WO2001088144A1

WO2001088144A1 - Transformant et procede de production de polyester au moyen de ce transformant

Info

Publication number: WO2001088144A1
Application number: PCT/JP2001/004158
Authority: WO
Inventors: Satoru Yokomizo; Takeshi Fukuchi; Fumio Osakada; Keiji Matsumoto; Masamichi Takagi; Akinori Ohta
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-18
Publication date: 2001-11-22
Also published as: EP1283266A4; KR20020029369A; US7083972B2; EP1283266A1; CA2374969A1; US20040146998A1; CN1380903A

Description

明細書

形質転換体およびそれを用いたポリエステルの製造方法技術分野 '

本発明は、共重合ポリエステル合成酵素をコードする遺伝子、同遺伝子を利用してポリエステルを発酵合成する微生物、及び、その微生物を用いたポリエステ. ルの製造方法に関する。詳しくは、宿主内で機能し、自然環境（土中、河川、海中）の下で、微生物の作用を受けて分解するプラスチック様高分子を酵素合成する遺伝子、及び、同遺伝子を形質転換して得られるプラスチック様高分子を発酵合成する能力が改善された形質転換体、並びに、その形質転換体を利用した共重合ポリエステルの製造方法に関するものである。背景技術 ―

現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては 3—ヒドロキシ酪酸（以下 3HBと略す）のホモポリマーであるポリ一 3—ヒドロキシ酪酸（以下、 P (3HB) と略す）であり、 1 925年にバシラス ' メガテリゥム（B a c i l l u s m e g a t e r i u m) で最初に発見された。 P ( 3 HB) は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目されてきた。しかし、 P (3HB) は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的は応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。

その中で、特開昭 57 - 1 50393号公報おょぴ特開昭 59— 2201 92 号公報などに 3—ヒドロキシ酪酸（3HB) と 3—ヒドロキシ吉草酸（3 HV) とからなる共重合体（以下 P (3 HB- c o - 3 HV) と略す）の製造方法が開示されている。この P ( 3 HB- c o - 3 HV) は P (3HB) に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際のところ P (3HB- C 0 - 3HV) は 3 HVモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムなどに使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、シャンプーポトルや使い捨て剃刀の取っ手など硬質成型体の分野にしか利用されなかった。

近年、 3 HBと 3—ヒドロキシへキサン酸（以下、 3HHと略す）との 2成分. 共重合ポリエステル（以下 P (3HB- c 0 - 3HH) と略す）およびその製造方法について研究がなされた。たとえば、特開平 5— 9 3 04 9号公報および特開平 7— 2 6 5 0 6 5号公報にそれぞれ記載されている。これらの公報の P (3 HB- c o - 3 HH) の製造方法は、土壌より単離されたァエロモナス ' キヤビェ（A e r om o n a s c a v i a .e) を用いてォレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、 P (3 HB— C O — 3 HH) の性質に関する研究もなされている（Y. D o i , S. K i t a m u r a , H. A b e , Ma c r omo l e c u l e s 2 8 , 48 2 2— 4 8 2 3 ( 1 9 9 5) ) 。この報告では炭素数が 1 2個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてァエロモナス ' キヤビエを培養し、 3 HHが 1 1〜 1 9mo 1 %の P ( 3 HB- c o - 3 HH) を発酵生産している。この P (3 HB— c o— 3 HH) は 3 HHモル分率の増加にしたがって、 P (3HB) の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、 P (3 HB— c o— 3HV) を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。しかしながら、本製造方法では菌体生産量 4 gZL'' 、ポリマー含量 3 0%でありポリマー生産性が低いことから、実用化に向け更に高い生産性が得られる方法が探索された。

P (3 HB- c 0 - 3 HH) を生産するァエロモナス ·キヤビエより P HA ( ポリヒドロキシアルカン酸）合成酵素遺伝子がクローユングされた（T. F u k u i , Y. D o i , J . B a c t e r i o l , v o l . 1 7 9, No . 1 5, 4 8 2 1 - 4 8 3 0 (1' 9 9 7) 、特開平 1 0— 1 0 8 6 8 2) 。本遺伝子をラルストニア . ユートロファ（R a 1 s t o n i a e u t r o p h a) (旧ァノレ力リゲネス · ユートロファス（A l c a l i g e n e s e u t r o p h u s ) ) に導入した形質転換株を用いて P ( 3 HB— c o— 3 HH) を生産を行った結果、菌体生産性は 4 gZL、ポリマー含量は 3 0%であった。更に本形質転換株を炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量 4 _{g /} L、ポリマー含量 8 0。/₀が達成された（T. F u k u i等 Ap p l . M i c r o b i o l . B i o t e c n o l . 4 9， 3 3 3 (1 9 9 8) ) 。また、大腸菌等の細菌や植物を宿主とした P ( 3 HB— c 0— 3 HH) の製造方法も開示されている（WO 0 0/4 3 5 2 5) 。しかし、本製造法による生産性は記載されていない。

本ポリマー P (3 HB— c o— 3 HH) は 3 HHモル分率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性を持っため、テレビの筐体などのように硬さを要求されるものから糸ゃフイルムなどのような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、これらの製造方法では本ポリマーの生産性が依然として低く、本ポリマーの実用化に向けた生産方法 ' としては未だ不十分といわざるを得ない。

最近になって、 3 HBの前駆物質であるァセチル C o Aを効率よく生産すると ' 考えられる酵母を生産菌とした生分解性ポリエステルの生産研究が L e a ί らによって行われた（M i c r o b i o l o g y, v o l . 1 4 2, ρ 1 1 6 9 - 1 1 8 0 ( 1 9 9 6) ) . 酵母の一種であるサッカロマイセス ·セルビシェ、S a c c h a r omy c e s c e r e v'i s i a e ) (こフノレストニア ' ユートロファのポリエステル合成酵素遺伝子を導入して形質転換体を作製し、ダルコースを炭素源として培養することによって P (3 HB) の蓄積（ポリマー含量 0 . 5 %) を確認している。しかし、本研究で生産されるポリマーは硬くて脆い性質を有する P (3 HB) であった。

酵母は増殖が早く菌体生産性が高いことで知られている。酵母菌体は過去 S i n g l e C e l l P r o t e i nとして注目され、ノルマルパラフィンを炭素源とした飼料用菌体生産が研究されたり、調味料としてその核酸成分が利用されてきた。また、ポリマーの前駆物質である a c e t y 1 — C o Aを効率よく生産すると考えられることから高いポリマー生産性が期待される。さらに、細菌と、比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、ポリマーの抽出精製工程をより簡単にすることも可能である。そこで、優れた物性を有する P' (3 HB- c 0 - 3 HH) を酵母を用いて生産する方法が求められていた。発明の開示

本発明は、上記現状に鑑み、酵母で機能的かつ効率よく発現できるポリエステル合成に関与する遺伝子、同遺伝子から成る遺伝子発現カセットを酵母に形質転換した形質転換体、及び、得られた形質転換株を培養することにより、生分解性かつ優れた物性を有する P ( 3 H B - c o - 3 H H) 等のポリエステルを製造する方法を提供するものである。

本発明者らは様々な検討を行った結果、下記一般式（1 ) に示す 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子であつて、酵母で実質的に遺伝子発現可能な酵素遺伝子の一種以上のそれぞれに、酵母で実質的に機能するプロモーター、ターミネータ一を連結することによ ·り遺伝子発現カセットを作製し、さらに本遺伝子発現カセットを酵母に導入して形質転換株を作成し、本形質転換株を培養することにより、その培養物から下記一般式（ 1 ) に示す 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルを製造することに成功した。

式中、 Rは、アルキル,を表す。

すなわち本発明は、酵母に、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子からなる遺伝子発現力セットがー種類以上導入されてなることを特徴とする形質転換体である。

本発明はまた、上記形質転換体を用いるポリエステルの製造方法であって、上記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取するポリエステルの製造方法である。

ここで、「実質的」とはポリエステル合成に関与する遺伝子並びに遺伝子発現カセットの構築に必要なプロモーター、ターミネータ一等の遺伝子配列は、遺伝子の機能並びに遺伝子発現に必要な機能を有する限り、当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていてもよいものとする。

さらに本発明は、遺伝暗号 C T Gの少なくとも 1つが、 T T A、 T T G、 C T T、 C T C、又は C T Aに変換されていることを特徴とするポリステルの合成に関与する酵素遺伝子にも関する。 '

以下に、本発明の詳細を説明する。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 2 (a) においてベクターとして使用したプラスミド p SUT 5を示す模式図である。

図 2は、実施例 2 (b) においてベクターとして使用したプラスミド pUT A 1 を示す模式図である。

図 3は、実施例 2 (a) において構築したプラスミド p SUT— p h a Jを示す模式図である。

図 4は、実施例 2 (a) において構築したプラスミド p SUT— PHA 1を示す模式図である。

図 5は、実施例 2 (a) において構築したプラスミド: p SUT— PHA 2を示す模式図である。

図 6は、 '実施例 2 '(b) において構築したプラスミド pUAL 1を示す模式図である。'

図 7は、実施例 2 (b) において構築したプラスミド pUAL— ORF 2を示す模式図である。

図 8は、実施例 2 (b) において構築したプラスミド pUAL— ORF 3を示す模式図である。

図 9は、実施例 2 (b) において構築したプラスミド p UTA— ORF—2 3を示す模式図である。

図 10は、実施例 2 (a) のプラスミドの構築方法を示したプラスミド構築図である。

図 1 1は、実施例 2 (b) プラスミドの構築方法を示したプラスミド構築図である。

図 1 2は、実施例 3'において製造されたポリエステルをキヤビラリーガスクロマトグラフィ一により分析した結果である。

図 1 3は、実施例 3において製造されたポリエステルの NMR分析のチヤ一トである。

図 1 4は、実施例 3において製造されたポリエステルの I R分析のチャートでめる。

図 1 5は、実施例 4において製造されたポリエステルの NMR分析チャートである。発明を実施するための最良の形態

(1 ) 宿主

使用する酵母には特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えば I FO、 AT C C 等）に寄託されているァシクロコ-ディウム属（A c i c u l o c o n i d i u m属）、アンプ口シォザイマ属（Amb r o s i o z yma属） , ァノレスロアスカス属 A r t h r o a s c u s属) ，ァノレキシォザィマ属 (A r x i o z ym a属），ァシュビア属（A s h b y a属），バブジエビア属（B a b j e v i a 属），ベンシングトニア属（B e n s i n g t o n i a属），ボトリオアスカス属 (B o t r y o a s c u s属），■ボトリォザィマ属（B o t r y o z ym a属 ) , ブレツタノマイセス属（B r e t t a n o.my c e s属），ビユレラ属 (B u l l e r a属) ，ビユレロマイセス属 (B u l l e r omy c e s属) ，キヤ'' ンディダ属 (C a n d i d a属）、シテ口マイセス属（C i t e r omy c e s 属），クラビスポラ属（C l a v i s p o r a属），タリプトコッカス属（C r y p t o c o c c u s属），シストフィロバシディゥム属（C y s t o f i 1 o b a s i d i u m属) , デノリォマィセス属 ( D e b a r y omy c e s属 ) , デッカラ属（D e k k a r a属） , ディボダスコプシス属（D i p o d a s c o p s i s属) ，ディポダス力ス属 ( D i p o d a s c u s属) , ェ-エラ属 (E e n i e l l a属) ，ェンドマィコプセラ属 (E n d omy c o p s e 1 1 a属），エレマスカス属（E r e m a s c u s Jh) ，エレモでンゥム jS r e m o t h e c i um属） , エリスロノくシディゥム属（E r y t h r o b a s i d i um属），フエロマイセス属（F e .l l omy c e s属），フィロノンディゥム属（F i 1 o b a s i d i um属），ガラクトマイセス属（G a 1 a c t o my c e s属），ゲォトリクム属（G e o t. r i c h um属），ガイラーモンデラ属 (G u i 1 1 i e r m o n d e l l a属），ノヽンセニァスポラ属（H a n s e n i a s p o r a属) ，ノヽンセヌラ属 (H a n s e n u l a属) ，ハセガワェァ属 (H a s e g a w a e a属) ，ホノレタ一マンニァ属 (H o l t e r ma n n i a属），ホルモアスカス属（H o r m o a s c u s属），ハイフォピキア属（ Hy p h o p i c h i a ) , ィサットへンキア属 ( I s s a t c h e n k i a 属），クロエケラ属（K l o e c k e r a属） , ク口エケラスポラ属（K 1 o e c k e r a s p o r fe) , ク /レイべロマイセス属 (K l u y v.e r omy c e s属），コンドア属（K o n d o a属），クライシァ属（Ku r a i s h i a属 ) , クノレツマノマイセス属（Ku r t zm a n omy c e s属） , ロイコスポリディウム属 IL e u c o s p o r i d i u m属) , リポマイセス属 (L i p o m y c e s属) , 口テロマイセス属 (L o d d e r omy c e s属) ，マラセジァ '属 (M a 1 a s s e z i a属），メトシュニコウイァ属 (Me t s c h n i k o w i a属），ムラキア属（Mr a k i a属），マイクソザイマ属（My x o z y m a属），ナドソニァ属（N a d s o n i a属），ナカザヮエア属 (N a k a z a w a e a ) , ネマトスポラ属 ( N e m a t o s p o r a属) , ォガタエア厲 (O g a t a e a属) ，オースポリディゥム属 (O o s p o r i d i u m属) . ，パチソレン属（P a c h y s o l e n属），ファチコスポラ属（P h a c h y t i c h o s p o r a属）. ，ファフィァ属（P h a f f i a属），ピキア属（P i c h i a属），ロドスポリディゥム属（R h o d o s p o r i d i u m属），ロドトノレラ属 (R h o d o t o r u l a属），サッカロマイセス属（S a c c h a r omy c e sノ禺) , サッカロマイコーァス (S a c c h a r omy c o d e s ) , サッカロマイコプシス属 (S a c c h a r omy c o p s i' s属) ，サイトエラ属（S a i t o e 1 1 a属) ' ，サカグチア属（S a k a g u c h i a属） , サターノスポラ属（S a t u r n o s p o r a属），シゾプラストスポリオン属（S c h i z o b l a s t o s p o r i o n属) ，シゾサッカ口マイセス ( c h i z o s a c c h a r omy c e s属) , シュヮニォマイセス属 ( S c hw a n n i omy c e s ) , スポリディォホラス属 (S p o r i d i o b o 1 u s属) ，スポロボロマィセス属 (S p o r o b o l omy c e s属) , スポロパキデミァ属（S p o r o p a c h y d e r.m i a属），ステファノァスカス属（S t e p h a n o a s c u s属），ステリグマトマイセス属（S t e r i gma t omy c e s属) ，ステリグマトスポリディウム属 (S t e r i gm a t o s p o r i d i u m属) ，シンビォタフリナ属 (S ymb i o t a p h r i n a属) ，シンポディォマイセス属 (S ymp o d i omy c e s属) ，シンポティォマィコプシス属 (S ymp o.d i omy c o p s i s属) ，ト Ζレラスポラ属（T o r u l a s p o r a属），トリコスポリエラ属（T r i c h o s p o r i e 1 1 a属），トリコスポロン属（T r i c h o s p o r o n属），トリゴノプシス属（T r i g o n o p s i s属），ツチヤエァ属（T s u c h i y a e a属），ゥデュオマイセス属（U d e n i o m y c e s属），ワルトマイセス属 (Wa l t omy c e s属) ，ウイカーノヽミァ属 (W i c k e r h am i a属) , ゥイカ一ハミエラ属（W i c k e r h a m i e 1 1 a属），ゥイリォプシス属

(W i 1 I i o p s i s属) ，ヤマダザィマ属 ( Y a m a d a z ym a属) ，ャロウイァ属（Y a r r o w i a属），ザィゴァスカス属（Z y g o a s c u s 属) ，ケィゴサッカロマイセス属 (Z y g o s a c c h a r omy c e s属) ，ザィゴウイリォプシス属（Z y g o w i l l i o p s i s属）又はザィゴザイマ属（Z y g o z ym a属などの酵母を使用することができる。

また、本発明の形質転換体において用いられる酵母として、キャンディダ 'マノレトーサ（C a n d i d a m a 1 o s a ) 、ャロウィァ ' リポリティ力.（Y a r r o w i a 1 i p o 1 y t i c a ) 力 S好ましい力 S、特にキヤンディダ 'マノレトーサが好ましい。 ·

(2) ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子

ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子としては特に限定されないが、„細菌由来の酵素をコードする遺伝子が好ましい。具体的には、上記一般式（1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子が好ましく、下記式（2) で示される 3—ヒドロキシ酪酸と下記式（ 3) で示される 3—ヒドロキシへキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステノレ P (3 HB- c o - 3 HH) の合成に関与する酵素遺伝子であることがより好ましい。

上記一般式（1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子としては特に限定されず、例えば特開平 1 0- 1 0 8 6 8 2号公報に記載されているポリエステル合成酵素遺伝子を用いることができる。上記ポリエステル合成酵素遺伝子としては、例えば、 PHA合成酵素遺伝子があげられる。また、本ポリエステル合成酵素遺伝子と共にポリエス ■ テル合成に関与する酵素遺伝子を用いても良い。これらの酵素遺伝子としては、たとえば、 |3酸化経路の中間体のエノィル C o Aをモノマーである（R) - 3 - ヒロキシァシル C o Aに変換する（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子（T. F u k u i , e t a 1 F EMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s , v o l . 1 7 0 , 6 9— 7 5 (1 9 9 9) ) や、ァセチノレ C ' o Aを二量化してモノマーである 3—ヒドロキシブチリル C o Aを合成する βケトチオラーゼ遺伝子、 NAD.PH依存性ァセトァセチル C ο Α還元酵素遺伝子（ P e o p l e s O P, e t a l J . B i o l . C h e m. 2 6 4 ( 2 6 ) 1 5 2 9 8 - 1 5 3 0 3 (1 9 8 9) ) などが挙げられる。

上記宿主酵母の中には遺伝暗号読みとりに異常を示す場合がある。例えばキヤンディダ ·シリンドラセァ（C a n d i d a c y l i n d r a c e a) (Y. K a w a g u c h i e t a 1 , N a t u r e 3 4 1 1 6 4— 1 6 6 (1. 9 8 9 ) ) やキャンディダ ·マノレトーサ（H. S u g i y a m a e t a l , Y e a s t 1 1 4 3— 5 2 ( 1 9 9 5) ) では遺伝暗号 CTGが、ロイシンではなくセリンに翻訳される特殊な酵母である。このような酵母では、ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子を発現させる場合、遺伝暗号の読みとり異常が生じることから、当該酵素のァミノ .酸配列の異なった酵素が生産されることがある。その結果、当該酵素の機能が十分発揮できない。このような現象は、予め遺伝子内に含まれる遺伝暗号 CTGをロイシンに対応する他の遺伝暗号（TTA， TTG, CTT, CTC, CTA ) に改変した遺伝子を使用することによって避けることができる。

また、酵母を含む生物の遺/云暗号解析の結果、遺伝暗号の使用頻度は生物によつて大きく異なることが明らかになつている。すなわち、複数ある同一アミノ酸を指定する遺伝暗号のうち使用される遺伝暗号は生物によって偏りが認められ、使用頻度の高い遺伝暗号から成る遺伝子の翻訳効率が高いことが指摘されている。例えばァエロモナス · キヤビエの PHA合成酵素遺伝子や（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子の GC含量はそれぞれ 6 7. 1 6%、 6 5. 7 7 %であるが、キャンディダ .マルトーサで現在までに報告されている酵素、例えばホスホグリセリン酸キナーゼでは 3 9. 55%また A LK 2— Aでは 35. 6 7%である。したがって、例えばポリエステル合成に関与する遺伝子をキャンデイダ 'マルトーサにおいて効率よく発現させるためには、前記の遺伝暗号 CTG を他のロイシン対応遺伝暗号に改変することに加えて、キャンディダ ·マルトーサにおいて使用頻度の高い遺伝暗号に改変した当該遺伝子を使用することが好ましい。

本ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子は、遺伝暗号に読みとり異常をさない酵母では、前記酵素遺伝子をそのまま利用しても良いし'、アミノ酸配列を変更することなく当該酵母において使用頻度の高い遺伝暗号に改変した遺伝子を利用しても良い。また、遺伝暗号に読みとり異常を示す酵母では、前記酵素遺伝子の CTGコドンを TTA, TTG, CTT, C T Cまたは C T Aに改変した遺伝子を利用しても良い。さらに、アミノ酸配列を変更することなく当該酵母において使用頻度の高い遺伝暗号に改変した遺伝子を利用しても良い。例えば、キャンデイダ 'マルトーサを宿主とした場合、本ポリエステル合成に関与する遺伝子として配列番号 3、配列番号 4に示される遺伝子を利用することができる。上記遺伝子の塩基配列は、本ポリエステルの合成に関与する酵素を生産するものであれば、当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていてもよい。また、上記 PHA合成酵素によって合成されるポリエステルは、上記一般式（ 1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるものであり、下記一般式（4) に示される。より好ましい態様においては、上記式（2) で示される 3—ヒドロキシ酪酸と上記式（3) で示される 3—ヒドロキシへキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステル P (3HB- c 0 - 3HH) であり、下記一般式（5) に示される。

R

H- 0— CH一 C一 C- -OH (4)

¾ 0

m

Rはアルキル基

mは 2以上の整数

m、 nは 1以上の整数

( 3 ) 遺伝子発現力セットの構築

酵母における遺伝子発現のためには、当該遺伝子の 5' 上流にプロモーター、 UAS等の DNA配列の連結、当該遺伝子の 3' 下流にポリ A付加シグナル、ターミネーター等の DN A配列の連結が必要である。これらの DN A配列は酵母で機能する配列であればどのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターも用いてもよい。

また、本発明の形質転換体においては、上記プロモーター、ターミネータ一は、ポリエステルの生産に使用する生物において機能するものであるものが好ましい。

以下、本発明の形質転換体に用いられる遺伝子発現カセット構築の例として、 · (a) 宿主としてャロウィァ · リポリティ力を使用する場合、（b) 宿主としてキャンディダ ·マルトーサを使用する場合について具体的に説明する。

(a) 宿主としてャロウィァ · リポリティ力を使用する場合宿主としてャロウィァ · リボリティカを使用する場合は、使用するプロモータ一、ターミネータ一は、ャロウィァ ■ リボリティカ由来であることが好ましい。より好ましくは、ャロウィァ ' リポリティ力 ALK3由来のプロモーター、ャロウイァ ■ リポリティ力 XRP 2由来のターミネータ一であることが好ましい。なお、上記プロモーター及び又はターミネータ一の DNA配列は、ャロウィァ · リボリティカで機能する配列であれば、 1つ若しくは複個の塩基が欠失、置換及び/又は、付加された D N A配列であってもよい。

構築に用いられるベクターは、大腸菌において自立増殖するプラスミドであればどのようなベクターでもよく、更に酵母において自.立増殖可能な領域を合わせ持っていてもよい。酵母において自立増殖できるベクターでは、菌体内に保持'される。また、遺伝子発現カセットを染色体上に組み込むこともできる。ャロウィァ ' リポリティ力'においては、自立増殖可能な p SAT4や p SUT 5を用いることができる（ 1 99 7年度東京大学大学院、博士論文「酵母 Y a r r ow i a l i p o l y t i c aの n—ァノレ力ン誘導型チトクローム P 450遺伝子群に関する研究」飯田敏也）。

上記酵母においては、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子がァエロモナス ·キヤビエ (Ae r omo n a s c a v i a e ) 由来の遺伝子であることが好ましく、例えば、 A. c a V i a e由来の P H A合成酵素遺伝子（以下 p h a Cと略す）（配列番号 1) 、または、 p h a Cおよび酸化経路の中間体のエノィル C o Aをモノマーである（R) — 3—ヒドロキシァシル C o Aに変換する（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子（以下 p h a jと略す）（T. F u k u i , e t 1 F EMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s , v o l . 1 70, 6 9— 75 ( 1 9 9 9) ) (配列番号 2 ) が好適に用いられる。 . これらの構造遺伝子のそれぞれ 5 ' 上流にャロウィァ . リポリティ力 A 1 k 3遺伝子のプロモーター ALK 3 p (配列番号 5) (G e nB a n k AB O 103 90) を連結することができる。 '

プロモーターと構造遺伝子とを連結するための制限酵素部位を作製するためには、 PCR法が利用できる。 P'CRに用いたプライマー配列を配列番号 8から配列番号 1 4に示す。 P CRの条件は目的遺伝子断片が増幅できればどのような条件を用いて-もよい。

プロモーター部分は配列番号 5を铸型にして配列番号 8と配列番号 9、配列番号 9と配列番号 1 0を用いて、それぞれ 5' 末端が Xb a I、 3 ' 末端が N d e lの ALK3 Xと 5 ' 末端が S a c I I、 3 ' 末端が N d e Iの A L K 3 Sを作製することができる。 p h a Cは配列番号 1を铸型にして配列番号 1 1 と配列番号 1 2とを用いて、 5 ' 末端が N d e I、 3 ' 末端が P s t Iである約 100 b pの断片を作製することができる。これに残りの P s t I— B a m H I約 1 70 0 b pを結合して、 5，末端が N d e l , 3 ' 末端が B a mH I である完全長の p h a Cを作製することができる。 p h a Jは配列番号 2を铸型にして配列番号 1 3と配歹 IJ番号 14とを用いて、 5' 末端が N d e l、 3 ' 末端が Kp η Iである p h a Jを作製することができる。ベクターにはプラスミド P SUT 5 (図 1、配列番号 1 9) と p SUT 5の Nd e lサイトを配列番号 20のリンカー DN Aを用いて、 Xb a Iサイトに変更したベクター; p S UT 6とを使用することができる。 p SUT 6のマルチクローニングサイトの S a c I I、 Kp n lサイトに ALK3 Sと p h a jとを結合し、プラスミド p SUT-p h a J (図 3) を構築することができる。次に p SUT 5のマルチタローニングサイトの Xb a I、 B amH Iサイトに ALK 3 Xと p h a C とを結合し、プラスミド p SUT— PHA Γ (図 4) を構築することができる。さらにプラスミド p SUT— p h. a j力ら S a c l I と Xb a l とを用いて、 ALK3 Sと p h a Jと下流にあるターミネータ一とを一緒に切り出し、ブラスミドp SUT— PHAlのS a _C I I、 Xb a lサイトに結合したプラスミド p SUT— PHA2 (図 5) の二種類の組換え用プラスミドを構築することができる。

以上の方法により、酵母ャロウィァ ' リボリティカにおいて上記一般式（1 ) で示される 3—ヒドロキシアル力ン酸を重合してなるポリエステルを製造するための遺伝子発現カセットを構築することができる。

(b) 宿主としてキャンディダ ·マルトーサを使用する場合宿主としてキャンディダ 'マルトーサを使用する場合は、使用するプロモータ一、ターミネータ一がキャンディダ ·マルトーサで機能するものであることが好ましく、キャンディダ■マルトーサ由来であることがより好ましい。さらに好ましくは、キャンディダ■マルトーサ ALK 1由来のプロモーター及びターミネ一ターを利用する。なお、上記プロモーター及び Z又はターミネータ一の DNA配列は、キャンディダ ·マルトーサで機能する配列であれば、 1つ若しくは複個の塩基が欠失、置換及び/又は、付加された DN A配列であってもよい。

構築に用いられるベクターとして、上記（a) で言及したものと同様のものが挙げられる。キャンディダ .マルトーサにおいては、自立増殖可能な p UTU l を用いることができる（M. O h k um a , e t a 1 J . B i o l . C h e m. ， v o l . 2 7 3, 3 9 48— 3 9 5 3 (1 9 9 8) ) 。

宿主としてキャンディダ ·マルトーサを使用する場合は、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子がァエロモナス ·キヤビエ由来の酵素と同じアミノ酸配列をコードする遺伝子であることが好ましく、例えば、ァエロモナス 'キヤビエの由来の PH A合成酵素アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を'キャンディダ ·マルトーサにおいてコードする遺伝子（以下 OR F 2と略す、配列番号 3) '、または、 OR F 2及び 3酸化経路の中間体のエノィル C o Aをモノマーである（R) - 3 —ヒドロキシァシル C o Aに変換する（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼと同じアミノ酸配列をキャンディダ .マルトーサにおいてコードする遺伝子（以下 OR F 3と略す、配列番号 4) が好適に用いられる。（T. F u k u i , e t · a 1 FEMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s , v o l . 1 70, '6 9 - 7 5 ( 1 9 9 9) )

これらの構造遺子のそれぞれ 5' 上流にキャンディダ■マルトーサの A 1 k 1遺伝子のプロモーター ALK 1 p (配列番号 6) 、 3' 下流にターミネータ一 AL K 1 t (配列番号 7) (G e n B a n k D 0 0 4 8 1) (M. T a k a g i , e t a l A g r i c . B i o l . C h em. , v o l . 5 , 2 2 1 7 一 2 2 2 6 (1 9 8 9) ) を連結することができる。 _ ' プロモーターおよびターミネータと構造遺伝子を連結するための制限酵素部位を作成するためには、 P CR法が利用できる。 P CRに用いるプライマー配列は配列番号 1 5から配列番号 1 8に示す。 PCRの条件は（a) で上述した条件を用いることができる。

プロモーター部分は配列番号 6を铸型にして配列番号 1 5と配列番号 1 6を用いて、 5' 末端が S a l I、 3 ' 末端が N d e Iの ALK 1 pを作製することができる。ターミネータ一部分は配列番号 7を铸型にして配列番号 1 7と配列番号 1 8を用いて、 5 ' 末端が H i n d I I I、 3 ' 末端が E c o RVの ALK 1 t . を作製することができる。ベクターには！） UTU 1とキャンディダ 'マルトーサの A d e 1遺伝子（配列番号 2 1、 G e n B a n k D 008 5 5) (S. K a w a i , e t a 1 , Ag r i c . B i o 丄 . C h e m. , v o l . o o , 5 9 - 6 5 ( 1 99 1 ) ) を用いて、マーカー遺伝子を U r a 3から Ad e 1に変更したベクター PUT A 1 (図 2) を使用することができる。 pUCNT (W 094/0 36 1 3に記載）の P v u I I、 Nd e Iサイトに ALK 1 を結合し、また p UCNTの H i n d I I I、 S s p Iサイトに A L Kl tを結合し.て p UAL 1 (図 6) を構築することができる。次に: UAL 1の N d e I、 P s t Iサイトに〇RF 2を結合し、プラスミド p UAL— OR F 2 (図 7) を構築することができる。また、 p UAL.1を構築する途中に構築する p UCNT—A LK l tの N d e l、 H i n d i I Iサイトに ORF 3を結合し、さらに ALK l pを結合することで、 pUAL—〇RF 3 (図 8) を構築することができる。つぎに、プラスミド： UAL— O R F 2から E c o T 22 Iを用いて、〇RF 2とともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 p UTA 1の P s t Iサイトに結合し、 pUTA— ORF 2を構築することができる。

さらに、 pUAL— ORF 3から S a 1 Iを用いて OR F 3とともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 pUTA— OR F 2の S a 1 Iサイトに結合したプラスミド pUTA— ORF 2 3. (図 9 ) を構琴することができる。

以上の方法により、酵母キャンディダ 'マルトーサにおいて上記一般式（1) で示されるアル力ン酸を共重合してなるポリエステルを製造するための遺伝子発現カセットを構築するこ'とができる。 (4) 形質転換体の作製

酵母にポリマー合成に関与する遺伝子発現カセット組換えベクターを導入するためには、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（L e d e r b e r g . E. M. e t a 1 . , J . B a c t e r i o l . 1 1 9. 1 0 7 2 ( 1 9 7 4) ) やエレクト口ポレーション法（C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo r e c u l a r B i o l o g y、 1 、 1. 8. 4 頁、 1 9 9 4年）等を用いることができる。また、 F a s t T r a c k™-Y e a s t T r a n s f o r m a t i o n K i t _SM (G e n o T e c h n o 1 o ,g y) のような市販の形質転換キットを利用することもできる。

例えば、宿主として、ャロウィァ ■ リポリティ力 CXAU 1株（T. l i d a , e t a 1 Y e a s t , 1 4, 1 3 8 7— 1 3 9 7 ( 1 9 9 8) ) を用いることができる。本菌株に上記の形質転換法を用いてポリマー合'成に関与する遺伝子発現カセットを形質転換し、 p SUT—PHA 1を有するャロウィァ ' リポリティ力 PHA 1株と、； SUT— PHA 2を有するャロウィァ ' リポリティカ P.H A 2株を作製することができる。

また宿主として、キャンディダ ·マルトーサ CHA 1株（S. K a w a i , e t a 1 , A g r i c . B i o l . C h e m. , v o l . 5 5 , 5 9— 6 5 ( 1 9 9 1)-) を用いることもできる。本菌株に上記の形質転換法を用いてポリマー合成に関与する遺伝子発現カセットを形質転換し、 ρ ΐίΤΑ— ORF 2 3を有するキャンディダ■マルトーサ CHA 1株を作製することができる。

(5) ポリエステルの製造 .

本発明のポリエステルの製造方法では、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取する。

本発明の形質転換体を培養することによるポリエステルの製造は、次のようにして行うことができる。培養に用いる炭素源としては、酵母が資化できるものであればどのようなものでもよい。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。誘導物質が主要炭素源である場合もある。炭素源以外の栄養源としては窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地が使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であればよいが、 2 0 °Cから 4 0 °Cが好ましい。培養時間には特に制限はないが、 1〜 7日程度で良い。その後、得られた該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収すればよい。炭素源としてはグルコース、グリセリン、シユークロース等の炭水化物や油脂類や脂肪酸類さらに.は n—パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えばナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などが挙げられる。脂肪酸としてはへキサン酸、ォク.タン酸、デカン酸、ラウリン酸、ォレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和■不飽和脂肪酸、. あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩など脂肪酸誘導体が挙げられる。例えば、キャデイダ ' マルトーサの培養及びャロウィァ ' リボリティカの培養において、炭素源として油脂を用いて培養することもできる。また、油脂を資化ができないかまたは効率よく資化できない酵母では、培地中にリパーゼを添加することによって改善することもできる。さらに、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。 '

また、炭素源として奇数の炭素鎖を有する脂肪酸や n—パラフィン等を用い.た場合、上記一般式（1 ) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルの炭素鎖に奇数成分の割合を高めることができる。

'窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二力リゥム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリゥムなどが挙げられる。

その他の有機栄養源としてはアミノ酸類、例えばグリシン、ァラニン、セリン、スレオニン、プロリンなどや、ビタミン類、例えばビタミン B l、ビタミン B 12、ビォチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミン C等が挙げられる。本発明において、ポリエステルの菌体からの回収は例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液を遠心分離器などで菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体をクロ口ホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液を濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやへキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。.沈殿したポリエステルを濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行う。

本発明のポリエステルの製造方法は、上述のような構成からなるので、上記一般式（1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルを生産性良く製造することができる。 .

また、上述したプラスミド p SUT— PHA 1、 p SUT— PHA2を有するャロウィァ · リポリティ力組み換え株、プラスミド pUTA— ORF 23を有するキャンディダ ·マルトーサ組み換え株等を作製し、培養する方法により、上記 —般式（2) で示される 3—ヒドロキシ酪酸と上記一般式（3) で示される 3— ヒドロキシへキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステル P (3HB- c o 一 3HH) を製造することができる。実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。

(実施例 1) ポリエステル合成に関与する遺伝子

(a) 宿主としてロウィァ . リボリティカを使用した場合

ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、了エロモナス ·キヤビエの由来の PHA合成酵素遺伝子（ }1 & 0 ;配列番号1) と、 iS酸化経路の中間体のエノィル C o Aをモノマーである（R) — 3—ヒドロキシァシル C 0 Aに変換する（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子（p h a J ；配列番号 2 ) (T. F u k u i , e t a 1 F EMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s , v o l . 1 7 0, 6 9— 7 5 (1 9 9 9) ) を使用した。

(b) キャンディダ 'マルトーサを宿主として使用した場合

ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、ァエロモナス · キヤビエの由来の P HA合成酵素と、 j3酸化経路の中間体のエノィル C o Aをモノマーである (R) 一 3—ヒドロキシァシル C o Aに変換する（R) 体特異的エノィル C o A ヒドラターゼ（T. F u k u i , . e t a 1 · F EMS M i c r o b i o 1 o g y L e t t e r s , v o l . 1 70, 6 9— 7 5 (1 9 9 9) ) のァミノ酸配列をもとに、当該酵素遺伝子を合成した。

キャンディダ ·マルトーサは CTGコドンをロイシンではなくセリンに翻訳する酵母である。このため、キャンディダ ·マ ·；レトーサにおいて使用するにあたり、ロイシンコドンには CTGを割り当てなかった。各アミノ酸に対 jfeするコドンはキャンディダ ·マルトーサにおいて使用頻度の高いコドンを優先的に選択した。コドンの使用頻度は K 1 a u s Wo l f 著の N o n c o n v e n t i o n a 1 Y e a s t i n B i o t e c h n o l o g y (S p r i n g e r出 /iR ) を参考にした。具体的には、メチォニン、トリプトファンは、それぞれを AT G、 TGGを割り当てた。フエ二ルァラニンでは、 TTTと TTCを交互に割り当！：た。ロイシンでは、ァエロモナス · キヤビエ DNA配列における CTCを T TA、 CTGを TTGにそれぞれ変換し、 T T Aと T T Gはそのまま用いた。ィソロイシンでは、ァエロモナス ■キヤビエ DNA配列における ATCを ATT、 ATAを ATCにそれぞれ変換し、 ATTはそのまま用いた。バリンでは、ァェ' ロモナス · キヤビエ DNA配列における GTGを GTT、 GTAを GTTにそれぞれ変換し、 GTCと GTTはそのまま用いた。セリンでは、ァエロモナス ' キャビエ DNA配列における AG Cを T C T、 TCAを TCT、 TCGを TCT それぞれ変換し、 TCCと TCTはそのまま用いた。プロリンでは、対応するコドンを全て C CAに変換した。スレオニンでは、ァエロモナス ' キヤビエ DNA 配列における AC Cを AC T、 ACGを AC C、 A C Aを A C Cにそれぞれ変換し、 ATCはそのまま用いた。ァラニンでは、ァエロモナス ■ キヤビエ DNA配列における GCCを GCT、。00を〇〇、 G C Aを G C Tにそれぞれ変換し、 GCTはそのまま用いた。チロシンでは、ァエロモナス 'キヤビエ DNA配列におけるチロシンコドンに対して、 TAT、 TACを交互に割り当てた。終始コドンは、 TAAを用いた。ヒスチジンでは、ァエロモナス 'キヤビエ DNA配列におけるヒスチジンコドンに対して、 CAT、 C ACを交互に割り当てた。ダルタミンでは、対応するコドンを全て C A Aに変換した。ァスパラギンでは、対応するコドンに対して AATと AACを交互に割り当てた。リジンでは、対応するコドンを全て AAAに変換した。ァスパラギン酸では、対応するコドンをすベて G ATに変換した。グルタミン酸では、対応するコドンを全て GAAに変換した。システィンでは、対応するコドンを全て TGTに変換した。アルギニンでは、 . 対応するコドンを全て AGAに変換した。グリシンでは、対応するコドンを全て GGTに変換した。さらにァエロモナス ·キヤビエの由来の PHA合成酵素 DN ' A配列において、 2箇所の Kp n I部位を作成するために、 96 9番目の Tを C ；、 1449番目の Tを Cに変換した。これらの置換によって当該遺伝子のァミノ酸配列構造は変更されない。

このようにして PHA合成酵素遺伝子（ORF 2 ；配列番号 3) と（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子（ORF 3 ；配列番号 4) を設計し、これらの配列を元に ORF 2と〇RF 3を全合成した。 (実施例 2) 組換えプラスミドおよび組換え株の構築

(a) 宿主としてャロウィァ · リボリティカを使用した場合

上記遺伝子がャロウィァ ' リ.ポリティ力で発現するように、それぞれの 5 ' 上流にャロウイァ ' リポリティ力の A 1 k 3遺伝子のプロモーター A L K 3 ρ (配列番号 5) (G e n B a n k ' AB 0 103 90) を連結することにした。プロモーターと構造遺伝子とを連結するための制限酵素部位を作製するためには、 PCR法を利用した。 PCRに用いたプライマー配列を配列番号 8から配列番号 14に示す。〇1 の条件は94°〇 1分、 5 5°C 2分、 72°C 3 分を 1サイクルとし、これを 25回繰り返して、目的遺伝子断片を増幅した。ポリメラーゼは宝酒造（株）の E xT a qを使用した。プロモーター部分は配列番号 5を铸型にして配列番号 8と配列番号 9、配列番号 9と配列番号 10を用いて、それぞれ 5 ' 末端が Xb a I、 3 ' 末端が Nd e Iの ALK3Xと 5 5 末端が S a c I I、 3 ' 末端が N d e Iの ALK 3 Sとを作製した。

p h a Cは配列番号 1を錄型にして配列番号 1 1と配列番号 1 2とを用いて、 5 ' 末端が N d e l , 3 ' 末端が P s t Iである約 1 00 b pの断片を作製した。これに残りの P s t I— B amH I断片約 1 700 b pを結合して、 '5 ' 末端が N d e l , 3 ' 末端が B a mH Iである完全長の p h a Cを作製した。 P a Jは配列番号 2を铸型にして配列番号 1 3と配列番号 14とを用いて、 5 ' 末端が N d e l , 3 ' 末端が Kp η Iである p h a Jを作製した。

ベクターにはプラスミド p SUT 5 (図 1、配列番号 1 9) と p SUT 5の N d e Iサイトを配列番号 20のリンカー DN Aを用いて、 X b a Iサイトに変更したベクター p SUT 6とを使用した。 p S U T 6のマルチクローニンク、' サイトの S a c I I、 Kp n Iサイトに ALK3 Sと p h a J j とを結合し、プラスミド p SUT— p h a j (図 3) を構築した。次に p SUT 5のマルチクローニングサイトの X b a I、 B amH Iサイトに ALK3 Xと p h a Cとを結合し、プラスミド p SUT— P HA 1 (図 4) を構築することができる。さらにプラスミド p SUT— p h a J力ら S a c l I と Xb a l とを用いて、 ALK3 Sと p h a jと下流にあるターミネータ一とを一緒に切り出し、同 D N Aをプラスミド p SUT-PHA 1の S a c I I、 Xb a lサイトに揷入することによりプラスミド p SUT— PHA 2 (図 5) を構築した。すなわち、このようにして二種類の組換え用プラスミド p SUT— PHA 1と p SUT— P HA 2を構築した。以上の方法により、酵母ャロウィァ ' リボリティカにおいて上記一般式（1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルを製造するための遺伝子発現カセットを構築した。全体,の構築図を図; I 0に示した。

宿主にはャ όウイァ . リボリティカ CXAU1株（T. I i d a , e t a 1 Y e a s t , 14, 1 387— 1 3 9 7 (1 9 98) ) を使用した。宿主に構築したプラスミドを導入するために、 F a s t T r a c k ^ - Y e a s t t r a n s fo rma t i o n K i t _{sl I} (Ge n o T e c h n o 1 o g y) を使用した。プロトコルにしたがって操作し、選択プレート（0. 6 ί w/ v% Y e a s t N i t r o g e n b a s e w i t h o u t am i n o a c i d, 2 w/v%グルコース、 24 m g Z Lアデニン塩酸塩、 2 v//v%寒天）を使用して組換え株を取得した。 (b) キャンディダ ·マルトーサを宿主として使用した場合

上記 OR F 2、 OR F 3がキャンディダ 'マルトーサで発現するように、それぞれの 5 ' 上流にキャンディダ 'マルトーサの A 1 k 1遺伝子のプロモーター ALKl p (配列番号 6、 G e nB a n k D 0048 1 ) を、 3' 下流にキヤンデイダ 'マルトーサの A 1 k 1遺伝子のターミネータ一 ALK 1 t (配列番号 7) を連結することにした。プロモータ一およびターミネータ一と構造遺伝子を違結するための制限酵素部位を作成するためには、 PCR法を利用した。 PCR に用いたプライマー配列を配列番号 1 5から配列番号 18に示す。 PCRの条件は 94°C 1分、 5 5°C 2分、 7 2°C 3分を 1サイクルとし、これを 25回繰り返して、目的遺伝子断片を増>畐した。ポリメラーゼは宝酒造（株）の E xT a qを使用した。プロモーター部分は配列番号 6を鐯型にして配列番号 1 5と配列番号 1 6を用いて、 5 ' 末端が S a 1 I、 3 ' 末端が N d e Iの ALK 1 pを作製した。ターミネータ一部分は配列番号 7を铸型にして配列番号 1 7と配列番号 1 8を用いて、 5 ' 末端が H i n d I I I、 3 ' 末端が E c o R Vの ALK 1 t を作製した。最終的に ORF 2と〇RF 3を連結するベクターには pUC 1 9にキャンディダ 'マルトーサの自己複製領域（AR S) (G e n B a n k D 2 97 5 8) およぴ U R A 3遺伝子（G e n B a n k D 1 2 7 20) を連結した pUTU (M. O h k urn a , e t a 1 , J . B i o l . C h e m. , v o 1. 2 7 3, 3 948- 3 9 5 3 ( 1 9 9 8) ) とキャンディダ 'マルトーサの ADE 1遺伝子（配列番号 21、 G e n e b a n k D 00 8 5 5) を用いて、マーカー遺伝子を U r a 3から A d e 1に変更したベクターである p U T A 1 (図 2) を使用した。 pUTAlは、 p UTU 1から Xh o Iを用いて URA 3 遺伝子を除去し、これに S a 1 Iを用いて切り出した ADE 1遺伝子断片を接続し構築した。

p UCNT (WO 94/0 36 1 3に記載）の P v u I I、 Nd e Iサイトに ALK l pを結合し、また: pUCNTの H i n d I I I、 S s p Iサイ卜に AL K 1 tを結合して p UAL 1 (図 6) を構築した。次に pUAL 1の N d e I、 P s t Iサイトに ORF 2を結合し、プラスミド pUAL— ORF 2 (図 7) を構築した。また、 pUAL 1を構築する途中に構築する pUCNT— ALK1 t の Nd e l、 H i n d i I Iサイトに ORF 3を結合し、さらに ALK 1 Pを結合することで、. UAL-ORF 3 (図 8)'を構築した。

つぎに、プラスミド pUAL— ORF 2から E c o T 22 Iを用いて、 ORF 2とともに上流にあるプロモーター、下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 p UTA 1の P s t Iサイトに結合し、 pUTA— ORF 2を構築した。さらに、 pUAL— ORF 3から S a 1 Iを用いて〇 R F 3とともに上流にあるプ口モーター、下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 pUTA— ORF 2 の S a 1 Iサイ.トに結合したプラスミド p UTA— ORF 2 3 (図 9) を構築した。以上の方法により、酵母キャンディダ 'マル.トーサにおいて上記一般式（1 ) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルを製造するための遺伝子発現カセットを構築した。全体の構築図を図 1 1に示した。

宿主にはキャンディダ .マルトーサ CHA 1株（S . K a w a i , e t a 1 , A g r i c. B i o l . C h e m. ， v o l . 55, 5 9— 6 5 ( 1 9 9 1) ) を使用した。宿主に構築したプラスミドを導入するために、 F a s t T r a c k™— Y e a s t T r a n s f o rma t i o n K i t _SM (G e n o T e c h n o l o g y) を使用した。プロトコルにしたがって操作し、選択プレート (0. り 7w/v%Ye a s t N i t r o g e n b a s e w i t h o u t am i n o a c i d 2 w/ v %グノレコース、 S Amg/L ヒスチジン、 2w/v%寒天）を使用して組換え株を取得した。

(実施例 3) ャロウィァ · リポリティ力組換え株を用いた P (3HB— c o— 3 HH) の生産

プラスミド p SUT 5、 p SUT— PHA1、 p S U T— P H A 2を有するャロウィァ ' リボリティカ組換え株を次のように培養した。前培地は YPD培地（l wZv% Y e a s t— e x t r a c t、 2 /v%B a c t o-P e p t o n, 2 w/v°/。グルコース）を使用した。ポリエステル生産培地には 1/ 4 Y P培地（0. 2 5 wZv%Y e a s t— e x t r a c t、 0. 5 w/ v % B a c t o-P e p t o n) とミネラル培地（0. 7 w/V%KH ₂ P0₄、 1 , 3 w/ v % (NH₄) ₂ HP〇 ₄、 0. 5 w/v% プロエキス AP— 1 2 (播州調味料）、 0. 04w/v。/。アデニン、 1 p pmチアミン塩酸塩、 1 v/v %微量金属塩溶液（ 0. 1 N塩酸に 8wZv%Mg S0₄ · 7H ₂0、 0. 6w/v%Z n S0₄ ' 7H₂0、 0. 9w/v%F e S0₄ - 7H ₂0 0. 05 w/v%C u S0₄ ' 5H₂0、 0. 1 w/ v%Mn S0₄ . 6— 7 H₂〇、 1 w/v%Na C 1 ) ) にパーム油を 2 w/v ⁰/。を添加したものを使用した。

各組換え株のグリセローストツク 100/ lを 100m lの前培地が入つた 50 Om 1坂口フラスコに接種して 20時間培養し、 50 OmLの生産培地を入れた 2 L坂口フラスコに 1 v/v%接種した。これを培養温度 30 °C、振；盪速度 120 r pm、培養時間は、 YPD培地で 24時間、ミネラル培地で 7 2啤.間という条件で培養した。培養液をォートクレーブ後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥して乾燥菌体重量を測定した。

得られた乾燥菌体を粉砕し、クロロホルムを 100ml添加し一晚攪拌して抽出した。濾過して菌体を除去し、ろ液をエバポレーターで 1一 2m 1にまで濃縮し、濃縮液に 10m lのへキサンを添加して、 .へキサン不溶物を析出させた。

得られたへキサン不溶物約.2 m gに 500 1の硫酸一メタノール混液（1 5 : 85) と 500 1のクロ口ホルムとを添加して密栓し、 100°Cで 14 0分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに 0. 3 gの炭酸水素ナトリウムを添加し、中和した。これに lm lのジイソプロピルエーテルを添加して攪拌機を用いて撹拌した。遠心分離して有機 ' 溶媒層を取り出し、その組成をキヤビラリ一ガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所 GC— 17 A、キヤビラリ一力ラムは G Lサイエンス社製 NEUTRA BOND- 1 (カラム長 25 m、カラム内径 0. 25mm、液膜厚 0. 4 μπι) を用いた。温度条件は、初発温度 10 0°Cから 8°Cノ分の速度で昇温した。得られた分析結果を表 1に、またその時のサンプル（3) のチャートを図 12に示す。また、得られたへキサン不溶物の NMR分析（J EOL、 J NM-EX 400) 、 I R分析（島津製作所、 D R- 800) も行った。その一例としてサンプル（6) の結果を図 1 3、図 1 4に示す。

表"！培養および分析結果

この結果から、酵母ャロウィァ . リボリティカを用いて共重合ポリエステル P (3HB— c o - 3 HH) が生産できることがわかった。

また、酵母にもごく僅かながらポリマーが存在することがわかった。

(実施例 4) キャンディダ .マルトーサ組換え株を用いた P (3HB— c o— 3 HH) の生産

プラスミド pUTA l , p UTA— OR F 23を有するキャンディダ ·マルト . ーサ組換え株を次のように培養した。前培地は YNB培地（0. 67w/v%Y e a s t N i t r o g e n b a s e w i t n o u t am i n o a c i a に.1 w/v%カザミノ酸、 2 w/v%パーム油添加した培地を使用した。ポリエステル生産培地は YNB培地に 1 w/v%カザミノ酸を添加し、炭素源として① 2w/v%パーム油、 ② 2w/v%ヤシ油、 ③ 2 / ％テトラデカン、 ④ 2w /v%へキサデカンを添加した培地を使用した。 .

各組換え株のグリセ口一ルストツク Ι Ο Ο μ Ι を 50m lの前培地が入った 5 00m 1坂口フラスコに接種して 20時間培養し、 50 OmLの生産培地を入れ ■ た 2 L坂口フラスコに 1 0 v/v%接種した。これを培養温度 30° 振盪速度 1 20 r p m、培養時間は 72時間という条件で培養した。培養液をォートクレーブ後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥して乾燥菌体重量を測定した。

得られた乾燥菌体を粉砕し、クロ口ホルムを 1 00 m 1添加し一晩攪拌して抽出した。濾過して菌体を除去し、ろ液をエバポレーターで 1— 2m 1にまで濃縮し、濃縮液に 1 Om 1のへキサンを添加して、へキサン不溶物を析出させた。その結果、プラスミド p UTA— ORF 2 3を導入した組換え株をヤシ油、テトラデカン、へキサデカンで培養したものに白色沈殿が見られた（表 2) 。ャシ油で培養したときに得られたへキサン不溶物の NMR分析（J EOL、 JNM 一 EX 400) の結果を表 2、図 1 5に示す。

" s gmMボリマーの磐賴

バーム油 12.5

ヤシ油 10.3 + +

テトラテカン 4,4

へキサデカン 3,6 + この結果から、酵母キャンディダ ·マルトーサを用いて共重合ポリエステル P (3 HB- c o - 3 HH) が生産できることがわかった。産業上の利用可能性

本発明により、生分解性かつ優れた物性を有する上記一般式（1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母を用いて生産することが可能となった。

Claims

請求の範囲

1. 酵母に、ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子からなる遺伝子発現力セットが一種類以上導入されてなることを特徴とする形質転換体。

2. ポリエステルは、下記一般式（1) で示される 3—ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合体である請求項 1記載の形質転換体。

式中、 Rは、. アルキル基を表す。

3. . ポリエステルは、下記式（2) で示される 3—ヒドロキシ酪酸と下記式（ 3) で示される 3—ヒドロキシへキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステル P (3HB- c o - 3 HH) である請求項 1または 2記載の形質転換体。

4. 酵母がァシクロコニディウム属、アンブロシォザイマ属，ァルスロァスカス属，アルキシォザイマ属，ァシュビア属，バブジエビア属，ベンシングトニア属，ボトリオァスカス属，ボトリオザイマ属，プレツタノマイセス属，ビユレラ属，ビユレロマイセス属，キャンディダ属、シテロマイセ属，クラビスボラ属，クリプトコッカス属，シストフイロバシディウム属，デバリオマイセス属，デッカラ属，ディボダスコプシス属，ディボダスカス属，ェニエラ属，ェンドマイコプセラ属，エレマスカス属，ェレモセシウム属，エリスロバシディウム属，フエロマイセス属，フイロバシディウム属，ガラクトマイセス属，ゲォトリクム属，ガイラーモンデラ属，ハンセニァスポラ属，ハンセヌラ属，ハセガワェァ属，ホルターマンニァ属，ホルモアスカス属，ハイフォピキア属，ィサットヘンキア属，クロエケラ厲，クロエケラスポラ属，クノレイべロマイセス属，コンドア属，クライシァ属，クルツマノマイセス属，ロイコスポリディウム属，リポマイセス属，ロデロマイセス属，マラセジァ属，メトシュニコウイァ属，ムラキァ属，マイクソザイマ属，ナドソユア属，ナカザヮエア属，ネマトスポラ属，ォガタエァ属，オースポリディウム属，パチソレン属，ファチコスボラ属，ファフィァ属，ピキア属，ロドスポリディウム属，ロドトルラ属，サッカロマイセス属, サッカロマイコーデス属，サッカロマイコプシス属，サイトエラ属，サカグチァ属，サターノスポラ属，シゾブラストスポリオン属，シゾサッカロマイセス属, シュヮニォマイセス属，スポリディオボラス属，スポロボロマイセス属，スポロパキデミァ属，ステファノァスカス属，ステリグマトマイセス属，ステリグマトスポリディウム属，シンビォタフリナ属，シンポディォマイセス属，シンポディォマイコプシス属，トルラスボラ属，トリコスポリエラ属，トリコスポロン属，トリゴノプシス属，ツチヤエァ属，ゥデュオマイセス属，ワルトマイセス属，ウイカーハミァ属，ウイカーハミエラ属，ウイリオプシス属，ヤマダザイマ属，ャロウィァ属，ザィゴァスカス属，ザィゴサッカロマイセス属，ザィゴウイリオプシス属又はザィゴザィマ属である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の形質転換体。

5 . 酵母がャロウィァ■ リボリティカである請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の形質転換体。

6 . 酵母がキャンディダ ·マルトーサである請求項 1〜 4記載のいずれか 1項に記載の形質転換体。

7 . ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子発現カセットが、酵母で機能するプロモーター、ターミネータ一からなる請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の形質転換体。

8. プロモーター、ターミネータ一がャロウィァ ' リボリティカ由来である請求項 7項に記載の形質転換体。

9. プロモーターがャロウィァ■ リポリティカの A LK 3甶来である請求項 7 又は 8に記載の形質転換体。

1 0. ターミネータ一がャロウィァ ' リポリティ力の XPR 2由来である請求項 7又は 8に記載の形質転換体。

1 1. プロモーター、ターミネータ一がキャンディダ.マルトーサ由来である請求項 7項に記載の形質転換体。

1 2. プロモーターがキャンディダ■マルトーサの ALK 1由来である請求項 7又は 1 1に記載の形質転換体。

1 3. ターミネータ一がキャンディダ■マルトーサの ALK 1由来である請求項 7又は 1 1に記載の形質転換体。

14. ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子が、ァエロモナス ' キヤビェ（A e r omo n a s c a v i a e) 由来の遺伝子である請求項 1〜 1 3 のいずれか 1項に記載の形質転換体。

1 5. ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子がァエロモナス ■ キヤビエ由来の PHA合成酵素遺伝子、または、 PHA合成酵素遺伝子および（R.) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子である請求項 1〜1 3に記載の形質転換体

1 6. 前記 P HA合成酵素遺伝子は配列番号 3に示す塩基配列からなり、 (R ) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子は配列番号 4に示す塩基配列からなる請求項 1 5に記載の形質転換体。

1 7. 請求項 1〜1 6記載のいずれか 1項に記載の形質転換体を用いるポリエステルの製造方法であって、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法。

1 8. 遺伝暗号 CTGの少なくとも 1つが、 TTA、 TTG、 CTT、 CTC、又は CT Aに変換されていることを特徴とするポリエステルの合成に関与する酵素： iais子。.

1 9. 細菌由来の酵素をコードする請求項 18記載のポリ主ステルの合成に関与する酵素遺伝子。

20. 前記細菌がァエロモナス ' キヤビエ（A e r om o n a s c a v i a e) である請求項 1 9記載のポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子。

2 1. ァエロモナス ■ キヤビヱ由来の酵素遺伝子が PH A合成酵素遺伝子又は (R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子である請求項 20に記載のポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子。 ' -

22. 前記 PHA合成酵素遺伝子が配列番号 3に示す塩基配列からなる請求項 2 1に記載のポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子。

2 3. 前記（R) 体特異的エノィル C o Aヒドラターゼ遺伝子が配列番号 4に示す塩基配列からなる請求項 2 1に記載のポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子。