesículas de membrana externa evaluados por ELISA. Figura 8. Respuestas séricas de IgG anti vesículas de membrana externa (VME) en ratones inmunizados por vía infranasal (IN) con vesículas de membrana exíerna evaluados por ELISA.

Figura 9. Respuesía en saliva de IgA aníi vesículas de membrana exíerna en ratones inmunizados por vía iníragásírica (IG) o intranasal (IN) con estrucíuras cocleares evaluados por ELISA.

Figura 10. Respuesía en saliva de IgA aníi vesículas de membrana exíerna en raíones inmunizados por vía iníranasal (IN) con vesículas de membrana exíerna evaluados por ELISA.

Figura 11. Resulíados en suero de las subclases de IgG aníi vesículas de membrana exíerna de animales inmunizados con esírucíuras cocleares evaluados por ELISA.

Figura 12. Resulíados en suero de las subclases de IgG aníi exierna de animales inmunizados con vesículas de membrana exíerna evaluados por ELISA.

Figura 13. Resultados en suero de la termo resistencia y la acidoresistencia de las eslrucíuras cocleares evaluados por ELISA.Figura 14. Evaluación de la producción de IL12 por las células U937 estimuladas con las estructuras cocleares.

Figura 15. Evaluación de la producción de IL12 por las células U937 estimuladas con vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis.

Figura 16. Producción de oxido nítrico por las células J774 incubadas con las estrucíuras cocleares. Figura 17. Producción de oxido níírico por las células J774incubadas con las vesículas de membrana exíerna de Neisseria meningitidis.

Figura 18. Estimulación de células dendrííicas humanas por esírucíuras cocleares. Figura 19. Resulíados de las induraciones de animales inmunizados con esírucíuras cocleares conteniendo amasíigoíes y reíados con Lelshmanais major. Figura 20. Resulíados del efecto adyuvante de la conjugación de polisacárido con vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis. Figura 21. Resultados del efecto adyuvante de la conjugación de polisacárido con vesículas de membrana externa de Salmonella tiphy.

Figura 22. Resultados de la incorporación de patrones moleculares asociados a patógenos Figura 23. Resulíados del efecto de la sonicación sobre la respuesta inducida por las esírucíuras cocleares.

Figura 24. Resulfados de la potenciación de la vía nasal por estímulo inicial intramuscular.

Figura 25. Cinética de respuesía de IgG aníi VME potenciada por las esírucíuras cocleares (AFCol ). La respuesía de IgG aníi VME fue determinada en el suero de animales inmunizados por vía inframuscular con VME, VA-MENGOC-BC^® o AFCol . Como puede apreciarse el AFCol indujo respuesías significativamente superiores y más duraderas.

Figura 26. Células dendríticas (CD) pueden procesar pépíidos de Ova incluidos en las vesículas de membrana exíerna (VME) (VME-Ova) y preseníarlos en MHC-II. La producción de IL-2 por el hibridoma de células TCD4⁺ fue cuaníificada por incorporación de [³H] limidina por la línea celular CTLL dependiente de IL-2. Los datos se presenten como la media + la desviación esíándar de fres experimentos difereníes. *s¡gnificativamente diferente de otros grupos. Figura 27. Respuesía de IgG aníi-Ova en raíones inmunizados con VME-Ova. Ratones C3H/HeN fueron inmunizados con dos dosis de VME-Ova 5 mg/ml, solución salina íamponada de fosfato o con la emulsión Tiíermax-Ova (conírol positivo). Los sueros fueron colecíados 21 días luego de la primera inmunización y evaluados por ELISA. Los datos muesíran la conceníración de IgG promedio de cinco animales en cada grupo ± la desviación esíándar y son represeníativos de fres ensayos difereníes.

Figura 28. Respuesía de subclases de IgG aníi-Ova en raíones inmunizados con VME-Ova. Raíones C3H/HeN fueron inmunizados con dos dosis de VME-Ova 5 mg/ml, solución salina tamponada de fosfato o con la emulsión Tiíermax-Ova (conírol positivo). Los sueros fueron colectados 21 días luego de la primera inmunización y evaluados por ELISA. Los datos muesíran el íííulo de lgG1 y de lgG2a de las mezclas del suero de cinco animales en cada grupo y son represeníativos de fres ensayos diferentes.

Figura 29. Respuesta de IgG coníra la proleína Core del Virus de Hepaíiíis C (VHC) inducida por inmunización iníramuscular de animales, evaluada por ELISA. La respuesía de IgG aníi Core fue determinada en el suero de animales inmunizados por vía iníramuscular con fres dosis (semanas 0, 3 y 7) y sangrados dos semanas posteriores a la última dosis. Como puede apreciarse la incorporación de los dos antígenos (Core y Cápside) en AFCol indujo respuesías significativamente superiores.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición vacunal caracíerizada porque comprende esírucíuras cocleares proíeolipídicas obtenidas a partir de vesículas de membrana exíerna de organismos vivos y opcionalmeníe uno o más aníígenos, así como un excipiente adecuado.

2. Composición vacunal según la reivindicación 1 , caracíerizada porque dichas esíructuras cocleares estén formadas por proteínas, lípidos y patrones moleculares asociados a patógenos.

3. Composición vacunal según la reivindicación 2, caracíerizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos se encueníran o sean adicionados eníre el 1 % y el 30% del peso proteico de la esfrucíura coclear.

4. Composición vacunal según reivindicación 3, caracíerizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos son seleccionados del grupo consistente en lipopolisacárido, peptidoglicano, lipoproíeína, ácido íeicoico, flagelina y lipofosfoglicano.

5. Composición vacunal según reivindicación 1 , caracíerizada porque el organismo vivo de donde se exíraen las vesículas de la membrana externa a partir de las cuales se forman las estrucíuras cocleares sea una bacteria, un protozoario o una célula animal.

6. Composición vacunal según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha bacteria puede ser Gram negativa o Gram positiva.

7. Composición vacunal según reivindicación 6, caracíerizada porque dicha bacteria Gram negaíiva sea de los géneros Neisseria, Haemophilus, Salmonella, Vibrio, Pseudomona o Shigella.

8. Composición vacunal según la reivindicación 6, caracíerizada porque dicha bacteria Gram positiva sea de los géneros Streptococcus o Staphylococcus.

9. Composición vacunal según reivindicación 5, caracterizada porque el organismo vivo sea el proíozoo del género Leishmania.

10. Composición vacunal según la reivindicación 5, caracterizado porque las estrucíuras cocleares provienen de una célula tumoral.

11. Composición vacuna! según la reivindicación 1 , caracíerizada porque los aníígenos a incluir adicionalmeníe se encuenlran con respecto a las proíeínas presentes en la esfructura coclear en una relación eníre 0,2-2,7 μg por cada 3-9 μg de proíeína.

12. Composición vacunal según la reivindicación 1 , caracíerizada porque los anlígenos a incluir adicionalmeníe son seleccionados del grupo consistente en: proíeínas naíurales o recombinaníes, pépfidos, sacáridos, ácidos nucleicos; conjugados o alérgenos.

13. Composición vacunal según la reivindicación 12, caracíerizada porque el aníígeno adicionado sean proteínas del virus de la hepatitis C.

14. Composición vacunal según la reivindicación 12, caracíerizada porque el aníígeno adicionado sean epííopes T o B

15. Adyuvante vacunal caracterizado porque comprende esírucíuras cocleares proleolipidicas obtenidas a partir de vesículas de membrana externa de organismos vivos.

16. Adyuvante vacunal según la reivindicación 15, caracíerizada porque dichas esírucíuras cocleares esíán formadas por proteínas, lípidos y paírones moleculares asociados a patógenos.

17. Adyuvante vacunal según la reivindicación 16, caracíerizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos se encueníran eníre el 1 % y el 30% del peso proteico de la esírucíura.

18. Adyuvante vacunal según reivindicación 16, caracíerizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos son seleccionados del grupo consistente en lipopolisacárido, peptidoglicano, lipoproíeína, ácido íeicoico, flagelina y lipofosfoglicano.

19. Adyuvante vacunal según reivindicación 15, caracíerizada porque el organismo vivo de donde se exíraen las vesículas de la membrana externa a partir de las cuales se forman las esírucíuras cocleares es una bacteria, un proíozoario o una célula animal.

20. Adyuvante vacunal según la reivindicación 19 caracíerizada porque dicha bacteria sea Gram negaíiva o Gram positiva.

21. Adyuvante vacunal según reivindicación 20, caracterizada porque dicha bacteria Gram negaíiva es de los géneros Neisseria, Haemophilus, Salmonella, Vibrio, Pseudomona o Shigella.

22. Adyuvante vacunal según la reivindicación 20, caracíerizada porque dicha bacteria Gram posiíiva es de los géneros Streptococcus o Staphylococcus.

23. Adyuvante vacunal según reivindicación 19, caracíerizada porque el organismo vivo sea el proíozoo del género Leishmania.

24. Adyuvante según reivindicación 19, caracterizado porque las esírucíuras cocleares provienen de una célula íumoral.

25. Composición vacunal caracíerizada porque comprende vesículas de membrana exíerna obtenidas a partir de organismos vivos y opcionalmeníe uno o más aníígenos, así como un excipiente adecuado.

26. Composición vacunal según la reivindicación 25, caracíerizada porque dichas vesículas de membrana externa eslán formadas por proteínas, lípidos y patrones moleculares asociados a patógenos.

27. Composición vacunal según la reivindicación 26, caracterizada porque los patrones moleculares asociados a patógenos se encueníran eníre el 1 % y el 7% del peso de proteico de la estrucíura.

28. Composición vacunal según reivindicación 26, caracíerizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos son seleccionados del grupo consistente en lipopolisacárido, pepíidoglicano, lipoproteína, ácido íeicoico, flagelina y lipofosfoglicano.

29. Composición vacunal según reivindicación 25, caracíerizada porque el organismo vivo de donde se exfraen las vesículas de la membrana exíerna es una bacteria, un proíozoario o una célula animal.

30. Composición vacunal según la reivindicación 29, caracterizada porque dicha bacteria puede ser Gram negativa o Gram posiíiva.

31. Composición vacunal según reivindicación 30, caracíerizada porque dicha bacteria Gram negaíiva es de los géneros Neisseria, Haemophilus, Salmonella, Vibrio, Pseudomona o Shigella.

32. Composición vacunal según la reivindicación 29, caracterizada porque dicha bacteria Gram posiíiva es de los géneros Streptococcus o Staphylococcus.

33. Composición vacunal según reivindicación 29, caracíerizada porque el organismo vivo es el proiozoo del género Leishmania.

34. Composición vacunal según la reivindicación 29, caracíerizado porque las vesículas de membrana exíerna provienen de una célula íumoral.

35. Adyuvante vacunal caracíerizado porque comprende vesículas de membrana exíerna obtenidas a partir de organismos vivos.

36. Adyuvante vacunal según la reivindicación 35, caracíerizada porque dichas vesículas de membrana exíerna esíán formadas por proíeínas, lípidos y paírones moleculares asociados a patógenos.

37. Adyuvante vacunal según la reivindicación 36, caracíerizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos se encueníran eníre el 1 % y el 7% del peso de proteico de la estrucíura.

38. Adyuvante vacunal según reivindicación 36, caracterizada porque los paírones moleculares asociados a patógenos son seleccionados del grupo consistente en lipopolisacárido, peptidoglicano, lipoproteína, ácido íeicoico, flagelina y lipofosfoglicano.

39. Adyuvante vacunal según reivindicación 35, caracíerizada porque el organismo vivo de donde se exíraen las vesículas de la membrana exíerna es una bacteria, un proíozoario o una célula animal.

40. Adyuvante vacunal según la reivindicación 39, caracíerizada porque dicha bacteria sea Gram negativa o Gram posiíiva.

41. Adyuvante vacunal según reivindicación 40, caracíerizada porque dicha bacteria Gram negaíiva sea de los géneros Neisseria, Haemophilus, Salmonella, Vibrio, Pseudomona o Shigella.

42. Adyuvante vacunal según la reivindicación 40, caracíerizada porque dicha bacíeria Gram posiíiva sea de los géneros Streptococcus o Staphylococcus.

43. Adyuvante vacunal según reivindicación 39, caracterizada porque el organismo vivo es el protozoo del género Leishmania.

44. Adyuvante según reivindicación 39, caracíerizado porque las vesículas de membrana exierna provienen de una célula lumoral.

45. Méíodo para la obtención de estructuras cocleares a partir de vesículas de membrana externa de organismos vivos caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a. preparación, a partir de las vesículas de membrana exíerna naíurales, de una solución a una conceníración de proíeínas íolales eníre 3 y 6 mg/mL, a la que se le añade un detergente no iónico hasía alcanzar una relación de 10 veces la conceníración de proíeínas.

b. de desear incorporar oíros aníígenos de interés o patrones moleculares asociados a patógenos estos se añaden a la solución preparada en a) homogenizando la misma a razón de 0,2-2,7 μg por cada 3-9 μg de proíeína para los anlígenos y de 1 a 30% la conceníración proteica para los paírones. c. posteriormente, la solución de los pasos a) ó b) se filíra a íravés de una membrana con íamaño de poro de 0.2 μm para esterilizarla y eliminar los agregados de vesículas de membrana exíerna no disuelíos.

d. posteriormente, se realiza una diálisis roíacional o filíración íangencial coníra una solución que contiene conceníraciones de un ion mulfivalenie, particularmente, Ca²⁺, Zn²⁺ o Mg²⁺, eníre 2,5 y 6,5 mM en condiciones íamponadas de pH 7,4 ± 0,2.

e. finalmente, a las estrucíuras cocleares obtenidas se les realiza un íraíamiento mecánico, particularmente, sonicación en baño de agua temperada a una temperaíura eníre 15 °C y 25°C duraníe 45 min., para homogeneizar el íamaño de las partículas.

46. Composición vacunal según reivindicaciones de la 1 a la 14, caracíerizada porque es aplicada por vía mucosal, pareníeral o combinación de las mismas.

47. Composición vacunal de las reivindicaciones de la 26 a la 34, caracterizada porque es aplicada por vía mucosal, pareníeral o combinación de las mismas.

48. Adyuvante de las reivindicaciones de la 15 a la 24, caracíerizado porque es aplicado por vía mucosal, pareníeral o combinación de las mismas.

49. Adyuvante de las reivindicaciones de la 35 a la 44 caracterizado, porque es aplicado por vía mucosal, pareníeral o combinación de las mismas.