WO2002092812A1 - ARTIFICIAL HUMAN CHROMOSOME CONTAINING HUMAN ANTIBODY μ LIGHT CHAIN GENE - Google Patents

ARTIFICIAL HUMAN CHROMOSOME CONTAINING HUMAN ANTIBODY μ LIGHT CHAIN GENE Download PDF

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WO2002092812A1
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Yoshimi Kuroiwa
Kazuma Tomizuka
Hitoshi Yoshida
Isao Ishida
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Medarex, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a chick artificial chromosome that is capable of highly efficient offspring transmission to the next generation by modifying a chromosome or a fragment thereof, a non-human animal for highly efficient offspring transmission of the human artificial chromosome to the next generation, and offspring thereof.
  • the present invention relates to a method for producing an antibody from the nonhuman animal or its progeny, and a human antibody-producing mouse.
  • HAC human artificial chromosome
  • HAC human artificial chromosome
  • a HAC uses a stable and progeny-transferable SC20 fragment derived from human chromosome 14 as a chromosome vector, and this vector contains a human antibody light chain gene on human chromosome number n and a 10 Mb sized chromosomal region containing human light chain gene. It is an artificial chromosome obtained by translocating and cloning as an insert.
  • this A HAC has almost the same stability as the SC20 fragment used as a vector, and may be stabilized by translocating various unstable chromosome-derived regions into SC20. showed that. Furthermore, this A HAC was introduced into mice, and a chimera mouse stably holding A HAC was successfully created.
  • the region 22Q11 on human chromosome 22 in which the human antibody IgA gene is present has a genetic expression disease-causing region dependent on gene expression such as cat eye syndrome, DiGeorge syndrome and der22 syndrome. (Eg, A. Puech et al., PNAS 97: 10090, 2000).
  • these genetic disease regions were removed, and only 10 Mb from the HCF2 locus to the LIF locus on human chromosome 22 was translocated into the SC20 chromosomal vector to construct A HAC, which was then introduced into the mouse.
  • the chimera rate of chimeric mice born from ES cells holding A HAC is increased as compared to the case where human full-length chromosome 22 is introduced.
  • the present inventors attempted to further improve human artificial chromosomes in order to achieve more efficient offspring transmission as compared to the conventional A HAC, and to examine their offspring transmission efficiency. went.
  • the present invention relates to a human artificial chromosome that is capable of modifying human chromosome 22 or a fragment thereof, and can transmit offspring with high efficiency to the next generation, and a non-human animal that holds the human artificial chromosome and offspring thereof. Intended to be provided.
  • the present invention also aims to provide a method of producing a human antibody using the non-human animal or a progeny thereof.
  • the present inventors have modified human chromosome 22 and selected two types of regions whose structure is clear including the antibody ⁇ light chain gene (IgA) region, We constructed a human moth artificial chromosome in which each of the selected regions was translocated to a human chromosome 14 fragment, and a high chimera ratio mouse carrying these was created. As a result, the present inventors have observed that the human artificial chromosome is transmitted to the next generation offspring through meiosis with high efficiency in the chimeric mouse, and completed the present invention.
  • IgA antibody ⁇ light chain gene
  • the gist of the present invention is as follows. ⁇
  • the present invention relates, in one aspect, to an additional human being capable of transmitting offspring through the germ line of a non-human animal, and an about 3.5 Mb to about 1 Mb region comprising the antibody ⁇ light chain gene derived from human chromosome 22;
  • the present invention provides an artificial chromosome, which is a combination of chromosome fragments derived from chromosomes.
  • said chromosomal fragment derived from another human chromosome is Any stable chromosomal fragment capable of progeny transmission can be used, for example, a human chromosome 14 fragment, a human chromosome 21 or a fragment thereof, or a SAC (smal (smal l acces sory chromosome (Genome Res., 11: 124-136, 2001) is preferably a human chromosome 14 fragment, for example, the SC20 chromosome vector derived from human chromosome 14 (Kuroiwa et al., supra).
  • the SC20 chromosomal vector can be used to clone a desired chromosomal fragment, for example, by inserting the ⁇ sequence by homologous recombination into the RNR2 gene locus located at the 14pl2 site (Kuroiwa et al. , Supra).
  • the chicken DT-40 cells (SC20) carrying the SC20 chromosomal vector are included in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (1st Street, 1st Street, 1st Street, Central 6th, Tsukuba, Japan) It was deposited internationally on May 9, and has been assigned the accession number FERM BP-7583.
  • the above-mentioned chromosome fragment derived from another human chromosome preferably comprises a chimeric non-human animal carrying said chromosomal fragment for various human chromosome fragments having a size of about 20 Mb or less. It can also be obtained by selecting one that stably holds the human chromosome fragment in the offspring of the chimeric non-human animal.
  • the region between the region containing the antibody ⁇ light chain gene derived from the above-mentioned ⁇ chromosome 22 and the human chromosomal fragment capable of transmitting the offspring can be linked by transposition or insertion via a site-specific recombination sequence such as the replication sequence. To be done.
  • Translocation binding occurs when the region containing the antibody ⁇ light chain gene is excised at both ends of the telomer and ⁇ sequences, as shown in the examples below.
  • the region containing the antibody ⁇ light chain gene is excised by inserting the ⁇ sequence at both ends, insertion occurs at the ⁇ sequence site on the progeny transmittable chromosome fragment.
  • the region comprising the antibody ⁇ light chain gene from human chromosome 22 is from about 2.5 Mb to about 1.5 Mb in size.
  • the region comprising the antibody ⁇ light chain gene from human chromosome 22 is about 2.5 Mb or about 1.5 Mb in size.
  • a specific example of the region of such size is each a bird DT-40 having accession number FERM BP-7582.
  • Cells human artificial chromosome consisting of AHAC held in ⁇ and avian DT-40 cells ( ⁇ HA held in ⁇ ) (Accession No. FERM BP-7581) (see Examples below).
  • the present invention also provides, in another aspect, a non-human animal carrying the above-mentioned present invention chick artificial chromosome.
  • a non-human animal refers to a vertebrate other than human, preferably a mammal.
  • the non-human animal carries a human artificial chromosome of either A HAC or A AHAC.
  • the non-human animal is a mammal.
  • the preferred mammal is a mouse.
  • the present invention further provides, in another aspect, introducing the above-mentioned human artificial chromosome of the present invention into an embryonic stem cell (ES cell) of a non-human animal by microcell method, and obtaining the obtained ES cell into the embryo of the non-human animal.
  • ES cell embryonic stem cell
  • Provided is a method of producing a human animal.
  • CH0 Chinese hamster ovary
  • the method further comprises: producing offspring of the screened non-chimeric animal screened for, and screening the offspring for the chromosome of the chick.
  • the non-human animal obtained by the above method is capable of expressing human antibody immunogloblin heavy chain and ⁇ chain proteins.
  • the non-hypox animal is a mammal, preferably a mouse.
  • the present invention further provides, in another aspect, a non-human animal carrying the above-mentioned human artificial chromosome of the present invention, which can be obtained by the above-mentioned method of the present invention.
  • the present invention further provides, in another aspect, the offspring of the above-mentioned non-human animal of the present invention.
  • Progeny animals are characterized by carrying the human artificial chromosome of the present invention.
  • the offspring animals can express human antibody immunoglobulin heavy and light chain proteins.
  • the offspring animals can express human antibody immunoglobulin heavy chain, ⁇ light chain and ⁇ light chain proteins.
  • the offspring is a mouse.
  • the present invention further comprises immunizing the non-human animal of the present invention as described above or the progeny of the present invention as described above with a desired antigen, and obtaining a human polyclonal antibody against the antigen from the animal.
  • a manufacturing method is provided.
  • the human polyclonal antibody is obtained from the blood of an animal.
  • the present invention further provides, in another embodiment, immunizing the above-mentioned mouse of the present invention or the above-mentioned present invention mouse of the present invention with a desired antigen, and then fusing spleen cells from the mouse with mouse myeloma cells to prepare
  • a method for producing an antibody comprises producing a doma and producing a human monoclonal antibody consisting of human immunoglobulin heavy and light chains against the antigen.
  • the present invention further provides, in another embodiment, immunizing the above-mentioned mouse of the present invention or the above-mentioned mouse of the present invention with a desired antigen, and then fusing spleen cells from the mouse with mouse myeloma cells to generate A tumor is prepared, a human antibody gene is isolated from the hybridoma, the human antibody gene is introduced into animal cells, yeast cells or insect cells, and the cells are cultured under conditions which allow expression of the human antibody gene.
  • a method for producing an antibody which comprises producing a human monoclonal antibody consisting of a human immunoglopurine heavy chain and a light chain against an antigen.
  • the present invention further provides, in another embodiment, immunizing the above-mentioned mouse of the present invention or the above-mentioned present invention mouse of the present invention with a desired antigen, and then using antibody display of antibody gene derived from the mouse cell by phage display method.
  • Selected and selected A human antibody gene is introduced into an animal cell, a yeast cell or an insect cell, and the cell is cultured under conditions that allow expression of the human antibody gene to prepare a human monoclonal antibody consisting of a human immunoglobulin heavy chain and a light chain against the antigen.
  • the method for the above expression can be carried out by a known method (for example, the method described in Sambrook et al., Mol Cloning A Laboratory Manual, second ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • animal cells, yeast cells or insect cells as hosts are CH0 cells, BHK cells, hepatoma cells, myeloma cells, baker's yeast cells, SF9 cells and the like.
  • the present invention further provides, in another embodiment, a human antibody-producing mouse that expresses a human antibody heavy chain comprising human antibody IgA, a human antibody ⁇ light chain and a human antibody ⁇ light chain in serum. Do.
  • the human antibody-producing mouse has unrearranged human antibody heavy chain locus, human antibody / c light chain locus, and human antibody ⁇ light chain locus, and at least the endogenous antibody heavy chain And both kappa light chain alleles are disrupted or inactivated.
  • variable region fragments V-D-J for heavy chain and V-J for light chain
  • ⁇ cells preferably B cells.
  • human antibody which is the gene product of the gene is produced in serum.
  • not rearranged means that the antibody locus has not undergone V_D-J recombination in the heavy chain and V-J recombination in the light chain, and the B gene has been differentiated. It is maintained in a mouse undifferentiated B cell in a state capable of causing V_D-J recombination in the heavy chain and V-J recombination in the light chain.
  • the human antibody-producing mouse retains at least 40% of the variable region of human antibody / C light chain.
  • the human antibody-producing mouse retains all variable regions of human antibody heavy chain, human antibody ⁇ light chain, and human antibody ⁇ light chain.
  • a human antibody heavy chain locus, a human antibody light chain locus, and a human antibody ⁇ light chain locus are carried on a chromosomal fragment derived from human.
  • the human antibody heavy chain locus and the human antibody ⁇ light chain locus are carried on a human artificial chromosome of either AHAC or ⁇ ⁇ .
  • the human antibody ⁇ light chain locus is carried on a chromosomal fragment of human origin.
  • the human antibody zeta light chain locus is inserted into a mouse chromosome.
  • the above-mentioned mouse that produces rabbit antibody is not a chimeric mouse, and preferably, the above-mentioned human antibody heavy chain locus, human antibody ⁇ light chain locus, and human antibody ⁇ light chain gene Communicate with the offspring.
  • the present invention relates to construction of a novel human artificial chromosome obtained by translocating and cloning a fragment containing an IgA gene on human chromosome 22 into a chromosome fragment derived from human chromosome 14 chromosome, and a mouse of said human artificial chromosome. Transmission of the offspring and production of transchromosomic non-human animals (eg, mammals such as mice) carrying the human artificial chromosome.
  • transchromosomic non-human animals eg, mammals such as mice
  • a human artificial chromosome refers to an artificial chromosome (HAC: Human Art if ial) produced by translocating a desired region on a human chromosome into a stable chromosomal fragment (chromosome vector). Say Chromosome).
  • transchromic non-human animals are animals other than hives whose offspring have been transmitted via heterozygous chromosomal fragments via germline.
  • the human artificial chromosome for example, inserts the ⁇ sequence and the human telomer sequence near the target gene region on the human chromosome by homologous recombination, and is sandwiched between the two sequences.
  • a stable and progeny transmittable chromosomal fragment eg, the SC20 chromosomal vector from human chromosome 14
  • they are constructed as human artificial chromosomes that retain only the periphery of the target gene region as inserts (chromosomal inserts) (Kuroiwa et al., Nature Biotech., 18: 1086, 2000).
  • the present inventors should remove as much of the chromosomal region presumed to have an adverse effect from the chromosomal DNA as much as possible so as not to adversely affect the development of a chromosomal transgenic animal such as a mouse.
  • a chromosomal transgenic animal such as a mouse.
  • the region between the two sequences contains many other genes besides the target gene, if these surplus genes were introduced into mice etc., they were feared to adversely affect the development. .
  • the relationship between the size of the chromosomal gene containing the target gene, the chimera rate of the transgenic animal and the transmission efficiency of the offspring were unknown.
  • a surplus gene refers to a harmful gene that adversely affects the development of a chromosome-introduced animal, and is, for example, a gene expression level-dependent hereditary disease causative region.
  • the human artificial chromosome of the present invention retains 10 Mb around the conventional Ig A gene region as a signal; its overall size is reduced as compared to L HAC, and it has high progeny transfer efficiency.
  • the modification of human chromosome 22 eliminates harmful genes that can adversely affect the development of mice and the like, and makes it possible to create a human artificial chromosome in which only a specific target Ig A gene region is retained as a signature.
  • the size reduction of the entire human artificial chromosome to be introduced is brought about, and a mechanism for eliminating abnormal chromosomes (in this case, the introduced human artificial chromosome) at the time of meiosis (for example, P. Hunt et al., Hum) Mol. Gene t., 4: 2007, 1995) can be avoided.
  • a transchromosomic non-human animal individual can be bred under conditions that can express a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and thereafter, the expression product can be recovered from the blood, ascites fluid and the like of the animal.
  • tissue or cell of transchromosomic non-human animal or an immortalized one (for example, a hybridoma immortalized by fusion with myeloma cells), etc. can be expressed as a condition under which a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof can be expressed. Under culture, the expression product can then be recovered from the culture.
  • foreign chromosomes or fragments thereof extracted from tissues, cells or immortalized versions of these transchromosomic non-human animals, DNAs constituting the foreign chromosomes or fragments thereof, or transchromosomal non-human animals CDNA derived from a foreign chromosome or a fragment thereof retained in a tissue, a cell, or an immortalized one thereof can be used as an animal cell, a yeast cell or an insect cell (eg, CH cell, BHK cell, hepatoma cell, (Eg, myeloma cells, baker's yeast cells, SF 9 cells, etc.), and culturing the cells under conditions that allow expression of the gene on the foreign chromosome or a fragment thereof, and then expressing the expression product (eg, specific antigen specific) Antibody protein etc.) from the culture can do.
  • a yeast cell or an insect cell eg, CH cell, BHK cell, hepatoma cell, (Eg, myeloma cells, baker's yeast cells,
  • the expression product can be recovered according to known methods such as centrifugation, and further according to known methods such as ammonium sulfate fractionation, partition chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, preparative thin layer chromatography and the like. It can be refined.
  • Biologically active substances include any substance encoded on foreign chromosomes and can include, for example, antibodies, in particular human antibodies.
  • a human antibody gene on the chromosome is cloned from the obtained transchromic non-human animal splenocytes or immortalized cells such as hybridomas thereof, and introduced into chimeric single hamster ovary cells (CHO) or myeloma cells.
  • Human antibodies can then be produced (Lynette et al., Biotechnology, 10: 1121, 1992; Bebbington et al., Biotechnology, 10: 169, 1992; Babcook et al., PNAS, 93: 7843, 19%).
  • a desired antibody-producing cell by selecting a hybridoma
  • spleens and lymph of the transchromosomic non-human animal of the present invention sensitized with an antigen unsensitized or a specific antigen are obtained.
  • Tissue-derived human immunoglobulin gene heavy and light chain variable regions cDNA can be used.
  • chromosomal engineering site-specific cleavage of endogenous mouse chromosomes in mouse ES cells (W0 98/54348) or recombination between homologous chromosomes (translocation) has been performed so far.
  • a non-human animal such as a mammal such as a mouse
  • a high chimera rate is obtained such that ES cells carrying human chromosomes or fragments thereof contribute to germ cells
  • introduced human chromosomes are in meiosis. It is a question whether sperm or ova holding the introduced human chromosome are formed without being excluded, as described above, in general, abnormal chromosomes are considered to have a mechanism to be excluded during meiosis, Cells carrying the transferred human chromosome are excluded in meiosis, and as a result, there is a possibility that they can not differentiate into sperm or egg.
  • the SC20 chromosomal vector (10-20 Mb) is progeny transferable and has high stability in mouse ES cells and individuals (Shinohara et al., Chromosome Res., 8: 713-725, 2000).
  • Such offspring transferable and mouse individual and stable naturally occurring chromosomal fragments can be obtained and selected by the methods described in W097 / 07671 and W098 / 37757.
  • human chromosomal fragments that are progeny-transferred and stable in mouse individuals are described in the report of Voet et al. (Genome Res., 11: 124-136, 2001). Furthermore, human chromosome 14 (about 100 Mb, Tomizuka et al., Nature Genet., 16: 133, 1997) and chromosome 21 (about 50 Mb, Sugahara et al., The 45th Japanese Family) which are stably retained in chimeric mice. Using the Society of Genetics Conference, October 2000) as the starting material, it can be used as a starting material by the chromosomal engineering method (Kuroiwa et al., Nature Biotech.
  • HACs constructed by translocating and cloning only the target gene region of a specific size range in the progeny transferable SC20 vector can transfer progeny by the vector effect of the SC20 fragment.
  • translocation may alter the stable structure of SC20, and furthermore, the size of the whole HAC may be larger than the original SC20 vector.
  • the size of the immunoglobulin ⁇ gene is smaller than that of A HAC (10 Mb), usually about 3.5 Mb to about 1 Mb, preferably about 3 Mb to about 1.2 Mb, and more. Preferably, it may be about 2.5 Mb to about 1.5 Mb.
  • the end on the centromeric side of the chromosomal translocation to be transposed is preferably the HCF2 locus, more preferably the AP000553 region (I. Dunham et al., Nature 402: 489, 1999). For such a strict chromosomal modification, the elucidation of the entire sequence of the chromosome to be modified as human chromosome 22 greatly contributes.
  • a human artificial chromosome obtained by translocating and cloning 5 Mb and 1.5 Mb regions containing the antibody ⁇ light chain gene on human chromosome 22 into the SC20 chromosomal vector. And ⁇ ⁇ ⁇ were prepared, then each of A HAC and AA HAC was introduced into a mouse individual, and the chimera rate in a chimeric mouse was compared with A HAC (Kuroiwa et al., Supra) to improve the chimera rate and human artificiality. The achievement of efficient offspring transmission of chromosomes was confirmed.
  • a HAC human artificial chromosome
  • Human antibody Chromosome 22 or a fragment thereof containing the human antibody ⁇ light chain gene can be obtained by a known method. That is, human chromosomes or fragments thereof can be library in mouse A9 cells by the microcell method (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res. 80: 413-418, 1989). By detecting a sequence specific to human antibody ⁇ light chain gene from the obtained library by PCR or the like, a clone retaining human chromosome 22 or a fragment thereof can be selected. Human chromosome 22 or a fragment thereof can be further transferred to a chicken DT-40 cell (RIKEN cell bank: RCB1464, ATCC: CRL-2111) by the microcell method for the convenience of subsequent modification.
  • RIKEN cell bank RCB1464, ATCC: CRL-2111
  • the human antibody ⁇ light chain gene class E1 is present at 22Q11. 2 on chromosome 22 (eg, JE Collins et al., Nature 377: 367, 1995).
  • chromosome 22 eg, JE Collins et al., Nature 377: 367, 1995.
  • a 10 Mb region from the HCF2 locus to the LIF locus has been translocating as a chromosomal signature.
  • 7 Mb is included on the telomere side of the Ig ⁇ gene region, and 1 Mb of extra chromosomal region is included on the centromere side.
  • chromosome 22 or its modified fragment (a fragment in which the ⁇ sequence is inserted into the HCF2 locus and telomere truncation at the LIF locus) is used as the IgA gene region.
  • AP000344 region I. Dunham et al., Nature 402: 489, 1999
  • telomeric side about 400 Kb telomere side
  • the insertion sequence is inserted by homologous recombination into the AP000553 region (I.
  • HCF2-Ig A -AP000344 fragment about 2.5 Mb
  • AP000553-Ig A -AP000344 fragment about 1.5 Mb
  • the constructed HAC can be used to generate a chimeric mouse after introduction into mouse ES cells by a conventional method. After confirming the retention of HAC in chimeric mice, they are crossed to obtain offspring mice. Transmission of HAC can be determined by confirming the retention of HAC in the resulting pups.
  • a transchromosomic non-human animal for example, a mouse
  • carries both the E. coli antibody heavy chain gene and the ⁇ light chain gene through offspring transfer of the human antibody ⁇ light chain gene Ig A whole region by AHAC Can be efficiently produced.
  • This is considered to be useful as a non-human animal producing human antibodies which can be drug candidates.
  • the diversity of human antibodies is due to the fact that the antibody containing ⁇ light chain accounts for about 40% in human serum and the number of ⁇ gene fragments (70) is equivalent to the number of V / chain genes (76). It is thought that an antibody containing ⁇ chain greatly contributes to the construction (Popov, AV., J. Exp. Med., 189: 1611, 1999).
  • mice are capable of offspring transmission of heterochromosomal fragments, mating will allow mass production of transchromosomic mice with uniform traits. Furthermore, mice carrying chromosomal fragments containing human antibody / light chain genes (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
  • They are Transgenic mouse introduced with a yeast artificial chromosome (YAC) containing part of Ig heavy chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, and human heavy chain // chain by combination of endogenous Ig heavy chain and ⁇ chain knock-out mouse
  • YAC yeast artificial chromosome
  • a mouse was constructed with human heavy chain /; I chain molecule as the main component of immunoglobulin.
  • the diversity and molecular structure of human immunoglobulins expressed in the mouse strain are significantly different from those in human.
  • one human Ig heavy chain YAC contains only the ⁇ constant region, and the other isotypes in the mouse strain, in particular, the 2 major YACs that do not express the largest component, i.e. It is assumed that the number of variable regions contained is small and the diversity of the rabbit antibody expressed in the mouse strain is also limited.
  • a hybridoma obtained by immunizing these human antibody-producing transchromosomic mice with a suitable antigen and fusing the spleen cells with mouse myeloma (Anto ⁇ Chiba, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Operation Procedure, Kodansha, Ltd.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Antibody Reagents
  • a hybridoma that produces a fully human monoclonal antibody consisting of human immunoglobulin heavy chain and ⁇ light chain can be obtained.
  • These monoclonal antibodies can be used as pharmaceutical antibodies.
  • polyclonal antibodies are considered to have greater therapeutic effect than monoclonal antibodies as therapeutic antibody drugs for infectious diseases and the like.
  • human polyclonal antibodies can also be developed as a so-called ⁇ globulin preparations. From the ES cells carrying A HAC or ⁇ constructed according to the present invention, a chimeric mouse is obtained with an actually high chimera ratio (about 80% to 100%, preferably about 85% to 100%), The chick pea artificial chromosomes transmit offspring with high efficiency, and continue to be maintained in the whole developmental process of being born as a pups from the stage of the fertile egg Rukoto has been shown.
  • antigen-specific human polyclonal antibody human ⁇ light chain-containing antibody
  • a large amount of antigen-specific human polyclonal antibody can be produced, which is a monoclonal antibody which is difficult to mass-produce. It can be expected as an antibody drug to replace antibodies.
  • the human artificial chromosome of the present invention can be introduced into not only mice but also other non-human animals, for example, mammals such as rats and pigs.
  • Establishment of ES cells or ES-like cells in animal species other than mice can be performed by using rats (Iannaccone et al., Dev. Biol., 163: 288, 1994), pigs (Wheeler et al., Reprod. Fertii. Dev. , 6: 563 (1994), and also attempted for medaka, chickens, etc. (Transgenic animal, protein-nucleic acid enzyme, October 1995 extra edition, Kyoritsu Publishing).
  • these ES or ES-like cells are used as recipient cells and human artificial chromosomes are transferred, as in the case of mice, they retain the human moth artificial chromosome or a fragment thereof and express genes on the human moth artificial chromosome.
  • Chickens can be produced.
  • these non-human animals can also be used to produce human ⁇ light chain-containing antibodies.
  • FIG. 1 shows the generation of human artificial chromosome ⁇ A AHAC.
  • Figure 2 shows the cassette vector pTELhi sD.
  • FIG. 3 shows a tagging vector and pTELhi sD A I.
  • Figure 4 shows the targeting vector p5531oxPHyg.
  • the cassette vector pTELPuro (Kuroiwa et al., Nature Biotech., 18: 1086-2000) is digested with the restriction enzyme Notl (Bei Ringer), and blunted at 72 ° (:, 5 minutes) using DNA Bluntingkit (Toyobo). After smoothing, it was dephosphorylated with bacteria-derived alkaline phosphatase (Takara Shuzo) at 65 ° (for 1 hour, then added with the restriction enzyme Bglll linker one (Takara Shuzo), and added to the ligation kit (Takara Shuzo).
  • Notl Bei Ringer
  • Toyobo DNA Bluntingkit
  • the plasmid pTELBg was constructed, in which the PGKPuro cassette in the pTELPuro plasmid was replaced with the Bglll linker fragment.
  • This plasmid was digested with the restriction enzyme Bglll and similarly dephosphorylated. Purification was performed by gel filtration using CHROMA SPIN-TE 400 (Clontech), and then plasmid # 1-132 (distributed by Professor Shunichi Takeda from Kyoto University) was cut with the restriction enzyme BamHI. The hisD fragment issued added, and the mixture was Raige Chillon reaction similarly.
  • PGKPuro cassette in pTELPuro plasmid cassette vector pTELhisD substituted with hisD cassette is produced (FIG. 2).
  • a targeting vector pTELhisDAI for inserting a human telomere sequence into the AP000344 region located in the telomerase side (approximately 400 Kb telomere side) which is located in the vicinity of the Ig locus on the human chromosome 22 is prepared as follows. First, the AP000344 genome region was amplified by PCR using the following primers. 1269D1-F; 5'-TCGAGGATCCGACAAGTTCTTCTTCTCTTTTCTTCTGCCC-3 '(SEQ ID NO: 1) 1269D1-R; 5'-TCGAGGATCCGCTGCTAAGCACTACTGTTCTCTTTTTCCCCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • PCR For PCR, use the GeneAmp 9600 made by Perkin-Elmer as a thermal cycler, Taa polymerase for LA TaQ (Takara Shuzo), buffer one or dNTPC dATP, dCTP, dGTP, dTTP) according to the recommended conditions. It was. The temperature and cycle conditions were heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, followed by 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 11 minutes. The PCR product was treated with Protenase K (Gibco) and gel-filtered with CHROMA SPIN-TE400 (Clontech).
  • PCR was performed using GeneAmp 9600 manufactured by Perkin-Elmer as a primary cycler.
  • LA Tad (Takara Shuzo) was used, and for the buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) was used according to the recommended conditions.
  • the temperature and cycle conditions were 98 cycles of 98 ° C.
  • the PCR product was treated with Protenase K (Gibco), and gel-filtered with CHROMA SPIN-TE400 (Clonintech). Then, it was digested with restriction enzyme SaiI (Beringa) and gel-filtered with CHROMA SPIN-TE1000 (Clontech). This The PCR fragment of was cloned into the Sail site of the plasmid pBluescriptll (previously the Notl site was deleted and the Sril linker fragment inserted into the SacII site) (pBS553).
  • Notl linker was inserted by ligation (pBS553N).
  • PBS553N was digested with restriction enzyme Notl and dephosphorylated, the DNA fragment containing ⁇ was excised from cassette vector ploxPHyg with restriction enzyme Notl (Beijing Ringer), and digested.
  • the cloning vector p5531oxPHyg was used in the same direction as the cloned APOO 0 553 genome fragment, with the direction of the LoxP sequence cloned ( Figure 4).
  • a chicken DT-40 cell (clone 52-18) retaining the full length of human chromosome 22 prepared by the method described in W098 / 37757 and a DT2 cell retaining human chromosome 22 fragment already cleaved at the LIF locus -Transfection of the DNA cloning vector pTELhisDA I prepared in Example 2 above into 40 cells (clone HF38), and inserting human telomerase sequence into the AP000344 genome region, so that chromosome 22 is inserted at the insertion site. I tried to disconnect.
  • the cuvettes were set on a gene pulsar (Bio-Rad), and a voltage was applied under conditions of 550 V, 25 ⁇ F. After standing for 10 minutes at room temperature, the cells were cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was replaced with a medium containing histidinol (0.5 mg / ml), aliquoted into 10 96-well culture plates, and selective culture was carried out for about 2 weeks. Puregene DNA Isolation from histidine resistant clones Genomic DNA is extracted using Kit (GentraSystem), HCF2 (Kuroiwa et al., Nature Biotech.
  • PCR was performed using GeneAmp 9600 manufactured by Perkin-Elmer as a thermal cycler, TaQ polymerase using LA Tad (Takara Shuzo), buffer or dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) according to the recommended conditions. .
  • the temperature and cycle conditions were heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, followed by 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
  • 48 clones were screened and 1 clone (T32) was a target clone.
  • HF38 was transfected, 96 clones were screened and 2 clones (HT69, HT72) were the target clones.
  • FISH analysis was performed using a probe capable of detecting the hisD resistance gene in the duvet vector.
  • the method followed Kuroiwa et al. (Nucleic Acid Research, 26: 3447-3448, 1998).
  • C0T1 staining indicates that chromosome 22 is fragmented in T32, ⁇ 69, and ⁇ 72 as compared to the full-length human chromosome 22.
  • the signal from hisD probe (FITC labeled, yellow) was detected at one end of the telomere. This indicates that AP000344, in which the vector has been incorporated, is one end of the telomerase of chromosome 22 fragment.
  • the ⁇ sequence has already been inserted into the HCF2 locus (about 1 Mb centromere side of the IgA locus). Therefore, in the clone T32, the sunsetging vector p5531oxPHyg prepared in Example 3 above was transfected into the AP000553 region located in the vicinity of the IgA gene locus and on the centromeric side (about 300 Kb St. mouth main side), and the oligonucleotide sequence I tried to insert it.
  • restriction vector Srf l (Toyobo) linearized vector p5531oxPHyg was transfected into clone T32, and the medium containing hygromycin B (1 mg / ml) was used for about 2 weeks. Selective culture was performed. Genomic DNA was extracted from hygromycin B resistant clones, and homologous recombination was identified by PCR using the following two sets of primers.
  • PCR uses Perkin-Elmer's GeneA immediate 9600 as a thermal cycler
  • TaQ polymerase uses LA TaQ (Takara Shuzo)
  • buffers and dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • temperature and cycle conditions were 98 cycles of 10 seconds and 68 cycles of 35 cycles of 15 minutes.
  • 3 clones were identified as homologous recombinants.
  • the clone HT72 obtained in Example 4 above is first fused with a DT-40 cell R clone (Kuroiwa et al., Nature Biotech. 18: 1086, 2000) retaining SC20 chromosome vector. Human chromosome 22 fragment and chromosome 14 Fragments A DT-40 hybrid was generated which carries both of the SC20 fragments.
  • the R clone was cultured in RPMI 1640 medium containing blasticidin S (10 g / ml), and the HT72 clone was cultured in RPMI 1640 medium containing hygromycin B (1 mg / ml). 1 to 2 ⁇ 10 7 clones were mixed and centrifuged, and then washed twice with serum-free RPMI 1640 medium. After completely removing the remaining medium, 0.5 ml of 50% PEG 1500 (Boehringer) previously incubated at 37 ° C. was gently added and mixed vigorously with pipetting for about 2 minutes.
  • RPMI 1640 medium 1 ml of serum-free RPMI 1640 medium was added thereto over 1 minute, and then 9 ml of serum-free RPMI 1640 medium was added over about 3 minutes, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. Then, it was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes and cultured in RPMI 1640 medium containing serum for 24 to 48 hours. Thereafter, the cells were replaced with RPMI 1640 medium containing blasticidin S (10 g / ml) -hygromycin B (1 mg / ml), aliquoted into five 24-well culture plates, and cultured for 3-4 weeks. Genomic DNA was extracted from double resistant clones and PCR was performed using the following primers to confirm that two fragments of human chromosome 14 fragment (SC20 chromosome vector) and chromosome 22 fragment were retained. .
  • VH3-F 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • VH3-R 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • PCR For PCR, use Perakin-Elmer's GeneA immediate 9600 as a thermal cycler, Taa polymerase using Ex TaQ (Takara Shuzo) Buffering and dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) are recommended conditions to be attached Used according to The temperature and cycle conditions were heat cycle of 94 ⁇ 1 min followed by 35 cycles of 98 10 sec, 56 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec. As a result of PCR, 6 clones (56HT2, 3, 4, 5, 6, 7) were positive. Furthermore, FISH analysis is performed using human C0T1 DNA as a probe. As a result, it became clear that all these clones hold two human chromosomal fragments in an independent state. From the above results, it can be determined that these six-hybrid clones retain two fragments of human chromosome 14 fragment (SC20 chromosome vector) and chromosome 22 fragment.
  • dNTP dNTP
  • the PGKPuro fragment excised with the restriction enzyme EcoRI from the plasmid in which the Notl site in plasmid PGKPuro (supplied from WHITE HEAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Lai rd) was replaced with EcoRI site was used as Cre recombinase expression vector pBS185 (Gibco Was cloned into the EcoRI site in (pBS185Puro).
  • Cre recombinant enzyme stable expression vector pBS185Puro linearized with restriction enzyme Kpnl (Bein Ringer) was transfected into 56HT2 hybrid clone, and aliquoted into 24 well plates, and then puro The selective culture was carried out for about 2 weeks in the presence of a mycin (3 g / ml). The genome was extracted from each of the wells, and nested PCR was performed using the following two sets of primers to examine whether or not translocation occurred between the SC20 chromosome vector and the chromosome 22 fragment of the silkworm chromosome.
  • GFP-2 5'-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • PCR is performed using GeneAmp 9600 manufactured by Perkin-Elmer as a thermal cycler, Tad polymerase using Ex Tad (Takara Shuzo), buffer one and dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) according to the recommended conditions.
  • the first PCR was carried out by heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, followed by 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 6 C for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute using PGK-1 and GFP-1 as primers. Using a portion of this reaction solution as a template, cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 59 ° C. for 30 seconds and 72 ° C.
  • the sorting of the cell fraction that appeared to be GFP positive was repeated twice. Culture after each sorting was performed in RPMI 1640 medium containing hygromycin B (1 mg / ml). As a result, it was possible to concentrate GFP-positive cells with a purity of 98-99%.
  • DT-55 hybrid carrying both human chromosome 22 fragment and chromosome 14 fragment SC20 vector was prepared by cell fusion of clone 552-2 obtained in Example 5 with R clone. did.
  • the R clone was cultured in RPMI 1640 medium containing plastocidin S (10 g / ml), and clone 553-2 was cultured in RPMI 1640 medium containing hygromycin B (1 mg / ml). Mix and centrifuge 1 to 2 ⁇ 10 7 clones and wash twice with serum free RPMI 1640 medium. After completely removing the remaining medium, 0.5 ml of 50% PEG 1500 (Bae Ringer) previously kept at 37 ° C. was gently added and vigorously mixed with a pipet for about 2 minutes.
  • RPMI 1640 medium 1 ml of serum-free RPMI 1640 medium was slowly added over 1 minute, and then 9 ml of serum-free RPMI 1640 medium was added over about 3 minutes, and allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. Then, it was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes and cultured in RPMI 1640 medium containing serum for 24 to 48 hours. Thereafter, the cells were replaced with RPMI 1640 medium containing blasticidin S (10 g / ml) and hygromycin B (1 mg / ml), aliquoted into five 24-well culture plates, and cultured for 3 to 4 weeks.
  • Genomic orchid A is extracted from a clone (for example, clone 553R1), PCR is performed using the same primers as in Example 6, and two human chromosome 14 fragments and chromosome 22 chromosome fragments are retained. It was confirmed. Furthermore, FISH analysis was performed using human C0T1 DNA as a probe, and it was confirmed that two human chromosome fragments were present in an independent state. From the above experiments, it was concluded that the hybrid clone 553R1 retains two fragments of human chromosome 14 fragment (SC20 chromosome vector) and chromosome 22 fragment.
  • Cre recombinant enzyme stable expression vector pBS185Puro linearized with restriction enzyme ⁇ ⁇ (Boehringer) was transfected into 553 R1 hybrid clone, and aliquoted into 12-well plate, puromycin (3 Selective culture was carried out for about 2 weeks in the presence of g / ml). The genome was extracted from each well, and nested PCR was carried out using the following two sets of primers to examine whether or not translocation occurred between the SC20 chromosome vector 1 and human chromosome 22 fragment.
  • GFP-1 5'-TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • GFP-2 5'-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • the PCR is recommended using Perkin-Elmer's GeneAmp 9600 as a thermal cycler, Taa polymerase using Ex Tad (Takara Shuzo), and buffer or dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) recommended. Used according to the conditions. First, the first PCR was carried out by heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles of PGK-1 and GFP-1 as primers for 98 10 seconds, 61 " ⁇ 30 seconds, 72 ° C 1 minute. A portion of the solution was used as a template for 35 cycles of PGK-2 and GFP-2 as primers at 98 ° C. for 10 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C.
  • the cell pool (2 pools of DDH5, 6) was increased to 10 7 cells, and the pool was PBS (phosphate added with 5% FBS and 1 ig / ml of providiam iodide (PI). Buffer solution was suspended in 4 ml and analyzed by FACSVantage (Becton 'Dickinson'). Sorting of cell fractions that appeared to be GFP positive was repeated twice. Culture after each sorting was performed in RPMI 1640 medium containing hygromycin B (l mg / ml). As a result, GFP positive cells could be enriched with a purity of 98 to 99%.
  • PBS phosphate added with 5% FBS and 1 ig / ml of providiam iodide (PI). Buffer solution was suspended in 4 ml and analyzed by FACSVantage (Becton 'Dickinson'). Sorting of cell fractions that appeared to be GFP positive was repeated twice. Culture after each sorting was performed in
  • ⁇ ⁇ Chickens holding HAC DT-40 cells' ( ⁇ ⁇ ⁇ is a National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (Ibaraki 1-chome, Ibaraki-ken, Japan) It was deposited internationally as of May 9, 2001 and was given the accession number FERM BP-7581.
  • Example 8 Cell fusion of AHAC-containing DT-40 hybrid cells with Chinese Hams Yuichi CH0 cells
  • the genome was extracted from the resistant clone, and PCR was performed using VH3 and an IgA detection primer in the same manner as in Example 6 above. As a result, 2 clones (D15, AC30) were PCR positive. Further, these two clones were subjected to FISH analysis by double staining using a human chromosome 14 specific probe and a human chromosome 22 specific probe in the same manner as in Example 6 above to confirm the presence of AHAC. Although it is a fusion cell of DT40 and CH0, the chromosome derived from DT40 was almost lost, and the karyotype was almost the same as that of wild-type CH0 cells.
  • DT-40 Hype lid clones ⁇ Derutaita5 6 were cultured in each ⁇ 25 flask (Sumi Ron) 8, 20% FBS, 1% Niwato Li serum as they become Konfuruen Bok, 10- 4 M 2-mercaptoethanol, The medium was changed to RPMI 1640 medium supplemented with 0.5 g / ml colcemid and cultured for an additional 24 hours to form microcells.
  • the cells were suspended in 24 ml of serum RPMI 1640 medium, and aliquoted into 2 ml (25 ml) of 25 cm 2 flasks for centrifugation previously coated with 100 xg / ml poly L-lysine, and 37 ° Incubate with C for 1 hour to allow cells to attach to the bottom of the flask.
  • the culture solution was removed, cytochalasin B (10 g / ml, Sigma) solution pre-incubated at 37 ° C. was filled in a centrifuge flask, and centrifugation was performed at 34 ° C., 8000 rpm for 1 hour.
  • the microcells were suspended in serum-free DMEM medium and purified with 8 m, 5 m and 3 m filters. After purification, it was centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes and suspended in 5 ml of serum-free DMEM medium. On the other hand, about 10 7 CH0 cells were detached by trypsinization, washed twice with serum-free DMEM medium, and suspended in 5 ml of serum-free DMEM medium. The microcell was again centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes, and 5 ml of the previous CH0 suspension was gently overlaid without removing the supernatant.
  • the culture solution was removed, 0.5 ml of PEG1500 solution (Boehringer) was added, and the mixture was vigorously stirred with a pipette for about 2 minutes. Thereafter, 10 ml of serum-free DMEM medium was added thereto over about 3 minutes, and allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. After centrifugation, the cells were suspended in F12 medium (Gibco) supplemented with 10% FBS, divided into 5-6 24 well culture plates, and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Then, it replaced
  • F12 medium Gibco
  • microcell transfer of CHA cells carrying AHAC or A AHAC obtained in Example 8 and Example 9 into mouse ES cells (wild type TT2F) did.
  • the microcell is purified from CH0 cells (D15, ⁇ , AAC13, etc.) retaining about 10 8 AHACs or ⁇ AHACs and suspended in 5 ml of DMEM did.
  • Chimeric mice were produced using the ES cell clone obtained in Example 10 according to the method of Tomizuka et al. (Nature Genet., 16: 133, 1997). Host: MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan), or male and female antibody heavy chain knockout mice (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 97, 722-727, 2000) An 8-cell embryo obtained by mating was used. As a result of transplantation of the injected embryo into a temporary parent, it is possible to determine whether the chimera is a chimera by the hair color.
  • MCH ICR
  • Tomizuka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 97, 722-727, 2000
  • Example 1 2 Retention of artificial chromosomes in chimeric mouse somatic cells prepared from ES cells carrying human artificial chromosomes AHAC and ⁇ AHAC
  • the tail-derived DNA of a chimera mouse (chimera ratio of about 100%, Example 1 1) derived from an ES cell clone ( ⁇ ⁇ ⁇ # 21) retaining ⁇ ⁇ ⁇ is also positive for the above two types of primers, A The retention of AHAC was confirmed. Furthermore, The same ELISA analysis shows that both the ⁇ chain and the ⁇ chain are positive in the ⁇ holding chimeric mouse serum.
  • the chimera ratio of ⁇ HAC-retaining chimeric mice obtained from ES cells retaining ⁇ HAC was at most about 80%, but about 85% and 90% in AHAC and about 100% of chimeras in ⁇ ⁇ HAC. Chimeric mice with rates were obtained. It is believed that the use of a higher chimera ratio chimeric mouse results in higher efficiency of differentiation of the transchromosomic ES cells into germ cells and transmission of the offspring of the transchromosome. That is, it is expected that the use of AHAC and AHAAC will enhance the efficiency of offspring transmission in mice of human chromosome 22 fragment containing antibody immunoglobulin ⁇ chain gene.
  • a female chimera mouse (chimera ratio of about 85%) prepared from the TT2F / AHAC clone ( ⁇ ⁇ # 6) in Example 1 was crossed with a male mouse (MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan).
  • MCH male mouse
  • 4 were dark brown, indicating that they retain dominant genetic traits derived from ES cells. That is, an ES cell line that holds AHAC, ⁇ # 6 was shown to differentiate into functional egg cells in female chimera mice. A portion of the tail of four dark brown pups was cut out, and genomic DNA was prepared from the sample.
  • the obtained rabbits were subjected to PCR using primers for detection of Ig ⁇ and VH 3 in the same manner as described above, and as a result of examining retention of AHAC, all two mice were positive for all two primers, and chimeric mouse offspring The retention of AHAC in was confirmed. Furthermore, the serum of 3 out of 4 animals is collected, and ELISA (Tomizuka ⁇ >, Nature Genet., 16: 133, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 97, 722-727, 2000) The expression of human chain and human ⁇ chain was examined according to. As a result, in all three animals examined, both human chains and ⁇ chains were positive.
  • mouse strains that retain and transmit AHAC or ⁇ AHAC the expression of a complete human antibody molecule consisting of human IgA chain / heavy chain is confirmed by ELISA or the like. Furthermore, a mouse strain that retains and transmits AHAC or AAHAC is repeatedly crossed with an endogenous antibody heavy chain, a mouse strain lacking the light chain ⁇ gene, retains each HAC, and carries an endogenous antibody heavy chain and ⁇ chain gene. Mouse strains can be obtained that are homozygous for the defect. In these mouse strains, fully human antibodies are produced, consisting mainly of rabbit Ig heavy chain and lambda chain.
  • Example 1 4 Construction of a mouse strain which simultaneously expresses rabbit immunoglobulin heavy chain, light chain, light chain ⁇
  • mice strains that simultaneously produce human Ig heavy chain, light chain ⁇ and light chain ⁇ , and produce an antibody whose main component is a molecule consisting of human Ig heavy chain and light chain ⁇ or light chain ⁇ are as follows ( ⁇ ) , ( ⁇ ) can be produced by crossing between lines.
  • the offspring mice obtained by crossing line (A) and line (B) are described in Example 13 and in the report by Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,, vol. 97, 722-727, 2000). Analyze by the method described in.
  • the offspring mice obtained by this mating are all heterozygous for endogenous antibody heavy chain deficiency and ⁇ chain deficiency, but among them, individuals carrying AHAC (or ⁇ ⁇ and individuals carrying the W23 fragment are crossed with each other to produce offspring. Finally, both endogenous antibody heavy chain defects, ⁇ chain homozygous for homozygosity, and AHAC (or ⁇ and W23 fragments are identical). Select individuals (strains (D)) that are sometimes held.
  • Example 1 5 Construction of a mouse strain that retains AHAC and in which both endogenous Ig heavy chain and ⁇ chain genes are disrupted
  • human Ig heavy chain and chain protein in the serum of two TC ( ⁇ / ⁇ / ⁇ individuals (8 weeks old) was described in Kuroiwa et al. (Nature Bioteclmol., 18: 1086-2000).
  • human Ig chain 430 g / mK Igr chain: 1802 g / ml
  • IgA chain 330 g / ml
  • human Ig i chain 720 xg / ml
  • Igr chain 320 g / ml
  • IgA chain 520 zg / ml.
  • Example 1 6 Construction of a mouse strain that retains a human chromosome 2 fragment containing AHAC and human Ig / c chain genes and in which both endogenous Ig heavy chain and K chain genes are disrupted together
  • Ig heavy chain as described in Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 97, 722-727, 2000), Ig chain knockout mouse with human Ig c chain gene as genetic background Containing the human chromosome 2 fragment (hCF (W23)) containing human (hereinafter referred to as TC (W23) / ⁇ / ⁇ )) and TC prepared in Example 15 ( ⁇ The / ⁇ / ⁇ ⁇ line was crossed, and the obtained mouse individuals were genotyped in the same manner as in Example 15.
  • TC ( ⁇ TC) an individual who simultaneously holds AHAC and hCF (W23) and is homozygous for endogenous Ig heavy chain knock out and homozygous for endogenous Ig K chain knock out (hereinafter referred to as TC ( ⁇ TC ( Furthermore, the serum of TC (AHAC) / TC 23) / ⁇ / ⁇ ⁇ individual was reported by Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,, vol. 97, 722-727, 2000) and the report by Kuroiwa et al. (Nature Biotechno L, 18: 1086-2000). The expression of ⁇ chain protein is detected.
  • Example 1 7 Construction of a mouse strain that retains a yeast artificial chromosome containing AHAC and human Ig / chain genes, and in which both alleles of endogenous Ig heavy chain and c chain genes are disrupted
  • a gene (KCo5: human / light chain) containing a human Ig K chain gene in the genetic background of the endogenous Ig heavy chain and ⁇ chain knockout mice described in Fishwild et al. (Nature Biotechno L, 14: 845-851, 1996)
  • a mouse strain (containing about 40% of the variable region of the gene) (obtained from the US company Medarex, hereinafter referred to as ⁇ 5 / ⁇ / ⁇ ), and TC ( ⁇ / ⁇ /) prepared in Example 15
  • the mouse individual obtained by crossing the ⁇ ⁇ line was subjected to the genotyping analysis using the PCR method and the ELISA method in the same manner as in Example 15.
  • TC ⁇ / ⁇ (: ⁇ 5 / ⁇ )
  • yeast artificial chromosome that constitutes the transgene KCo5 and the microorganism that retains the plasmid have been deposited with the US ATCC under the accession number as follows: Yeast artificial chromosome yeast carrying yl7: ATCC No. PTA-3842, E. coli carrying plasmid pKV4: ATCC No. PTA-3843, E.
  • Example 15 Two ⁇ / ⁇ / ⁇ ⁇ mice prepared in 5 were immunized with ⁇ G-CSF.
  • TiterMaxGold (CytRx) was used. At first, a total of 37.5 g of human G-CSF was divided into three sections and immunized subcutaneously. In the second and third rounds, a total of 10 g was divided into three sections and immunized subcutaneously on the 14th and 38th days after the primary immunization in the same manner as the primary immunization. The final immunization on the 48th day after the primary immunization was intravenous injection of lO ig G-CSF without adjuvant.
  • hybridoma obtained by fusing the spleen cells of the above-described immunized mouse individual with mouse myeloma cells (Anto, Chiba, Introduction to experimental procedures for monoclonal antibodies, Kodansha Scientific, 1 9 9 By screening 1) by ELISA, it is possible to obtain a hybridoma that produces a complete human monoclonal antibody consisting of human Ig heavy chain and light chain ⁇ .
  • Example 15 The TC ( ⁇ HAC) / TC (W23) / AH / A ⁇ ⁇ ⁇ mouse individual prepared in Example 15 is immunized with human G-CSF in the same manner as Example 18.
  • Anti-G-CSF human IgG antibody titer, human IgA antibody titer and human IgK antibody titer in the serum of this mouse ELISA The anti-hypergrow G-CSF human IgG antibody titer, the human anti-IgA antibody titer and the human Ig kappa antibody titer increase are confirmed.
  • Example 18 Furthermore, in the same manner as in Example 18, by fusing mouse spleen cells of the above-described immunized mouse individual with mouse myeloma cells, a fully human monoclonal antibody consisting of rabbit Ig heavy chain and light chain ⁇ or light chain / 1. Hybridomas that produce antibodies can be obtained.
  • a TC ( ⁇ / ⁇ (; ⁇ 5 / ⁇ / ⁇ mouse individual prepared in Example 1 5 is immunized with human G-CSF in the same manner as Example 1 8 and anti-G-CSF human in serum).
  • the IgG antibody titer, the human IgA antibody titer and the human Ig / antibody titer were measured by ELISA, and as a result, it was confirmed that the anti-human G-CSF human IgG antibody titer, the human IgA antibody titer and the human Ig / antibody titer increased. It was done.
  • Example 18 a full human monoclonal antibody consisting of human Ig heavy chain and light chain ⁇ or light chain by fusing spleen cells of the above-described immunized mouse individual with mouse Mitochondrial cells. It was possible to obtain a hybridoma that produces. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the present invention provides a human artificial chromosome that retains the entire region of human antibody heavy and light chain genes and can be highly efficiently transmitted to the next generation. Also, according to the present invention, non-hyptation animals and offspring thereof are provided that progenitally transmit the human artificial chromosome to the next generation. Furthermore, the present invention makes it possible to produce human antibodies. Sequence table free text

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Description

明 細 書
ヒト抗体え軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体、 および子孫伝達可能な該ヒト人工染色体を含む非ヒト動物
技 術 分 野
本発明は、 染色体あるいはその断片を改変し、 次世代に高効率で子孫伝 達可能となるヒ卜人工染色体、 該ヒト人工染色体を次世代に高効率で子孫 伝達する非ヒト動物およびその子孫、 該非ヒト動物またはその子孫からの 抗体の作製方法、 ならびにヒト抗体産生マウスに関する。
背 景 技 術
染色体断片を含むミクロセルと分化多能性を有する細胞との融合により 得られるハイブリツド細胞からキメラ動物を作製する技術 （W097/07671) の開発により、 従来不可能であった長大な外来遺伝子を保持する非ヒト動 物の作製が可能になった。
非ヒト動物に導入される染色体断片を改変することにより、 （1 )不要な 遺伝子の除去、 （2 ) 所望の遺伝子の付加、 （3 ) 染色体断片の安定化等を 行い得ることは有用である。 W098/37757には、 非ヒト動物に導入される染 色体断片の改変方法の概要ならびにニヮトリ由来の DT- 40細胞に保持され たヒト染色体にテロメァ配列をターゲティングし、 高効率で所望の欠失染 色体を取得できたことが記載されている。 また、 マウス E S細胞およびマ ウス個体において安定に保持され、 かつ子孫伝達効率の高いヒト染色体断 片について記載されている。 さらに、 WO00/10383には、 ヒト染色体上の所 望の領域を安定な染色体断片 （染色体ベクター） に転座させた、 より安定 なヒト人工染色体 （Human Art i f icial Chromosome；以下、 HACと略記する ことがある） の作製方法が記載されている。
近年、 黒岩ら （Nature Biotech. 18 : 1086, 2000) は、 メガベース （Mb) サイズの特定ヒト染色体領域をインサートとして保持するヒト人工染色体 (HAC) の作製に世界で初めて成功した。 この HAC ( A HAC) は、 安定かつ 子孫伝達可能なヒト 14番染色体由来の SC20断片を染色体ベクターとして 用い、 このベクターにヒト n 番染色体上のヒト抗体え軽鎖遺伝子を含む 10Mb サイズの染色体領域をインサートとして転座しクロ一ニングするこ とによって得られた人工染色体である。 彼らは、 この A HAC がベクターと して用いた SC20断片とほぼ同等の安定性を持つことを示し、様々な不安定 染色体由来の領域を SC20 へ転座クローニングすることで安定化できる可 能性を示した。 さらに、 この A HACをマウスへ導入し、 安定に A HACを保持 するキメラマウスの作出に成功した。
非ヒト動物における導入ヒト染色体の次世代への子孫伝達は、 交配によ る均一な性質を持ったトランスクロモソミック動物（異種染色体断片が生 殖系列を経由して子孫伝達された、非ヒト動物のことをいう。 ）の大量生産 という点のみならず、 導入ヒト染色体の生殖系列を介した構造 ·機能解析 という点でも重要である。 今まで、 数種類のヒト染色体がマウスへ導入さ れてきたが、 その子孫伝達能は導入ヒト染色体の構造に依存していると考 えられる。子孫伝達のためには、第一に ES細胞が高い効率で生殖細胞へ寄 与しているキメラ率の高いキメラマウスを得ることが必須条件であるが、 このキメラ率は導入染色体上にどのようなヒト遺伝子が存在しているのか という導入ヒト染色体の構造が関与していると考えられる。 例えば、 ヒ卜 2番、 14番染色体断片を導入した場合には 100%キメラ率に近いキメラマウ スが得られ、その子孫伝達効率も高い（Tomizukaら， Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA, 97 : 722-727, 2000) のに対して、 ヒト 22番染色体断片を導入した場 合には 50%以下の低キメラマウスがほとんどである。 これは、 ヒト 22番染 色体上にはマウスの発生に悪影響を及ぼす有害なヒト遺伝子が存在してい ることに起因しているかもしれない。 実際に、 ヒト抗体 IgA遺伝子が存在 するヒト 22番染色体上の 22Q11領域には猫目症候群、 DiGeorge症候群、 der22 症候群などの遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域が存在している ことが報告されている （例えば、 A. Puech ら、 PNAS 97 : 10090, 2000)。 前 述したように、これらの遺伝病領域を取り除き、ヒト 22番染色体上の HCF2 遺伝子座から LIF遺伝子座までの 10Mbのみを SC20染色体ベクターへ転座 クローニングして A HACを構築し、マウスへ導入した結果、 A HACを保持す る ES細胞から誕生したキメラマウスのキメラ率はヒト 22番染色体全長を 導入した場合と比較すると高まったことが報告されている。
このような状況下で、 本発明者らは、 従来の A HAC に比してより効率的 な子孫伝達を達成する目的で、 さらなるヒト人工染色体の改良を試み、 そ の子孫伝達効率の検討を行った。
すなわち、 本発明は、 ヒト 22番染色体あるいはその断片を改変し、 次世 代に高効率で子孫伝達可能であるヒト人工染色体、 ならびに該ヒト人工染 色体を保持する非ヒト動物およびその子孫を提供することを目的とする。 本発明はまた、 該非ヒト動物またはその子孫を用いてヒト抗体を作製す る方法を提供することを目的とする。
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 ヒト 22 番染色体を改変し、 抗体 λ軽鎖遺伝子 （IgA ) 領域を含む構造が明らかな 2種類の領域を選出し、該選出領域の各々をヒト 14番染色体断片に転座さ せたヒ卜人工染色体を構築し、 これらを保持する高キメラ率マウスを作出 した。 その結果、 本発明者らは、 該キメラマウスにおいて、 該ヒト人工染 色体が減数分裂を経て次世代の子孫へ高効率で伝達することを観察し、 本 発明を完成させた。
発 明 の 開 示
本発明の要旨は以下の通りである。 ·
本発明は、一の態様において、 ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子 を含む約 3. 5Mb〜約 1Mb領域と、 非ヒト動物の生殖系列を経由して子孫伝 達されうる別のヒト染色体由来の染色体断片が結合したものである、 ヒ卜 人工染色体を提供する。
その一の実施形態において、前記の別のヒト染色体由来の染色体断片は、 安定でかつ子孫伝達可能な任意のヒ卜染色体断片であればいずれでもよく、 例えば、 ヒト 14番染色体断片、 ヒト 21番染色体またはその断片、 あるい はヒト 1 番染色体 1ρ22 領域を含む SAC (smal l acces sory chromosome) (Genome Res. , 1 1 : 124-136, 2001)など、好ましくはヒト 14番染色体断片、 例えば、 ヒト 14番染色体由来の SC20染色体ベクター （黒岩ら、 前出） で ある。 該 SC20染色体ベクターは、 例えば、 14p l 2部位に位置する RNR2遺 伝子座に ΙοχΡ配列を相同組換えにより挿入することにより、所望の染色体 断片をクローニングするために使用することができる（黒岩ら、前出）。 SC20 染色体ベクターを保持するニヮトリ DT- 40細胞 （SC20) は、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番地 1中央第 6 ) に 2 0 0 1年 5月 9日付けで国際寄託され、 受託 番号 FERM BP— 7583が与えられている。 前記の別のヒト染色体由来の染色 体断片は、 WO97/07671 に開示された方法により、 好ましくは大きさが約 20Mb 以下の種々のヒト染色体断片について該染色体断片を保持するキメ ラ非ヒト動物を作製し、 前記キメラ非ヒト動物の子孫において前記ヒト染 色体断片が安定に保持されるものを選抜することによつても取得すること ができる。前記ヒ卜 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む領域と、子 孫伝達可能なヒト染色体断片との結合は、 ΙοχΡ配列などの、 部位特異的組 換え配列を介した転座あるいは挿入により行われる。 抗体 λ軽鎖遺伝子を 含む領域が、 後述の実施例において示される如く、 テロメァ配列と Ι οχΡ 配列を両端として切り出される場合には転座による結合が起こる。 一方、 両端に Ι οχΡ 配列を挿入することにより抗体 λ軽鎖遺伝子を含む領域が切 り出される場合には、子孫伝達可能なヒ卜染色体断片上の Ι οχΡ配列部位へ の挿入が起こる。
別の実施形態において、ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む 領域は、 約 2. 5Mb〜約 1. 5Mbの大きさである。
別の実施形態において、ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む 領域は、 約 2. 5Mbまたは約 1. 5Mbの大きさである。 このような大きさの該 領域の具体例はそれぞれ、 受託番号 FERM BP-7582 であるニヮトリ DT - 40 細胞 （ΔΗΑΟ に保持される AHAC、 および受託番号 FERM BP-7581である二 ヮトリ DT- 40細胞 （Δ Δ ΗΑΟ に保持される△ AHACからなるヒト人工染色 体である（後述の実施例参照）。
本発明はまた、 別の態様において、 上記の本発明ヒ卜人工染色体を保持 する非ヒト動物を提供する。 本明細書中、 非ヒト動物とは、 ヒトを除く脊 椎動物、 好ましくは哺乳動物をいう。
その一の実施形態において、非ヒト動物は、 A HACまたは A AHACのいず れかのヒト人工染色体を保持する。
その別の実施形態において、 非ヒト動物が哺乳動物である。 好ましい哺 乳動物は、 マウスである。
本発明はさらに、 別の態様において、 上記の本発明ヒト人工染色体を非 ヒト動物の胚性幹細胞 （ES 細胞） 中にミクロセル法により導入すること、 得られた ES細胞を該非ヒト動物の胚に注入すること、得られた注入胚を仮 親に移植すること、 該仮親からキメラ非ヒト動物を出産により得ること、 該キメラ非ヒト動物を、 該ヒト人工染色体についてスクリーニングするこ とを含む、 非ヒト動物の作製方法を提供する。
ES細胞への導入に際して、 ヒト人工染色体を保持するチャイニーズハム スター卵巣（CH0)細胞を作製し、 該 CH0細胞を介して該ヒト人工染色体を ES細胞に導入してもよい。
その一の実施形態において、上記方法は、上記スクリーニングされたキメ ラ非ヒ卜動物の子孫を作出し、 該子孫を上記ヒ卜染色体についてスクリー ニングすることをさらに含む。
別の実施形態において、 前記方法によって得られる非ヒト動物は、 ヒト 抗体免疫グロプリン重鎖および λ鎖蛋白質を発現可能である。
また別の実施形態において、 非ヒ卜動物が哺乳動物、 好ましくはマウス である。
本発明はさらに、 別の態様において、 上記の本発明方法によって得るこ とができる、 上記の本発明ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物を提供す る。 本発明はさらに、 別の態様において、 上記の本発明非ヒト動物の子孫動 物を提供する。 子孫動物は、 本発明ヒト人工染色体を保持することを特徴 とする。
その一の実施形態において、 子孫動物は、 ヒト抗体免疫グロブリン重鎖 およびえ軽鎖蛋白質を発現可能である。
別の実施形態において、 子孫動物は、 ヒト抗体免疫グロブリン重鎖、 κ 軽鎖および λ軽鎖蛋白質を発現可能である。
別の実施形態において、 子孫動物はマウスである。
本発明はさらに、 上記の本発明非ヒ卜動物、 または上記の本発明子孫動 物を、 所望の抗原で免疫し、 該動物から該抗原に対するヒトポリクローナ ル抗体を得ることを含む、 抗体の作製方法を提供する。
その実施形態において、 前記ヒトポリクローナル抗体は動物の血液から 得られる。
本発明はさらに、 別の態様において、 上記の本発明マウス、 あるいは上 記の本発明子孫マウス、 を所望の抗原で免疫し、 次いで、 該マウスからの 脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイプリドーマを作製し、 該抗原に対するヒト免疫グロプリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナ ル抗体を作製することを含む、 抗体の作製方法を提供する。
本発明はさらに、別の態様において、上記の本発明マウス、 あるいは上記 の本発明子孫マウス、 を所望の抗原で免疫し、 次いで、 該マウスからの脾 臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイプリドーマを作製し、 該 ハイプリ ドーマからヒト抗体遺伝子を単離し、 該ヒト抗体遺伝子を動物細 胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞をヒト抗体遺伝子を発現し うる条件下で培養し、 抗原に対するヒト免疫グロプリン重鎖と軽鎖からな るヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、 抗体の作製方法を提供 する。
本発明はさらに、 別の態様において、 上記の本発明マウス、 あるいは上 記の本発明子孫マウス、 を所望の抗原で免疫し、 次いで、 該マウスの Β細 胞由来の抗体遺伝子をファージディスプレイ法により選抜し、 選抜された ヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に導入し、該細胞を ヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 抗原に対するヒト免疫グロ プリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、 抗体の作製方法を提供する。
ここで上記発現のための方法は、公知の方法 （例えば、 Sambrook ら， Mol ecul ar Cloning A Laboratory Manual, second ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press に記載される方法） によって実施し得る。 宿主 としての動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞は、 例えば、 CH0 細胞、 BHK 細胞、 肝ガン細胞、 ミエローマ細胞、 パン酵母細胞、 SF9細胞等である。 本発明はさらに、 別の態様において、 血清中にヒト抗体 I gァ アイソ夕 イブを含むヒト抗体重鎖、 ヒ卜抗体 κ 軽鎖およびヒト抗体 λ軽鎖を発現 する、 ヒト抗体産生マウスを提供する。 当該ヒト抗体産生マウスは、 再配 列されていない、 ヒト抗体重鎖遺伝子座、 ヒト抗体 / c 軽鎖遺伝子座、 およ びヒト抗体 λ 軽鎖遺伝子座を保持し、 少なくとも内因性抗体重鎖および κ軽鎖の両アレルが破壊または不活性化されている。
上記ヒト抗体産生マウスでは、 Β細胞の分化に伴いヒト抗体遺伝子の再 配列による特定可変領域断片の連結 （重鎖では V— D— J、 軽鎖では V— J ) が生じ、 好ましくは B細胞の成熟に伴い抗体遺伝子の可変領域におけ る体細胞変異を経た後、 血清中に当該遺伝子産物であるヒト抗体が産生さ れる。
すなわち、 「再配列されていない」 とは、 抗体遺伝子座が、 重鎖において は V _ D— J組換え、 軽鎖においては V— J組換えを起こしておらず、 B 細胞の分化に伴い重鎖においては V _ D— J組換え、 軽鎖においては V— J組換えを起こしうる状態で、 マウスの未分化な B細胞に保持されている ことをいう。
その一の実施形態において、上記ヒト抗体産生マウスは、 ヒト抗体 /C軽 鎖の可変領域の少なくとも 40 %を保持する。
別の実施形態において、 上記ヒト抗体産生マウスは、 ヒト抗体重鎖、 ヒ ト抗体 κ軽鎖、 およびヒト抗体 λ軽鎖のすべての可変領域を保持する。 また別の実施形態において、 ヒト抗体重鎖遺伝子座、 ヒト抗体 軽鎖遺 伝子座、およびヒト抗体 λ軽鎖遺伝子座は、 ヒト由来の染色体断片上に保 持される。
さらに別の実施形態において、 ヒト抗体重鎖遺伝子座およびヒト抗体 λ 軽鎖遺伝子座は、 AHACまたは Δ Δ ΗΑΟのいずれかのヒト人工染色体上に 保持される。
さらに別の実施形態において、 ヒト抗体 κ 軽鎖遺伝子座は、 ヒト由来の 染色体断片上に保持される。
さらに別の実施形態において、 ヒト抗体 Κ軽鎖遺伝子座は、マウス染色 体に挿入される。
さらにまた別の実施形態において、 上記ヒ卜抗体産生マウスはキメラマ ウスではないことを特徴とし、 好ましくは上記ヒト抗体重鎖遺伝子座、 ヒ ト抗体 κ軽鎖遺伝子座、 およびヒト抗体 λ軽鎖遺伝子座を子孫伝達しう る。 ，
1 . ヒト人工染色体 （HAC)、 およびトランスクロモソミック非ヒト動物 の作製とその利用
本発明は、 ヒト 22番染色体上の IgA遺伝子を含む断片を、 ヒト 14番染 色体に由来する染色体断片に転座、 クロ一ニングした新規ヒト人工染色体 の構築、 該ヒト人工染色体のマウスでの子孫伝達および該ヒト人工染色体 を保持するトランスクロモソミック非ヒト動物 （例えば、 マウスなどの哺 乳動物） の作製に関する。
本明細書中において、 ヒト人工染色体とは、 ヒ卜染色体上の所望の領域 を安定な染色体断片 （染色体ベクター） に転座させて作製された、 人工染 色体 （HAC :Human Art i f ic ial Chromosome) をいう。 また、 トランスクロモ ソミック非ヒト動物とは、 異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達 された、 ヒ卜以外の動物をいう。
ヒト人工染色体は、 例えば、 ΙοχΡ配列およびヒトテロメァ配列をヒト染 色体上の目的遺伝子領域の近傍に相同組換えにより挿入し、 両配列に挟ま れた目的遺伝子領域周辺のみを別の染色体断片 （安定でかつ子孫伝達可能 な染色体断片であることが望ましい； ヒト 14番染色体由来 SC20染色体べ クタ一など）上の対応 ΙοχΡ配列挿入部位に特異的に転座させることによつ て、 目的遺伝子領域周辺のみをインサート （染色体インサート） として保 持するヒ ト人工染色体として作製される （黒岩ら， Nature Biotech. , 18 : 1086, 2000)。
本発明者らは、 ヒト人工染色体の作製において、 マウスなどの被染色体 導入動物の発生に悪影響を与えないように、 悪影響を及ぼすと推定される 染色体領域を染色体ィンサート上から可能な限り除去することが望ましい と考えてきた。 しかし、 従来は、 ヒト染色体の詳細な配列等の構造に関す る情報がないか、または不足していたため、目的遺伝子の近傍に、例えば、 ΙοχΡ 配列およびヒトテロメァ配列を挿入することが困難な場合があった。 この場合、 両配列に挟まれた領域には目的遺伝子以外にも、 その他多くの 遺伝子が含まれるので、 これら余剰遺伝子がマウスなどに導入された場合 に、 発生に悪影響を及ぼすことが危惧された。 さらにまた、 目的遺伝子を 含む染色体ィンサートのサイズと、 被染色体導入動物のキメラ率および子 孫伝達効率との関係が不明であつた。
本発明者らは、 IgA遺伝子が存在するヒト 22番染色体の構造に関する情 報 （例えば、 I. Dunliamら、 Nature 402 : 489, 1999) に基づき、 ある特定サ ィズ範囲の、 IgA遺伝子含有染色体インサートについて、 被染色体導入動 物のキメラ率および子孫伝達効率がいずれも有意に上昇することを今回見 出した。 このように余剰遺伝子をヒト人工染色体から取り除くことによつ て、特定された IgA遺伝子領域周辺をインサートとして保持する新規ヒト 人工染色体を作製することが可能となった。本明細書中、余剰遺伝子とは、 被染色体導入動物の発生に悪影響を与える有害遺伝子を指し、例えば、遺伝 子発現量依存性の遺伝病原因領域などである。本発明のヒト人工染色体は、 従来の Ig A遺伝子領域周辺 10Mbをィンサートとして保持する； L HACと比べ て、 その全体の大きさが縮小しており、 また高い子孫伝達効率を有してい る。 このように、 ヒト 22番染色体の改変により、マウスなどの発生に悪影響 を与え得る有害遺伝子が除去され、特定の目的 Ig A遺伝子領域のみをィン サートとして保持するヒト人工染色体を作製できる。 また、 上記改変の結 果、 導入されるヒト人工染色体全体のサイズ縮小化をもたらすとともに、 減数分裂時における異常染色体 （この場合、 導入ヒト人工染色体） の排除 機構（例えば、 P. Hunt ら、 Hum. Mo l. Gene t. , 4 : 2007, 1995) を回避できる。 さらにまた、 従来の A HAC (黒岩ら、 前出） と比較して、 導入ヒト人工染色 体をヒト人工染色体導入動物 （例えば、 マウス） の子孫に伝達させること がより容易になるし、 またヒト抗体重鎖 · λ軽鎖全領域を保持する卜ラン スクロモソミック非ヒト動物の作製をより効率的に行うことが可能である。 上記のようにして得られるトランスクロモソミック非ヒト動物を利用し て、 外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物を回収す ることにより、 生物学的に活性な物質を製造することができる。 具体的に は、 トランスクロモソミック非ヒト動物個体を外来染色体またはその断片 上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後、発現産物を動物の血液、 腹水などから回収することができる。
また、 トランスクロモソミック非ヒト動物の組織、 細胞あるいはそれを 不死化したもの （例えば、 ミエローマ細胞との融合により不死化したハイ プリドーマ） などを、 外来染色体またはその断片上の遺伝子が発現しうる 条件下で培養し、 その後、 発現産物を培養物から回収することができる。 あるいはまた、これらトランスクロモソミック非ヒト動物の組織、細胞、 またはそれを不死化したものから抽出した外来染色体もしくはその断片、 この外来染色体もしくはその断片を構成する DNA、 またはトランスクロモ ソミック非ヒト動物の組織、 細胞、 またはそれを不死化したものに保持さ れた外来染色体もしくはその断片に由来する c DNAを、動物細胞、酵母細胞 あるいは昆虫細胞 （例えば、 C H〇細胞、 B H K細胞、 肝ガン細胞、 ミエ ローマ細胞、 パン酵母細胞、 S F 9細胞等） に導入し、 該細胞を外来染色 体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 その後、 発現 産物 （例えば、 特定の抗原特異的な抗体タンパク質等） を培養物から回収 することができる。 発現産物は遠心分離などの公知の方法に従って回収す ることができ、 さらに硫安分画、 分配クロマトグラフィー、 ゲルろ過クロ マ卜グラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 分取薄層クロマトグラフィー などの公知の方法に従って精製することができる。 生物学的に活性な物質 は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、抗体、 特にヒト抗体などを挙げることができる。 例えば、 得られたトランスクロ モソミック非ヒト動物の脾細胞あるいはそのハイプリ ドーマなどの不死化 細胞から該染色体上のヒト抗体遺伝子をクローニングし、 チヤィニ一ハム スター卵巣細胞 （C H O ) やミエローマ細胞に導入してヒト抗体を産生す ることができる（Lyne t teら， Biotechnology, 10 : 1121, 1992 ; Bebbington ら， Biot echnology, 10 : 169, 1992 ; Babcookら, PNAS, 93 : 7843, 19%)。 ハイプリドーマを選抜することにより所望の抗体産生細胞を選抜すると いう従来の方法に加えて、近年開発されたファージディスプレイ法により、 所望の抗体を選抜することも可能である（Winterら， Annu. Rev. Immunol. , 12 : 433, 1994)。様々な特異性を持つヒト抗体をその表面に発現するファー ジライブラリーを得るためには、 抗原未感作あるいは、 特定の抗原を感作 した本発明のトランスクロモソミック非ヒト動物の脾臓ゃリンパ組織由来 のヒト免疫グロプリン遺伝子重鎖および軽鎖可変領域 c DNA を用いること ができる。
以下に、 子孫伝達効率の高いヒト人工染色体の作製方法について、 さら に詳細に述べる。
望みのヒト染色体領域を含み、 それを安定保持し、 子孫伝達するような 非ヒト動物を作製するためには、 偶発的に生じた染色体断片ではなく、 ヒ 卜染色体を所望の部位で切断することにより、有害遺伝子を取り除いたり、 所望の染色体断片のみを安定かつ子孫伝達可能な別の染色体につなげるな ど、 染色体を自在に加工する技術が望まれる。 このような技術は、 染色体 工学と呼ばれ、これまで主にマウス ES細胞中で内在性マウス染色体を部位 特異的に切断したり （W0 98/54348)、 相同染色体間で組換え （転座） を起 こさせることで特定の遺伝子領域を欠失 ·逆位 ·倍加させ、 そのような改 変染色体を有する変異マウスが作製されてきた （R. Ramirez-Sol is ら、 Nature 378 : 720, 1995)。 本発明においても、この技術を利用できる。
ヒト染色体あるいはその断片を保持する ES 細胞が生殖細胞へ寄与する ような高キメラ率の非ヒト動物 （例えば、 マウスなどの哺乳動物） が得ら れた場合、 次は導入ヒト染色体が減数分裂において除外されることなく、 導入ヒト染色体を保持する精子あるいは卵子が形成されるかが問題である 前述したように、 一般に、 異常染色体は減数分裂時に除外される機構があ ると考えられており、 導入ヒト染色体を保持する細胞は減数分裂において 除外され、結果的に精子あるいは卵子に分化できない可能性が考えられる。 これは減数分裂時には相同染色体間でのペアリングが必要であるが、 導入 ヒト染色体は 1本しか存在しないので、 基本的にはペアリングできないと 考えられる。 それ故に、 導入ヒト染色体は減数分裂から除外される可能性 がある。 実際、 富塚ら （Nature Genet. , 16 : 133, 1997) は、 およそ 50Mb 以上のヒ卜 14 番染色体断片の導入は雄キメラマウスの不妊をもたらした と報告している。 一方、 サイズが 10〜20Mb前後と推定されるヒト 2番、 14 番染色体断片 （SC20) の子孫伝達では、 減数分裂の通過のためには導入染 色体のサイズが重要な因子であることが示唆された （Tomizukaら， Nature Genet. , 16 : 133, 1997, Pro Nat l. Acad. Sc i. USA. , vol. 97, 722-727, 2000)。 SC20 染色体ベクター （10〜20Mb) は子孫伝達可能であると共に、 マウス ES細胞および個体において高い安定性をもっている（Shinoharaら， Chromosome Res. , 8 : 713-725, 2000)。 このような子孫伝達可能かつマウ ス個体で安定な自然発生染色体断片は、 W097/07671および W098/37757に 記された方法で取得、 選抜することができる。 また、 子孫伝達し、 マウス 個体で安定な自然発生ヒト染色体断片については Voet らの報告 （Genome Res. , 11 : 124-136, 2001) にも記載されている。 さらに、 キメラマウスに おいて安定に保持されるヒト 14番染色体 （約 100Mb、 Tomizukaら， Nature Genet. , 16 : 133, 1997) や 21番染色体 （約 50Mb、 篠原ら、 第 45回日本人 類遺伝学会大会、 2000年 10月） を出発材料として、 これを染色体工学的 手法 (Kuroiwa ら、 Nature Biotech. 18 : 1086, 2000) により 10〜藤以 下のサイズに縮小化することができる。 本発明によれば、 上記の手法を利 用して導入染色体を特定のサイズ範囲に縮小することによって、 マウス個 体において安定かつ子孫伝達効率の高い人工染色体を得ることができる。 例えば、子孫伝達可能な SC20ベクターに特定サイズ範囲の目的遺伝子領 域のみを転座、 クロ一ニングして構築された HACは、 SC20断片のベクター 効果によって子孫伝達することが可能となる。 この場合、 転座によって SC20の安定構造が変化すること、 さらに HAC全体の大きさが元来の SC20 ベクターよりも大きくなる可能性も考えられるので、 転座させる染色体ィ ンサ一ト （ヒト 22番染色体上の免疫グロブリン λ遺伝子を含む。） の大き さは、 A HAC ( 10Mb) よりも小さいサイズ、 通常約 3. 5Mb〜約 1 Mb、 好まし くは約 3 Mb〜約 1. 2Mb、 さらに好ましくは約 2. 5Mb〜約 1. 5Mbとしうる。前 記転座させる染色体ィンサートのセントロメァ側の端は、好ましくは HCF2 遺伝子座であり、 より好ましくは AP000553 領域 （I. Dunham ら、 Nature 402 : 489, 1999) である。 このような厳密な染色体の改変のためには、 ヒト 22 番染色体のように改変すべき染色体の全配列の解明が大きく貢献する。 すなわち、全ヒト染色体の配列が明らかとなれば、 ヒト 22番染色体のみな らず様々なヒ卜染色体上の目的遺伝子を含む周辺領域のみを厳密に SC20 染色体ベクターへ転座、 クロ一ニングし、 効率よく子孫伝達させることが 可能になる。
上述したように、 導入ヒト染色体のマウス等の非ヒト動物での子孫伝達 を達成するためには、 幾つかの障害があり、 特にヒト 22番染色体上の Ig λ遺伝子領域を効率良く子孫伝達させることは、 困難であると考えられて きたが、 本発明により、 この課題が解決される。
具体的には、本発明により、 ヒト 22番染色体上の抗体 λ軽鎖遺伝子を含 む . 5Mbおよび 1. 5Mb領域を SC20染色体ベクターに転座、クローニングし て得られたヒト人工染色体（A HACおよび Δ Δ ΗΑΟ を作製し、次いで A HAC および A A HAC の各々をマウス個体へ導入し、 キメラマウスにおけるキメ ラ率について A HAC (黒岩ら、 前出） と比較し、 キメラ率の向上とヒト人工 染色体の効率的な子孫伝達の達成を確認した。 キメラ率は、 キメラ動物に おける E S細胞の寄与率を示すものであり、 通常キメラ動物の体表面にお ける E S細胞に由来する体毛色の占める割合を視覚的に評価することによ り決定されうる。 以下に、 この特定例について、 具体的に説明する。 2 . Δ ΗΑ A A HAC、 およびトランスクロモソミックマウスの作製とそ の利用
ヒト抗体 λ軽鎖遺伝子を含むヒト 22番染色体あるいはその断片は、周知 の方法で取得しうる。 すなわち、 ミクロセル法によりヒト染色体あるいは その断片をマウス A 9細胞にライブラリ化することができる（Ko i ら， Jpn. J. Cancer Res. 80 : 413-418, 1989)。 得られたライブラリから、 P C R等 によりヒト抗体 λ軽鎖遺伝子特異的な配列を検出することにより、 ヒト 22 番染色体あるいはその断片を保持するクローンを選抜することができる。 ヒト 22番染色体あるいはその断片は、その後の改変の便宜のため、 さらに ミクロセル法により好ましくはニヮトリ DT- 40 細胞 （理研セルバンク ： RCB1464, ATCC： CRL-2111) に移入させることができる。
ヒト抗体 λ軽鎖遺伝子クラス夕一は 22番染色体上の 22Q11. 2に存在する (例えば、 J. E. Col l ins ら、 Nature 377 : 367, 1995)。 前述の A HACにおい ては、 HCF2遺伝子座から LIF遺伝子座までの 10Mb領域が染色体ィンサー トとして転座クローニングされていた。 この 10Mbインサートにおいて、 Ig λ遺伝子領域よりもテロメァ側には 7Mbの、 セントロメァ側には 1Mbの余 分な染色体領域が含まれている。そこで、まず 7Mb領域を取り除くために、 22番染色体あるいは、 その改変断片 （ΙοχΡ配列が HCF2遺伝子座に挿入さ れ、 LIF遺伝子座でテロメアトランケーシヨンされている断片） を IgA遺 伝子領域の極く近傍かつテロメァ側 （約 400Kb テロメァ側） に存在する AP000344領域 （I. Dunhamら、 Nature 402 : 489, 1999) でテロメアトランケ ——ンヨン (例えば、 黒岩ら、 Nuc le ic Acid Research, 26 : 3447, 1998) す ることで切断する。 次に、 IgA遺伝子領域の極く近傍かつセントロメァ側 (約 300Kbセント口メァ側）に位置する AP000553領域（I. Dunhamら、 Nature 402 : 489, 1999) に ΙοχΡ配列を相同組換えにより揷入する。 これらの改変 により、 HCF2-Ig A -AP000344 断片 （約 2. 5Mb) あるいは AP000553-Ig A -AP000344断片 （約 1. 5Mb) のみを染色体インサートとして SC20染色体べ クタ一へ転座クローニングできる。 構築された HACは従来の方法でマウス ES細胞へ導入後、 キメラマウスを作製できる。 キメラマウスにおける HAC の保持を確認後、交配し、仔マウスを得る。得られた仔マウスにおいて HAC の保持を確認することによって、 HACの子孫伝達を判定できる。
本発明により、 AHACによるヒト抗体 λ軽鎖遗伝子 Ig A全領域の子孫伝 達を介して、 ヒ卜抗体重鎖遺伝子と λ軽鎖遺伝子を共に保持するトランス クロモソミック非ヒト動物 （例えば、 マウスなどの哺乳動物） の効率のよ い作出が可能になる。 これは、 医薬品の候補となり得るヒト抗体を産生す る非ヒ卜動物として有用であると考えられる。 ヒト血清中で λ軽鎖を含む 抗体は約 40%を占めること、 νλ遺伝子断片の数（70個）が V / 鎖遺伝子（76 個） と同等数存在することなどから、 ヒト抗体の多様性構築には λ鎖を含 む抗体が大きく寄与していると考えられている（Popov, AV. ， J. Exp. Med. , 189 : 1611, 1999)。 一方、 現在世界で医薬品として用いられているヒト化抗 体ゃヒト抗体の多くはその軽鎖が κ軽鎖から成っている。 本発明の A HAC、 Δ AHAC トランスクロモソミックマウスは λ軽鎖を含むヒト抗体医薬開発 に有用である。 Δ ΗΑ Δ Δ ΗΑΟ トランスクロモソミックマウスは異種染色 体断片の子孫伝達が可能であるので、 交配により均一な形質を持ったトラ ンスクロモソミックマウスの大量生産が可能になるだろう。 さらに、 ヒト 抗体/ 軽鎖遺伝子を含む染色体断片を保持するマウス（Tomizukaら、 Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, vol. 97, 722-727, 2000)、 あるいはヒト抗体/ 軽 鎖遺伝子を含むトランスジエニックマウス （F i shwi ld e t al. , Nature B iotechnol. , 14 : 845-851, 1996 ; Mendez et al. , Nature Genet. , 15 : 146-156, 1997) と該 AHACまたは△ AHAC トランスクロモソミックマウス とを交配させることによって、 ヒト抗体重鎖、 κ軽鎖、 および λ軽鎖の全 てから成るヒト抗体を産生するヒト抗体産生マウスを作製することも可能 となる。 ヒト重鎖、 κ鎖、 λ鎖を同時に発現するマウス系統については Nicho l son らの報告 （J. I匪 imol. , 163 : 6898, 1999) がある。 彼らはヒ ト Ig重鎖、 κ鎖、 λ鎖の一部をそれぞれ含む酵母人工染色体 （YAC) を導 入したトランスジエニックマウスと内在性 Ig重鎖、 κ鎖ノックァゥトマウ スの組み合わせによりヒト重鎖/ / 鎖、 ヒト重鎖/ ; I鎖分子を免疫グロプリ ンの主な成分とするマウスを構築した。 しかし、 当該マウス系統にて発現 するヒト免疫グロブリンの多様性、 分子構成は本来のヒトにおけるものと 大きく異なる。例えば、①ヒト Ig重鎖 YACには 、 δ定常領域のみが含ま れ、 該マウス系統においては他のアイソタイプ、 特に最も大きな成分であ る Ig rアイソタイプが発現していない、 ② 3種の YACに含まれている可変 領域の数が少なく、 該マウス系統で発現するヒ卜抗体の多様性も限定的で あると想像される。
本明細書で開示されるヒト Ig重鎖、 κ鎖、 λ鎖を同時に発現するマウス 系統においては、 ヒトで発現している抗体の多様性、 分子構成等がより忠 実に再現される。 例えば、 ① Ig rアイソタイプ （4 つのサブクラス全て） が発現している、②重鎖、 λ鎖、 κ鎖について全ての可変領域を含むため、 ヒ卜におけるのと同様な多様性が再現される。
これらのヒト抗体産生トランスクロモソミックマウスを適当な抗原によ り免疫し、 その脾臓細胞とマウスミエローマを融合することにより得られ る、 ハイプリ ドーマ （安東 ·千葉， 単クローン抗体実験操作入門， 講談社 サイェンティフイク， 1991) を ELI SAによりスクリーニングすることによ り、 ヒト免疫グロブリン重鎖および λ軽鎖からなる完全なヒトモノクロ一 ナル抗体を産生するハイブリ ドーマを得ることができる。 これらのヒ卜モ ノクローナル抗体は医薬品用抗体として用いることができる。
また、 感染症などの治療用抗体医薬としては、 モノクローナル抗体より もポリクローナル抗体の方が治療効果は大きいと考えられる。 さらに、 ヒ トポリクローナル抗体はいわゆる Τグロプリン製剤として開発することも できる。 本発明によって構築される A HACまたは Δ Δ ΗΑΟを保持する ES細 胞からは、 実際高キメラ率 （約 80 %〜100 %、好ましくは約 85 %〜100 % ) でキメラマウスが得られ、 導入ヒ卜人工染色体は高効率で子孫伝達し、 受 精卵の段階から仔マウスとして生まれる全発生過程において保持され続け ることが示された。 マウス等の非ヒト動物に、 それと異種の抗原を免疫す ることにより、 大量の抗原特異的ヒトポリクローナル抗体 （ヒト λ軽鎖含 有抗体） を産生することができ、 これは大量生産が難しいモノクローナル 抗体に代わる抗体医薬として期待できる。
また、 本発明のヒト人工染色体は、 マウスのみならず他の非ヒト動物、 例えば、 ラット、 ブタ等の哺乳類に導入しうる。 マウス以外の動物種にお ける ES細胞あるいは ES様細胞の樹立はラット（Iannacconeら、 Dev. B io l. , 163 : 288, 1994)、 ブタ （Whee lerら、 Reprod. Fert i l. Dev. , 6 : 563, 1994) において報告され、 さらにメダカ、 ニヮトリ等でも試みられている （トラ ンスジエニック動物、 蛋白質核酸酵素、 1995年 10月号増刊、 共立出版）。 これらの ESあるいは ES様細胞を受容細胞として、 ヒト人工染色体を移入 すれば、 マウスの場合と同様に、 ヒ卜人工染色体あるいはその断片を保持 し、該ヒ卜人工染色体上の遺伝子を発現する非ヒ卜動物が作製可能である。 さらに、 これらの非ヒト動物を利用して、 ヒト λ軽鎖含有抗体の作製も可 能である。
図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト人工染色体 Δ ΗΑ A AHACの作製を示す。
図 2は、 カセットベクター pTELhi sDを示す。
図 3は、 タ一ゲティングベクタ一 pTELhi sD A Iを示す。
図 4は、 ターゲティングベクタ一 p5531oxPHygを示す。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2001-142371号の明細書に 記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。 以下の実施例 1〜実施例 14において、 ヒト 22番染色体上の抗体 λ軽鎖 遺伝子周辺領域 2.5Mbと 1.5Mbを SC20染色体ベクターへ転座クローニング したヒト人工染色体 AHAC、 ΔΔΗΑΟの作製について説明する（図 1)。 さら には、 作製された各 HACのマウス個体への導入および HACのキメラマウス 子孫への伝達について説明する。
〔実施例 1〕 カセッ卜ベクター pTELhisDの作製
カセットベクター pTELPuro (黒岩ら、 Nature Biotech. , 18:1086- 2000) を制限酵素 Notl (ベ一リンガー） で切断し、 DNA Bluntingkit (東洋紡） . を用いて 72° (：、 5分間で末端を平滑化した。 平滑後、 バクテリア由来アル カリフォスファターゼ（宝酒造）を用いて 65° ( 、 1時間で脱リン酸化した。 その後、 制限酵素 Bglllリンカ一 （宝酒造） を加え、 ライゲーシヨンキッ ト （宝酒造） を用いてライゲーシヨンを行った。 これで、 pTELPuroプラス ミド中の PGKPuro カセッ卜が Bglll リンカ一で置換されたプラスミド pTELBgが作製された。 このプラスミドを制限酵素 Bglllで切断し、 同様に 脱リン酸化後、 CHROMA SPIN- TE400 (クローンテック） を用いてゲル濾過す ることで精製した。 次にプラスミド #1-132 (京都大学 武田俊一教授より 分与）から制限酵素 BamHIで切り出した hisD断片を加え、 同様にライゲー シヨン反応を行った。 これで、 pTELPuroプラスミド中の PGKPuroカセット が hisDカセットに置換されたカセットベクター pTELhisDが作製された（図 2)。
〔実施例 2〕 ターゲティングベクタ一 pTELMsDlIの作製
ヒ卜 22番染色体上の Ig 遺伝子座のごく近傍かつテロメァ側（約 400Kb テロメァ側）に位置する AP000344領域にヒトテロメァ配列を揷入するため のターゲティングベクター pTELhisDAI を以下のようにして作製した。 ま ず、 AP000344ゲノム領域を以下のプライマ一を用いて PCRにより増幅した。 1269D1-F; 5'-TCGAGGATCCGACAAGTTCTCTTCTCTTTTCCTTCTGCCC-3' (配列番号 1) 1269D1-R; 5' -TCGAGGATCCGCTGCTAAGCTACTGTTCTCTTTTTTCCCC-3' (配列番号 2)
PCRは、サーマルサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taaポリメラーゼは LA TaQ(宝酒造)を用レ 、バッファ一や dNTPCdATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイ クル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 68°C 11分を 35サイクル行つ た。 PCR産物をプロテネース K (ギブコ） 処理した後、 CHROMA SPIN-TE400 (クローンテック） でゲル濾過した。 その後、 制限酵素 BamHI (ベーリン ガー）で切断し、 CHROMA SPIN- TE1000 (クローンテック）でゲル濾過した。 この PCR断片をプラスミド pTELhisDの BamHI部位にクローニングした。 AP000344ゲノムシークェンスの方向はセントロメァ→テロメァなので、 ク ローニングされた AP000344 ゲノム断片がヒトテロメァ配列と同方向のも のを目的のターゲティングベクター pTELhisDA I とした （図 3 )。 〔実施例 3〕 夕ーゲティングベクター p5531oxPHygの作製
ヒト 22番染色体上の IgA遺伝子座のごく近傍かつセントロメァ側 （約 300Kbセントロメァ側）に位置する AP000553領域に Cre組換え酵素の認識 配列 ΙοχΡを挿入するためのタ一ゲティングベクタ一 p5531oxPHygを以下の ようにして作製した。 まず、 AP000553ゲノム領域を以下のプライマーを用 いて PCRにより増幅した。
553-F3 ; 5' -TCGAGTCGACTGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3' (配列番号 3) 553-R3 ; 5' -TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3' (配列番号 4) PCRは、サ一マルサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taaボリメラーゼは LA Tad(宝酒造)を用い、バッファ一や dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイ クル条件は 94 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 68°C 15分を 35サイクル行つ た。 PCR産物をプロテネース K (ギブコ） 処理した後、 CHROMA SPIN- TE400 (クロ一ンテック） でゲル濾過した。 その後、 制限酵素 Sai l (ベーリンガ 一） で切断し CHROMA SPIN-TE1000 (クローンテック） でゲル濾過した。 こ の PCR断片をプラスミド pBluescriptll (予め Notl部位を欠失後、 SacII 部位に Sril リンカ一を挿入したもの） の Sail 部位にクローニングした (pBS553)。 次に， PBS553を制限酵素 Hpal (ベーリンガー） で切断し脱リ ン酸化後、 Notl リンカ一をライゲーシヨンにより挿入した （pBS553N)。 PBS553N を制限酵素 Notl で切断し脱リン酸化後、 カセッ トベクター ploxPHygから制限酵素 Notl (ベ一リンガー） で ΙοχΡを含む DNA断片を切 り出し、 ライゲ一シヨンした。 LoxP 配列の方向がクローニングした APOO0553 ゲノム断片と同方向のものを夕ーゲティ ングベクター p5531oxPHygとした （図 4)。
〔実施例 4〕 ニヮトリ DT-40細胞中でのヒト 22番染色体の部位特異的切 断
W098/37757に記載された方法で作製されたヒト 22番染色体全長を保持 するニヮトリ DT- 40細胞 （クローン 52-18) と既に LIF遺伝子座で切断済 みのヒト 22番染色体断片を保持する DT- 40細胞 （クローン HF38) に上記 実施例 2で作製したタ一ゲティングベクタ一 pTELhisDA I を卜ランスフエ クシヨンし、 AP000344ゲノム領域にヒトテロメァ配列を挿入することによ つて、 その挿入部位で 22番染色体を切断することを試みた。
ニヮ卜リ DT-40細胞の培養は 10%ゥシ胎児血清 （ギブコ、 以下 FBSで記 す）、 1%ニヮトリ血清 （ギブコ）、 10— 4M 2-メルカプトエタノール （シグマ） を添加した RPMI1640培地 （ギブコ） 中で行った。 約 107個の細胞を無添加 RPMI1640培地で一回洗浄し、 0.5 mlの無添加 RPMI 1640培地に懸濁し、 制 限酵素 Srfl (東洋紡） で線状化したターゲティングベクタ一 pTELliisDII を 25-30 加え、 エレクト口ポレーシヨン用のキュベット （バイオラッ ド） に移し、 室温で 10分間静置した。 キュべットをジーンパルサー （バイ ォラッド） にセットし、 550 V、 25 ^Fの条件で電圧印加した。 室温で 10 分間静置後、 24時間培養した。 24時間後、 ヒスチジノール （0.5 mg/ml) を含む培地に交換し、 96穴培養プレート 10枚に分注して約 2週間の選択 培養を行った。 ヒスチジノ一ル耐性クローンから Puregene DNA Isolation Ki t (Gent raSystem社） を用いてゲノム DNAを抽出して、 HCF2 (黒岩ら、 Nature Biotech. 18 : 1086, 2000)、 IgA (富塚ら， Nature Genet. , 16 : 133, 1997) , D22S1174, D22S315, D22S275 (BIOS社）、そして LIF (黒岩ら、 Nucle ic Acid Research, 26 : 3447-3448, 1998) を検出するプライマーを用いた PCR により、 ヒト 22番染色体が AP000344ゲノム領域で切断されていることを 確認した。
PCRは、サーマルサイクラ一として Perkin- Elmer社製の GeneAmp9600を、 TaQポリメラーゼは LA Tad (宝酒造）を用い ッファーや dNTP(dATP， dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイ クル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 56°C30秒、 72°C 30秒を 35 サイクル行った。 52- 18をトランスフエクシヨンした場合、 48クローンを スクリーニングして 1 クローン （T32) が目的のクローンであった。 HF38 を卜ランスフエクションした場合、 96ク口一ンをスクリーニングして 2ク ローン （HT69, HT72) が目的のクローンであった。
さらに、 AP000344領域で 22番染色体の切断が起こっているか否かを FISH 解析により、 確認した。
ヒト 22番染色体が AP000344ゲノム領域で切断されていることを視覚的 に判断するために夕ーゲティングベクタ一中の hisD 耐性遺伝子を検出で きるプローブを用いた FISH解析を行った。 方法は黒岩ら （Nucleic Ac id Research, 26 : 3447-3448, 1998) に従った。 C0T1 染色 （ローダミン標識、 赤色） により、 全長のヒト 22番染色体と比較して T32， ΗΤ69, ΗΤ72では、 22番染色体が断片化していることが分かる。さらに、 hisDプローブ由来の シグナル （FITC標識、 黄色） がテロメァ一端に検出された。 このことは夕 ーゲティングベクターが揷入された AP000344が 22番染色体断片のテロメ ァ一端になっていることを示している。
以上の結果から、 T32， HT69, HT72において、ヒト 22番染色体が AP000344 領域で切断されていると結論できた。
〔実施例 5〕 ニヮトリ DT- 40細胞中での loxPHygカセットのヒ卜 22番染 色体上への部位特異的揷入
上記 HT69、 72においては、 既に HCF2遺伝子座 （IgA遺伝子座よりも約 1Mbセントロメァ側）に ΙοχΡ配列が揷入されている。そこで、クローン T32 において、 IgA遺伝子座のごく近傍かつセントロメァ側 （約 300Kbセント 口メァ側）に位置する AP000553領域に上記実施例 3で作製した夕ーゲティ ングベクター p5531oxPHygをトランスフエクシヨンし、 ΙοχΡ配列の挿入を 試みた。
上記と同様に、 制限酵素 Srf l (東洋紡） で線状化した夕ーゲティングべ クタ一 p5531oxPHygをクローン T32に卜ランスフエクションし、 ハイグロ マイシン B (l mg/ml) を含む培地で約 2週間の選択培養を行った。 ハイグ ロマイシン B耐性クローンからゲノム DNAを抽出し、 以下の 2組のプライ マーを用いた PCRにより相同組換え体の同定を行った。
553-F4； 5 ' -GCTAAGGCACTTCGGTTCTCTTTGTGTTC-3' (配列番号 5 )
553-R4； 5' -GGTTGTCTTTAAAAGCAGGGATAAGGATG-3' (配列番号 6 )
553-F5 ; 5 ' -AGAAGAAAGGAGTGGGTGCTAAACATTCAG-3 ' (配列番号 7 )
553-R5 ; 5' -GGTTAGATGGCACCAAATGAAAGGAGAAG-3' (配列番号 8 ) ,
PCRは、サーマルサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneA即 9600を、 TaQポリメラーゼは LA TaQ(宝酒造）を用い、バッファーや dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイ クル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 68で 15分を 35サイクル行つ た。 6 9クローンをスクリーニングした結果、 3クローン （553-2， 6, 14) が相同組換え体として同定された。
〔実施例 6〕 ヒト抗体 λ軽鎖遺伝子領域周辺（HCF2- IgA - AP000344) 2. 5Mb を SC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体 AHACの構 築
まず、 最初に上記実施例 4で得られたクローン HT72を SC20染色体べク 夕一を保持する DT- 40細胞 Rクローン（黒岩ら、 Nature Biotech. 18 : 1086, 2000) と細胞融合することによって、 ヒト 22番染色体断片と 14番染色体 断片 SC20断片の両者を保持する DT- 40ハイプリッドを作製した。
( 1 ) ヒト 22 番染色体断片と SC20 染色体ベクターの両者を保持する DT-40ハイプリッドの作製
Rクローンはブラストサイジン S( 10 g/ml)含有 RPMI 1640培地で、 HT72 クローンはハイグロマイシン B (1 mg/ml)含有 RPMI 1640培地で培養した。 l〜2 x 107個の両クローンを混合し遠心後、 無血清 RPMI 1640培地で 2回洗 浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め 37°Cで保温しておいた 50% PEG 1500 (ベーリンガー） 0. 5 mlを静かに加え、 約 2分間ピぺッ卜で激し く混合した。 その後、 無血清 RPMI 1640培地 1 mlを 1分間かけてゆつくり 加え、 続いて無血清 RPMI 1640培地 9 mlを約 3分間かけて加え、 37°Cで 1 0分間静置した。その後， 1， 200 rpmで 5分間遠心し、血清を含む RPMI 1640 培地で 24〜48時間培養した。 その後、 ブラストサイジン S (10 g/ml) - ハイグロマイシン B (1 mg/ml) 含有 RPMI 1640培地に交換し、 24穴培養プ レート 5枚に分注し、 3-4 週間培養した。 ダブル耐性クローンからゲノム DNAを抽出して、 以下のプライマ一を用いて PCRを行い、 ヒト 14番染色体 断片 （SC20染色体ベクター）、 22番染色体断片の 2本が保持されているこ とを確認した。
ヒト 14番染色体検出用プライマー
VH3-F； 5' -AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3 ' (配列番号 9 )
VH3-R; 5' -GTTGTGCTACTCCCATCACT-3' (配列番号 1 0 )
ヒト 22番染色体検出用プライマー
IgA -F ; 5' -GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3' (配列番号 1 1 )
IgA -R; 5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3' (配列番号 1 2 )
PCRは、サ一マルサイクラ一として Perkin- Elmer社製の GeneA即 9600を、 Taa ポリメラーゼは Ex TaQ (宝酒造）を用い ッファーや dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイ クル条件は 94^ 1分の熱変性後、 98 10秒、 56°C30秒、 72°C 30秒を 35 サイクル行った。 PCR の結果、 6クローン （56HT2, 3, 4， 5, 6, 7) が陽 性であった。 さらに、 ヒト C0T1 DNAをプローブに用いて FISH解析を行つ た結果、 これらのクローンは全て 2本のヒト染色体断片を独立した状態で 保持していることが明らかとなった。 以上の結果から、 これらの 6ハイプ リッドクローンはヒト 14番染色体断片（SC20染色体ベクター）、 22番染色 体断片の 2本を保持していると判断できた。
( 2 ) DT-40ハイブリッドクローン （56HT2) におけるヒト 22番染色体 領域 （HCF2- IgA _AP000344) 2. 5Mbの SC20染色体ベクターへの部位特異的
( 2 ) - 1 Cre組換え酵素安定発現ベクター pBS185Puroの構築
黒岩ら （前出） の方法に従って、 ヒト染色体間の部位特異的転座は Cre-loxPシステムを用いることによって行った。 このシステムにおいても、 今回のように非相同染色体間での組換え効率は非常に低いことが予想され るため、 Cre 酵素を一過性ではなく安定発現させることを考え、 以下のよ うな発現べクタ一を構築した。
プラスミド PGKPuro (WHITEHEAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Lai rdから分 与）中の Not l部位を EcoRI部位に置換したプラスミドから制限酵素 EcoRI にて切り出した PGKPuro断片を Cre組換え酵素発現ベクター pBS185 (ギブ コ）中の EcoRI部位にクローニングした （pBS185Puro)。
( 2 ) - 2 Cre-loxPシステムを用いた DT-40ハイブリッドクローンにお けるヒト 番染色体領域 （HCF2 - IgA - AP000344) 2. 5M の SC20染色体べ クタ一への部位特異的転座
上記と同様にして、 制限酵素 Kpnl (ベ一リンガー） で線状化した Cre組 換え酵素安定発現ベクター pBS185Puroを 56HT2ハイプリッドクローンに卜 ランスフエクシヨンし、 2 4穴プレートへ分注し、 ピューロマイシン （3 g/ml) 存在下で約 2週間選択培養した。 それぞれのゥエルからゲノムを 抽出し、 以下の 2組のプライマーを用いたネステッド （nested) PCRを行 い、 SC20染色体ベクターとヒ卜 22番染色体断片間で転座が起こったか否 かを検討した。
PGK-1 ; 5' -ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3' (配列番号 1 3 )
GFP-1 ; 5' -TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3' (配列番号 1 4 ) PGK-2 ; 5' -TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3' (配列番号 1 5 )
GFP-2 ; 5' -TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3' (配列番号 1 6 )
PCRは、サーマルサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneAmp9600を、 Tadポリメラーゼは Ex Tad (宝酒造)を用い、バッファ一や dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 まず、 第一 の PCRは、 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 6 C 30秒、 72°C 1分を PGK - 1 と GFP-1をプライマーとして 35サイクル行った。この反応液の一部を錶型 として、 98°C 10秒、 59°C 30秒、 72°C 30秒を PGK- 2と GFP - 2をプライマー として 35サイクル行った。 PCR陽性で転座が確認できたゥエル中の細胞プ —ルを 107細胞数になるまで増やし、 プールを 5% FBSと 1 g/ml .のプロ ピディアムアイオダイド （PI) を添加した PBS (リン酸緩衝溶液） 4mlに 懸濁し、 FACS Vantage (べクトン 'ディッキンソン） により解析した。 黒 岩ら （前出） の報告にあるように、 ΙοχΡ間での組換え転座が起こると GFP 遺伝子が再構築され発現するので転座を起こした細胞を FACS で検出でき る。 GFP 陽性と思われる細胞画分のソーティングを 2回繰り返した。 毎回 のソーティング後の培養はハイグロマイシン B ( lmg/ml)含有 RPMI 1640培 地で行った。 その結果、 GFP陽性細胞を 98- 99%の純度で濃縮することがで さた。
次に、 FACSでクローニングされた GFP陽性クローン（Δ Η21)において、 期待通り ΙοχΡ間で組換えが起こっていることを前記 PGK-2と GFP- 2をブラ イマ一として用いた PCRによって確認した。 さらに、 クローン Δ Η21 に対 して、 ヒト 14番染色体特異的プローブ （ローダミン標識） とヒト 22番染 色体特異的プローブ （FITC標識） を用いた FISH解析 （黒岩ら、 前出） を 行った結果、 確かにヒト 22番染色体領域が SC20染色体ベクター （ヒト 14 番染色体断片） に転座した人工染色体の存在が確認された。
以上の結果から、 クローン Δ Η21 において、 ヒト抗体 λ軽鎖遺伝子領域 周辺 （HCF2-Igえ- ΑΡ000344) 2. 5Mbが SC20染色体ベクターへ転座クロー二 ングしたヒト人工染色体 AHACが構築できたと結論付けた。
△ HACを保持するニヮトリ DT- 40細胞 （A HAC) は、 独立行政法人 産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 )に 2 0 0 1年 5月 9日付けで国際寄託され、 受託番号 FERM BP-7582が与えられた。 〔実施例 7〕 ヒト抗体 λ軽鎖遺伝子領域周辺（ΑΡ000553- IgA - ΑΡ000344) 1. 5Mbを SC20染色体べク夕一へ転座クローニングしたヒト人工染色体△△ HACの構築
上記 AHACにおいては、 IgA -HCF2間に約 1Mbの余分な領域がまだ残存し ている。 そこで、 厳密に余分な染色体領域を取り除き、 Ig A遺伝子領域周 辺のみを転座クローニングする目的で、 AP000553- Ig A - AP000344 領域 1. 5Mbを SC20染色体ベクターへ転座クローニングしたヒト人工染色体△△ HACを構築することを試みた。
まず、 最初に実施例 5で得られたクローン 553- 2を Rクローンと細胞融 合することによって、ヒト 22番染色体断片と 14番染色体断片 SC20染色体 ベクターの両者を保持する DT- 40ハイプリッドを作製した。
( 1 ) ヒト 22 番染色体断片と SC20 染色体ベクターの両者を保持する DT-40ハイプリッドの作製
Rクローンはプラストサイジン S ( 10 g/ml) 含有 RPMI 1640培地で、 ク ローン 553- 2はハイグロマイシン B ( 1 mg/ml) 含有 RPMI 1640培地で培養 した。 1〜2 X 107個の両クローンを混合し遠心後、 無血清 RPMI 1640培地で 2回洗浄する。 残量培地を完全に取り除いた後に、 予め 37°Cで保温してお いた 50% PEG 1500 (ベ一リンガー） 0. 5 mlを静かに加え、 約 2分間ピぺッ トで激しく混合した。 その後、 無血清 RPMI 1640培地 1 mlを 1分間かけて ゆっくり加え、 続いて無血清 RPMI 1640培地 9 ml を約 3分間かけて加え、 37°Cで 1 0分間静置した。 その後、 1, 200 rpm で 5分間遠心し、 血清を含 む RPMI 1640培地で 24〜48時間培養した。その後、ブラストサイジン S ( 10 g/ml) ·ハイグロマイシン B ( 1 mg/ml) 含有 RPMI 1640培地に交換し、 24 穴培養プレート 5枚に分注し、 3〜4週間培養した。 得られたハイブリッド クローン （例えば、 クローン 553R1) からゲノム蘭 Aを抽出して、 実施例 6と同じプライマーを用いて PCRを行い、 ヒト 14番染色体断片、 22番染 色体断片の 2本が保持されていることを確認した。 さらに、 ヒト C0T1 DNA をプローブに用いて FISH解析を行い、 2本のヒト染色体断片が独立した状 態で存在していることを確認した。 以上の実験から、 ハイブリッドクロー ン 553R1がヒト 14番染色体断片（SC20染色体ベクター）、 22番染色体断片 の 2本を保持していると結論付けた。
( 2 ) DT- 40ハイブリッドクローン （553R1) におけるヒト 22番染色体 領域 (AP000553-IgA -AP000344) 1. 5Mbの SC20染色体ベクターへの部位特 異的転座
上記と同様にして、 制限酵素 ΚρηΙ (ベーリンガー） で線状化した Cre組 換え酵素安定発現ベクター pBS185Puroを 553R1ハイプリッドクローンにト ランスフエクシヨンし、 12 穴プレートへ分注し、 ピューロマイシン (3 g/ml) 存在下で約 2週間選択培養した。 それぞれのゥエルからゲノムを抽 出し、 以下の 2組のプライマーを用いた nes ted PCRを行い、 SC20染色体 ベクタ一とヒト 22番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討した。 PGK-l ; 5' -ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3' (配列番号 1 3 )
GFP-1 ; 5' -TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3' (配列番号 1 )
PGK-2 ; 5' -TGTTCTCCTCTTCCTACTCTCC-3' (配列番号 1 5 )
GFP-2 ; 5' -TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3' (配列番号 1 6 )
PCRは、サ一マルサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taaポリメラ一ゼは Ex Tad (宝酒造)を用い、バッファ一や dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 まず、 第一 の PCRは、 94°C 1分の熱変性後、 98 10秒、 61"Ό30秒、 72°C 1分を PGK- 1 と GFP-1をプライマーとして 35サイクル行った。この反応液の一部を鍀型 として、 98°C 10秒、 59°C30秒、 72°C30秒を PGK- 2と GFP- 2をプライマー として 35サイクル行った。 PCR陽性で転座が確認できたゥエル中の細胞プ ール（DDH5, 6の 2プール）を 107細胞数になるまで増やし、プールを 5% FBS と 1 i g/mlのプロビディアムアイオダイド （PI) を添加した PBS (リン酸 緩衝溶液） 4ml に懸濁し、 FACSVantage (べクトン 'ディッキンソン） に より解析した。 GFP 陽性と思われる細胞画分のソーティングを 2回繰り返 した。 毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシン B ( l mg/ml) 含有 RPMI 1640培地で行った。 その結果、 GFP陽性細胞を 98〜99%の純度で濃縮 することができた。
次に、 FACSでクローニングされた GFP陽性クローン （Δ Δ Η5, 6) におい て、 期待通り ΙοχΡ間で組換えが起こっていることを前記 PGK- 2 と GFP - 2 をプライマーとして用いた PCRによって確認した。 さらに、 クローン△△ H5, 6に対して、 ヒト 14番染色体特異的プローブ （ローダミン標識） とヒ ト 22番染色体特異的プローブ （FITC標識） を用いた FISH解析 （黒岩ら、 前出） を行った結果、両クローン共に、確かにヒト 22番染色体領域が SC20 染色体ベクター（ヒト 14番染色体断片） に転座した人工染色体の存在が確 認された。
以上の結果から、 2クローン Δ Δ Η5, 6において、 ヒト抗体 λ軽鎖遺伝子 領域周辺 (AP000553-IgA -AP000344) 1. 5Mbが SC20染色体ベクターへ転座 クロ一ニングしたヒ卜人工染色体△△ HACが構築できたと結論付けた。
△△HACを保持するニヮトリ DT-40細胞'（Δ Δ ΗΑΟは、独立行政法人 産 業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1中央第 6 )に 2 0 0 1年 5月 9日付けで国際寄託され、受託番号 FERM BP - 7581が与えられた。
〔実施例 8〕 AHAC含有 DT- 40ハイプリッド細胞とチャイニーズハムス 夕一 CH0細胞との細胞融合
黒岩ら （前出） の報告にあるように、 構築された HACをマウス ES細胞へ 導入するために、 まず CH0 細胞への導入を試みた。 しかしながら、 A HAC 含有 DT- 40ハイプリッド細胞 ΔΗ21はミクロセル形成能が低く、 A HACのミ クロセル法による CH0細胞への導入 （W000/10383) は成功しなかった。 そ こで、 新しい試みとして、 AHAC含有 DT- 40ハイブリッド細胞 Δ Η21と CH0 細胞との細胞融合による AHACの CH0細胞への導入を試みた。 l〜2 x 107個の ΔΗ21クローンと l x 107個の CHO細胞とを混ぜ、遠心後、 無血清 DMEM培地で 2回洗浄した。残量培地を完全に取り除いた後に、予め 37°Cで保温しておいた 50% PEG 1500 (ベーリンガ一）0. 5 mlを静かに加え、 約 2分間ピペットで激しく混合した。 その後、 無血清 DMEM培地 1 mlを 1 分間かけてゆつくり加え、 続いて無血清 DMEM培地 9 mlを約 3分間かけて 加え、 37°Cで 1 0分間静置した。 その後、 1, 200 rpmで 5分間遠心し、 血 清を含む F12培地（ギブコ）で 24時間培養した。その後、 G418 (l mg/ml) · ハイグロマイシン B (0. 6 mg/ml) 含有 Π2培地に交換し、 24穴培養プレー ト 3枚に分注し、 3〜4週間培養した。
耐性クローンからゲノムを抽出し、上記実施例 6と同様に VH3と IgA検 出用プライマ一を用いて PCRを行った。その結果、 2クローン（D15， A C30) が PCR陽性であった。 さらに、 これら 2クローンに関して、 上記実施例 6 と同様にしてヒト 14番染色体特異的プローブとヒト 22番染色体特異的プ ローブを用いた 2重染色による FISH解析を行い、 AHACの存在を確認した。 DT40と CH0の融合細胞であるが、 DT40由来の染色体はほとんど脱落してお り、 核型は野生型 CH0細胞とほぼ同じであった。 このことから、 DT40細胞 と CH0細胞との細胞融合によって、 結果的には AHACを保持した CH0クロ ーンを得ることができた。 DT40クローンのミクロセル形成能が低い場合の 代替法として有用である可能性が示された。
〔実施例 9〕 Δ ΔΗΑ0含有 DT- 40ハイプリッド細胞からの CH0細胞への △△HACの導入
△△HAC含有 DT-40ハイプリッドクローン Δ ΔΗ5, 6のミクロセル形成能 は悪くなかったので、 黒岩ら （前出） の報告にあるように、 ミクロセル法 を用いた。
DT-40ハイプリッドクローン△ ΔΗ5, 6をそれぞれ Π25フラスコ (スミ ロン） 8本で培養し、 コンフルェン卜になった時点で 20% FBS、 1% ニヮト リ血清、 10— 4M 2-メルカプトエタノール、 0. 05 g/mlコルセミドを添加し た RPMI 1640培地に交換し、さらに 2 4時間培養してミクロセルを形成させ た。 細胞を 24ml の血清 RPMI 1640培地に懸濁し、 予め 100 x g/ml のポリ L -リジンでコートした遠心用 25 cm2フラスコ 1 2本 （コ一二ング） に 2 ml ずつ分注し、 37°Cで 1時間培養し、 細胞をフラスコの底に付着させた。 培 養液を除去し、予め 37°Cで保温したサイトカラシン B( 10 g/ml, シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 34°C、 8000 rpm、 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清 DMEM培地に懸濁し、 8 m, 5 m, 3 mフィルターに て精製した。 精製後、 1700 rpm, 10分間遠心し、 無血清 DMEM培地 5 mlに 懸濁した。 一方、 約 107個の CH0細胞をトリプシン処理によりはがし、 無 血清 DMEM培地で 2回洗浄し、 無血清 DMEM培地 5 mlに懸濁した。 再度、 ミ クロセルを 1700 rpm、 10分間遠心し、 上清を除かずに先の CH0懸濁液 5ml を静かに重層した。 遠心後、 培養液を除去し、 PEG1500 溶液 （ベーリンガ 一） 0. 5 mlを加え、 約 2分間ピペットで激しく攪拌した。 その後、 無血清 DMEM培地 10ml を約 3分間かけてゆつくり加え、 37°Cで 10分間静置した。 遠心後、 10% FBS添加 F12培地 （ギブコ） に細胞を懸濁し、 24穴培養プレ —ト 5-6枚に分注し、 37°Cで 24時間培養した。 その後、 G418 800 g/ml 含有 F12培地に交換し、 3〜4週間選択培養した。
G418耐性クローンからゲノム丽 Aを抽出して IgAと VH3検出用プライマ 一および PGK- 2、 GFP-2プライマーを用いて、前述と同様の条件で PCRを行 レ 、 △ AHACを保持する CH0クローンを同定した （例えば、 Δ Δ (;ΐΟ, 13)。 さらに、 上記 PCRで陽性だったクローンに対して、 ヒト 14番染色体、 22 番染色体特異的プローブを用いて FISH解析を行い、視覚的に A AHACの存 在を確認した。 これらの結果から、 A AHACを保持する CH0細胞クローン が得られたと結論できた。 〔実施例 1 0〕 CH0細胞からの AHACあるいは△ AHACのマウス ES細胞へ の移入
△ HACあるいは A AHACを保持するキメラマウスを作製するために、実施 例 8、実施例 9で得られた AHACあるいは A AHACを保持する CH0細胞から マウス ES細胞 （野性型 TT2F) へミクロセル法により導入した。 富塚ら （Nature Genet. 16:133, 1997) の方法に従い、 約 108個の AHAC あるいは△ AHACを保持する CH0細胞（D15， ΔΔΟΙΟ, AAC13など）から ミクロセルを精製し、 DMEM 5 mlに懸濁した。約 107個のマウス ES細胞 TT2F をトリプシン処理により剥がし、 DMEMで 3回洗浄後 DMEM 5 mlに懸濁し、 遠心したミクロセルに加え、 1250 rpmで 10分間遠心し、 上清を完全に取 り除いた。 沈殿をタッピングにより十分ほぐし、' 1:1. PEG溶液 [5g PEG 1000 (和光純薬）、 1 ml DMS0 (シグマ) を DMEM 6 mlに溶解] 0.5 mlを加 え、 約 1分 30秒間、 十分攪拌した。 その後、 DMEM 10mlをゆつくり加え、 1250rpmで 10分間遠心し、 30 mlの ES培地に懸濁し、 予めフィーダ一細 胞をまいた直径 100讓シャーレ （コ一二ング） 3枚に分注し、 培養した。 24時間後、 300 ig/mlの G418を含む培地に交換し、 約 1週間選択培養し た。
その結果、 D15クローン （AHAC保持） からは 14クローン、 ΔΔ Ο (Δ △ HAC保持） からは 8クローン、 ΔΔ(:ΐ3 (ΔΔΗΑΟ保持） からは 8クロ一 ンが IgAと VH3検出用プライマ一を用いた PCRで陽性であった。 さらに、 ヒト C0T1 DNAプローブを用いて FISH解析 （Tomizukaら、 Nature Genet. 16:133, 1997) を行った結果、 C0T1プローブにより特異的に検出される△ HACあるいは ΔΔΗΑϋの存在が確認された。
以上のことから、 AHAC保持 TT2F細胞が 14クローン、△ AHAC保持 TT2F 細胞が 16クローン得られたと結論付けた。
〔実施例 11〕 ヒト人工染色体 ΔΗΑ (；、 △ AHACを保持するキメラマウス の作製
実施例 10で得られた ES細胞クローンを用いて富塚らの方法 （Nature Genet., 16:133, 1997)でキメラマウスを作製した。宿主としては MCH(ICR) (白色、 日本クレア社より購入）、 あるいは抗体重鎖ノックアウトマウス (Tomizukaら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000) の雌雄交配により得られる 8細胞期胚を用いた。 注入胚を仮親に移植した 結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。 野性型 TT2F/AHACクローン （ΤΔ #6、 実施例 1 0で取得） を注入した 400 個の胚を仮親に移植した結果、 7匹のキメラマウス （毛色に濃茶色の部分 の認められる） が誕生した。 すなわち、 ヒト人工染色体 AHAC を保持する ES細胞株 （TT2F) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の 正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
上記と同様にして、実施例 1 0で得られた野性型 TT2F/A AHACクローン (ΤΔ△ # 21)を注入した 180個の胚を仮親に移植した結果、 2匹のキメラマ ウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。 うち 1匹は白色の部 分がほとんど観察できないキメラ率約 100%の個体であった。 すなわち、 ヒト人工染色体 A AHACを保持する ES細胞株 （TT2F) はキメラ形成能を保 持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持してい ることが示された。
〔実施例 1 2〕 ヒト人工染色体 AHAC、 Δ AHACを保持する ES細胞より 作製されたキメラマウス体細胞における人工染色体の保持
実施例 1 1で TT2F/AHACクローン （ΤΔ #6) より作製されたキメラマウ ス （キメラ率約 85%) の尻尾から富塚らの報告 （Nature Genet. , 16 : 133, 1997) に記された方法でゲノム肩 Αを調製し、 IgAおよび VH3検出用ブラ イマ一を用いた PCRを前記と同様に行い、 AHACの保持を検討した。 その 結果、 2 種のプライマー共に陽性であり、 キメラマウス体細胞における△ HACの保持が確認された。 また、 キメラマウス （キメラ率約 85%) および ΤΔ # 6より作製された他のキメラマウス （キメラ率約 90%) より血清を 採取し、 ELISA法（Tomizukaら， Nature Genet. , 16 : 133, 1997, Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA. , vol. 97, 722-727, 2000) によって、 ヒト 鎖およびヒ ト λ鎖夕ンパク質の発現を検討した。その結果、 2匹のキメラマウス共に、 ヒト 鎖、 λ鎖の両者が陽性であった。
同様に、 Δ ΔΗΑΟを保持する ES細胞クローン（ΤΔ Δ # 21)由来のキメラ マウス（キメラ率約 100%、 実施例 1 1 )の尻尾由来 DNAにおいても上記 2 種のプライマ一陽性であり、 A AHAC の保持が確認された。 さらには、 上 記同様の ELISA解析により、 該 Δ ΔΗΑΟ保持キメラマウス血清においては ヒ卜 鎖、 λ鎖両者が陽性であることが示される。
λ HACを保持する ES細胞から得られた λ HAC保持キメラマウスのキメラ 率は最高で約 80%であったが、 AHACにおいては約 85%および 90%、 △△ HACにおいては約 100%のキメラ率を有するキメラマウスが得られた。より 高いキメラ率のキメラマウスの使用はより高い効率の導入染色体保持 ES 細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達をもたらすと考えられ る。 すなわち AHAC、 A AHACの使用により、 抗体免疫グロブリン λ鎖遺伝 子を含むヒト 22 番染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まるこ とが期待される。
〔実施例 1 3〕 ヒ卜人工染色体 ΔΗΑ を保持するキメラマウス からの人工染色体子孫伝達
実施例 1 1で TT2F/AHACクローン （Τ Δ #6) より作製された雌キメラマ ウス （キメラ率約 85%) を MCH (ICR) (白色、 日本クレア社より購入） 雄マ ウスと交配した。 キメラマウスより誕生した 10匹の仔マウスのうち、 4匹 が ES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すな わち AHACを保持する ES細胞株、 ·ΤΔ #6は雌キメラマウスにおいて機能的 な卵細胞に分化したことが示された。 濃茶色仔マウス 4匹中の尻尾を一部 切り取り、 その試料よりゲノム DNAを調製した。 得られた丽 Αについて Ig λおよび VH3検出用プライマーを用いた PCRを前記と同様に行い、 AHAC の保持を検討した結果、 4匹全てにおいて 2種のプライマ一共に陽性であ り、キメラマウス子孫における AHACの保持が確認された。 さらに 4匹中 3 匹の血清を採取し、 ELISA法 (Tomizuka ζ> , Nature Genet. , 16 : 133, 1997, Proc. Nat l. Acad. Sci. USA. , vol. 97, 722-727, 2000) によって、 ヒト 鎖およびヒト λ鎖の発現を検討した。 その結果、 調べた 3匹全てにおい てヒト 鎖、 λ鎖の両者が陽性であった。実施例 1 1で TT2F/A AHACクロ —ンより作製されるキメラマウスからの Δ ΔΗΑΟ 子孫伝達も同様な方法で 示される。 △ HACあるいは△ AHACをそれぞれ保持し、子孫伝達するマウス系統にお ける各 HACの安定保持を、尻尾より調製した繊維芽細胞の FISH解析等で検 討する。 その結果、 当該マウス系統体細胞における各 HACの安定保持が示 される。
また、 AHACあるいは△ AHACを保持し子孫伝達するマウス系統において、 ヒト IgA鎖/重鎖からなる完全なヒト抗体分子の発現は ELISA法等で確認 される。さらに AHACあるいは AAHACを保持し子孫伝達するマウス系統を 内在性抗体重鎖、 軽鎖 κ遺伝子を欠損しているマウス系統と繰り返し交配 し、 各 HACを保持しかつ内在性抗体重鎖および κ鎖遺伝子欠損についてホ モであるマウス系統を得ることができる。 これらのマウス系統においては 主としてヒ卜 Ig重鎖と λ鎖からなる完全なヒト抗体が産生される。
〔実施例 1 4〕 ヒ卜免疫グロブリン重鎖、 軽鎖え、 軽鎖 κを同時に発現 するマウス系統の構築
ヒト Ig重鎖、 軽鎖 κ、 軽鎖 λを同時に産生し、 かつヒト Ig重鎖と軽鎖 κあるいは軽鎖 λからなる分子を主成分とする抗体を産生するマウス系統 は以下の （Α)、 (Β) 系統間の交配により作製できる。
(A) AHAC を保持し子孫伝達するマウス系統、 TC (ΔΗΑΟ あるいは△ △ HACを保持し子孫伝達するマウス系統、 TC (△△ HAC) (実施例 1 3参照）。
(Β) 内因性抗体重鎖、 鎖遺伝子欠損についてホモ接合体かつ 2番染色 体断片 W23を保持し子孫伝達するマウス系統 (Ψ23)/ΔΗ/Δ κ (Tomizuka ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722 - 727， 2000)。
系統 (A)と系統（B)の交配により得られる仔マウスは、 実施例 1 3および 富塚らの報告 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,, vol. 97, 722-727, 2000) に記載された方法で解析する。 本交配により得られる仔マウスは全て内因 性抗体重鎖欠損、 κ鎖欠損についてヘテロ接合体であるが、そのうち AHAC (あるいは Δ ΔΗΑΟを保持する個体と W23断片を保持する個体を交配して さらに子孫を得る。 最終的には内因性抗体重鎖欠損、 κ鎖欠損について共 にホモ接合体であり、 かつ AHAC (あるいは ΔΔΗΑΟ および W23断片を同 時に保持する個体 （系統 （D)) を選抜する。
系統 (D)におけるヒト免疫グロブリン重鎖、 /c鎖、 λ鎖の発現は富塚らの 報告 （Pro Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000) および (W098/37757) に記載された方法で確認される。
〔実施例 1 5〕 AHACを保持し、 かつ内因性 Ig重鎖、 κ鎖遺伝子の両ァ レルが共に破壊されたマウス系統の構築
実施例 1 3で作製された TC(AHAC)を、富塚らの報告（Pro Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000) に記載された内因性 Ig重鎖、 κ鎖 ノックァゥトマウス系統に戻し交配し、得られたマウス個体について、 PCR 法、 ELISA法を用いて遺伝子型の解析を行った （実施例 1 2および富塚ら の報告参照）。
その結果、 AHACを保持し、 内因性 Ig重鎖ノックアウトについてホモ接 合体、 かつ内因性 Ig/c鎖ノックアウトについてホモ接合体である個体 （以 下、 TC (ΔΗΑΟ /ΔΗ/Δ κと記す） を得た。
2匹の TC (ΔΗΑΟ /ΔΗ/Δ κ個体 (8 週齢） の血清中におけるヒト Ig 重鎖および； 鎖タンパク質の発現を、 黒岩らの報告 （Nature Bioteclmol. , 18:1086- 2000) に記載された ELISA法にて解析した結果、 それぞれ、 ヒ ト Ig 鎖： 430 g/mK Igr鎖： 1802g/ml、 IgA鎖： 330 g/mlおよび、 ヒト Ig i 鎖： 720 xg/ml、 Igr 鎖： 320 g/ml、 IgA 鎖： 520 zg/mlであ つた。
〔実施例 1 6〕 AHACおよびヒト Ig/c鎖遺伝子を含むヒト 2番染色体断 片を保持し、かつ内因性 Ig重鎖、 K鎖遺伝子の両アレルが共に破壊された マウス系統の構築
富塚らの報告 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000) に記載の内因性 Ig重鎖、 κ鎖ノックアウトマウスの遺伝的背景にヒト Ig c鎖遺伝子を含むヒト 2番染色体断片（hCF (W23)) を保持するマウス系統 (以下、 TC (W23) /ΔΗ/Δ κと記す） と実施例 1 5で作製された TC (ΔΗΑΟ /ΔΗ/Δ κ系統を交配し、得られたマウス個体について、実施例 1 5と同様 に遺伝子型の解析を行った。
その結果、 AHACおよび hCF(W23)を同時に保持し、内因性 Ig重鎖ノック ァゥ卜についてホモ接合体、かつ内因性 IgK鎖ノックァゥ卜についてホモ 接合体である個体（以下、 TC (ΔΗΑΟ TC (W23) /ΔΗ/Δ κと記す） を得た。 さらに、 TC(AHAC)/TC 23)/ΔΗ/Δ κ個体の血清を、富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 97, 722-727, 2000) および黒岩らの報告 (Nature BiotechnoL, 18:1086- 2000) に記載された ELISA法で解析す ることにより、 ヒ卜 Ig//鎖、 ァ鎖、 λ鎖、 κ鎖タンパク質の発現が検出 される。
〔実施例 1 7〕 AHACおよびヒト Ig/ 鎖遺伝子を含む酵母人工染色体を 保持し、かつ内因性 Ig重鎖、 c鎖遺伝子の両アレルが共に破壊されたマウ ス系統の構築
Fishwild らの報告 (Nature BiotechnoL , 14: 845-851, 1996) に記載 された内因性 Ig重鎖、 κ鎖ノックアウトマウスの遺伝的背景にヒト IgK 鎖遺伝子を含むトランスジーン（KCo5:ヒト / 軽鎖遺伝子の可変領域の約 40%を含む） を保持するマウス系統 （米国 Medarex 社より入手。 以下、 Κ0ο5/ΔΗ/Δ κ と記す） と、 実施例 1 5で作製された TC (ΔΗΑΟ /ΔΗ/Δ κ系統を交配して得られたマウス個体について、 実施例 1 5と同様に PCR 法、 ELISA法を用いて遺伝子型の解析を行った。
その結果、 AHACおよび KCo5を同時に保持し、 内因性 Ig重鎖ノックァ ゥトについてホモ接合体、かつ内因性 IgK鎖ノックアウトについてホモ接 合体である個体 （以下、 TC (ΔΗΑΟ /Κ(:ο5/ΔΗ/Δ / と記す） を得た。 なお、トランスジーン KCo5を構成する酵母人工染色体とプラスミドを保 持する微生物は、米国 ATCCに寄託されている。受託番号は下記のとおりで ある。 酵母人工染色体 yl7を保持する酵母： ATCCNo. PTA-3842, プラスミ ド pKV4を保持する大腸菌： ATCC No. PTA- 3843、 プラスミド pKCIBを保持 する大腸菌： ATCC No. PTA-3844o TC(AHAC) /Κ0ο5/ΔΗ/Δ κ個体の血清を、 実施例 16と同様に ELISA法に て解析した結果、 ヒト Ig 鎖、 ァ鎖、 λ鎖、 κ鎖タンパク質が検出され た。 また、 測定した 3個体における Ύ鎖の値の平均値は n鎖の平均値よ りも高かった。
〔実施例 1 8〕 TC (ΔΗΑΟ /ΔΗ/Δ κマウス系統における抗 G- CSF抗体 産生
実施例 1 5で作製された ΚΔΗΑΟ/ΔΗ/Δ κマウス 2個体をヒ卜 G- CSF により免疫した。 アジュバントとしては TiterMaxGold(CytRx)を用いた。 初回は計 37.5 gのヒト G-CSFを 3箇所に分けて皮下に免疫した。 2回目 および 3回目は初回免疫後 14日目および 38日目に計 10 gを初回免疫と 同様に 3箇所に分けて皮下に免疫した。 初回免疫後 48 日目の最終免疫は lO igの G-CSFをアジュバントなしで静注した。 最終免疫より 3 日後に採 血を行い、血清中の抗 G-CSFヒト IgG抗体価およびヒト IgA抗体価を黒岩 らの報告 (Nature Biotechnol. , 18:1086- 2000) に記載された ELISA法 にて測定した。 その結果、 2個体共に抗ヒト G- CSFヒト IgG抗体価および ヒト IgA抗体価の上昇が観察された。
さらに、 上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞とマウスミエローマ細 胞を融合することにより得られる、 ハイプリドーマ （安東、 千葉、 単クロ ーン抗体実験操作入門、 講談社サイェンティフイク、 1 9 9 1) を ELISA によりスクリーニングすることにより、ヒト Ig重鎖および軽鎖 λからなる 完全なヒ卜モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得ることがで きる。
〔実施例 1 9〕 TC(AHAC)/TC (W23)/AH/A κマウス系統における抗 G-CSF抗体産生
実施例 1 5で作製された TC( \HAC)/TC(W23)/AH/A κマウス個体を、実 施例 1 8と同様に、 ヒト G- CSFにより免疫する。 このマウスの血清中の抗 G-CSFヒト IgG抗体価、 ヒト IgA抗体価およびヒト IgK抗体価を ELISA法 で測定し、 抗ヒ卜 G-CSF ヒト IgG抗体価、 ヒ卜 IgA抗体価およびヒト Ig κ抗体価の上昇を確認する。
さらに、 実施例 1 8と同様に、 上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞 とマウスミエローマ細胞を融合することにより、ヒ卜 Ig重鎖および軽鎖 λ あるいは軽鎖/ 1からなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマを得ることができる。
〔実施例 2 0〕 TC (ΔΗΑΟ /KCo5/AH/A κマウス系統における抗 G- CSF 抗体産生
実施例 1 5で作製された TC (ΔΗΑΟ /Κ(;ο5/ΔΗ/Δ κマウス個体を、 実 施例 1 8と同様に、 ヒト G-CSFにより免疫し、 血清中の抗 G- CSFヒト IgG 抗体価、 ヒト IgA抗体価およびヒト Ig/ 抗体価を ELISA法で測定した。そ の結果、抗ヒト G-CSFヒト IgG抗体価、 ヒト IgA抗体価およびヒト Ig/ 抗 体価の上昇が確認された。
さらに、 実施例 1 8と同様に、 上記の免疫されたマウス個体の脾臓細胞 とマウスミエ口一マ細胞を融合することにより、ヒト Ig重鎖および軽鎖 λ あるいは軽鎖 からなる完全なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマを得ることができた。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参 考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、 ヒト抗体重鎖およびえ軽鎖遺伝子全領域を保持し、 かつ 次世代へ高効率で子孫伝達可能なヒト人工染色体が提供される。 また、 本 発明により、 該ヒト人工染色体を高効率で次世代に子孫伝達する非ヒ卜動 物およびその子孫が提供される。 さらに本発明によりヒト抗体の作製が可 能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1一人工配列の説明 プライマ一 配列番号 2一人工配列の説明 プライマー 配列番号 3一人工配列の説明 プライマー 配列番号 4一人工配列の説明 プライマー 配列番号 5一人工配列の説明 プライマー 配列番号 6—人工配列の説明 プライマー 配列番号 7一人工配列の説明 プライマー 配列番号 8一人工配列の説明 プライマー 配列番号 9一人工配列の説明
配列番号 1 0一人工配列の説明 プライマ、 配列番号 1 1一人工配列の説明 プライマ- 配列番号 1 2一人工配列の説明
配列番号 1 3一人工配列の説明 プライマー 配列番号 1 4一人工配列の説明
配列番号 1 5一人工配列の説明 プライマ' 配列番号 1 6一人工配列の説明 プライマ、

Claims

1 . ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む約 3. 5Mb〜約 1Mb領 域と、 非ヒト動物の生殖系列を経由して子孫伝達されうる別のヒ卜 染色体由来の染色体断片が結合したものである、 ヒト人工染色体。
2 . 別のヒト染色体由来の染色体断片が、 ヒト 14番染色体断片である、 請求の範囲第 1項に記きロ青載のヒト人工染色体。
3 . ヒト 14番染色体断片が SC20染色体ベクターである、 請求の範囲第
2項に記載のヒト人工染色体。の
4 . ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む領域が、 約 2. 5Mb〜 約 1. 5Mbの大きさである、 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか一 囲
項に記載のヒ卜人工染色体。
5 . ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む領域が、約 2. 5Mbの 大きさである、 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか一項に記載の ヒト人工染色体。
6 . 受託番号 FERM BP-7582である細胞に保持される A HACである、 請求 の範囲第 5項に記載のヒ卜人工染色体。
7 . ヒト 22番染色体由来の抗体 λ軽鎖遺伝子を含む領域が、約 1. 5Mbの 大きさである、 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか一項に記載の ヒト人工染色体。
8 受託番号 FERM BP-758 1である細胞に保持される△△ HACである、 請 求の範囲第 7項に記載のヒト人工染色体。
9 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれか一項に記載のヒト人工染色体 を保持する非ヒト動物。
1 0 . A HACまたは A A HACのいずれかを保持する、 請求の範囲第 9項に 記載の非ヒト動物。
1 1 . 哺乳動物である、請求の範囲第 9項または第 1 0項に記載の非ヒト 動物。
1 2 . 哺乳動物がマウスである、請求の範囲第 1 1項に記載の非ヒ卜動物 c
1 3 . 請求の範囲第 9項〜第 1 2項のいずれか一項に記載の非ヒト動物 の作製方法であって、 該方法が、 請求の範囲第 1項〜第 8項のいず れか一項に記載のヒト人工染色体を非ヒト動物の胚性幹細胞 （ES細 胞） 中にミクロセル法により導入すること、 得られた ES細胞を、 該 非ヒト動物の胚に注入すること、 得られた注入胚を仮親に移植する こと、 該仮親からキメラ非ヒト動物を出産により得ること、 該キメ ラ非ヒト動物を、 該ヒト人工染色体についてスクリーニングするこ とを含む、 上記方法。
1 4 . 前記スクリーニングされたキメラ非ヒト動物の子孫を作出し、該子 孫を前記ヒト人工染色体についてスクリーニングすることをさらに 含む、 請求の範囲第 1 3項に記載の方法。
1 5 . ヒト抗体免疫グロブリン重鎖および λ鎖蛋白質を発現可能である、 請求の範囲第 1 3項または第 1 4項に記載の方法。
1 6 . 非ヒ卜動物が哺乳動物である、請求の範囲第 1 3項〜第 1 5項のい ずれか一項に記載の方法。
1 7 . 哺乳動物がマウスである、 請求の範囲第 1 6項に記載の方法。
1 8 . 請求の範囲第 1 3項〜第 1 7項のいずれか一項に記載の方法によ つて得ることができる、 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれか一項 に記載のヒ卜人工染色体を保持する非ヒト動物。
1 9 . 請求の範囲第 9項〜第 1 2項、第 1 8項のいずれか一項に記載の非 ヒト動物の子孫動物であって、 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれ か一項に記載のヒト人工染色体を保持することを特徴とする前記子 孫動物。
2 0 . ヒト抗体免疫グロプリン重鎖および λ軽鎖蛋白質を発現可能であ る、 請求の範囲第 1 9項に記載の子孫動物。
2 1 . ヒト抗体免疫グロプリン重鎖、 / 軽鎖および λ軽鎖蛋白質を発現可 能である、 請求の範囲第 1 9項に記載の子孫動物。
2 2 . マウスである、請求の範囲第 1 9項〜第 2 1項のいずれか一項に記 載の子孫動物。
請求の範囲第 9項〜第 1 2項、第 1 8項のいずれか一項に記載の非 ヒ卜動物、 または請求の範囲第 1 9項〜第 2 2項のいずれか一項に 記載の子孫動物を、 所望の抗原で免疫し、 該動物から該抗原に対す るヒトポリクローナル抗体を得ることを含む、 抗体の作製方法。 ヒトポリクローナル抗体が動物の血液から得られる、請求の範囲第 2 3項に記載の方法。
請求の範囲第 1 2項または第 1 8項に記載のマウス、あるいは請求 の範囲第 2 2項に記載の子孫マウス、 を所望の抗原で免疫し、 次い で、 該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させて ハイプリ ドーマを作製し、 該抗原に対するヒ卜免疫グロブリン重鎖 と軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、 抗 体の作製方法。
請求の範囲第 1 2項または第 1 8項に記載のマウス、あるいは請求 の範囲第 2 2項に記載の子孫マウス、 を所望の抗原で免疫し、 次い で、 該マウスからの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させて ハイプリドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマからヒト抗体遺伝子を 単離し、該ヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞に 導入し、 該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 抗 原に対するヒト免疫グロプリン重鎖と軽鎖からなるヒトモノクロ一 ナル抗体を作製することを含む、 抗体の作製方法。
請求の範囲第 1 2項または第 1 8項に記載のマウス、あるいは請求 の範囲第 2 2項に記載の子孫マウス、 を所望の抗原で免疫し、 次い で、 該マウスの B細胞由来の抗体遺伝子をファージディスプレイ法 により選抜し、選抜されたヒト抗体遺伝子を動物細胞、酵母細胞ある いは昆虫細胞に導入し、 該細胞をヒト抗体遺伝子を発現しうる条件 下で培養し、 抗原に対するヒト免疫グロプリン重鎖と軽鎖からなる ヒトモノクローナル抗体を作製することを含む、 抗体の作製方法。 再配列されていないヒ卜抗体重鎖遺伝子座、再配列されていないヒ ト抗体 /c 軽鎖遺伝子座、 および再配列されていないヒト抗体 λ 軽 鎖遺伝子座を保持し、少なくとも内因性抗体重鎖および 軽鎖の両 アレルが破壊または不活性化されており、 血清中にヒト抗体 I gァ アイソタイプを含むヒ卜抗体重鎖、ヒト抗体 κ 軽鎖およびヒト抗体 λ 軽鎖を発現する、 ヒト抗体産生マウス。
ヒ卜抗体 κ軽鎖の可変領域の少なくとも 40 %を保持するものであ る、 請求の範囲第 2 8項記載のヒ卜抗体産生マウス。
ヒト抗体重鎖、 ヒト抗体 /c軽鎖、 およびヒト抗体 λ軽鎖のすべて の可変領域を保持するものである、 請求の範囲第 2 8項記載のヒト 抗体産生マウス。
ヒト抗体重鎖遺伝子座、 ヒト抗体 κ 軽鎖遺伝子座、 およびヒト抗 体 λ遺伝子座が、ヒト由来の染色体断片上に保持されるものである、 請求の範囲第 2 8項記載のヒ卜抗体産生マウス。
ヒト抗体重鎖遺伝子座およびヒト抗体 λ 軽鎖遺伝子座が、 A HAC または A A HAC上に保持されるものである、 請求の範囲第 2 8項記 載のヒト抗体産生マウス。
ヒト抗体 / 軽鎖遺伝子座が、 ヒト由来の染色体断片上に保持され るものである、 請求の範囲第 2 8項記載のヒト抗体産生マウス。 ヒト抗体 κ 軽鎖遺伝子座が、 マウス染色体に挿入されたものであ る、 請求の範囲第 2 8項記載のヒト抗体産生マウス。
キメラマウスではないことを特徴とする、請求の範囲第 2 8項記載 のヒト抗体産生マウス。
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