WO1996002576A1 - Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine - Google Patents

Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine Download PDF

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WO1996002576A1
WO1996002576A1 PCT/JP1995/001396 JP9501396W WO9602576A1 WO 1996002576 A1 WO1996002576 A1 WO 1996002576A1 JP 9501396 W JP9501396 W JP 9501396W WO 9602576 A1 WO9602576 A1 WO 9602576A1
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human
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antibody
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PCT/JP1995/001396
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Kouji Matsushima
Yoshihiro Matsumoto
Yoshiki Yamada
Koh Sato
Masayuki Tsuchiya
Tatsumi Yamazaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a complementarity determining region (CDR) and a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody against human interleukin-18 (IL-8), and human / mouse against human IL-18.
  • CDR complementarity determining region
  • V region variable region
  • the skimmer antibody, the human light chain (L chain) variable region and the human heavy chain (HID variable region complementarity determining region (CDR)) are replaced by the mouse monoclonal antibody to human IL-18 CDR.
  • the present invention further provides a DNA encoding the above antibody or a part thereof
  • the present invention further provides a vector comprising the DNA.
  • the present invention relates to an expression vector, and a host transformed with the vector.
  • the present invention further provides a method for producing a chimeric antibody against human IL-18, and a reconstituted human against IL-18. Antibody And a method of manufacturing the same.
  • Interlokin-1 8 is found in culture supernatants of monocytes stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and is derived from monocyte-derivedneutrophilchemotactic factor (MDNCF) or neutrophi-1 activating protein-1 (NAP-). 1) It is a migratory sitekine (chemokine), which was called etc. IL-18 is produced by various cells and acts on polymorphonuclear leukocytes and lymphocytes to chemotaxis along their concentration gradient. It has nature. It not only induces neutrophils to migrate, but also has the effect of activating neutrophil functions such as degranulation, release of active oxygen, and enhanced adhesion to endothelial cells. ing.
  • LPS lipopolysaccharide
  • MDNCF monocyte-derivedneutrophilchemotactic factor
  • NAP- neutrophi-1 activating protein-1
  • Inflammatory diseases more specifically respiratory diseases such as pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, adult respiratory distress syndrome, sarcoidosis, pleuritic pleurisy, and skin diseases such as psoriasis), and In diseases such as chronic rheumatic rheumatitis, Crohn's disease, and ulcerative colitis, leukocyte infiltration is pathologically recognized at the lesion site.
  • IL-18 was detected in test substances derived from patients with these diseases, and is considered to play a central role in inflammation.
  • anti-human IL-18 antibodies other than WS-4 A. 5.1.2.14 (Bol an, A. M. et al., J. Clin. Invest., 89, 1 2 5 7-1 2 6 7, 1 9 9 2), anti-P ep-1 antibody or anti-P ep — 3 antibody or D MZ disclosed in international patent application W 0 9-0 4 3 7 2 C7 (ulligan, S. et al., J. Immun 01. 150.55, 855-55, 595, 1993) and the like are known.
  • pulmonary ischemia / reperfusion injury (Sekido, N. et al., Nature, 365, 65) was achieved by administering mouse monoclonal antibody WS-4. 4-65 7, 1993), LPS-induced dermatitis (Harada, A. et al., Internal 1.Immunol., 5, 681-69 0, 1993), LPS or interlokine-1 (IL-1) -induced arthritis (Akahoshi, T. et al., Lymphokine and Cytokine
  • Rabbits also have a homologue of human IL-18 (homo 1 ogue), which is called Egret IL-8. It has been shown that the mouse monoclonal antibody WS-14 cross-reacts with Egret IL-8 and inhibits the binding of Eg IL-8 to Eg neutrophils (Harada, A. et al., I nternatl. I mmunol., O, 681-690, 1993), which suggests that the anti-human IL-18 antibody is useful as a therapeutic agent for the treatment of inflammatory diseases in humans. And suggests.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals other than humans are highly immunogenic (sometimes referred to as "antigenic") in humans and, for this reason, their medical characteristics in humans. Therapeutic value is limited. For example, even if a mouse antibody is administered to a human, the mouse antibody can be metabolized as a foreign substance. Therefore, the half-life of the mouse antibody in the human is relatively short, and the expected effect cannot be sufficiently exerted. In addition, human anti-mouse antibodies raised against the administered mouse antibodies will elicit inconvenient and dangerous immune responses to the patient, such as serum sickness or other allergic reactions. And for this reason, humans cannot receive frequent mouse antibodies.
  • Mouse antibodies can be humanized in two ways. A simpler method is to prepare chimeric antibodies in which the variable region (V region) is originally derived from a mouse monoclonal antibody and the constant region (C region) is derived from an appropriate human antibody. is there. Since the resulting chimeric antibody has the complete variable region of the original mouse antibody, it can be expected to bind to the antigen with the same specificity as the original mouse antibody.
  • V region variable region
  • C region constant region
  • chimeric antibodies have less immunogenicity than the original mouse antibodies because the ratio of protein sequences derived from animals other than the peptide is substantially reduced compared to the original mouse antibodies. Expected to be low. Chimeric anti-tumours bind better to antigens and are less immunogenic, but may still generate an immune response against the mouse variable region (LoBug1io, AF, et al. roc.N atl.A cad.S ci.USA, 86, 4 22 0-4 2 2 2, 1 9 8 9
  • the second G method to transform mouse antibodies into humans More complex ? However, it significantly reduces the potential immunogenicity of mouse antibodies.
  • a “reshaped” human variable region is prepared by transplanting only a competibility determining region (CDR) from a mouse antibody variable region into a human variable region.
  • CDR competibility determining region
  • the structure of the framework region (FR) supporting the CDR may be changed.
  • CDR portion derived from the protein sequence other than human in the finally reconstituted human antibody is CDR and only a part of FR.
  • CDR is composed of hypervariable protein sequences, which do not show species-specific sequences. For this reason, reshaped human antibodies carrying mouse CDR should no longer be more immunogenic than native human antibodies containing human CDR.
  • reconstituted human antibodies are expected to be useful for therapeutic purposes, but no reconstituted human antibodies against human IL-8 are known. Furthermore, there is no uniform method that can be universally applied to any antibody in a method for producing a reshaped human antibody. Therefore, in order to produce a reshaped human antibody exhibiting a sufficient binding activity or a neutralizing activity for a specific antigen, various measures are required (for example, Sat0, K. et al.). , 53, 851-85 6, 1993). Therefore, the present invention provides an antibody having low immunogenicity against human IL-18.
  • the present invention provides a reshaped human antibody against human IL-18.
  • the present invention also provides a human / mouse chimeric antibody useful in the process of producing the reshaped human antibody.
  • the present invention further provides fragments of the reconstituted human anti-cancer.
  • the present invention provides an expression system for producing chimeric antibodies, reshaped human antibodies, and fragments thereof.
  • the present invention further provides
  • the present invention provides
  • the present invention further provides
  • L ⁇ comprising the human L chain C region and the L protein V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-18;
  • H chain comprising the human H chain C region, and the H chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-18;
  • the present invention further provides
  • an L chain comprising a human L chain C region and an L chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-18;
  • a chimeric antibody against human IL-18 is provided.
  • the present invention further provides
  • the present invention further provides
  • an L protein comprising the human L chain C region, and the LIV region of mouse monoclonal antibody WS-4 against human IL-18;
  • mice L chain comprising the mouse L chain V region of mouse monoclonal antibody W S-4 against human L chain C region and mouse IL-8;
  • a chimeric antibody against human IL-18 is provided.
  • the present invention further provides
  • the present invention further provides
  • the present invention further provides
  • FR framework region of the human L chain V region
  • the present invention further provides
  • human L chain C region (2) an antibody against human IL-18 comprising: an L chain V region comprising an L chain CDR of a mouse monoclonal antibody against human L chain FR and human IL-8; Constituent human light chains; and
  • an H chain V region comprising the H chain CDR of a mouse monoclonal antibody against human H chain FR and human IL-18; and reconstitution of an antibody against human IL-18. Provides a human heavy chain.
  • the present invention further provides
  • H chain comprising a human H chain FR and a mouse monoclonal antibody H chain CDR against human IL-18;
  • the present invention further provides
  • mouse H monoclonal V domain against mouse IL-8 comprising a CDR of the H chain V domain of W S-4; and a reshaped human H domain of an antibody against human IL-8.
  • the present invention further provides
  • an H chain V region comprising an H chain CDR of a mouse monoclonal antibody WS— against human H chain FR and human IL-8; Provides antibody reconstitution human H ⁇ .
  • the present invention further provides
  • a reshaped human antibody against human IL-18 is provided.
  • Examples of the human LFR include those having the following amino acid sequence.
  • Examples of the human H chain FR include those having the following amino acid sequence.
  • FR1 Glu Va 1 G 1 n Leu Leu G 1 u Ser Gl G1 Gl Leu Val G in Pro G 1 y Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys A 1 a A 1 a Ser G 1 y Phe Thr Phe Ser
  • the present invention also covers DNA encoding the polypeptides or fragments thereof constituting the various antibodies.
  • the present invention also relates to a vector comprising the above DNA, for example, an expression vector.
  • the present invention further provides a host transformed with the above vector.
  • the present invention further provides methods for producing chimeric antibodies against human IL-8 and fragments thereof, and methods for producing reshaped human antibodies against human IL-18 and fragments thereof.
  • FIG. 1 shows a human 'erogenation' factor—la (HEF—1a) promoter / enhancer useful for expression of the L chain and H chain of the antibody of the present invention, respectively.
  • the expression vectors HEF-VL-gA: and HEF-VH-g-c1 are shown.
  • Figure 2 shows the results of ELISA for confirming the binding ability of the chimeric WS-4 antibody (chL / chH) of the present invention produced in the culture supernatant of COS cells to human IL-8. This is the graph shown.
  • FIG. 3 shows the first version of the H ⁇ V region of the reshaped human WS-4 antibody of the present invention, “a ⁇ RVH a) (A), and the reshaped human WS-4 antibody.
  • FIG. 4 shows the L chain V region (RVLa) and the H chain V region (RVH a) of the reconstituted human WS-4 antibody of the present invention, and the chimera WS-4 antibody H chain V region (chH), respectively.
  • chimera WS-4 antibody L-protein V region (chL) in COS cells and the ability to bind to human IL-18 and the amount of production were determined by using the chimera of the present invention produced in the culture supernatant of COS cells.
  • FIG. 5 shows eight reconstituted human WS—4 antibodies (RVLa, RVLa / RVHb, RVLa) comprising the RVLa of the present invention produced in the culture supernatant of COS cells. / RVHc, RVLa / RVHd, RVLa / RVHe, RVLa / RVHf, RVLa / RVHg, RVLa / RVHh) to human IL-18.
  • 4 is a graph showing the results of ELISA for comparison with the chimeric WS-4 antibody (chL / chH) of the present invention produced in the culture supernatant of Example 1.
  • FIG. 6 shows eight reconstituted human WS-4 antibodies (RVLb / RVHa, RVLb / RVHb, RVLb) comprising the RVLb of the present invention produced during the eradication of COS cells.
  • COS cells 4 is a graph showing the results of ELISA for comparison with the chimeric WS-4 antibody of the present invention (chLZchH) produced in the culture supernatant.
  • Figure 7 shows the purified reconstituted human WS-4 antibody of the present invention, RVLa ZR.
  • VH g average :: ' ⁇ RVL b ZRVH g O ⁇ .
  • FIG. 3 is a graph showing the results of ELISA for comparison with the purified Chimera WS-4 antibody of the present invention (chL / chH).
  • FIG. 3 is a graph showing the results of ligand-receptor single-binding inhibition assay for comparison with the chimeric WS-4 antibody of the present invention ((; 11 shi / (: 11-1)).
  • a mouse monoclonal antibody against human IL-18 was used as a source of the gene. It is necessary to produce hybridomas that produce chromosomes. After extracting mRNA from the hybridoma, it is converted to single-stranded cDNA by a known method, and the target DNA is amplified using the polymerase chain reaction (PCR). can get.
  • PCR polymerase chain reaction
  • An example of a source of this gene is the hybridoma WS-4, which produces a mouse monoclonal antibody against human IL-18, produced by Ko, ⁇ -C. Et al. The method for producing this hybridoma is described in J. Immunol.Mehods, 19,
  • the hybridoma cells are lysed by guanidinium thiosinate treatment and centrifuged by cesium chloride density gradient centrifugation.
  • C hirg In. J. M. et al., Biochemistr :, '. 1S, 529-529, 1979) can obtain total RNA.
  • RNase ribonuclease
  • the methods already used to clone other protein genes such as surfactants in the presence of ribonuclease (RNase) inhibitors such as vanadium complexes, have been used. It is also possible to use a method of carrying out processing and phenol processing (Berger, S.L., et al., Biochemistry, 18: 51-43-514, 1979).
  • oligo (dT) which is an oligonucleotide complementary to the P01yA chain located at the 3 'end of mRNA, was used as a primer, and The mRNA contained in the obtained total RNA can be treated with a reverse transcriptase to produce a single-stranded cDNA complementary to the mRNA (Larrick, JW). Et al., Bio ZTechnology. 7, 934-9338, 1989). At that time, a random primer may be used. When only mRNA is obtained, all RNA can be applied to an oligo dT cellulose column, and only mRNA having p01A $ 1 can be separated.
  • cDNA encoding the V region is specifically amplified using the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • SEQ ID NOS: 11 types of oligonucleotide primers shown in 1-11 M0useKapP a Variable (MKV) and SEQ ID NO: 12 were used as the 5′-end primer and 3′-end primer, respectively, for the Mouse Kappa Constant (MKC).
  • MKY 'image is hybridized with the DNA sequence encoding the C'-type L-chain leader sequence, and the MKY' image is hybridized with the DNA sequence.
  • the MKC primer hybridizes with the DNA system K that encodes the mouse force saliva-type L chain C region.
  • oligonucleotide primer shown in 5 is used as the 5 ′ unprimed primer and 3 ′ terminal primer, respectively.
  • the MHV primer hybridizes with a DNA sequence encoding a mouse H chain leader sequence
  • the MHC primer encodes a DNA encoding a mouse H chain C region. Hybridizes with the sequence.
  • all 5 'terminal primers (MKV and MHV) have a sequence CTCGAC which provides a restriction enzyme Sa1I cleavage site near the 5' end, and all 3 'terminal primers
  • the imers ( ⁇ 410 and ⁇ 1 ⁇ 1C) have a nucleotide sequence CCCGGG near the 5 'end that provides a restriction enzyme XmaI cleavage site. These restriction enzyme cleavage sites are used for subcloning DNA fragments encoding both V regions into respective cloning vectors. If these restriction sites are also present in the target DNA sequence encoding both V regions, other restrictions may be used so long as they are used to subclone the respective cloning vectors. It may be an enzyme cleavage site.
  • the PCR amplification product was converted to a low-melting-point agarose gel or a column [kit for PCR product purification ( QIAGEN ⁇ Separation and purification are performed using a CRP urification Spin Kit: QIAGEN) and a DNA purification kit (GENECLEAN II: BI0101).
  • the purified product is treated with the restriction enzymes SalI and Xma1 to obtain a DNA fragment encoding the desired V region of the mouse monoclonal antibody.
  • an appropriate clone vector such as plasmid pUC19 is cut with the same restriction enzymes Sa1I and XmaI, and the DNA fragment is ligated enzymatically to this pUC19.
  • a plasmid containing a DNA fragment encoding the target V region of the mouse monoclonal antibody is obtained.
  • Sequencing of the cloned DNA can be performed according to any conventional method, for example, by using an automatic DNA sequencer (Applied BiosystemsInc.). Example 1 and Example 2 specifically describe the objective DNA closing and sequencing thereof.
  • CDR Complementarity determination region
  • the present invention further provides a super V region or complementarity determining region (CDR) of the V region of a mouse monoclonal antibody to human IL-18.
  • CDR complementarity determining region
  • the V regions of both the L ⁇ and H chains of the antibody form the antigen binding site. This region on the L and H chains has a similar basic structure.
  • Both V regions constitute four framework regions of relatively conserved sequence, which are linked by three super-V regions or CDRs (Kabat, EA, et al. r S equencesof Proteinsof Immunological Interestj, USD ept.H ealthand Human S ervices 1 9 9 1) »
  • Most of the four framework regions (FR) have a / 9-sheet structure, and the three CDRs form a loop. Where CDR is In some cases, a P- -port structure-part may be formed.
  • the FRs keep the three CDRs very close sterically to each other, and together with the three CDRs in a pair, contribute to the formation of an antigen-binding site.
  • the present invention also provides these CDRs useful as materials for humanized antibodies, and DNAs encoding them. By comparing these CDR regions with the known amino acid sequences of the V region, Kabat, EA, et al., "Sequences of Proteinsois".
  • Immunu olog iCal l Inte r e s st can be determined, and this will be specifically described in the third embodiment.
  • chimeric antibodies Prior to designing the reshaped human V region of the antibody against human IL-18, it is necessary to ensure that the CDRs used actually form the antigen-binding region. For this purpose, chimeric antibodies were produced. In order to produce chimeric antibodies, it is necessary to construct DNA encoding L ⁇ and H ⁇ of chimeric antibodies. The basic method for constructing both DNAs is as follows. The DNA sequences of the mouse leader sequence and mouse V region sequence found in PCR-cloned cDNA are used in mammalian cell expression vectors. It is to ligate the human C region that already exists in the DNA sequence to the coding sequence.
  • the human antibody C region can be any human L chain C region and any human H chain C region.
  • human L chain C or for C and H chain For IgG, Cr 1, C ⁇ 2, Cr 3 or Cr 4 (Ellison, J. et al., DNA, 1, 1 1 1 1 1 (1 8 1), Takahashi, N. , C e H, 29, 67 1-67 9 (198 2), K rawinke 1, U. et al., EMBOJ. 1, 40 3 — 40 7 (198 2)) or Each of the other ISO types can be mentioned.
  • Two types of expression vectors are prepared for 'antibody production C', ie, under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system, a mouse L chain V region and a human L chain.
  • the mouse H protein V region and the human H chain under the control of an expression vector consisting of DNA encoding the L protein C region and an expression control region such as the enhancer / promoter system.
  • host cells such as mammalian cells are co-transformed with both of these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo to produce chimeric antibodies.
  • W 091 — 1 692 8 for example, W 091 — 1 692 8).
  • the DNA encoding the mouse L chain V region and human L chain C region and the DNA encoding the mouse H chain V region and human H chain C region are introduced into a single expression vector, Then, the vector can be used to transform a host cell, and the transformed cell can be cultured at an in-vivo or in-vivo to produce a chimeric antibody.
  • Mouse WS — 4 Clones cDNA encoding the ⁇ -type L chain leader region and V region, cloned using PCR, and has a human genomic DNA encoding the human L protein C region. Link to an expression vector. Similarly, cDNA coding for the H-leader region and V-region of the mouse WS-4 antibody is cloned by PCR using the PCR method, and expression is performed with genomic DNA coding for the human] region. Link to vector.
  • cDNAs encoding the V region of the mouse WS-4 antibody were introduced with appropriate nucleotide sequences at their 5 'and 3' ends ( 1) They must be expressed As is click data one easily inserts, and (2 ⁇ it we were in earthenware pots by function properly with said expression Beno 'in terpolymer (e.g., in the present invention and this for poison entering the K 0 zak sequence
  • Beno 'in terpolymer e.g., in the present invention and this for poison entering the K 0 zak sequence
  • the DNA encoding the V region of the mouse WS-4 antibody obtained by amplifying the primers by PCR using these primers was inserted into the desired DNA.
  • the chimera WS-4 antibody When the binding activity of the chimera WS-4 antibody thus prepared was tested, the chimera WS-4 antibody showed an activity of binding to human IL-8 (see Fig. 2). Therefore, it was shown that the correct mouse V region was cloned and the sequence was correctly determined.
  • the amino acid sequence of the FR of the mouse monoclonal antibody having the CDR to be transplanted must be prepared. It is desirable that there be high identity between the amino acid sequence of FR and that of the human monoclonal antibody to which the CDR is to be transplanted.
  • the L-chain V region of the mouse WS-4 antibody was compared to the known L-chain V region of a human antibody by comparison with the human antibody HAU (Watanabe, S. et al., Hoppe—Seel's Z. 365, 1291-129, 970), which is most similar to the L ⁇ V region, with 69.2% identity.
  • the H chain V region of the WS-4 antibody was compared with the known human antibody H chain V region in comparison with the human antibody VDH26 (Bu1 uwe 1a., L. et al., EMBOJ., 7, It is most similar to 200-3-210, 198 88) with 71.4% identity.
  • the identity of the amino acid sequence of the mouse V region to the amino acid sequence of the human V region is lower than the identity of the amino acid sequence of the mouse V region to the amino acid sequence.
  • the FR of the L ⁇ V region of the mouse WS-4 antibody is most similar to the consensus sequence of the FR of human L chain V region subgroup I (HSG1), with 64.4% identity. Exists.
  • the FR of the H ⁇ V region of mouse WS-4 is most similar to the consensus sequence of the FR of subgroove 'III (HSGIII) of the human HII V region, with 62.3% of the same. Oneness exists.
  • the L ⁇ V region in the human antibody HAU belongs to subgroup I of the human light chain V region.
  • the H chain V region in the human antibody VDH26 belongs to subgroup III of the human H chain V region.
  • a human L ⁇ V region belonging to subgroup I HSGI
  • the reshaped human WS-4 antibody H chain V region was used. It is best to use the human antibody H chain V region belonging to subgroup ⁇ (HSG III) for the design of DNA.
  • the L ⁇ V region of the mouse WS-4 antibody is the L ⁇ V of human anti-resting REI, which is a member of the subgroup 'I of the human L chain V region.
  • the area was similar. Therefore, the FRs from RE RE were used in the design of the reshaped human WS-4 antibody.
  • the original human REI Pa 1 n .: W c ;,. Hope-S e 1 er '? Z. P hysio '. Chem., 35 6, 16 7-19 1, 19 7 5; Ep P, 0. et al., Biochemistry, 14, 4 9 4 3-49
  • 5 amino acids positions 39, 71, 104, 105 and 107; see Table 2 compared to 52,1975).
  • the amino acid numbers in the table are based on the experience of Kabat, EA, et al. (1991).
  • the change in the two amino acids at positions 39 and 71 was a change back to the amino acids present in the FRs of the L region V region of the rat CAMPATH-1H antibody (Riechmann et al.). , 198 8).
  • three amino acid changes in FR4 were not found in other human eL proteins. It does not deviate from the human because it is based on the J region.
  • RVLa the FR is identical to the REI-based FR present in the reconstituted human CAMPATH-1H antibody (Riechmann et al., 1988), and the CDR is the mouse WS It was identical to the CDR in the V region of the L chain of the 14 antibody.
  • RVLb is based on RVLa and differs only in one amino acid at position 71 in human FR3. As defined by C hothia, C. et al., J. Mo 1. Biol. 196: 91-91, 19787, residue 71 is located in the L ⁇ V region. It is part of the standard (canonica 1) structure of CDR 1.
  • the amino acid at this position is expected to directly affect the structure of the CDR1 loop of the V region of the L chain, and is therefore thought to greatly affect antibody binding.
  • RVLb of the reshaped human WS-4 antibody L chain V region phenylalanine at position 71 has been changed to tyrosine.
  • table 2 is the LmV region of the mouse WS-4 antibody.
  • FR of REI modified for use in the CAPATH-1H antibody (Riechmann et al., 1988)
  • the amino acid sequence of each of the two versions of the L ⁇ V region of the antibody WS-4 antibody is shown.
  • REI FR is found in the reshaped human CAMPATH — 1H antibody (Riechmann et al., 1988).
  • the five underlined amino acids in the FR of RE 1 are the amino acid residues of human REI.
  • the amino acid is different from that in the column:
  • the maleic acid is represented by one letter and the amino acid number is as defined by Kabat et al.
  • the F R in the H chain V region of the mouse WS-4 antibody is most similar to the human H chain V region belonging to subgroove 111 (Table 1).
  • the H $ V region of the mouse WS-4 antibody is one member of the subgroup ⁇ of the human H ⁇ V region, FR1 through FR3, compared to the known human H ⁇ V region. It was most similar to the H-domain V region of certain human antibody VDH26 (Bu1 uwe 1a, L. et al., EMBOJ., 7, 2003-302, 1098, 1988). . Regarding FR4, since the sequence of the FR of VDH26 has not been clarified, the human antibody 4 ⁇ ⁇ ⁇ 4 belonging to subgroup III (Sa ⁇ , I. et al., J. Immunol 1., 14 The amino acid sequence of FR4 of 2, 883-887, 1989) was used. These human H domain V regions were used as a basis for the design of the H ⁇ V region of the reconstituted human WS-4 antibody.
  • Tables 3 and 4 show the H chain V region of mouse WS-4 antibody, FRs 1-3 of long-lived human antibody VDH26, FR4 of human antibody 4-4, and reconstituted human WS. — 4 The amino acid sequence of each of the eight versions of the V region of the ⁇ chain of the antibody. Table 3 Reconstruction hit WS — 4 H
  • V region design (Continued in Table 4
  • RVHa ⁇ h EVQ then ESGGG then VQPGGStR then SCAASGFTFS DYYLS
  • RVHa RLTISREDSKNTLYtQMSSLKTEDLAV'YYCAR ENYRYDVELAY RVHb
  • RVHa [! Are RVHa, RVHb, RVHc,
  • WS-4H WGQGTLVTVSA RVHd, RVHe, RVHf, RVHg and 4B4 WGQGTLVTVSS RVHh are shown.
  • the amino acid number is Kabat
  • DNA encoding the first version of each of the reshaped human WS-4 antibody L chain and H chain V regions was synthesized. Then, determine the sequence and re- Constituent human WS—4 It was confirmed that the whole DNA sequence of antibody “L” and the HV region “a” coded the correct amino acid sequence.
  • Reconstituted human WS Sequence of the 4 antibody LHV region purge ion “a” is shown in SEQ ID NO: 62, and sequence of the reshaped human WS4 antibody H chain V region version “a” is shown in SEQ ID NO: 38.
  • the DNA coding for the other version of the reshaped human WS-4 antibody V region was prepared using the published version of PCR-mutagenesis (Kammann, M. , 17, 54, 4, 1989) with a slight modification. As described in the design of the reshaped human WS-4 antibody V region, one additional version of the reshaped human WS-4 antibody light chain V region (version "b") was added.
  • the DNA to be coded is prepared and reconstituted human WS—4 antibody H protein V region with seven additional versions (no, 'one' b ',' cj, ' d ",” ej, "f", rg "and” hj) were prepared.
  • Reconstructed human WS-4 antibody H chain V region purge region "b” is shown in SEQ ID NO: 65 as SEQ ID NO: 65
  • reshaped human WS-4 antibody H chain V region version "b" and "c” , "D”, “e”, “f”, “g”, and “h” are shown in SEQ ID NOs: 41, 4, 45, 48, 51, 54, and 55, respectively.
  • Reconstructed human WS — 4 antibody V region D ⁇ ⁇ sequence of various versions The DNA encoding the reshaped human 4 antibody V region was subcloned into a mammalian cell expression vector already harboring the DNA encoding the human C region. I did. That is, the DNA coding for the reshaped human WS-4 antibody V ⁇ L region is coded into the DNA sequence coding for the human light chain C region, and the reshaped human WS-4 antibody H chain V region is coded. The DNA was ligated to each of the DNA sequences encoding the human C1 region.
  • both reconstituted human antibodies (RV and a / RVH g and RVL b / RVH g) comprising the L version "a" and 2 are "b" and the H version "g" Showed the ability to bind to IL-18 at the same level as the Chimera WS-4 antibody.
  • any expression system such as a eukaryotic cell, such as an animal cell, such as an established mammalian cell line, a filamentous fungal cell , And yeast cells, as well as prokaryotic cells, for example, bacterial cells, for example, E. coli cells and the like.
  • a eukaryotic cell such as an animal cell, such as an established mammalian cell line, a filamentous fungal cell , And yeast cells, as well as prokaryotic cells, for example, bacterial cells, for example, E. coli cells and the like.
  • the chimeric or reshaped antibodies of the present invention are expressed in mammalian cells, such as C0S cells or CHO cells.
  • conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used.
  • human's site megalovirus phase I humancytomegalovirusimmediateear 1; HCMV
  • expression vectors having an HCMV promoter include HCMV-VH-HCrl, HCMV-VL-HC and the like, which are derived from PSV2neo (International Publication W092-1977 ⁇ ). 9).
  • promoters for gene expression in mammalian cells include retroviruses, polymolyviruses, and adenoviruses.
  • Virus promoters such as virus, Simian Winnores 40 (SV40), or human 'polypeptides * chains' geronguesion' factor A promoter derived from a mammalian cell such as let (HEF-1 ⁇ ) may be used.
  • SV40 Simian Winnores 40
  • the method of MulIigan, R.C. et al. (Nature, 277, 108—114, 19779) and HEF — 1 o
  • Mizushima, S. et al. Nucleic A cids Res.
  • HEF-1a promoter Another specific example of a promoter useful for the present invention is the HEF-1a promoter.
  • Expression vectors having this promoter include HEF-VH-grl and HEF-VL-g (Fig. 1).
  • DNA sequences derived from poliovirus, adenovirus, SV40, bovine papillomavirus (BPV), etc. can be used.
  • aminodarcoside 3'-phosphotransferase or neo resistance gene aminodarcoside 3'-phosphotransferase or neo resistance gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli It is possible to use the gene for di-n-guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT) gene and dihydrofolate reductase (dfr) gene.
  • the present invention firstly encodes the L-chain V region and H-chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-8, and the DNA encoding the L-chain V region and the H-chain V region. Provide DNA to be loaded.
  • These are human mouse chimeric antibodies against human IL-18 and One example of a monoclonal antibody useful for producing a constituent human antibody is WS-4.
  • the L chain V region has, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and the H chain V region has, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27. These amino acid sequences are coded by, for example, the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively.
  • the mouse L chain V region and mouse H chain V region and the DNA encoding them are as described above.
  • the human L ⁇ C region can be any human light chain C region, such as a human C ⁇ or C region.
  • the human H chain C region can be any human H chain C region and can be, for example, a human Crl, Cr2, Cr3 or Cr4 region (Ellison, J. et al. DNA, 1, 1 1 — 1 8 (1 9 8 1), Takahashi, N. et al., CeH, 29, 6 7 1-6 7 9 (1 9 8 2), K rawinke 1, U et al. , EMBOJ., 1, 4 0 3 — 4 0 7 (1 98 2)).
  • a mouse LV region and a human L region C region under the control of an expression control region such as an enhancer promoter system.
  • Expression vector containing DNA, and expression containing DNA encoding mouse H protein V region and human H ⁇ C region based on expression control region such as enhancer / promoter system make a vector.
  • a host cell such as a mammalian cell, is co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are transformed in vitro or in vivo.
  • quinora antibodies are coded: a mouse LV region and a human L region C region under the control of an expression control region such as an enhancer promoter system.
  • the DNA encoding the mouse L chain V nod region and the human L chain C region, and the DNA encoding the mouse H chain V region and the human H chain C region are introduced into a single expression vector. Then, a host cell is transformed using the vector, and the transformed host is cultured in vivo or in vitro to produce the desired chimeric antibody. .
  • the reshaped human W S-4 antibody of the present invention comprises:
  • H ⁇ comprising a human H ⁇ FR and an H chain V region comprising the H chain CDR of a mouse monoclonal antibody WS-4 against human IL-8;
  • the L chain CDR is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and the range of the amino acid sequence is defined in Table 5.
  • the H chain CDR has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, and the range of the amino acid sequence is defined in Table 5.
  • the human L chain FR is derived from REI; the human H ⁇ FRs 1, 2 and 3 are derived from VDH26 and FR4 is derived from 4B4;
  • the chain C region is a human C region; and the human H region C region is a human C7.1 region.
  • the human HC region may be a human C74 region, or a radioisotope may be substituted for the human light chain C region and the Z or human HiC region. They may be combined.
  • the L chain V region has the amino acid sequence shown as RVLa or RVLb in Table 2, and the H chain V region is shown in Tables 3 and 4 as RVHa, RVH. b, RVHc, RVHd, RVHe, RVHf, RVHg, or RVHh.
  • the amino acid at position 41 in the H chain V region FR2 is proline and the amino acid at position 47 is tributphan And / or the amino acid at position 67 in FR 3 is preferably phenylalanine, and RVH b, RVH d, RVH e, RVH f, RVH g or RVH h Those having an amino acid sequence represented by are more preferable. Of these, RVHg is most preferred as the H ⁇ V region.
  • reconstituted antibodies For the production of reconstituted antibodies, two types of expression vectors, DNA encoding the reconstituted human light chain as defined above under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system, are used.
  • An expression vector comprising an expression vector comprising a reshaped human H-encoding DNA as defined above under an expression control region, such as an enhancer promoter system. I do.
  • host cells such as mammalian cells, are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vivo or in vitro for reconstitution. To produce antibodies.
  • the DNA encoding the reconstituted human L protein and the DNA encoding the reconstituted human H protein are introduced into a single expression vector, and the host is transformed using this vector. Then, the transformed host cells are cultured in vivo or in vitro to obtain the desired reconstituted human cells. To produce antibodies.
  • the chimeric antibody or reshaped human antibody produced in this way can be used in a conventional manner, for example, for protein A-affinity chromatography or ion-exchange chromatography. It can be isolated and purified by chromatography, gel filtration, etc.
  • the chimeric L protein or reconstituted human L protein of the present invention can be used to produce a complete antibody by combining it with an H chain.
  • the chimeric H chain or reconstituted human H chain of the present invention can be used to produce a complete antibody by combining it with an L chain.
  • the mouse L chain V region, the reconstituted human L chain V region, the mouse H chain V region, and the reconstituted human H protein V region of the present invention naturally bind to the antigen, human IL-18. It is considered to be useful as a medicine, a diagnostic agent, or the like as a region itself or as a fusion protein with another protein.
  • L chain V region CDR and H chain V region CDR of the present invention are originally a portion that binds to the antigen, human IL-18, and may be used as such or as a fusion protein with another protein.
  • pharmaceutical is considered to be useful as a diagnostic agent, such as ⁇ Te
  • the DNA encoding the mouse L ⁇ V region of the present invention is useful for the production of DNA encoding chimeric L protein or DNA encoding reconstituted human L ⁇ .
  • DNA encoding a mouse V chain V region is useful for producing DNA encoding a chimera chain or DNA encoding a reconstituted human.
  • the DNA encoding the L chain V region CDR of the present invention is useful for the production of DNA encoding the reshaped human L chain V region and DNA encoding the reshaped human L chain.
  • the DNA encoding the H ⁇ V region CDR of the present invention is useful for preparing DNA encoding the reshaped human H chain V region and DNA encoding the reshaped human H chain.
  • the F ( ab ') z It is possible to produce a single-chain Fv in which F ab or F v is linked to both H straight and L f Fv in an appropriate host, and use it for the aforementioned purpose. (See, for example, Bird, RE, et al., TIBTECH, 9, 1332—137, 1991).
  • Single-chain FV is obtained by linking the V region of the reshaped human antibody to human IL-8 and the V region of the light chain.
  • the ⁇ ⁇ V region and the L ⁇ V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al. Proc.Nal.A cad.S ci.U.S.A., 85,587 79-58 883,1988).
  • the HIV region and L region V region in singleglutinin Fv may be any of those described above as the H chain and L region V region of the reconstituted human antigen.
  • an H protein V region consisting of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 38, 41, 44, 45, 48, 51, 54, 55
  • a single chain FV comprising an L ⁇ V region consisting of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 62 and 65 (see W088-01649). ).
  • V regions are preferably linked by a peptide linker.
  • a peptide linker for example, any single peptide consisting of amino acid residues 12 to 19 is used (see W088-009344).
  • the DNA coding for single-glutinin FV may be the DNA coding for the H region or V region of the reshaped human antibody described above and the DNA coding for the L chain or L chain V region.
  • Type III the DNA portion encoding the desired amino acid sequence of those sequences is amplified by PCR using primer pairs defining both ends, and then, DNA encoding a portion of the peptide linker and both It is obtained by combining and amplifying a pair of primers that define the ends to be connected to each of the H and L ⁇ .
  • DNAs encoding singleglutinin FV are prepared, an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • single tuin Fv can be obtained using the host according to a conventional method.
  • Single-tuin FV is more easily transferred to tissues than antibody molecules, and is used for imaging by radioisotope labeling, and is a therapeutic agent that has the same function as reconstituted human antibodies. Is expected to be used.
  • reshaped human antibodies to human IL-18 of the present invention As a method for confirming the binding activity of chimeric antibodies, reshaped human antibodies to human IL-18 of the present invention and their F (ab ') z , Fab, Fv or single chain FV, , ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), E1A (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay) or a fluorescent antibody method.
  • an enzyme immunoassay is used for chimeric and reconstituted human antibodies
  • human IL-8 is added to a plate coated with an anti-human IL-18 monoclonal antibody.
  • a chimeric antibody against human IL-18 a culture supernatant of a cell producing a reconstituted human antibody or a purified sample is added thereto, and the mixture is labeled with an enzyme such as an alkaline phosphatase. Add the next antibody. After incubation and washing of the plate, the antigen binding activity can be evaluated by adding an enzyme substrate such as p-2-trophenyl phosphate and measuring the absorbance.
  • a solution containing IL-18 appropriately labeled with Z5I and the like and unlabeled IL-8 is mixed with a solution containing the antibody of the present invention or a fragment thereof prepared at an appropriate concentration, and then mixed with the above solution. Add to neutrophil suspension. After a certain period of time, neutrophils can be separated and labeled activity on neutrophils can be measured.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof is diluted with an appropriate culture solution, IL-8 is added, and the resultant is dispensed into a chamber. Then, the prepared neutrophil suspension is added to the chamber and left for a certain period of time.
  • the migrating neutrophils adhere to the filter attached to the chamber, and the number of neutrophils may be measured by a usual method such as a staining solution or a fluorescent antibody. It is also possible to make judgments with the naked eye under a microscope or perform automatic measurement using a machine.
  • the chimeric antibody against human IL-18 of the present invention, the reshaped human antibody, and the F (ab ') 2 , Fab, Fv or single chain FV thereof can be filtered through a membrane filter.
  • a membrane filter After sterilization, preferably parenterally, for example, by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc., or by airway, for example, nebulizer ] I7.
  • the dose to humans that can be administered as a pharmaceutical therapy varies depending on the condition and age of the patient, but is approximately 1 to 1000 mgZbody. O mgZkgZ Allows you to select a weekly divided dose.
  • injectable preparations may include purified chimeric antibodies against human IL-8, reconstituted human antibodies and their F (ab ') 2 , Fab, Fv or single tune Fv in a solvent, e.g. It is dissolved in saline solution, buffer solution, etc. and added with an anti-adsorption agent, such as Tween 80, gelatin, human serum albumin (HSA), or for reconstitution before use. It may be freeze-dried. Sugar alcohols or sugars such as mannitol and glucose can be used as excipients for freeze-drying.
  • the DNA encoding the variable region of the mouse monoclonal antibody against human IL-18 was cloned as follows.
  • RNAs from the noibri dorma WS-4 were compared to Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 18, 5 29 4-5 2 9 9,7,797, was prepared by modification of the method of density gradient centrifugation of heptachloride: ''' ⁇ ⁇ ⁇ .
  • RNA pellet is washed with 80% ethanol, and 20 mM with 1 O mM EDTA and 0.5% N- sodium sodium lauroyl sarcosinate After dissolving Tris-HC 1 ( PH 7.5) 2 0 0 // 1 ⁇ , and adding Protenase (manufactured by Boehringer) to 0.5 mg ⁇ 1, The plate was incubated in a warm bath for 30 minutes at 37 ° C. The mixture was extracted with phenol and black-mouthed form, and the RNA was precipitated with ethanol. Next, the RN ⁇ precipitate was dissolved in 10 mM Tris-HC 1 (pH 7.5) 200 1 containing I mM EDTA.
  • single-stranded cDNA was synthesized from about 40 ng of the mRNA obtained in step 2 above, and H town V area C Amplification of D ⁇ A: This was used.
  • a single-stranded cDNA was synthesized from about 10 ⁇ g of the total RNA.
  • the primer for PCR is as shown in SEQ ID NO: 13 to 24.
  • PCR solution 1001 contains 10 mM Tris-HC1 (pH 8.3), 50 mM KC1, 0.ImM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP.dTTP), 1. 5 mM M g C 1 2 , 0.
  • MKC M0 use K appa
  • SEQ ID NO: 12 C c ⁇ z ⁇ an ⁇ ⁇ ⁇ J J J '''J J J J J J J J (J one'.
  • Amplification of cDNA was performed using the H chain in 4. (1) except that amplification was performed using a 0.25 / M MKV primer mixture and a 3.0 M MKC primer, respectively. Amplification was performed from 2.0 ⁇ l of the single ic DN'A solution obtained in 3. above in the same manner as described for the amplification of the V region gene.
  • the D ⁇ fragments of each of the ⁇ chain V region and the L chain V region amplified by the PCR method as described above were separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% low melting point agarose (manufactured by Sigma). A piece of agarose containing the approximately 450 bp long H fragment DNA fragment and the approximately 400 bp long L fragment DNA fragment was cut out, and then melted at 65 ° C. for 5 minutes. the HC 1 (P H 7 5.
  • a DNA fragment comprising a gene encoding the mouse A: type L chain V region and a DNA fragment comprising the gene encoding the mouse H ⁇ V region were obtained.
  • Each of the above DNA fragments has a S a1I cohesive end at its 5 ′ end and an XmaI cohesive end at its 3 ′ end.
  • Sa1I-XmaI DNA fragment containing the gene coding for the mouse-Skappa-type L protein V region prepared as described above was used to prepare Sa1I, Xma PUC19 vector (Takara Shuzo) prepared by digesting with I and E. coli-derived alkaline phosphatase (BAP; Takara Shuzo) About 0.1 l / g, 1 unit In a reaction mixture containing T4 DNA ligase (GIBCO BRL) and the attached buffer, the reaction was carried out at 16 for 4 hours and ligated.
  • GIBCO BRL T4 DNA ligase
  • Escherichia coli was spread on the Old Spring Harbor Laboratory Press (19989), AL aboratory Manual, Sambrook et al., And incubated overnight at 37. Thus, an E. coli transformant was obtained.
  • the transformant was cultured overnight in 37 ml of 2 XYT medium containing 50 g Zml of ambicilin at 37 ° C., and the culture was purified from a QIAGEN plasmid minikit (QIAGEN). Was prepared according to the method described in the instruction manual.
  • pUC-WS41-VL The thus obtained plasmid having a gene encoding the mouse ⁇ -type L chain V region derived from the wild hybridoma WS-4 was named pUC-WS41-VL.
  • a gene encoding a mouse H chain V region derived from hybridoma WS-4 is prepared according to the same method as described above, except that E. coli concomitant cells are used with JM109. Plasmids were made from the Sa1I-XmaI DNA fragment and named PUC-WS4-VH.
  • the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the above-mentioned plasmid was used as a sequence primer for M13PrimerRV and M13.
  • SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the L region V region of the mouse WS-4 antibody, which is located at plasmid P ⁇ C—WS4—VL.
  • SEQ ID NO: 27 shows the nucleotide sequence of a gene encoding the mouse V-region of the mouse WS-4 antibody contained in the plasmid PUC-WS4-V.
  • the basic structures of the V regions of the L and ⁇ chains are similar to each other, with each of the four framework regions being linked by three hypervariable regions, the complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • the amino acid sequence of the framework is relatively well conserved, while the amino acid sequence in the CDR region is extremely variable (Kabat, EA, et al. equencesof Proteinsof Immuno 1 ogica 1 Interest ”USD ept. Hea 1 thand Human Services, 1991).
  • the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human IL-18 was applied to the amino acid sequence database of the antibody created by Kabat et al. By examining the homology, the CDR region was determined as shown in Table 5.
  • mouse WS — 4 cDNA clones encoding the L chain and H chain V regions, respectively p UC — WS 4 — VL and pUC—WS4—VH was modified by PCR. Then, it was introduced into a HEF expression vector (see W092—19759 and FIG. 1 described above).
  • the posterior primer for the L chain V region (SEQ ID NO: 28) and the posterior primer for the H chain V region (SEQ ID NO: 29) are the leaders of each V region. Hybridizes to the coding DNA at the beginning of a sequence and provides a Kozak consensus system! (Kozak, M. et al., J. Uo1. Biol. 196, 947-950, 1987) and were designed to have a HindllI restriction site.
  • the forward primer for the light chain V region (SEQ ID NO: 30) and the forward primer for the H chain V region (SEQ ID NO: 31) are the DNA sequences encoding the ends of the J region. And designed to add a subsequence donor sequence and a BamHI restriction site.
  • the expression vectors were tested in COS cells to observe the transient expression of the Chimera WS-4 antibody.
  • Each DNA (1 0 // g) was added to ⁇ Li co over bets 0. 8 ml of 1 X 1 0 7 cells Zml in PBS, to pulses of 1. Of 5 k V, 2 5 ⁇ F capacitor Gave.
  • the electroporated cells were transferred to a DMEM culture medium (GIBC) containing 5% r-globulin free fetal serum. It was rinsed to 15 ml and added to tissue culture dishes. After incubation for 96 hours, culture supernatants were collected, cell debris was removed by centrifugation, and a disk final letter with a diameter of 0.45 // m (Ge 1 man S cience).
  • GIBC DMEM culture medium
  • ELISA plates for antigen binding measurement and antibody concentration measurement were prepared as follows.
  • An ELISA plate for measuring the antigen binding activity was prepared as follows. 9
  • Each plate of a 6-well plate (manufactured by Nunc) was solidified into a buffer (0.1 M) at a concentration of 2 g Zm 1.
  • TAGO Ze-labeled goat anti-human IgG antibody
  • 96-well plate was solidified with 1 tig / m 1 goat anti-human IgG antibody (manufactured by TAGO) 100 I, and after blocking, Purified chimera antibody samples or culture supernatants of COS cells expressing them were serially diluted and added to each well, and then concentrated at a concentration of 11 mM alkaline phosphatase-conjugated goat antibody.
  • -Human IgG antibody (TAGO) 100a1 was added. After incubation and washing, a substrate solution (1 mg / m1P—nitrofuunil phosphoric acid, manufactured by Sigma) was added, and then the absorbance at 405 ⁇ was measured.
  • the DNA coding for the reshaped human WS-4 antibody H V region was designed as follows. Known DNA sequences encoding FR1 to 3 of human antibody VDH26 and FR4 of human antibody 4B4 are ligated to DNA sequences encoding CDRs of mouse WS-4 antibody H chain V region. Thus, a full-length DNA encoding the reshaped human WS-4 antibody H protein V region was designed.
  • a HindII I recognition site / K0ZAK consensus sequence and a BamHI recognition site / splice donor sequence were added to the 5 'and 3' sides of this DNA sequence, respectively, and HEF was added. Insertion into the expression vector was enabled.
  • the DNA sequence thus designed is divided into four approximately equal oligonucleotides, which in turn may interfere with the assembly of these oligonucleotides.
  • the secondary structure in the oligonucleotide was analyzed by a computer.
  • the sequences of the four oligonucleotides are shown in SEQ ID NOs: 32 to 35. These oligonucleotides have a length of 113 to 144 bases, and two adjacent oligonucleotides have a 20-base homologous region with each other. Of the four oligonucleotides, HF 1 (SEQ ID NO: 32) and HF 3 (SEQ ID NO: 34) have a sense DNA sequence, And another HF? (K column number: 3?), HF.! (SEQ ID NO: 35 has an antisense DNII sequence. These oligonucleotides can be converted to an automatic DNA synthesizer (App 1 ied Biosystems). ).
  • Fig. 3 shows a method of assembling these four oligonucleotides by PCR. Approximately 10 ng of HF1 and HF2, and HF3 and HF4 were combined and added to a final reaction volume of 98 ⁇ l containing 2.5 u of Pfu DNA polymerase. . After the initial denaturation at 9 4 for 3 minutes, one cycle of 9 4 for 2 minutes, 5 5 for 2 minutes and 7 2 for 2 minutes is performed for 2 cycles. C
  • the PCR reaction mixture was added. With 50; 1 mineral oil and a first denaturation at 94 ° C for 3 minutes, followed by 94 ° C for 1 minute, 55 ° (: 1 minute and 72 ° C). The cells were incubated for 45 minutes for 1 minute and then incubated for 10 minutes at 72.
  • the DNA fragment of about 450 base pairs was purified using a 1.5% low melting point agarose gel and purified by H digested with indIll and BamHI and then cloned into the HEF expression vector HEF — VH — gr1 o EF — 1 primer (SEQ ID NO: 66) and HIP primer ( After determining the DNA sequence using SEQ ID NO: 67), the plasmid containing the DNA fragment encoding the correct amino acid sequence of the H region V region was named HEF-RVH a-gr1.
  • SEQ ID NO: 38 shows the amino acid sequence and base sequence of the V region of the H chain contained in this plasmid HEF—RVHa- ⁇ 1.
  • the reshaped human W5 antibody HV regions are identified as “b —. ⁇ -”, “D”, “e”, “ ⁇ ”, “g”, and “ ⁇ ” as follows. It was prepared as follows.
  • Version “b” is a mutagenic primer, LTW1 (SEQ ID NO: 39), designed to mutate strongly into a tributin phantom at position 47.
  • LTW-2 SEQ ID NO: 40
  • RVH 5 '(SEQ ID NO: 36) and RVH 3' SEQ ID NO: 37
  • Mid HEF — RVH a — grl was used as type I DNA and amplified by PCR to obtain plasmid HEF — RVH b — gr 1.
  • the amino acid sequence and the base sequence of the H chain V region contained in this plasmid HEF—RVHb-gr1 are shown in SEQ ID NO: 41.
  • Version “c” refers to the mutagenic primers QTP1 (SEQ ID NO: 42) and QTP2 (SEQ ID NO: 4) designed to mutate 41-position glutamine to proline.
  • plasmid 3 plasmid HEF — RVH — grl was used as type I DNA and amplified by PCR to obtain plasmid HEF — RVH c — gr1.
  • the amino acid sequence and base sequence of the H ⁇ V region contained in this plasmid HEF—RVHc-gr1 are shown in SEQ ID NO: 44.
  • Version ⁇ d uses QTP1 and QTP2 as mutagenic primers, uses plasmid HEF — RVH b-gr1 as type I DNA, and converts plasmid HEF — RVH d — gr1 into plasmid DNA. Obtained.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of the H region V region contained in this plasmid HEF-RVHd-grl are shown in SEQ ID NO: 45.
  • Version “ej” was obtained by using mutagenic primers ATP1 (SEQ ID NO: 46) and ATP2 (SEQ ID NO: 47) designed to mutate alanine at position 40 to proline, Mid HEF — RVH d -g 7] was amplified on a proud DA and amplified to obtain -'- HEF-PVH-gr1.
  • the amino acid sequence and base sequence of the H chain V region of this plasmid HEF-RVHe-1 are shown in SEQ ID NO:
  • Version “ ⁇ ” is a mutagenic BRI GTA1 (SEQ ID NO: 49) and GTA2 (SEQ ID NO: 50) designed to mutate the glycin at position 44 to alanine. )
  • GTA2 SEQ ID NO: 50
  • Section “ g ” is a mutagenic primer designed to convert rouisin at position 67 to phenalanine LTF 1 (SEQ ID NO: 52) and LTF 2 Using (SEQ ID NO: 53), plasmid HEF—RVH d—gr1 was amplified as type I DNA to obtain plasmid HEF—RVH g-gr1.
  • the amino acid sequence and base sequence of the V region of the H chain contained in the plasmid HEF-RVHg-1 are shown in SEQ ID NO:
  • Version “h” uses LTF1 and LTF2 as mutagenic primers, amplifies brassmid HEF — RVH b-gr1 as type I DNA, HEF — RVH h — g r 1
  • the amino acid sequence and base sequence of the H region V region in this plasmid HEF-RVHh-gr1 are shown in SEQ ID NO: 55.
  • the DNA encoding the L chain V region of the reshaped human WS-4 antibody was designed as follows. DNA sequence encoding FR of human antibody REI and mouse WS — 4 DNA sequence encoding CDR of antibody L chain V region We designed a full-length DNA fragment that encodes the reconstituted human WS-4 antibody LIII.V region so as to be linked.
  • a Hind111 recognition site / K0ZAK consensus sequence and a BamHI recognition site / subrice donor sequence were added to the 5 'and 3' sides of this DNA sequence, respectively, to express HEF. Enabled to be inserted into the vector.
  • the DNA sequence thus designed is divided into four oligonucleotides of approximately equal length, and then the oligonucleotides that may interfere with the assembly of these oligonucleotides The structure of the secondary structure in the nucleoside was analyzed by a contributor.
  • the sequences of the four oligonucleotides are shown in SEQ ID NOs: 56-59. These oligonucleotides have a length of 06 to 124 bases, and two adjacent oligonucleotides are 19 to 23 bases apart from each other. Having. Of the four oligonucleotides, LF1 (SEQ ID NO: 56) and LF3 (SEQ ID NO: 58) have a sense DNA sequence, and the other LF2 (SEQ ID NO: 58). 57) and LF4 (SEQ ID NO: 59) have antisense DNA sequences. These oligonucleotides were synthesized in the same manner as in HF 1-4 described above.
  • the assembly was performed at 94'C with a PCR mix of 981 containing 4 OOng of each of the 4 oligonucleotides and 5u of Amp1iT aq. After an initial denaturation of 3 minutes, one cycle consisted of 94 minutes for 2 minutes, 55 minutes for 2 minutes, and 72 minutes for 3 minutes, and this was performed for 2 cycles. After adding the RVL 5 'primer (SEQ ID NO: 60) and RVL 3' primer (SEQ ID NO: 61) in lOO p moles as external primers, the PCR reaction mixture was added.
  • a DNA fragment of about 400 base pairs was purified using a 1.5% low melting point agarose gel, digested with Hind III and Bam HI, and then the HEF expression vector HEF—VL—g Crowjung. After determining the DNA sequence using EF-1 primer (SEQ ID NO: 6G) and KIP primer (SEQ ID NO: 68), encode the correct amino acid sequence of the L chain V region.
  • the plasmid containing the DNA fragment was named HEF-RVLa-g.
  • the amino acid sequence and the base sequence of the V region of the ⁇ chain, which is included in this plasmid HEF—RVLa—g ⁇ , are shown in SEQ ID NO: 62.
  • Version “b” is the mutagenic primer FTY1 (SEQ ID NO: 63) and FTY2 designed to mutate phenylalanine at position 71 to tyrosine. (SEQ ID NO: 64) and RVL 5 '(SEQ ID NO: 60) and RVL 3' (SEQ ID NO: 61) as primers for defining both ends.
  • HEF — RVL a — gc was used as type I DNA and amplified by PCR to obtain plasmid HEF — RVL b —.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of the L region V region contained in this plasmid HE F — R V L b -g ⁇ are shown in SEQ ID NO: 65.
  • the “a” version (RVLa) of the reshaped human WS-4 antibody L chain showed the same binding activity as the chimeric WS-4 antibody L chain.
  • the “a” version (RVLa) of the reconstituted H fragment and reconstituted human WS—4 antibody L fragment were simultaneously transfected into COS cells. It was done by taking a shot.
  • Antibodies with a version (RVH g) are capable of reforming functional antigen-binding sites with good antigen-binding properties and co-transfection into COS cells. Suggests that it produces a production level comparable to that of Mera WS-4 antibody (chL / chH) Done ⁇
  • RVLa H chain “a” version
  • RVH g H chain “g” version
  • RVLb L chain “b” purge ion
  • the above neutrophil suspension is centrifuged, and the cell concentration is 2X in the binding buffer (D-PBS containing 1% BSA and 0.1% sodium azide).
  • CT / JP94Z080959 CT / JP94Z080959
  • human IL-16 its antigen, human IL-16, were added at concentrations of about 50 / g Zml and about 40 ng / ml, respectively. For 30 minutes.
  • IL-18 radiolabeled with 125 I (74 TB q / mmol. Amersham) and unlabeled IL-18 (Amersbam) was used.
  • Two-fold serial dilutions were performed to about 8 ng / ml, with a mI force.
  • the IL-18 solution and each antibody solution were mixed in 501 each, and incubated at ice temperature for 30 minutes. Thereafter, the neutrophil suspension 1001 was added, and the mixture was incubated at ice temperature for 1 hour while stirring every 15 minutes. After incubation, this cell suspension was overlaid on a 20% 20% saccharose solution, centrifuged and frozen. To measure the amount of IL-18 bound to the cells, the cell sediment was cut, and the radioactivity was measured using an r-counter (manufactured by Aroca). Figure 8 shows the results.
  • RVLa L chain "a” version
  • RVH g H chain “g” version
  • RVLb L chain "b” purge ion
  • Antibodies with the same H chain “g” version (RVH g) inhibit IL-8 binding to the IL-8 receptor to the same extent as chimeric antibodies (chL / chH) It was found to have activity.
  • E. coli having the plasmid HEF-RVLa-g is Escherichiaco 1 i DH5 or (HEF-RVLa-gA :), and E. coli having the plasmid HEF-RVHg-gr1 is Escherichiacoli JM109 (HEF-RVH g-gr1) was submitted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (I 1-3, Higashi 1-3-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture) by the Institute of Industrial Science and Technology. On that day, they were internationally deposited under the Budapest Treaty as FERMBP-47338 and FERMBP-4714, respectively.
  • the hybridoma producing anti-human IL-8 monoclonal antibody was composed of spleen cells and mouse myeloma cells of BALB nc mice immunized with human IL-8, P3X63-Ag8.6. 53 was prepared by fusing polyethylene glycol in a conventional manner. Screening was performed using the activity of binding to human IL-8 as an indicator, and hybridoma WS-4 was established (Ko, ⁇ -C., Et al., J. Immunol. Methods, 1). 4 9, 2 2 7-2 3 5, 1 9 9 2) ⁇ Industrial applicability
  • the present invention provides a reshaped human antibody against human IL-8, in which the CDRs of the V region of the human antibody are replaced by CDRs of a mouse monoclonal antibody against human IL-8. .
  • Most of the reshaped human antibodies are derived from human antibodies, and CDRs are originally low in antigenicity, so that the reshaped human antibodies of the present invention have low antigenicity to humans, and Therefore, it is expected to be used for medical therapy.
  • Escherichia col i DH5 (HEF-R V then a-g A:)
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Mouse Immediate origin
  • Sequence type nucleic acid
  • ATC CAG TGT GAG GTG AAA CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG ATA CAG 96 lie Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Gly Leu He Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • TAAGCTTCCA CCATGGAGTT TGGGCTGAGC TGGGTTTTCC TTGTTGCTAT TTTAAAGGGT 60 GTCCAGTGTG AAGTGCAGCT GTTGGAGTCT GGGGGAGGCT TGGTCCAGCC TGGGGGTTCT 120 CTGAGACTCT CATGTGC 137 SEQ ID NO: 3 3
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of towns: One town
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name mouse and human
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name mouse and human Immediate origin
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name mouse and human
  • Organism name mouse and human
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name mouse and human
  • Amino acid 1 0 1-1 1 1 CDR 3
  • Amino acid 1 1 2 — 1 2 2 FR 4 sequence
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

ヒ ト イ ンターロイ キ ン— 8 に対する再構成ヒ ト抗体 技術分野
本発明は、 ヒ ト イ ンターロイ キ ン一 8 ( I L — 8 ) に対するマウ スモノ ク ローナル抗体の相補性決定領域 （ C D R ) 及び可変領域 （ V領域） 、 並びにヒ ト I L一 8 に対する ヒ ト /マウ スキメ ラ抗体、 ヒ ト軽鎖 （ L鎖） 可変領域及びヒ ト重鑌 ( H ID 可変領域の相補性 決定領域 （ C D R ) がヒ ト I L一 8 に対するマウ スモノ ク ローナル 抗体の C D Rにより置き換えられている再構成 （ r e s h a p e d ) ヒ ト抗体に閲する。 本発明はさ らに、 上記の抗体又はその部分を コー ドする D N Aを提供する。 本発明はさ らに、 前記 D N Aを舍ん で成るベクター、 特に発現ベクター、 並びに該ベク ターにより形質 転換された宿主に閬する。 本発明はさ らに、 ヒ ト I L一 8 に対する キメ ラ抗体の製造方法、 及びヒ ト I L一 8 に対する再構成ヒ ト抗体 の製造方法を提供する。 背景技術
イ ンターロ イ キ ン一 8 ( I L — 8 ) は、 リ ポ多糖 （ L P S ) で刺 激した単球の培養上清より見いだされ、 m o n o c y t e - d e r i v e d n e u t r o p h i l c h e m o t a c t i c f a c t o r ( M D N C F ) あるいは n e u t r o p h i 1 a c t i v a t i n g p r o t e i n — 1 ( N A P — 1 ) 等と称されてい た遊走性サイ ト カ イ ン （ c h e m o k i n e ) である。 I L一 8 は 様々な細胞により産生され、 多形核白血球およびリ ンバ球に作用し て、 その濃度勾配に沿って遊走 （ c h e m o t a x i s ) させる活 性を有している。 また、 好中球に対してはその遊走を誘導する ばか りでな く 、 脱顆粒、 活性酸素の放出、 内皮細胞への接着亢進などの 好中球の機能をも活性化させる作用を有している。
炎症性疾患、 より詳し く は、 囊胞性肺線維症、 特発性肺線維症、 成人呼吸促迫症候群、 サルコ ィ ドーシス、 化騮性胸膜炎などの呼吸 器疾患、 並びに乾癬などの皮 )1疾患、 並びに慢性リ ウマチ閭節炎、 ク ロー ン病、 潰癟性大腸炎などの疾患においては、 それらの病巣部 位に白血球浸潤が病理学的に認められている。 また、 これら疾患の 患者由来の被検物質に、 I L 一 8が検出されており、 炎症において 中心的役割を果たしていると考えられている。
( M c E l v a n e y , N . G . ら、 J . C l i n . I n v e s t . , 9 0 , 1 2 9 6 - 1 3 0 1 , 1 9 9 2、 L n c h III, J . P . ら、 A m. R e v . R e s p i r . D i s . , 1 5 , 1 4
3 3 - 1 4 3 9 , 1 9 9 2、 D o n n e l l y , S . C . ら、 L a n c e t , 3 4 1 , 6 4 3 - 6 4 7 , 1 9 9 3、 C a r , B . D. ら、 A m. J . R e s p i r . C r i t . C a r e M e d . , 1 4 9 , 6 5 5 - 6 5 9 , 1 9 9 4. A n t o n y , V . B . ら、 J . I m m u n o l . , 1 5 1 , 7 2 1 6 — 7 2 2 3 , 1 9 9 3、 T a k e m a t s u , H . ら、 A r c h . D e r m a t o l . , 1 2 9 , 7 4 - 8 0 , 1 9 9 3. B r e n n a n , F . M . ら、 E u r . J . I m m u n o l . , 2 0 , 2 1 4 1 - 2 1 4 4 , 1 9 9 0 、
I z z o , R . S . ら、 S c a n d . J . G a s t r o e n t e r o 1 . , 2 8 , 2 9 6 - 3 0 0 , 1 9 9 3、 \ z z o , R . S . ら s Am. J . G a s t r o e n t e r o l . . 8 7 , 1 4 4 7 - 1
4 5 2 , 1 9 9 2 ) o
K o , Y— C . らは、 ヒ ト I L — 8 を抗原と してマウ スに免疫す る こ とにより、 ヒ ト I L 一 8 に結合し、 かつ、 その結合によってヒ ト I L — 8が好中球に結合する こ とを阻害する、 すなわちヒ ト ！ L 一 8が有する生物学的活性を中和するマウ スモ ノ ク ローナル抗体 w S— 4 を調製した。 マウ スモノ ク ローナル抗体 W S— 4のア イ ソ タ イ ブは、 型 L鎖及び C r 1型 H鎖である こ とが明らかになつてい る （ J . I mm u n o l . e t h o d s , 1 4 9 , 2 2 7 - 2 3 5 , 1 9 9 2 ) .
W S— 4以外の抗ヒ ト I L一 8抗体と しては、 A. 5. 1 2. 1 4 ( B o 1 a n , A. M . ら、 J . C l i n . I n v e s t . , 8 9 , 1 2 5 7 - 1 2 6 7 , 1 9 9 2 ) 、 国際特許出願 W 0 9 2 - 0 4 3 7 2に開示されている抗 P e p - 1抗体または抗 P e p — 3 抗体あるいは D MZ C 7 ( u l l i g a n , . S . ら、 J . I m m u n 0 1 . . 1 5 0 , 5 5 8 5 - 5 5 9 5 , 1 9 9 3 ) 等が知 られている。
家兎を用いた実験系に於て、 マウ スモノ ク ローナル抗体 W S — 4 を投与する こ とによって、 肺虚血 · 再灌流障害 （ S e k i d o , N . ら、 N a t u r e , 3 6 5 , 6 5 4 - 6 5 7 , 1 9 9 3 ) 、 L P S誘導の皮膚炎 （ H a r a d a , A. ら、 I n t e r n a l 1 . I mm u n o l . , 5 , 6 8 1 - 6 9 0 , 1 9 9 3 ) 、 L P Sあるい はイ ンターロ イ キ ン一 1 ( I L一 1 ) 誘導の関節炎 （ A k a h o s h i , T . ら、 L y m p h o k i n e a n d C y t o k i n e
R e s . , 1 3 , 1 1 3 - 1 1 6 , 1 9 9 4 ) における好中球浸 潤が抑制されたこ とが見いだされた。
家兎にもヒ ト I L一 8の相同体 （ h o m o 1 o g u e ) が存在し 、 ゥサギ I L - 8 と称されている。 マウスモノ ク ローナル抗体 W S 一 4 はゥサギ I L— 8 に対して交差反応し、 ゥサギ I L - 8がゥサ ギ好中球に結合するのを阻害する こ とが明らかになつている （ H a r a d a , A. ら、 I n t e r n a t l . I m m u n o l . , o , 6 8 1 - 6 9 0 , 1 9 9 3 ) ので、 こ れ らの こ と は、 ヒ ト における 炎症性疾患の治療のための療法剤と して抗ヒ ト I L 一 8抗体が有用 であるこ とを示唆している。
ヒ ト以外の哺乳類由来のモノ ク ローナル抗体は ヒ 卜において高度 に免疫原性 （ 「抗原性」 という場合もある ） があ り 、 そ して こ の理 由のため、 ヒ トにおけるそれらの医学療法的価値は制限される。 例 えば、 マウ ス抗体をヒ ト に投与しても異物と して代謝されう るので 、 ヒ 卜におけるマウス抗体の半滅期は比較的短く 、 期待された効果 を充分に発揮できない。 さ らに、 投与したマウ ス抗体に対して発生 するヒ ト抗マウ ス抗体は、 血清病あるいは他のア レルギー反応など 、 患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。 そしてこの理 由のため、 ヒ ト にマウ ス抗体を頻回投与する こ と はでき ない。
これらの問題を解決するため、 ヒ ト型化 （ h u m a n i z e d ) 抗体の製造方法が開発された。 マウ ス抗体は 2つの方法でヒ ト型化 する こ とができ る。 より簡単な方法としては、 可変領域 （ V領域） はも とのマウ スモ ノ ク ローナル抗体に由来し、 定常領域 （ C領域） は適当なヒ ト抗体に由来するキメ ラ抗体を作製する方法がある。 得 られるキメ ラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全なかたちで 舍有するので、 もとのマ ウ ス抗体と同一の特異性をもって抗原に結 合するこ とが期待て'きる。
さ らに、 キメ ラ抗体ではもとのマウス抗体に比ペヒ ト以外の動物 に由来する蛋白質配列の比率が実質的に滅少しているためもとのマ ウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。 キメ ラ抗休は抗原 によ く 結合しそして免疫原性が低いが、 それでもなおマウ ス可変頟 域に対する免疫応答が生ずる可能性がある （ L o B u g 1 i o , A . F . ら、 P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A, 8 6 , 4 2 2 0 - 4 2 2 4 , 1 9 8 9 マ ウ ス抗体を ヒ ト型化亡るための第二 G方法 一層複？ tて るか 、 しかしマウス抗体が有する潜在的な免疫原性を大幅に低下させる ものである。 この方法においては、 マ ウ ス抗体の可変領域から相捕 性決定領域 （ c o m p 1 e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n g r e g i o n ； C D R ) のみをヒ ト可変領域に移植して 「 再構成」 （ r e s h a p e d ) ヒ ト可変領域を作製する . ただし必 要によっては、 再構成ヒ ト可変領域の C D Rの構造をより一層もと のマ ウ ス抗体の構造に近づけるために、 C D Rを支持している フ レ ーム ワーク領域 （ F R ) の一部の蛋白質配列をマ ウ ス抗体の可変頟 域からヒ ト可変領域に移植する場合がある。
次に、 これらの再構成ヒ ト可変領域をヒ ト定常領域に連結する。 最終的に再構成された ヒ ト型抗体のヒ ト以外の蛋自質配列に由来す る部分は C D R、 および、 極く 一部の F Rのみである。 C D Rは超 可変蛋自質配列により構成されており、 これらは種特異的配列を示 さない。 こ の理由のため、 マ ウ ス C D Rを担持する再構成ヒ ト抗体 はもはやヒ ト C D Rを含有する天然ヒ ト抗体より強い免疫原性を有 しないはずである。
再構成ヒ ト抗体についてはさ らに、 R i e c h m a n n , L . ら 、 N a t u r e , 3 3 2 , 3 2 3 - 3 2 7 , 1 9 8 8 ,- V e r h o e y e n , M. ら、 S c i e n c e , 2 3 9 , 1 5 3 4 - 1 5 3 6 , 1 9 8 8 ; K e t t l e b o r o u g h , C . A, ら、 P r o t e i n E n g . , 4 , 7 7 3 - 7 8 3. 1 9 9 1 ； a e d a , H. ら、 H u m. A n t i b o d i e s H y b r i d o m a s , 2 , 1 2 4 - 1 3 4 , 1 9 9 1 ; G o r m a n , S . D . ら、 P r
0 c . N a t l . A c a d . S c i . U S A, 8 8 , 4 】 8 1 - 4
1 8 5 , 1 9 9 1 ； T e m p e s t , P . R . ら、 B i oノ T e c h n o 1 o g y , 9 , 2 6 6 - 2 7 1 , 1 9 9 1 ； C o , . S . ら .， P r e : . N 2 L 1 . A c a d . 5 c ； . U S A ; 8 Z , 2
6 9 - 2 8 7 3 , 1 9 9 1 ； C a r t e r , P . ら、 P r o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A , 8 9 , 4 2 8 5 - 4 2 8 9 ,
1 9 9 2 ； C o , M . S . ら、 J . I m m u n o 1 . , 1 4 8 , 1
1 4 9 - 1 1 5 4 , 1 9 9 2 ; および S a t o , K. ら、 C a n e e r R e s . , 5 3 , 8 5 】 一 8 5 6 , 1 9 9 3 を参照のこ と。
発明の開示
前記のごと く 、 再構成ヒ ト抗体は療法目的のために有用である と 予想されるが、 ヒ ト I L — 8 に対する再構成ヒ ト抗体は知られてい ない。 さ らに、 再構成ヒ ト抗体の製造方法において任意の抗体に普 遍的に適用し得る画一的な方法は存在しない。 従って、 特定の抗原 に対して十分な結合活性あるいはノな らびに中和活性を示す再構成 ヒ ト抗体を作製するためには種々 の工夫が必要である （例えば、 S a t 0 , K . ら、 C a n c e r R e s . , 5 3 , 8 5 1 - 8 5 6 , 1 9 9 3 ) 。 従って、 本発明はヒ ト I L 一 8 に対する、 免疫原性 の低い抗体を提供する ものである。
本発明は ヒ ト I L 一 8 に対する再構成ヒ ト抗体を提供する。 本発 明はまた、 該再構成ヒ ト抗体の作製の過程で有用である ヒ 卜 /マ ウ ス キ メ ラ抗体を提供する。 本発明はさ らに、 再構成ヒ ト抗休の断片 を提供する。 並びに本発明はキメ ラ抗体、 再構成ヒ ト抗体およびそ れらの断片の製造のための発現系を提供する。 本発明はさ らにまた
、 ヒ ト I L 一 8 に対するキメ ラ抗体およびそれらの断片の製造方法
、 及びヒ ト I L 一 8 に対する再構成ヒ ト抗体およびそれらの断片の 製造方法を提供する。
さ らに具体的には、 本発明は、
( 1 ) ヒ ト I L 一 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナ ル抗体の L鎮 V領 域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するマウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 V領 域 ；
を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウスモノ ク ロ ーナル抗体の L鎮 V領域を含んで成る L鑌 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウスモノ ク ロ ーナル抗体の H鎮 V領域を含んで成る H鎖 ；
を提供する。
本発明はさ らにまた、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウスモノ ク ロ ーナル抗体の L鎖 V領域を舍んで成る L鎖 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鑌 C領域、 及びヒ ト I L — 8 に対するマウスモノ ク ロ ーナル抗体の H鎮 V領域を含んで成る H鎮 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L 一 8 に対するキメ ラ抗体を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体 W S — 4 の L鎖 V領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体 W S — 4 の H鎖 V領域 ； を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウスモノ ク ロ ーナル抗体 W S — 4 の L鑌 V領域を含んで成る L鎮 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体 W S — 4 の H鑌 V領域を含んで成る H鎖 ；
を提供する。 本発明 .さ ら にま た .
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及びヒ ト I L — 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体 W S — 4 の L鎮 V領域を舎んで成る L鎮 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体 W S — 4 の H鎮 V領域を舎んで成る H鎖 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L 一 8 に対するキメ ラ抗体を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト I L 一 8 に対するモ ノ ク ロ ーナ ル抗体の L鎖 V領域の C D R ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するモ ノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 V領域の C D R ； を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト I L — 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体の L鎖 V領 域の C D R ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 V領 域の C D R ； を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 V領域のフ レーム ワーク領域 （ F R ) ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体の L鎖 V領 域の C D R ； を含んで成る、 ヒ ト I L 一 8 に対する抗体の再構成ヒ ト L鎖 V領域 ； 並びに
( 1 ) ヒ ト H鑌 V領域の F R ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L 一 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 V頟 域の C D R ； を含んで成る、 ヒ ト I L — 8 に対する抗体の再構成ヒ ト H鎮 V領域を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域 ； 並びに ( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ 卜 I L— 8に対するマウスモノ ク ロ一 ナル抗体の L鎖 C D Rを含んで成る L鎖 V領域 ； を含んで成る、 ヒ ト I L一 8に対する抗体の再構成ヒ ト L鎖 ； 並びに
( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L一 8に対するマウスモノ クロ一 ナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鎖 V領域 ； を含んで成る、 ヒ ト I L一 8に対する抗体の再構成ヒ ト H鎖を提供する。
本発明はさ らにまた、
( A) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ ト I L一 8に対するマウスモノ ク ローナル抗体の L鎖 C DRを含んで成る L鎖 ； 並びに
(B) ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L一 8に対するマウスモノ クローナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鎖 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L一 8に対する再構成ヒ ト抗体を提供する。 本発明はさ らに詳しく は
( 1 ) 以下の配列に示す又はその一部を有する、 ヒ ト I L一 8に対 するマウ スモノ クローナル抗体 WS— 4の L鎖 V領域の C D R、
C D R 1 ； Arg Ala Ser Glu lie lie Tyr Ser Tyr Leu Ala
C D R 2 ； Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
C D R 3 ； Gin His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr
並びに
( 2 ) 以下の配列に示す又はその一部を有する、 ヒ ト I L一 8に対 するマウスモノ クローナル抗体 WS— 4の H鎖 V領域の C D R、
C D R 1 ； Asp Tyr Tyr Leu Ser
C D R 2 ； Leu He Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Ty r Ser Ala Ser Val Lys Gly C D R 3 ； G l u Asr, T r krz Tyr Asp Va 1 G 1 u Leu Al a T r を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 V領域のフ レーム ワーク領域 （ F R ) ·' 並びに
( 2 ) ヒ ト I L— 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体 W S— 4 の L鎖 V領域の C D R ; を舎んで成る、 ヒ ト I L一 8に対する抗体の 再構成ヒ ト L鎖 V領域 ； 並びに
( 1 ) ヒ ト H鎖 V領域の F R ； 並びに
( 2 ) ヒ ト I L— 8に対する マウ スモノ ク ローナル抗体 W S— 4 の H鎖 V領域の C D R ； を含んで成る、 ヒ ト I L— 8 に対する抗体の 再構成ヒ ト H鎮 V領域
を提供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト L鎮 F R、 及びヒ ト I L一 8に対する マウ スモ ノ ク ロ一 ナル抗体 W S— 4 の L鎖 C D Rを含んで成る L鎖 V領域 ； を舎んで成る、 ヒ ト I L 一 8に対する抗体の再構成ヒ ト L鎖 ； 並び に
( 1 ) ヒ ト H鎮 C領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L— 8に対するマウ スモ ノ ク ロ一 ナル抗体 W S— の H鎖 C D Rを舎んで成る H鎖 V領域 ； を含んで成る、 ヒ ト I L— 8に対する抗体の再構成ヒ ト H鑌を提供 する。
本発明はさ らにまた、
( A ) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ ト I L— 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナ ル抗体 W S— 4 の L鎖 C D Rを含んで成る L钹 ； 並びに ( B 「 1 ) ヒ ト H鎮 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L — 8 に対するマ ウ ス モ ノ ク ローナル抗体 W S — 4 の H鎖 C D Rを含んで成る H鎮 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L 一 8 に対する再構成ヒ ト抗体を提供する。 前記ヒ ト L鑌 F Rは下記のア ミ ノ酸配列を有する ものが挙げられ る。
FR1： Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
Va 1 G ly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys
FR2： Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
Tyr
FR3: Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys
FR4： Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
または、
FR1： Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser /U a Ser
Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys
FR2: Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys し eu Leu lie
Tyr
FR3: Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys
FR4: Phe Gly Gin Gly Thr lys Val Glu He Lys
前記ヒ ト H鎖 F R は下記のア ミ ノ酸配列を有する ものが挙げられ る。
FR1： Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
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FR2: Trp Val Arg Gin Ala Gin Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly F 3： Arg Phe Thr l ie Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr C s 1 a Arg
FR ： Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
本発明はまた、 前記種々 の抗体を構成するボリ ペプチ ド、 又はそ の断片をコー ドする D N Aに閲する。 本発明はまた、 上記 D N Aを 含んで成るベク ター、 例えば発現ベク ターに関する。 本発明はさ ら に、 上記ベクターによ り形質転換された宿主を提供する。
本発明はさ らにまた、 ヒ ト I L — 8 に対するキメ ラ抗体およびそ の断片の製造方法、 及びヒ ト 1 L 一 8 に対する再構成ヒ ト抗体およ びその断片の製造方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 それぞれ本発明の抗体の L鎮および H鎖の発現のために 有用な、 ヒ ト ' エ ロ ンゲー シ ヨ ン ' フ ァ ク タ—— l a ( H E F — 1 a ) プロモーター/ェ ンハ ンサ一系を舎んで成る発現ベク ター H E F - V L - g A:および H E F — V H — g 丁 1 を示す。
図 2 は、 C O S細胞の培養上清中に産生された本発明のキメ ラ W S — 4抗体 （ c h L / c h H ) の ヒ ト I L — 8 に対する結合能の確 認のための E L I S Aの結果を示すグラ フである。
図 3 は、 本発明の再構成ヒ ト W S — 4 抗体の H鑌 V領域の第一バ 一ジ ョ ン 「 a ί R V H a ) ( A ) 、 および再構成ヒ ト W S — 4 抗 休の L鎖 V領域の第一 '、'一ジ ョ ン 「 a — ( R \' L a ) ( B ) O各ァ ミ ノ酸配列をコー ドする D N Aを構築するためのダイ ヤグラムであ る。
図 4 は、 本発明の再構成ヒ ト W S — 4 抗体の L鎖 V領域 （ R V L a ) ならびに H鎮 V領域 （ R V H a ) を、 それぞれキメ ラ W S — 4 抗体 H鎮 V領域 （ c h H ) ならびにキメ ラ W S — 4抗体 L鎮 V領域 ( c h L ) と C O S細胞に発現させ、 ヒ ト I L一 8 に対する結合能 と産生量を、 C O S細胞の培養上清中に産生された本発明のキメ ラ W S — 4抗体 （ c h L / c h H ) と比較するための E L I S Aの結 果を示すグラ フである。
図 5 は、 C O S細胞の培養上清中に産生された本発明の R V L a を舍んでなる 8種の再構成ヒ ト W S — 4 抗体 （ R V L aノ R V H a , R V L a / R V H b , R V L a / R V H c , R V L a / R V H d , R V L a / R V H e , R V L a / R V H f , R V L a / R V H g , R V L a / R V H h ) のヒ ト I L一 8 に対する結合能と産生量を . C O S細胞の培養上清中に産生された本発明のキメ ラ W S — 4抗 体 （ c h L / c h H ) と比較するための E L I S Aの結果を示すグ ラフである。
図 6 は、 C O S細胞の培養上消中に産生された本発明の R V L b を舍んでなる 8種の再構成ヒ ト W S — 4抗体 （ R V L b / R V H a , R V L b / R V H b , R V L b / R V H c , R V L b / R V H d , R V L b / R V H e , R V L b / R V H f 1 V L b / R V H g , R V L b Z R V H h ) の ヒ ト I L一 8 に対する結合能と産生量を 、 C O S細胞の培養上清中に産生された本発明のキメ ラ W S — 4抗 体 （ c h L Z c h H ) と比較するための E L I S Aの結果を示すグ ラフである。
図 7 は、 精製した本発明の再構成ヒ ト W S — 4抗体 R V L a Z R V H g並：：'· R V L b Z R V H g Oヒ ί. ! L ― 8 に対する結合能を
、 精製した本発明のキメ ラ W S — 4 抗体 （ c h L / c h H ) と比較 するための E L I S Aの結果を示すグラ フである。
図 8 は、 精製した本発明の再構成ヒ ト抗体 R V L a V H g な らびに R V L bノ R V H g の I L — 8 レセ プターに対する I L 一 S の結合阻害活性をマウ ス W S — 4 抗体な らびに本発明のキ メ ラ W S ー 4抗体 （ （； 11 し / (： 11 ?1 ) と比較するための、 リ ガン ド レセブタ 一結合阻害ア ツ セ ィ の結果を示すグラ フである。 発明を実施するための具体的な形態
マウス Y領域をコー ドする D N Aのク ローニ ング
ヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の V領域をコ一 ドする遺伝子をク ローニ ングするためには、 該遺伝子の取得源と し て、 ヒ ト I L 一 8 に対する マウ スモノ ク ローナル抗体を生産するハ イ ブリ ドーマを作製するこ とが必要である。 ハイ プリ ドーマから m R N Aを抽出した後、 既知の方法によ り一本鎖 c D N Aに変換し、 ボリ メ ラーゼ連鎮反応 （ P C R ) 法を用いて目的とする D N Aを増 幅する こ とで得られる。 こ の遺伝子の取得源と して、 K o , Υ — C . らが作製した、 ヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体 を産生するハイ プリ ドーマ W S — 4 があげられる。 このハイ ブリ ト 一マの作製方法は J . I m m u n o l . M e h o d s , 1 9 ,
2 2 7 - 2 3 5 , 1 9 9 2 に記載されており、 これを参考例 1 に後 記する。
( 1 ) 全 R N Aの採取
マ ウ スモノ ク ローナル抗体の V領域をコー ドする 目的の D N Aを ク ロー ン化するため、 グァニジ ンチオ シァネー ト処理によ り ハイ ブ リ ドーマ細胞を破壌し、 塩化セ シウ ム密度勾配遠心 （ C h i r g i n . J . M . ら、 B i o c h e m i s t r :,' . 1 S 、 5 2 9 4 - 5 2 9 9 , 1 9 7 9 ) をおこなって全 R N Aを得る こ とができ る。 なお、 他の蛋白質の遺伝子をク ローユ ングする際に用いられたすで に報告されている方法、 例えばバナジゥム複合体などのリ ボヌク レ ァーゼ （ R N a s e ) イ ンヒ ビター存在下て、 界面活性剤処理、 フ ヱノ ール処理をおこなう方法 （ B e r g e r , S . L . ら、 B i o c h e m i s t r y , 1 8 , 5 1 4 3 - 5 1 4 9 , 1 9 7 9 ) を用 いる こ ともできる。
( 2 ) c D N Aの合成
次に、 m R N Aの 3 ' 末端に局在する P 0 1 y A鎖に相補的なォ リ ゴヌク レオチ ドであるオ リ ゴ （ d T ) をプラ イ マーと して、 上記 のごと く して得た全 R N Aに舍まれている m R N Aを $寿型に、 逆転 写酵素で処理して m R N Aに相補的な一本鎖 c D N Aを合成する こ とができる （ L a r r i c k , J . W. ら、 B i o ZT e c h n o l o g y . 7 、 9 3 4 - 9 3 8 , 1 9 8 9 ) 。 また、 その時にラ ン ダムブラ イ マーを用いても良い。 なお、 m R N Aだけを取得する場 合は、 全 R N Aをオ リ ゴ d Tセルロースカ ラ ムにかけ p 0 1 A $1 を有する m R N Aだけを分離するこ とができる。
( 3 ) ボリ メ ラーゼ連鎖反応による V領域をコー ドする D N Aの増 幅
次に、 ボリ メ ラーゼ連鎖反応 ( P C R ) 法を用いて前記 V領域を コー ドする c D N Aを特異的に増幅する。 マウスモノ ク ローナル抗 体のカ ッパ （ ） 型 L鎖 V領域の増幅のため、 配列番号 ； 1 〜 1 1 に示す 1 1 種のオ リ ゴヌク レオチ ドプラ イ マー （ M 0 u s e K a p P a V a r i a b l e ; M K V ) 及び配列番号 ： 1 2 に示すォ リ ゴヌ ク レオチ ドフ 'ラ イ マー （ M o u s e K a p p a C o n s t a n t ； M K C ) をそれぞれ 5 ' 末端プラ イ マー及び 3 ' 末端ブ ラ イ マ一と して使用する . 前記 M K Y ' イ マーはマ ウ ス力 ■ ハ'型 L鎖リ ーダ一配列をコー ドする D N A配列とハイ ブ リ ダィ ズし、 そ して前記 M K Cブラ イ マーはマ ウ ス力 ツバ型 L鎖 C領域をコ一 ドす る D N A配歹 Kとハイ ブリ ダイ ズする。
マウスモノ ク 口ーナル抗体の H鎮 V領域の増幅のため、 配列番号 ： 1 3〜 2 4 に示す 1 2種のオ リ ゴヌ ク レオチ ドプラ イ マー （ M o u s e H e a v y V a r i a b l e ; M H V ) 及び配列番号 ： 2 5に示すオ リ ゴヌ ク レオチ ドプラ イ マー （ M o u s e H e a v y C o n s t a n t ； M H C ) をそれぞれ 5 ' 未端プラ イ マー及 び 3 ' 末端プラ イ マ一と して使用する。 前記 M H Vプラ イ マーはマ ウ ス H鎖リ ーダ一配列をコー ドする D N A配列とハイ ブリ ダィ ズし 、 そ して前記 M H Cプラ イ マーはマウ ス H鎖 C領域をコー ドする D N A配列とハイ ブリ ダイ ズする。
なお、 全ての 5 ' 末端プラ イ マー （ M K V及び M H V ) はその 5 ' 末端近傍に制限酵素 S a 1 I 切断部位を提供する配列 C T C G A Cを舍有し、 そ して、 全ての 3 ' 末端プラ イ マー （ \41 0及び\1 ^1 C ) はその 5 ' 末端近傍に制限酵素 X m a I 切断部位を提供する ヌ ク レオチ ド配列 C C C G G Gを舍有する。 これらの制限酵素切断都 位は両 V領域をコー ドする目的の D N A断片をそれぞれのク ローニ ングベク ターにサブク ローニ ングするために用い られる。 こ れらの 制限酵素切断部位が、 両 V領域をコー ドする目的の D N A配列中に も存在する場合、 それぞれのク ローニ ングベクターにサブク ロ一二 ングするために用いられる限り、 他の制限酵素切断部位でも良い。 ( ) V領域をコー ドする D N Aの単離
次に、 目的とするマ ウ スモ ノ ク ローナル抗体の V領域をコー ドす る D N A断片を得るために、 P C R増幅生成物を低融点ァガロース ゲルあるいはカ ラ ム 〔 P C R産物精製用キ ッ ト （ Q I A G E N Γ C R P u r i f i c a t i o n S p i n K i t ： Q I A G E N社製） 、 D N A精製用キ ッ ト （ G E N E C L E A N II ： B I 0 1 0 1社製） 〕 等により、 分離、 精製をおこ な う 。 その精製物を制 限酵素 S a l I及び X m a 1で酵素処理して、 マウ スモノ ク ローナ ル抗体の目的とする V領域をコー ドする D N A断片を得る。
他方、 プラス ミ ド p U C l 9 のごとき適当なク ローユングべクタ 一を同じ制限酵素 S a 1 I及び X m a Iにより切断させ、 この p U C 1 9に前記 D N A断片を酵素的に連結する こ とにより、 マウスモ ノ ク ローナル抗体の目的とする V領域をコー ドする D N A断片を舍 むプラ ス ミ ドを得る。 ク ローユ ングされた D N Aの配列決定は任 意の常法に従って行う こ とができ、 例えば、 自動 D N Aシークェ ン サ一 （ A p p l i e d B i o s y s t e m s I n c . 製) 力く挙 げられる。 目的とする D N Aのク ローユング及びその配列決定を実 施例 1 及び実施例 2 に具体的に記載する。
相補性决定領域 （ C D R )
本発明はさ らに、 ヒ ト I L一 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗 体の V領域の超 V領域又は相補性決定領域 （ C D R ) を提供する。 抗体の L鑌及び H鎖の両 V領域は抗原結合部位を形成する。 L鎮及 び H鎖上のこ の領域は類似する基本的構造を有する。 両鑌の V領域 は配列が比較的保存された 4個のフ レーム ワーク領域を舍み、 それ らは 3個の超 V領域又は C D Rにより連結されている （ K a b a t , E . A. ら、 r S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I m m u n o l o g i c a l I n t e r e s t j , U S D e p t . H e a l t h a n d H u m a n S e r v i c e s 1 9 9 1 ) »
前記 4個のフ レーム ワーク領域 （ F R ) の多 く の部分は /9ー シー ト構造をとり、 3個の C D Rはループを形成する。 C D Rはある場 合 P― -一 ト構造 —部分を形成する こ と もある。 F Rによ て 3個の C D Rは相互に立体的に非常に近い位置に保持され、 そ し て、 対をなす 3個の C D R と共に抗原結合部位の形成に寄与する。 本発明は、 ヒ ト型化抗体の素材と して有用なこれらの C D R、 及び それをコー ドする D N Aをも提供する。 これらの C D R領域は、 V 領域の既知ァ ミ ノ 酸配列と照合する こ とによって、 K a b a t , E . A. ら、 「 S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o i
I m m u n o l o g i c a l I n t e r e s t 」 の経験則力、ら 決定する こ とができ、 実施例 3において具体的に説明する。
キメ ラ抗体の作製
ヒ ト I L 一 8 に対する抗体の再構成ヒ ト V領域を設計する に先立 つて、 使用する C D Rが実際に抗原結合領域を形成する こ とを確か める必要がある。 こ の目的のため、 キメ ラ抗体を作製した。 キメ ラ 抗体を作製するためにキメ ラ抗体の L镇並びに H鑌をコ一ドする D N Aを構築する必要がある。 両 D N Aを構築する基本的な方法は、 P C R—ク ロー ン化 c D N Aに見られるマ ウ ス リ ーダー配列及びマ ウ ス V領域配列のそれぞれの D N A配列を、 哺乳類細胞発現べク タ 一中にすでに存在する ヒ ト C領域をコー ドする D N A配列に連結す る こ とである。
前記ヒ ト抗体 C領域は、 任意のヒ ト L鎖 C領域および任意のヒ ト H鎖 C領域である こ とができ、 例えば、 L鎖についてはヒ ト L鎮 C あるいは C 、 H鎮については I g Gであれば C r 1 , C τ 2 , C r 3 あるいは C r 4 ( E l l i s o n , J . ら、 D N A, 1 , 1 1 一 1 8 ( 1 9 8 1 ) , T a k a h a s h i , N . ら、 C e H , 2 9 , 6 7 1 - 6 7 9 ( 1 9 8 2 ) , K r a w i n k e 1 , U . ら 、 E M B O J . 1 , 4 0 3 — 4 0 7 ( 1 9 8 2 ) ) あるいは他の アイ ソ タ イ プをそれぞれ挙げる こ とができ る。 キ 、' 抗体の製造 C'ために 2 種類の発現ベク ターを作製する 即ち、 ェ ンハ ンサー， /プロモーター系のよう な発現制御領域による 制御のもとで、 マ ウ ス L鎖 V領域ならびにヒ ト L鎮 C領域をコー ド する D N Aを舍んでなる発現ベク ター、 およびェ ンハ ンサ一/プロ モーター系のような発現制御領域による制御のもとで、 マウス H鎮 V領域ならびにヒ ト H鎖 C領域をコー ドする D N Aを舍んでなる発 現ベクターを作製する。 次に、 これらの両発現べクタ一により哺乳 類細胞などの宿主細胞を同時形質転換し、 そして形質転換された細 胞をィ ンー ビ ト ロまたはィ ンー ビボで培養してキメ ラ抗体を製造す る （例えば、 W 0 9 1 — 1 6 9 2 8 ) 。
あるいは、 マウ ス L鎖 V領域ならびにヒ ト L鎖 C領域をコー ドす る D N Aおよびマウ ス H鎖 V領域ならびにヒ ト H鎖 C領域をコー ド する D N Aを単一の発現ベクターに導入し、 そして、 該ベク ターを 用いて宿主細胞を形質転換し、 そ して形質転換された細胞をィ ンー ビ ト 口またはィ ンー ビボで培養してキメ ラ抗体を製造する こ と もで きる。
モノ ク ローナル抗体 W S— 4 からのキメ ラ抗体の作製を実施例 4 に記載する。
マウ ス W S — 4 κ型 L鎖リ ーダー領域及び V領域をコー ドする c D N Aを P C R法を用いてク ローニ ングし、 ヒ ト L鎮 C 領域をコ ー ドする ヒ トゲノ ム D N Aを舍有する発現ベクターに連結する。 同 様にマウ ス W S - 4抗体の H鎮リ ーダー領域及び V領域をコー ドす る c D N Aを P C R法を用いてク ローユングし、 ヒ ト 】 領域を コー ドするゲノ ム D N Aを舍有する発現ベクターに連結する。
より詳し く は、 特に設計された P C Rプライ マーを用いて、 マウ ス W S — 4抗体の V領域をコー ドする c D N Aをそれらの 5 ' 及び 3 ' 末端において適当な塩基配列を導入して （ 1 ) それらが発現べ ク タ一 容易に挿人されるよう に、 且つ （ 2 〗 それ らが該発現ベノ' ター中で適切に機能するよ う にした （例えば、 本発明では K 0 z a k配列を毒入する こ とにより転写効率を上げるよ う工夫してある） 次に、 これらのプライ マーを用いて P C Rによ り増幅して得たマ ウ ス W S — 4抗体の V領域をコー ドする D N Aを、 所望のヒ ト C領 域をすでに舍有する H E F発現ベク ター （図 1 参照） に挿人した。 これらのベク ターは、 種々 の哺乳類細胞系における遺伝子操作され た抗体の一過性 （ t r a n s i e n t ) 発現又は安定な究現のため に適当である。
こ のよ う に作製したキメ ラ W S — 4 抗体の結合活性を試験したと こ ろ、 キ メ ラ W S — 4 抗体は ヒ ト I L — 8 に結合する活性を示した (図 2参照） 。 従って、 正しいマウ ス V領域がク ローニングされ、 そして正し く配列が决定されていたこ とが示された。
再構成ヒ ト W S - 4 抗体の設計
マウ スモ ノ ク 口一ナル抗体の C D Rがヒ ト抗体に移植されている 再構成ヒ ト抗体を作製するためには、 移植する C D Rを有するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の F R のァ ミ ノ酸配列と、 C D Rが移植され る ヒ ト モノ ク 口一ナル抗体の F Rのァ ミ ノ酸配列との間に高い同一 性が存在する こ とが望ま しい。
この目的のためには、 マウスモノ ク ローナル抗体の F Rのァ ミ ノ 酸配列と ヒ トモノ ク ローナル抗体の F R のァ ミ ノ酸配列とを比較す る こ とにより、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体の V領域の設計の基礎とな る ヒ ト V領域を選択する こ とが可能になる。 具体的には遣伝子解析 ソ フ ト G E N E T X ( S o f t w a r e D e v e 1 o p m e n t
C o . , L t d . ) を用いてマ ウ ス W S — 4抗体の L鎮及び H鎮 の V $ 域を、 N a t i o n a l B i o m e d i c a l R e s e a r c F o u n d a t i o n ( N B R' F ) の ータベースに見 出されるすべての既知のヒ トの V領域と比較した。
マ ウ ス W S - 4抗体の L鎖 V領域は、 既知のヒ ト抗体 L鎖 V領域 との比較においてヒ ト抗体 H A U (W a t a n a b e , S . ら、 H o p p e — S e 1 e r ' s Z . P h y s i o l . C h e . 3 5 1 , 1 2 9 1 - 1 2 9 5 , 1 9 7 0 ) の L鑌 V領域に最も類似し ており、 6 9. 2 %の同一性が存在する。 一方、 W S— 4抗体の H 鎖 V領域は、 既知のヒ ト抗体 H鎖 V領域との比較においてヒ ト抗体 V D H 2 6 ( B u 1 u w e 1 a . , L . ら、 E M B O J . , 7 , 2 0 0 3 - 2 0 1 0 , 1 9 8 8 ) に最も類似しており、 7 1. 4 % の同一性が存在する。
一般的に、 マウ ス V領域のア ミ ノ酸配列のヒ ト V領域のア ミ ノ酸 配列に対する同一性は、 マウ ス V領域のァ ミ ノ酸配列に対する同一 性より も低い。 これはマウ ス W S— 4抗体の V領域がヒ ト V領域に 完全には類似していないこ と示し、 そして同時に、 ヒ ト患者におけ る免疫原性の問題を解决するためにマウス W S— 4 の V領域をヒ ト 型化する （ h u m a n i z e ) こ とが最善であるこ とを示している マウ ス W S— 4抗体の V領域をさ らに、 K a b a t , E . A. ら 、 ( 1 9 9 1 ) S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I mm u n o l o g i c a l I n t e r e s t . F i f t h
E d i t i o n , U . S . D e p a r t m e n t o f H e a 1 t h a n d H u m a n S e r v i c e s , U. S . G o v e r n m e n t P r i n t i n g O f f i c eにより定義され る ヒ ト V領域サブグループのコ ンセ ンサス配列と比較し、 V領域の F R間で対比された。 その結果を表 1 に示す。
表 1 マウ ス W S— 4 の V領域の F Rと、 種々 のサブグループの ヒ ト V領域のコ ン 七 ン サ ス配列の F R と O間の同一性 C % Ί
A. L鎖 V領域における F R
H S G I H S G 11 H S G III H S G IV
6 4 . 4 5 1 . 3 5 7 . 3 5 7 . 5
B . H鎖 V領域における F R
H S G I H S G II H S G II1
4 6. 9 4 0. 9 6 2. 3
マウス W S — 4抗体の L鑌 V領域の F Rはヒ ト L鎖 V領域のサブ グループ I ( H S G 1 ) の F Rのコ ンセ ンサス配列に最も類似して おり、 6 4 . 4 %の同一性が存在する。 一方、 マウ ス W S — 4 の H 鑌 V領域の F Rはヒ ト H II V領域のサブグルーフ' III ( H S G III ) の F Rのコ ンセ ンサス配列に最も類似しており、 6 2. 3 %の同 一性が存在する。
これらの結果は、 既知のヒ ト抗休との比較から得られた結果を支 持しており、 ヒ ト抗体 H A U中の L鑌 V領域はヒ ト L鎖 V領域のサ ブグループ Iに属し、 そ してヒ ト抗体 V D H 2 6 中の H鎖 V領域は ヒ ト H鎖 V領域のサブグループ IIIに属する。 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖 V領域の設計のためにはサブグループ I ( H S G I ) に属 する ヒ ト L鍈 V領域を使用し、 そして再構成ヒ ト W S — 4抗体 H鎮 V領域の設計のためにはサブグループ ΙΠ ( H S G III ) に属する ヒ ト抗体 H鎖 V領域を用いるのが最善であろう。
既知ヒ ト抗体 L鎖 V領域との比較において、 マウ ス W S - 4 抗体 の L鑌 V領域はヒ ト L鎖 V領域のサブグルーフ' Iの 1 構成員である ヒ ト抗休 R E I の L鑌 V領域にも類似していた。 従って、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体し鎮 V領域の設計において R E 〗 の F Rを使用した 。 R E 1 に基 く これらのヒ ト F R中には、 原著のヒ ト R E I ( P a 1 n.： W c;, . H o p p e - S e 1 e r ' ？. Z . P h y s i o ' . C h e m. , 3 5 6 , 1 6 7 - 1 9 1 , 1 9 7 5 ； E p P , 0. ら、 B i o c h e m i s t r y , 1 4 , 4 9 4 3 - 4 9 5 2 , 1 9 7 5 ) に比較して 5個のア ミ ノ酸 （位置 3 9 , 7 1 , 1 0 4 , 1 0 5及び 1 0 7 ； 表 2を参照） の相違が存在する。
なお、 表におけるア ミ ノ酸番号は K a b a t , E. A. ら （ 1 9 9 1 ) の経験に基づいている。 位置 3 9及び 7 1 における 2個のァ ミ ノ酸の変化はラ ッ ト C A M P A T H— 1 H抗体の L鎖 V領域の F R中に存在するア ミ ノ酸にもどる変化であった （ R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) 。 K a b a t ら、 （ 1 9 9 1 ) によれば、 F R 4 中の 3個のア ミ ノ酸の変化 （位置 1 0 4 , 1 0 5及び 1 0 7 ) は他 の ヒ ト e L鎮からの J領域に基いており、 ヒ トから逸脱する もので はない。
再構成ヒ ト W S — 4抗体 L鑌 V領域の 2つのバージ ョ ンを設計し た。 第一のバージ ョ ン R V L a においては、 F Rは再構成ヒ ト C A M P A T H - 1 H抗体中に存在する R E I に基く F R ( R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) と同一であり、 そして C D Rはマウス W S 一 4抗体の L鎖 V領域中の C D Rと同一にした。 第二のバージョ ン R V L bは R V L a に基き、 ヒ ト F R 3中の位置 7 1 におけるア ミ ノ酸 1個のみを異にする。 C h o t h i a , C . ら、 J . M o 1 . B i o l . 1 9 6 : 9 0 1 - 9 1 7 , 1 9 8 7 により定義されるご と く 、 残基 7 1 は L鑌 V領域の C D R 1 の標準的 （ c a n o n i c a 1 ) 構造の部分である。
こ の位置のァ ミ ノ酸は L鎖 V領域の C D R 1 ループの構造に直接 影響する と予想され、 それ故に抗体結合に大き く 影響する と考えら れている。 再構成ヒ ト W S— 4抗体 L鎖 V領域の R V L bにおいて は、 位置 7 1 のフ エ 二ルァ ラ ニ ンがチロ シ ンに変え られている。 表 2 は . マ ウ ス W S — 4 抗体の L m V領域 . 再構成ヒ ト C A P A T H一 1 H抗体中での使用のために修飾された R E I の F R ( R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) 及び再構成ヒ ト W S — 4 抗体の L鑌 V 領域の 2 種類のバージ ョ ンの、 それぞれのア ミ ノ酸配列を示す。
表二 再構成ヒ ト W? - 4 L鎖 V領域の設計
1 2 3 4
12345678901234567890123 45678901234 567890123456789
WS-4L DIQMTQSPASLSASVGETVTITC RASEIIYSYLA WYQQKQGKSPQLLVY REI DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY RVLa DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASEIIYSYLA WYQQKPGKAPKLLIY RVLb
FR1 CDR1 FR2
5 6 7 8 9
0123456 78901234567890123456789012345678 901234567
WS-4L NA TLAD GVSSRFSGSGSGTQFSLRISSLQPEDFGSYYC QHHFGFPRT REI GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLflPEDIATYYC
RVLa NAKTLAD GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHHFGFPRT RVLb —— Y
CDR2 FR3 CDR3 10
8901234567
WS-4L FGGGTKLELK
REI FGQGTKVEIK RVLa FGQGTKVEIK
RVLb
F 4 注 ： R E I の F R は再構成ヒ ト C A M P A T H _ 1 H抗体中に見 出される ものである （ R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) 。 R E 1 の F R中の 5個の下線を付したア ミ ノ酸はヒ ト R E I のア ミ ノ酸配 列と異な マ ミ 酸である： なお、 マ ノ酸は一文字表記による ア ミ ノ酸番号は K a b a t らの定義による ものである。
マウ ス W S — 4 抗体の H鎖 V領域中の F R はサブグルーフ · 111 に 属する ヒ ト H鎖 V領域に最も類似している （表 1 ) 。
マ ウ ス W S — 4 抗体の H $ V領域は、 既知のヒ ト H鑌 V領域との 比較において、 F R 1 から F R 3 までは、 ヒ ト H钹 V領域のサブグ ループ ΠΙ の 1 構成員である ヒ ト抗体 V D H 2 6 の H鎮 V領域 （ B u 1 u w e 1 a , L . ら、 E M B O J . , 7 , 2 0 0 3 - 2 0 1 0 , 1 9 8 8 ) に最も類似していた。 F R 4 については、 V D H 2 6 の F R の配列が明らかになっていなかつたため、 サブグループ III に属する ヒ ト抗体 4 Β 4 ( S a η ζ , I . ら、 J . I m m u n o 1 . , 1 4 2 , 8 8 3 - 8 8 7 , 1 9 8 9 ) の F R 4 のア ミ ノ 酸 配列を用いる こ と と した。 これらのヒ ト H鎮 V領域を、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体の H鑌 V領域の設計のための基礎と して用いた。
再構成ヒ ト W S — 4抗体 H鎮 V領域の 8種類のバージ ョ ンを設計 した。 8種類のバージ ョ ンのすべてにおいて、 ヒ ト F R 1 , 2及び 3 は ヒ ト抗体 V D H 2 6 の F R 1 , 2及び 3 に、 F R 4 はヒ ト抗体 4 B 4 の F R 4 に基いており、 そ して、 マウス C D R はマウス W S 一 4 抗体 H鎮 V領域の C D R と同一である。
表 3 および 4 に、 マウ ス W S — 4抗体の H鎖 V領域、 ί寿型のヒ ト 抗体 V D H 2 6 の F R 1 〜 3、 ヒ ト抗体 4 Β 4 の F R 4 および再構 成ヒ ト W S — 4 抗体の Η鎖 V領域の 8種類のバージョ ンの、 それぞ れのア ミ ノ酸配列を示す。 表 3 再構成ヒ ト W S — 4 H | V領域の設計 （表 4 につづ く
1 2 3
123456789012345678901234567890 12345
WS-4H EVKし VESGGGし IQPGDSし！?し SCVTSGFTFS DYYIS VDH26 EVQしし ESGGGし VQPGGSLRLSCAASGFTFS
RVHa〜h EVQしし ESGGGし VQPGGStRし SCAASGFTFS DYYLS
FR1 CDR1
4 5 6
67890123456789 012ABC3456789012345
KS- 4H WVRQPPGKALEWVG LIRNKANGYTREYSASVKG
VDH26 WVRQAQGKGLELVG
RVHa WVRQAQGKGLELVG LIRNKANGYTREYSASVKG
RVHb
RVHc p
RVHd P W- -
RVHe —— PP W--
RVHf P--A--W--
RVHg p W--
RVHh
FR2 CDR2
表 再構成ヒ ト W S - 4 H鎮 V領域 O設計 （表 3 のつつ'き
7 8 9 100
67890123456789012ABC345678901234 567890ABC12
KS-4H RFTISRDDS9SILYLQMNTLRGEDSATYYCAR EN'YRYDVEし AY VDH26 RLTISREDSKNUY MSSLKTEDし AmCAR
RVHa RLTISREDSKNTLYtQMSSLKTEDLAV'YYCAR ENYRYDVELAY RVHb
RVHc
RVHd
RVHe
VHf
VHg
RVH
FR3 CDR3
110
34567890123 注 ： RVHa〜[！ は RVHa, RVHb, RVHc,
WS-4H WGQGTLVTVSA RVHd, RVHe, RVHf , RVHg及び 4B4 WGQGTLVTVSS RVHhを示す。
RVHa〜h WGQGTし VTVSS なお、 ァ ミ ノ酸は一文字表記
FR4 によ る。 ァ ミ ノ酸番号は Kabat
らの定義による ものである。 再構成ヒ ト W S - 4 抗体 V領域をコー ドする D N Aの作製
再構成ヒ ト W S — 4抗体 V領域の作製を実施例 5 に具体的に記載 する。
再構成ヒ ト W S - 4 抗体 L鎖及び H鎖 V領域のそれぞれの第一バ 一ジ ョ ンをコー ドする D N Aを合成した。 そ して配列决定して、 再 構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎮及び H V領域のハ一ジ ョ ン 「 a の全 体 D N A配列が正しいア ミ ノ酸配列をコー ド している こ とを確認し た。 再構成ヒ ト W S — 4抗体 L H V領域パージ ヨ ン 「 a 」 の配列を 配列番号 ： 6 2 に、 再構成ヒ ト W S 4 抗体 H鎖 V領域バージ ョ ン 「 a 」 の配列を配列番号 ： 3 8 に示す。
再構成ヒ ト W S — 4抗体 V領域の他のバージ ョ ンをコー ドする D N Aは、 第一バージ ョ ン 「 a 」 を铸型に、 公表されている P C R — 変異誘発法 （ K a m m a n n , Mら、 N u c 1 e i c A c i d s e s . , 1 7 , 5 4 0 4 , 1 9 8 9 ) にわずかな変更を加えた 方法を用いて作製した。 再構成ヒ ト W S — 4抗体 V領域の設計に閲 して記載したよう に、 再構成ヒ ト W S — 4抗体 L鎖 V領域の 1 つの 追加のバージ ョ ン （バージ ョ ン 「 b 」 ） をコー ドする D N Aを作製 し、 そ して再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H鎮 V領域の 7種類の追加のバ 一ジ ョ ン （ノ、 '一ジ ョ ン 「 b 」 ， 「 c j , 「 d 」 ， 「 e j , 「 f 」 ， r g 」 及び 「 h j ) をコー ドする D N Aを作製した。
これらの追加のバージョ ンは、 第一バージョ ンからのア ミ ノ酸配 列の一連の微細な変化を舍み、 ア ミ ノ酸配列のこれらの微細な変化 は P C R変異誘発を用いて D N A配列の微細な変更を行う こ とによ り達成された。 D N A配列に必要な変化を導入する P C Rプラ イ マ 一が設計された。 一連の P C R反応に铳き、 P C R生成物をク ロー ン化し、 そして配列決定して D N A配列中の変化が計画通り に起つ ている こ とを確 ¾した。 再構成ヒ ト W S — 4抗体 L鎖 V領域パージ ヨ ン 「 b 」 の配列を配列番号 ： 6 5 に、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H 鎖 V領域バージ ョ ン 「 b 」 ， 「 c 」 ， 「 d 」 ， 「 e 」 ， 「 f 」 ， 「 g 」 ， 「 h 」 のそれぞれの配列を配列番号 4 1 , 4 , 4 5 , 4 8 , 5 1 , 5 4 , 5 5 に示す。
再構成ヒ ト W S — 4抗体 V領域の種々 のバージ ョ ンの D Ν Α配列 を 列決定によ り確 し た後 . 再構成ヒ ト 4 抗体 V領域をコ ー ドする D N Aを、 ヒ ト C領域をコー ドする D N Aをすでに舍有す る哺乳類細胞発現ベク ターにサブク ローニ ングした。 即ち、 再構成 ヒ ト W S— 4抗体 V鑌 L領域をコー ドする D N Aを ヒ ト L鎖 C領域 をコー ドする D N A配列に、 再構成ヒ ト W S - 4抗体 H鎖 V領域を コー ドする D N Aをヒ ト C 1 領域をコー ドする D N A配列にそれ ぞれ連結した。
次に再構成ヒ ト L鎖 V領域バージ ョ ン 「 a 」 あるいは 「 b 」 と、 H鑌 V領域バージ ョ ン 「 a 」 〜 「 h 」 のすベての組合せを ヒ ト I L 一 8への結合について試験し、 そしてその結果、 図 7 に記載するよ
3
う に、 L鎮バージ ョ ン 「 a 」 また 2は 「 b 」 と H鎮バージ ョ ン 「 g とを含んで成る両再構成ヒ ト抗体 （ R V し a /R V H g及び R V L b / R V H g ) がキメ ラ W S— 4 抗体と同じレベルで I L一 8 に結 合する能力を示した。
ヒ ト I L一 8 に対する本発明のキメ ラ抗体又は再構成ヒ ト抗体の 製造のために任意の発現系、 例えば真核細胞、 例えば動物細胞、 例 えば樹立された哺乳類細胞系、 真糸状菌細胞、 及び酵母細胞、 並び に原核細胞、 例えば細菌細胞、 例えば大腸菌細胞等を使用する こ と ができ る。 好ま し く は、 本発明のキメ ラ抗体又は再構成抗体は哺乳 類細胞、 例えば C 0 S細胞又は C H 0細胞中で発現される。
これらの場合、 哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモ 一ターを用いる こ とができ る。 例えば、 ヒ ト ' サイ ト メ ガロウ ィ ル ス刖期 ( h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s i m m e d i a t e e a r 1 ； H C M V ) プロ モータ ーを使用する のが 好ま しい。 H C M Vプロモーターを舍有する発現ベクターの例には 、 H C M V - V H - H C r l 、 H C M V - V L - H C 等があり、 P S V 2 n e o に由来する もの （国際公閒出願 W 0 9 2 - 1 9 7 δ 9 を参照） が含まれる。
また、 その他に本発明に用いる こ とのでき る哺乳動物細胞に於け る遗伝子発現のプロ モータ ー と しては、 レ ト ロ ウ イ ルス、 ポ リ オ一 マウ ィ ルス、 アデノ ウ イ ルス、 シ ミ ア ンウ イ ノレス 4 0 ( S V 4 0 ) 等のウ ィ ルスプロ モーター、 あるいは、 ヒ ト ' ポ リ ペプチ ド * チェ ー ン ' ェ ロ ンゲー シ ヨ ン ' フ ァ ク タ—— l et ( H E F— 1 α ) 等の 哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。 例えば、 S V 4 0 のプロモーターを使用する場合は、 M u l I i g a n , R . C . らの方法 （ N a t u r e , 2 7 7 , 1 0 8 — 1 1 4 , 1 9 7 9 ) 、 また、 H E F— 1 o プロ モータ ーを使用する場合は、 M i z u s h i m a , S . らの方法 ( N u c l e i c A c i d s R e s . ,
1 8 , 5 3 2 2 , 1 9 9 0 ) に従えば実施する こ とができ る。
本発明のために有用なプロモーターの他の具体例は H E F— 1 a プロモーターである。 このプロモーターを舍有する発現ベクターに は H E F— V H— g r l及び H E F— V L— g （図 1 ) が舍まれ る。 複製起点と しては、 ポ リ オ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ イ ルス、 S V 4 0、 牛パピローマウ ィ ルス （ B P V ) 等の由来の D N A配列を 用いる こ とができ、 さ らに、 宿主細胞系中での遺伝子コ ピー数増幅 のため、 選択マーカーと して、 ァ ミ ノ ダルコ シ ド 3 ' —ホスホ ト ラ ンス フ ヱ ラーゼあるいは n e o耐性遺伝子、 チ ミ ジ ンキナーゼ （ T K ) 遺伝子、 大腸菌キサ ンチ ンーグァニ ンホスホ リ ボシル ト ラ ンス フ ユ ラーゼ （ X G P R T ) 遣伝子、 ジ ヒ ドロ葉酸還元酵素 （ d f r ) 遺伝子を用いる こ とができ る。
要約すれば、 本発明はまず、 ヒ ト I L — 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体の L鎮 V領域及び H鎖 V領域、 並びに該 L鎮 V領域を コー ドする D N A及び該 H鎖 V領域をコー ドする D N Aを提供する 。 これらは、 ヒ ト I L一 8に対する ヒ ト マウスキメ ラ抗体及び再 構成ヒ ト抗体の作製のために有用である モ ノ 々 ロ ーナル抗体と し ては、 例えば W S— 4があげられる。 L鎖 V領域は例えば配列番号 ： 2 6 に示すァ ミ ノ 酸配列を有し、 そ して H鎮 V領域は例えば配列 番号 ： 2 7 に示すア ミ ノ酸配列を有する。 これらのア ミ ノ酸配列は 例えばそれぞれ配列番号 ： 2 6， 2 7 に示すヌ ク レオチ ド配列によ り コ ー ドされている。
本発明のヒ ト I L— 8 に対するキメ ラ抗体は、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域及びマウ ス L i V領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域及びマ ウ ス H鎖 V領域 ；
から構成される。
マウス L鎖 V領域及びマウス H鎖 V領域並びにこれらをコー ドす る D N Aは前記の通りである。 前記ヒ ト L鑌 C領域は任意のヒ ト L 鎖 C領域である こ とができ、 そ して例えばヒ ト C Λ あるいは C ス領 域である。 前記ヒ ト H鎮 C領域は任意のヒ ト H鎖 C領域である こ と ができ、 そして例えばヒ ト C r l , C r 2 , C r 3あるいは C r 4 領域 （ E l l i s o n , J . ら、 D N A, 1 , 1 1 — 1 8 ( 1 9 8 1 ) , T a k a h a s h i , N . ら、 C e H , 2 9 , 6 7 1 - 6 7 9 ( 1 9 8 2 ) , K r a w i n k e 1 , Uら、 E M B O J . , 1 , 4 0 3 — 4 0 7 ( 1 9 8 2 ) ) である。
キメ ラ抗体の製造のためには 2種類の発現ベクター、 すなわちェ ンハンサーノプロモーター系のごとき発現制御領域による制御のも とでマ ウ ス L钹 V領域及びヒ ト L鎮 C領域をコー ドする D N Aを舍 んで成る発現ベク ター、 並びにェ ンハンサ一/プロモーター系のご とき発現制御領域のも とでマ ウ ス H鎮 V領域及びヒ ト H鑌 C領域を コー ドする D N Aを舎んで成る発現ベク ターを作製する。 次に、 こ れらの発現ベク ターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質 転換し、 そ して形質転換された細胞をイ ンービ ト ロ又はイ ンー ビボ で培養してキ ノ ラ抗体を製造する。
あるいは、 マウ ス L鎖 V頷域及びヒ ト L鎮 C領域をコー ドする D N A並びにマ ウ ス H鎮 V領域及びヒ ト H鎖 C領域をコー ドする D N Aを単一の発現ベク ターに導入し、 そ して該ベク ターを用いて宿主 細胞を形質転換し、 次にこの形質転換された宿主をイ ンー ビボ又は ィ ン一 ビ ト ロで培養して目的とするキメ ラ抗体を生産させる。
本発明の再構成ヒ ト W S— 4抗体は、
( A ) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト L鑌 F R、 及びヒ ト I L一 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体 W S — 4 の L鎖 C D Rを含んで成る L鎖 V領域、 を 含んで成る L鑌 ； 並びに
( B ) ( 1 ) ヒ ト H鎮 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト H鑌 F R、 及びヒ ト I L— 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体 W S— 4 の H鎖 C D Rを舎んで成る H鎖 V領域、 を 含んで成る H鑌 ；
から構成される。
好ま しい態様においては、 前記 L鎖 C D Rは配列番号 ： 2 6に示 されるア ミ ノ酸配列であって、 該ア ミ ノ酸配列の範囲が表 5 におい て定義されるア ミ ノ酸配列を有し、 前記 H鎮 C D Rは配列番号 ： 2 7 に示されるァ ミ ノ酸配列であつて該ァ ミ ノ酸配列の範囲が表 5に おいて定義されるア ミ ノ酸配列を有し ； 前記ヒ ト L鎖 F Rが R E I に由来する ものであり ； 前記ヒ ト H鑌 F R 1 , 2および 3 は V D H 2 6 に、 F R 4 は 4 B 4 に由来する ものであり ； 前記ヒ ト L鎖 C領 域はヒ ト C 領域であり ； そして前記ヒ ト H鎮 C領域はヒ ト C 7· 1 領域である。 また、 前記ヒ ト H鑌 C領域はヒ ト C 7 4領域であって もよ く 、 あるいは前記ヒ ト L鎖 C領域および Zまたはヒ ト H i C領 域のかわり にラ ジオア イ ソ トープを結合させてもよい。 特定の抗原 対して十分に活性がある再構成ヒ ト抗体を作 H!す ために、 前記ヒ ト F Rのア ミ ノ酸配列の一部を置換する こ とが望ま しい。
好ま しい態様においては、 L鎖 V領域は表 2 において R V L a あ るいは R V L b と して示されるァ ミ ノ酸配列を有し、 H鎮 V領域は 表 3 および表 4 に R V H a 、 R V H b、 R V H c、 R V H d 、 R V H e、 R V H f 、 R V H g又は R V H h と して示されるア ミ ノ 酸配 列を有する。 さ らに、 H鎖 V領域 F R 2 中の 4 1 位のア ミ ノ酸がプ ロ リ ンである こ と、 同 4 7 位のア ミ ノ酸力く ト リ ブ ト フ ァ ンである こ と、 および/または同 F R 3 中の 6 7位のア ミ ノ酸がフエ二ルァラ ニ ンである こ とがよ く 、 R V H b , R V H d , R V H e , R V H f , R V H g又は R V H h と して示されるア ミ ノ酸配列を有する もの がより好ま しい。 このう ち、 R V H g が H鑌 V領域と して最も好ま しい。
再構成抗体の製造のためには、 2種類の発現ベクター、 すなわち ェ ンハ ンサー /プロモーター系のごとき発現制御領域による制御の もとに前に定義した再構成ヒ ト L鎖をコー ドする D N Aを含んで成 る発現ベク ター、 及びェ ンハ ンサー プロモーター系のごとき発現 制御領域のもとに前に定義した再構成ヒ ト H鎮をコー ドする D N A を含んで成る もう一つの発現ベク ターを作製する。 次に、 これらの 発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換 し、 そ してこの形質転換された細胞をイ ン — ビボ又はイ ン ー ビ ト ロ で培養して再構成ヒ ト抗体を生産せしめる。
あるいは、 再構成ヒ ト L鎮をコー ドする D N A及び再構成ヒ ト H 鎮をコ一 ドする D N Aを単一の発現ベク ターに導入し、 そ してこの ベク ターを用いて宿主を形質転換し、 次にこの形質転換された宿主 細胞をィ ンー ビボ又はィ ンー ビ ト ロで培養して目的とする再構成ヒ ト抗体を生産せしめる。
こ う して生産されたキメ ラ抗体又は再構成ヒ ト抗体は、 常法に従 つて、 例えばプロ テ イ ン Aァ フ ィ 二テ ィ 一ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ィ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 ゲル濾過等によ り単離、 精製する こ とができる。
本発明のキメ ラ L鎮又は再構成ヒ ト L鎮は H鎖と組合わせる こ と により完全な抗体を作製するために使用する こ とができ る。 同様に 本発明のキメ ラ H鎖又は再構成ヒ ト H鎖は L鎖と組合わせる こ とに より完全な抗体を作製するために用いる こ とができる。
本発明のマウ ス L鎖 V領域、 再構成ヒ ト L鎖 V領域、 マウ ス H鎖 V領域、 及び再構成ヒ ト H鎮 V領域は、 本来、 抗原である ヒ ト I L 一 8 と結合する領域であり、 それ自体と して、 又は他の蛋白質との 融合蛋白質と して医薬、 診断薬等と して有用である と考えられる。
また、 本発明の L鎖 V領域 C D R及び H鎖 V領域 C D R も、 本来 、 抗原である ヒ ト I L 一 8 と結合する部分であり、 それ自体と して 又は他の蛋白質との融合蛋白質と して医薬、 診断薬等と して有用で ある と考え られる β
本発明のマウス L鑌 V領域をコー ドする D N Aはキメ ラ L鎮をコ ー ドする D N A又は再構成ヒ ト L鑌をコー ドする D N Aの作製のた めに有用である。 同様にマウス Η鎖 V領域をコー ドする D N Aはキ メ ラ Η鎖をコー ドする D N A又は再構成ヒ ト Η鑌をコー ドする D N Αの作製のために有用である。 また、 本発明の L鎖 V領域 C D Rを コー ドする D N Aは再構成ヒ ト L鎮 V領域をコー ドする D N A及び 再構成ヒ ト L鎖をコー ドする D N Aの作製のために有用である。
同樣に本発明の H鑌 V領域 C D Rをコー ドする D N Aは再構成ヒ ト H鎖 V領域をコー ドする D N A及び再構成ヒ ト H鎮をコー ドする D N A作製のために有用である。 さ らには、 再構成ヒ ト抗体の F ( a b ' ) z . F a b あるいは F v を . 又 . H ί直及び L鑌の両 F v を連結させたシ ングルチヱー ン F vを適当な宿主で産生させ、 前述 の目的に使用する こ とができ る （例えば、 B i r d , R . E . ら、 T I B T E C H , 9 , 1 3 2 — 1 3 7 , 1 9 9 1 を参照） 。
シ ングルチヱ イ ン F V は、 ヒ ト I L — 8 に対する再構成ヒ ト抗体 の Η鎮 V領域と L鎖 V領域を連結してなる。 こ の シ ングルチヱ イ ン F V において、 Η鑌 V領域と L鎮 V領域はリ ンカ一、 好ま し く は、 ペプチ ド リ ンカ一を介して連結されている （ H u s t o n , J . S . ら、 P r o c . N a l . A c a d . S c i . U . S . A. , 8 5 , 5 8 7 9 - 5 8 8 3 , 1 9 8 8 ) .
シ ングルチヱ イ ン F vにおける H I V領域および L鎮 V領域は、 再構成ヒ ト抗休の H鎖および L鎮 V領域と して前記記載された もの のいずれであってもよい。 具体例と して、 配列番号 3 8 , 4 1 , 4 4 , 4 5 , 4 8 , 5 1 , 5 4 , 5 5のいずれかに記載のア ミ ノ酸配 列からなる H鎮 V領域と、 配列番号 6 2 , 6 5 のいずれかに記載の ァ ミ ノ酸配列からなる L鑌 V領域を含んでなる シングルチエイ ン F Vが挙げられる （W 0 8 8 - 0 1 6 4 9を参照） 。
これらの V領域は、 好ま し く は、 ペプチ ド リ ンカ一によ つて連結 されている。 ペプチ ドリ ンカ一と しては、 例えばア ミ ノ酸 1 2〜 1 9残基からなる任意の一本鎮ペプチ ドが用いられる （ W 0 8 8 — 0 9 3 4 4 を参照） 。
シ ングルチユ イ ン F Vをコー ドする D N Aは、 前記記載の再構成 ヒ ト抗体の H鎮または、 H鎮 V領域をコー ドする D N A、 および L 鎖または、 L鎖 V領域をコー ドする D N Aを铸型と し、 それらの配 列のう ちの所望のァ ミ ノ酸配列をコー ドする D N A部分を、 その両 端を規定するプラ イマー対を用いて、 P C R法により増幅し、 次い で、 さ らにべプチ ド リ ンカ一部分をコー ドする D N Aおよびその両 端を各 H鎮、 L鑌と連結されるよ う に規定するブラ イ マ ー対を組 み合せて増幅する こ とによ り得られる。
また、 一旦シ ングルチヱイ ン F Vをコー ドする D N Aが作成され れば、 それらを舍有する発現ベクター、 および該発現べクタ一によ り形質転換された宿主を常法に従って得る こ とができ、 また、 その 宿主を用いて常法に従って、 シ ングルチュ イ ン F vを得る こ とがで きる。
シ ングルチュ イ ン F V は、 抗体分子に比べ、 組織への移行性が優 れており、 ラ ジオァイ ソ トープ標識によるイ メ ージングへの利用、 および再構成ヒ ト抗体と同様の機能を有する治療剤と しての利用が 期待される。
本発明のヒ ト I L一 8に対するキメ ラ抗体、 再構成ヒ ト抗体およ びその F ( a b ' ) z , F a b , F vある いはシ ングルチェー ン F V の結合活性を確認する方法と して、 E L I S A (酵素結合免疫吸 着検定法） ， E 1 A (酵素免疫測定法） 、 R I A (放射免疫測定法 ) あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。 例えば、 キメ ラ抗体 、 再構成ヒ ト抗体について、 酵素免疫測定法を用いる場合、 抗ヒ ト I L一 8ボ リ ク ローナル抗体をコー ト したプレー ト に ヒ ト I L— 8 を添加し、 こ こ に ヒ ト I L一 8に対するキ メ ラ抗体、 再構成ヒ ト抗 体を産生する細胞の培養上清あるいは精製サ ンプルを加え、 アル力 リ フ ォ スフ ァ ターゼ等の酵素で標識した適切な二次抗体を添加する 。 ブレー ト のイ ンキ ュ ベー シ ョ ンおよび洗浄の後、 p— 二 ト ロ フ エ ニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定する こ とで抗原結合 活性を評価する こ とができる。
本発明のヒ ト I L一 8に対するキメ ラ抗体、 再構成ヒ 抗体およ びその F ( a b ' ) 2 , F a b , F vあるいはシ ングルチェ イ ン F V の I L一 8 レセプターに対する I L一 8結合阻害活性は、 通常の リ ガン ド レセプ ー桔合阻害マ '；' セ ィ によ り評価される。 例えば - 好中球上の I L — 8 レセプタ ーに対する I L 一 8 の結合阻害ア ツ セ ィ には、 へバリ ン採血などにより得られる好中球を遠心分離等の手 段で分離した後、 上記ア ツセ ィ に好適な数の細胞懸濁液となるよう 調製して用いる こ とができ る。
1 Z5 I などで適当に標識した I L一 8 と非標識の I L— 8を舍む 溶液と適当な濃度に調製した本発明の抗体またはその断片を含む溶 液を混合し、 次いでこれを上記好中球懸濁液に添加する。 一定時間 の後、 好中球を分離し、 好中球上の標識された活性を測定すればよ い ,
本発明の抗体またはその断片による好中球遊走作用 （ケモタキ シ ス ； c h e m o t a x i s ) の阻害能を評価する には通常知られた 方法、 例えば G r o b , P . . ら J . B i o l . C h e m. , 2 6 5 , 8 3 1 1 — 8 3 1 6 , 1 9 9 0 に記載された方法を用いるこ とができ る。
市販のケモタキ シスチャ ンバ一を用いる場合、 本発明の抗体また はその断片を適当な培養液で希釈した後、 I L — 8を加え、 これを チ ャ ンバ一に分注する。 ついで、 調製した好中球懸濁液をチ ャ ンバ 一に添加し、 一定時間放置する。 遊走する好中球は、 チ ャ ンバ一に 装着されたフ ィ ルターに付着するので、 その好中球の数を染色液あ るいは蛍光抗体等の通常の方法で測定すればよい。 また、 顕微鏡下 での肉眼による判定や機械を用いる自動測定も可能である。
本発明のヒ ト I L 一 8 に対するキメ ラ抗体、 再構成ヒ ト抗体およ びその F ( a b ' ) 2 , F a b , F vあるいは シ ングルチェー ン F V は、 メ ンブレ ンフ ィ ルタ一によ る濾過滅菌の後、 好ま し く は非経 口的に、 例えば、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射 等により、 あるいは経気道的に、 例えば、 ネブラ イ ザ一 （ n e b u 】 i 7 。 Γ ) によ り 、 医薬療法剤と して投与する こ とができ るく ヒ トに対する投与量は、 患者の状態、 年齢等により異なるがおよそ 1 〜 1 0 0 0 mgZbodyであり、 1 一 1 O mgZkgZ週の分割用量を選択 する こ とができ る。
本発明のヒ ト I L一 8に対するキメ ラ抗体、 再構成ヒ ト抗体およ びその F ( a b ' ) 2 , F a b , F vあるいはシングルチェーン F V は、 精製され結合活性を評価された後に、 生理活性タ ンパク質の 製剤化に通常用いられる方法により、 医薬療法剤と して製剤化され る。 たとえば、 注射用製剤は精製された ヒ ト I L— 8に対するキメ ラ抗体、 再構成ヒ ト抗体およびその F ( a b ' ) 2 , F a b , F v あるいはシングルチューン F vを、 溶剤、 例えば、 生理食塩水、 緩 衝液などに溶解し、 それに吸着防止剤、 例えば、 T w e e n 8 0、 ゼラチ ン、 ヒ ト血清アルブミ ン （ H S A) などを加えたものであり 、 または使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであって もよい。 凍結乾燥のための賦形剤と しては、 糖アルコール又は糖、 例えばマンニ トール、 ブ ドウ糖などをもちいるこ とができ る。 実施例
次に、 本発明を下記の実施例により具体的に説明する力、'、 これに より本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例 1. ヒ ト I L— 8に対するマウスモノ ク ローナル抗体の
V領域をコー ドする D N Aのク ローニング
ヒ ト I L一 8に対するマウスモノ ク ローナル抗体の可変領域をコ 一ドする D NAを次の様にしてク ローユングした。
1. 全 R N Aの調製
ノヽイ ブリ ドーマ W S— 4からの全 R NAを、 C h i r g w i n , J . M . ら、 B i o c h e m i s t r y , 1 8 , 5 2 9 4 - 5 2 9 9 , 1 9 7 9 によ り 記載されている塩化七 ： ''' ^ ム密度勾配遠心法を 修飾して調製した。
すなわち、 1 X 1 07 個のハイ プリ ドーマ W S — 4 の細胞を 2 5 mlの 4 Μグァニジ ンチオ シァネー ト （ F u 1 k a社製） 中で完全に ホモジナイ ズさせた。 ホモ ジネー トを遠心管中の 5. 7 M塩化セ シ ゥ ム溶液層上に重層し、 次にこれを B e c k m a n S W 4 0 口一 ター中で 3 1 . 0 0 0 rpm にて 2 0 'Cで 1 4時間遠心分離する こ と によ り R N Aを沈殺させた。
R N A沈殺物を 8 0 %エタノ ールによ り洗浄し、 そ して 1 O mM E D T A及び 0. 5 % N— ラ ウ ロ イ ルザルコ シ ン酸ナ ト リ ウ ムを 舍有する 2 0 mM T r i s - H C 1 (PH 7. 5 ) 2 0 0 // 1 Φに溶 解し、 そしてそれに P r o t e n a s e ( B o e h r i n g e r社 製） を 0. 5 mg Ζπι 1となるよ う に添加した後、 3 7 て にて 3 0分間 温浴中でイ ンキュベー ト した。 混合物をフヱノ ール及びク ロ 口ホル ムで抽出し、 そ して R N Aをエタ ノ ールで沈殺させた。 次に、 R N Α沈殺物を I mM E D T Aを舍有する 1 0 mM T r i s - H C 1 ( pH 7. 5 ) 2 0 0 1 に溶解した。
2 . メ ッ セ ンジャー R N A ( m R N A ) の抽出
マ ウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体 W S— 4 H鎖をコー ドする m R N Aを 抽出するため、 F a s t T r a c k m R N A I s o 1 a t i o n K i t V e r s i o n 3. 2 ( l n v i t r o g e n社 製） を用いて、 その指示書に記載の方法に従い、 上記 1 . で得られ た全 R N Aから p 0 1 y ( A ) ポジテ ィ ブな m R N Aを抽出した。
3. 一本鎮 c D N Aの合成
c D N A C y c l e K i t ( I n v i t r o g e n社製） を 用いて、 その指示書に記載の方法に従い、 上記 2. で得られた約 4 0 n gの m R N Aより一本鎖 c D N Aを合成し、 マウ ス H鎮 V領域 をコー ドする c D Ν Aの増幅：こ用いた。 尚、 マウ ス L ί . V領域を r 一ドする c D N Aを増幅するために、 約 1 0 μ gの上記全 R N Aよ り一本鎮 c D N Aを合成した。
4. 抗体可変領域をコー ドする遺伝子の P C R法による増幅
( 1 ) マウ ス H鑌 V領域をコー ドする c D N Aの増幅
P C Rのためのプラ イ マーは、 配列番号 ： 1 3〜 2 4 に示す M H V
(M o u s e H e a v V a r i a b l e プラ イ マー ：！ 〜 1 2、 及び配列番号 ： 2 5 に示す M H C ( M o u s e H e a v y C o n s t a n t ) プラ イ マー （ J o n e s , S . T. ら、 B i o /T e c h n o l o g y , 9 , 8 8 - 8 9 , 1 9 9 1 を使用した。
P C R溶液 1 0 0 1 は、 1 0 mM T r i s - H C 1 (pH 8. 3 ) , 5 0 mM K C 1 , 0. I mM d N T P s ( d A T P , d G T P , d C T P . d T T P ) 、 1. 5 mM M g C 1 2 , 0. 0 0 1 % ( W/V ) ゼラ チ ン， 5ユニ ッ ト の D N Aボ リ メ ラーゼ A m p 1 i T a q ( P e r k i n E l m e r C e t u s社） 、 0. 2 5 〃 M の配列番号 ： 1 3〜 2 4 に示す1^ 11 ¥プラィ マーのぅ ち一っと 1. 7 5 Mの配列番号 ： 2 5に示す M H Cブラ イ マー及び上記 3. で 得られた一本鎮 c D N A溶液 1. 5 ;t 1 を含有し、 M H V 1〜 1 2 プラ イ マーの各々 について別々に用意した。 これを 5 0 μ 1 の鉱油 で覆った後、 9 4 ての初期温度にて 3分間そして次に 9 4 てにて 1 分間、 5 5 てにて 1 分問及び 7 2 ·(： にて 1 分間、 こ の順序で加熱し た。 この温度サイ クルを 3 0回反復した後、 反応混合物をさ らに 7 2て にて 1 0分間イ ンキ ュ ベー ト した。
( 2 ) マウ ス L鎖 V領域をコー ドする c D Ν Αの増幅
P C Rのためのプライ マーと して配列番号 ： 1〜 1 1 に示す M K V ( M o u s e K a p a V a r i a b l e ) フ ラ イ マー ：！ 〜
1 1 、 及び配列番号 ： 1 2に示す M K C ( M 0 u s e K a p p a C c Ώ z ι a n ί ) 二 く マー （ J o n e ' . . 丁. ら 、 B ； o / T e c h n o l o g y , 9 , 8 8 — 8 9 , 1 9 9 1 ) を使用 し た。
c D N Aの増幅は、 それぞれ 0 . 2 5 / Mの M K Vプラ イ マー混 合物と 3 . 0 Mの M K Cプラ イ マーを用いて増幅した点を除いて 、 前記 4 . ( 1 ) において H鎖 V領域遺伝子の増幅について記載し たのと同じ方法により上記 3 . で得られた一本 i c D N' A溶液 2 . 0 μ 1 から増幅を行なった。
5 . P C R生成物の精製および断片化
前記のよう に して P C R法により増幅した Η鎖 V領域および L鎖 V領域それぞれの D Ν Α断片を 1 . 5 %低融点ァガロース （ S i g m a社製） を用いるァガロースゲル電気泳動により分離した。 約 4 5 0 bp長の H鎮 D N A断片と約 4 0 0 bp長の L鎮 D N A断片を舍有 するァガロース片をそれぞれ切り取り、 そ して 6 5 てにて 5分間溶 融せしめ、 そしてこれと同容積の 2 niM E D T A及び 3 0 0 mM N a C 】 を舍有する 2 0 mM T r i s - H C 1 (PH 7 . 5 ) を加えた この混合物をフ Λノ ール及びク ロ 口ホルムにより抽出し、 そ して D N A断片をエタノ ール沈殺により回収し、 そして I mM E D T A を舍有する 1 0 mM T r i s — H C 1 (PH 7 . 5 ) に溶解した。 次 に、 1 0 mM M g C l 2 及び l mMジチオス レイ ト一ルを舍有する 1 0 mM T r i s - H C 1 (PH 7 . 9 ) 中で 5 ユニ ッ トの制限酵素 X m a I ( N e w E n g l a n d B i o L a b s 社製) を用いて 3 7 てにて 3時間消化した。 次に、 4 0 ユニ ッ ト の制限酵素 S a 1 I (宝酒造社製） により 3 7 てにて 2時間消化し、 そして生ずる D N A断片を、 1 . 5 %低融点ァガロース （ S i g m a 社製） を用い るァガロースゲル電気泳動によ り分離した。 D N A断片を舍有するァガロース片を切り取り そ して 6 5 てにて 5分間溶融せしめ、 そ してこれと同容積の 2 mfl E D T A及び 3 0 0 ηιΜ N a C 1 を舍有する 2 0 mM T r i s - H C 1 (PH 7 . 5 ) を加えた。 こ の混合物をフ ヱ ノ ール及びク 口 口ホルムにより抽出し 、 そして D N A断片をエタノ ール沈殺により回収し、 そ して I mM E D T Aを舍有する 1 0 mM T r i s — H C 1 (PH 7 . 5 ) に溶解 した。
こ う して、 マウス A:型 L鎖 V領域をコー ドする遺伝子を含んで成 る D N A断片、 及びマウス H鑌 V領域をコー ドする遺伝子を含んで 成る D N A断片を各々得た。 上記 D N A断片はいずれもその 5 ' 末 端に S a 1 I 接着末端を有し、 そ してその 3 ' 末端に X m a I 接着 末端を有する。
6. 連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウ スカ ッパ型 L鎮 V領域をコー ドす る遺伝子を含んで成る S a 1 I - X m a I D N A断片約 0. 3 〃 gを、 S a 1 I、 X m a I 及び大腸菌由来のアルカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ （ B A P ； 宝酒造社製） で消化する こ とにより調製した P U C 1 9 ベクター （宝酒造社製） 約 0. l / g と、 1 ユニ ッ ト T 4 D N Aリ ガーゼ （ G I B C 0 B R L社製） 及び添付のバッ ファーを 含有する反応混液中で、 1 6 てにて 4時間反応させ連結した。
次に、 5 1 の上記連結混合物を大腸菌 D H 5 αのコ ン ピテ ン ト 細胞 （ G I B C O B R L社製） 5 0 / 1 に加え、 そ してこの細胞 を氷上で 3 0分問、 4 2 'Cにて 1 分間そ して再び氷上で 1 分間静置 した。 次いで 4 0 0 // 1 の 2 Χ Υ Τ培地 （ M o 1 e c u 1 a r C 1 o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l , S a m b r o o k ら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , ( 1 9 8 9 ) ) を加え、 3 7 てにて 1 時間イ ン キ 二 ペー ト した後.. 5 Q μ C m 1のァ ン ピ シ リ ン (明治製 菓社製） を舍有する 2 X Y T寒天培地 （ M o 1 e c u 1 a r C 】
0 n i n g ： A L a b o r a t o r y M a n u a l , S a m b r o o k ら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , ( 1 9 8 9 ) ) 上に こ の大腸菌をま き、 3 7 てにて一夜イ ンキ ュ ベー ト して大腸菌形質転換体を得た。
尚、 こ の際選択マーカーと して X— G a l ( 5 - b r 0 m 0 - 4 — c h I o r o — 3 — i n d o l y l — /? 一 D— g a l a c t o s
1 d e , 宝酒造社製） 5 0 i/ gを塗布した。
こ の形質転換体を、 5 0 g Zmlのア ン ビシ リ ンを舍有する 2 X Y T培地 1 O ml中で 3 7 てにて一夜培養し、 そ してこの培養物から 、 Q I A G E N p l a s m i d m i n i k i t ( Q I A G E N社製） を用いて、 その指示書に記載の方法に従ってプラス ミ ド D N Aを調製した。
こ う して得られた、 ノヽイ ブリ ドーマ W S— 4 に由来するマウス κ 型 L鎖 V領域をコー ドする遺伝子を舍有するプラ ス ミ ドを p U C— W S 4 一 V L と命名した。
大腸菌コ ン ビテ ン ト細胞を J M 1 0 9を用いた点を除いて、 上記 の同じ方法に従って、 ハイ プリ ドーマ W S— 4 に由来するマ ウ ス H 鎖 V領域をコー ドする遺伝子を舍有するプラ ス ミ ドを S a 1 I - X m a I D N A断片から作成し、 そ して P U C— W S 4 — V Hと命 名した。
実施例 2. D N Aの塩基配列の决定
前記のブラス ミ ド中の c D N Aコー ド領域の塩基配列を、 シーク エ ンスプラ イ マーと して M 1 3 P r i m e r R Vおよび M l 3
P r i m e r M 4 (両者と も宝酒造社製） 、 自動 D N Aシーク ェ ンサ一 （ A p p l i e d B i o s y s t e m I n c製） およ び T a D e o x T e r m i n s L o r C y c 1 e S e q u e n c i n g K i t ( A p p l i e d B i o s y s t e m I n c製） を用いて、 メ ーカー指定のプロ ト コールに従 つて塩基配列を決定した。 プラス ミ ド P ϋ C— W S 4 — V Lに舍ま れるマウス W S — 4抗体の L鎮 V領域をコー ドする遺伝子の塩基配 列を配列番号 ： 2 6 に示す。 また、 プラス ミ ド P U C— W S 4 — V Ηに含まれるマウス W S — 4 抗体の Η鎮 V領域をコー ドする遣伝子 の塩基配列を配列番号 ： 2 7 に示す。
実施例 3. C D Rの決定
L鎖及び Η鎖の V領域の基本的構造は、 互いに類似性を有してお り、 それぞれ 4 つのフ レームワーク領域が 3 つの超可変領域、 即ち 相補性決定領域 （ C D R ) により連結されている。 フ レームワーク のア ミ ノ酸配列は、 比較的良 く 保存されているが、 一方、 C D R領 域のア ミ ノ 酸配列の変異性は極めて高い （ K a b a t , E . A. ら 、 「 S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I m m u n o 1 o g i c a 1 I n t e r e s t 」 U S D e p t . H e a 1 t h a n d H u m a n S e r v i c e s , 1 9 9 1 ) 。 この様な事実に基づき、 ヒ ト I L一 8 に対するマウスモノ ク ロ一 ナル抗体の可変領域のァ ミ ノ酸配列を K a b a t らにより作成され た抗体のァ ミ ノ酸配列のデータベースにあてはめて、 相同性を調べ る こ とにより C D R領域を表 5 に示す如く 決定した。
表 5 マウス W S — 4 抗体の L鎮 V領域ならびに H鎮 V領域中の C D R
プラス ミ ド 配歹！!番号 CDR1 CDR2 CDR3 pUC- WS4-VL 26 24— 34 50 - 56 89 - 97
PUC-KS4-VH 27 31— 35 50 - 68 101— 111 荬施例 4 . ク 匚' ー ン化 c D N Aの発現の確 (キ メ ラ W — Λ 杭休の作製）
発現べクターの作製
キメ ラ W S — 4 抗体を発現するベク タ ーを作製するため、 それぞ れマ ウ ス W S — 4 L鎖及び H鎖 V領域をコー ドする c D N Aク ロー ン p U C— W S 4 — V L及び p U C— W S 4 — V Hを P C R法によ り修飾した。 そ して H E F発現ベクター （前記、 W 0 9 2 — 1 9 7 5 9及び図 1 を参照のこ と） に導入した。
L鎖 V領域のための後方ブラ イ マ一 （配列番号 ： 2 8 ) 及び H鎮 V領域のための後方ブラ イ マ一 （配列番号 ： 2 9 ) は、 各々の V領 域のリ ーダ一配列の最初をコー ドする D N Aにハイ ブリ ダィ ズし且 つ K o z a k コ ンセ ンサス配歹！] ( K o z a k , M . ら、 J . U o 1 . B i o l . 1 9 6 , 9 4 7 - 9 5 0 , 1 9 8 7 ) 及び H i n d ll I 制限部位を有するよう に設計した。 L鎖 V領域のための前方ブラ イ マ一 （配列番号 ： 3 0 ) 及び H鎮 V領域のための前方プラ イ マー (配列番号 ： 3 1 ) は、 J領域の末端をコー ドする D N A配列にハ イ ブリ ダィ ズし、 且つ、 スブラ イ ス ドナー配列及び B a m H I 制限 部位を付加するよう に設計した。
2 0 mM T r i s - H C 1 ( H 8. 2 ) 、 1 0 mM K C 1、 6 mM ( N H 4 ) 2 S 04 , l %T r i t o n X - 1 0 0 1 0 0 〃 M d N T P s、 1 . 5 mM M g C l 2 、 l O O pmole ずつの各ブライ マー、 1 0 0 n g の铸型 D N A ( p U C - V L又は p U C — V H ) 、 及び 2. 5 し'の A m p l i T a q酵素を舍有する 1 0 0 1 の P C R反応混合物を 5 0 1 の鉱油で覆い、 9 4 'Cにて 3分間最初 の変性の後、 9 4 て にて 1 分間、 5 5 'Cにて 1 分間、 7 2 て にて 1 分間のサ イ ク ルを 3 0 回行い、 最後に 7 2 て にて 1 0分間ィ ンキ ュ ペー ト した。 P C P生成物を I . 5 %低融点ァ ガ ロ ー ス ゲルを用いて精製し - H i n d III 及び B a m H I で消化し、 そ して L鎮 V領域について は、 H E F発現ベクター H E F — V L — g x に、 H鎮 V領域につい ては H E F発現ベクター H E F — V H - g 丁 1 にそれぞれク ロー二 ングした。 D N A配列決定の後、 正しい D N A配列を有する D N A 断片を舍むプラス ミ ドをそれぞれ H E F — c h W S 4 L - g κ , Η Ε F - c h W S 4 Η - g τ 1 と命名した。
C O S細胞への ト ラ ンスフ エ ク ショ ン
キメ ラ W S — 4抗体の一過性発現を観察するため、 前記発現べク ターを C O S細胞において試験した。 H E F — c h W S 4 L — g « な らびに H E F — c h W S 4 H— g r l を G e n e P u l s e r 装置 （ B i o R a d社製） を用いてエ レク ト ロボレーシ ョ ンにより C O S細胞に同時形質転換した。 各 D N A ( 1 0 // g ) を、 P B S 中 1 X 1 07 細胞 Zmlの 0. 8 mlのァ リ コ ー ト に加え、 1 . 5 k V 、 2 5 μ Fの容量にてパルスを与えた。
室温にて 1 0分間の回復期間の後、 エ レク ト ロボ レー シ ョ ン処理 された細胞を、 5 %の r一グロプリ ンフ リ ーゥ シ胎児血'清を含有す る D M E M培養液 （ G I B C 0社製） 1 5 m l に憨濯し、 組織培養 シ ャー レに添加した。 9 6時間のィ ンキ ュ ベーシ ョ ンの後、 培養上 清を集め、 遠心分離により細胞破片を除去し、 直径 0. 4 5 // mの デ ィ ス ク フ イ ノレター （ G e 1 m a n S c i e n c e社製） にて滹 過した。
E L I S A
抗原結合測定および抗体濃度測定のための E L I S Aプレー トを 次のよう にして調整した。 抗原結合活性測定のための E L I S Aプ レー ト は次の様に して調製した。 9 6穴プレー ト （ N u n c社製） の各ゥ ュルを、 濃度 2 g Zm 1 で固層化バ ッ フ ァ ー （ 0. 1 M 炭酸水素ナ ト リ ウ 一 . 2 ア ジ化十 ト リ ウ ム ） に瑢解し た ャギ抗ヒ ト I L — 8 ボ リ ク ローナル抗休 （ R & D s y s t e m s 社製） 1 0 0 1 で固層化し、 希釈バ ッ フ ァ ー （ 5 0 m M T r i s — H C l , p H 7 . 2 , 1 %ゥ シ血清アルブ ミ ン （ B S A ) , 1 m M M g C 1 2 , 0 . 1 5 N a C 1 , 0 . 0 5 % T e e n 2 0 , 0 . 0 2 % ア ジ化ナ ト リ ウム） 2 0 0 〃 1 でブロ ッキ ン グの後、 濃度 5 n g ノ m l 組換えヒ ト I L — 8 ( A m e r s h a m 社製） 1 0 0 1 を添加した。
キメ ラ抗体の精製サンプル、 あるいはこれらを発現させた C O S 細胞の培養上'清を順次希釈して、 各ゥ ュルに加え、 次に濃度 1 g / m 1 のアルカ リ ホ ス フ ァ タ ーゼ標識ャギ抗ヒ ト I g G抗体 （ T A G O社製） 1 0 0 1 を加えた。 イ ンキ ュ ベー シ ョ ン及び洗浄の後 、 基質溶液 （ l m g /m l P — 二 ト ロフ ユ ニル燐酸） を加え、 次 に 4 0 5 nmでの吸光度を測定した。
抗体濃度測定には、 9 6穴プレー トを濃度 1 ti g /m 1 ャギ抗一 ヒ ト I g G抗体 （ T A G O社製） 1 0 0 I で固層化し、 ブロ ッキ ングの後、 キメ ラ抗体の精製サ ンプル、 あるいはこれらを発現させ た C 0 S細胞の培養上清を順次希釈して、 各ゥ ルに加え、 次に濃 度 1 1 のアルカ リ ホスフ ァ ターゼ結合ャギ抗ー ヒ ト I g G 抗体 （ T A G O社製） 1 0 0 a 1 を加えた。 ィ ンキュベーシ ョ ン及 び洗浄の後、 基質溶液 （ 1 m g / m 1 P —ニ ト ロフ ユニル燐酸、 S i g m a 社製） を加え、 次に 4 0 5 ηιτιでの吸光度を測定した。 その結果、 キ メ ラ抗体 W S — 4 力く I L — 8 に特異的に結合したこ とによ り 、 こ のキ メ ラ抗体がマウ スモ ノ ク ローナル抗体 W S — 4 の V領域の正しい構造を有する こ とが示唆された （図 2 を参照のこ と なお、 前記ブラ ス ミ ド H E F — c h W S 4 L — g を有する大腸 菌は E h e r i c h i a c l : D H 5 Q- ( H E F - c 1： Ψ S 4 I - g K ) 、 および前記プラ ス ミ ド H E F — c h W S 4 H — g r , を有する大腸菌は E s c h e r i c h i a c o 1 i J M 1 0 9 ( H E F - c h W S 4 H - g r . ) と して工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 （茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 3号） に、 平成 6 年 7 月 1 2 曰に各々， F E R M B P — 4 7 3 9 、 および F E R M
B P — 4 7 4 0 と してブタぺス ト条約に基づき国際寄託された。 実施例 5. 再構成ヒ ト W S — 4杭体の作製
再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H鎖 V領域の作製
再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H鑌 V領域をコー ドする D N Aを次の様 に して設計した。 ヒ ト抗体 V D H 2 6 の F R 1 〜 3 およびヒ ト抗体 4 B 4 の F R 4 をコー ドするそれぞれ既知の D N A配列をマウス W S — 4 抗体 H鎖 V領域の C D Rをコー ドする D N A配列が連結され るよう に再構成ヒ ト W S — 4抗体 H鎮 V領域をコー ドする全長 D N Aを設計した。
次に、 こ の D N A配列のそれぞれ 5 ' 側及び 3 ' 側に H i n d II I 認識部位/ K 0 Z A Kコ ンセ ンサス配列及び B a m H I 認識部位 /スプラ イ ス ドナー配列をそれぞれ付加して、 H E F発現ベク ター に挿入でき るようにした。 こ う して設計した D N A配列をほぼ均等 な 4 本のオ リ ゴヌク レオチ ドに分け、 そ して次に、 これらのオ リ ゴ ヌ ク レオチ ドのアセ ンブ リ ーを妨害する可能性のあるオ リ ゴヌ ク レ 才チ ド中の二次構造についてコ ンビューター解析した。
4 本のオ リ ゴヌ ク レオチ ド配列を配列番号 ： 3 2〜 3 5 に示す。 これらのオ リ ゴヌク レオチ ドは 1 1 3 〜 1 4 3塩基の長さを有し、 隣接する 2本のオ リ ゴヌク レオチ ドは互いに 2 0塩基のォ一バラ ッ プ領域を有する。 4本のオ リ ゴヌ ク レオチ ドの内 H F 1 (配列番号 : 3 2 ) 、 H F 3 (配列番号 ： 3 4 ) はセ ンス D N A配列を有し、 そ して他の H F ？ ( K列番号 ： 3 ？ ) 、 H F .! (配列番号 ： 3 5 はア ンチセ ンス D N Α配列を有する。 これらのオ リ ゴヌ ク レオチ ド を自動 D N A合成装置 （ A p p 1 i e d B i o s y s t e m s 社 ) によ って合成した。
また、 これら 4 本のオ リ ゴヌ ク レオチ ドの P C R法によるア ツセ ンブリ ーの方法を図 3 に記す。 約 1 0 O ngずつの H F 1 と H F 2 、 H F 3 と H F 4 を組み合わせて、 2. 5 u の P f u D N Aボ リ メ ラーゼを舍有する最終容量 9 8 μ 1 の P C R反応液に添加した。 9 4 てにて 3分間の最初の変性の後、 9 4 てにて 2分間、 5 5 てにて 2分間及び 7 2 てにて 2 分間を 1 サイ クルと し、 これを 2 サイ クル 行った c
P C R反応液の半量を相互に交換したのち、 さ らに 2 サイ クルの イ ンキュベーシ ョ ンを行った。 l O O p moleずつの R V H 5 ' ブラ イ マ一 （配列番号 ： 3 6 ) 及び R V H 3 ' ブラ イ マ ー （配列番号 ： 3 7 ) を外部プラ イ マーと して添加した後、 P C R反応液を 5 0 ; 1 の鉱油で覆い、 そ して 9 4 てにて 3分間の最初の変性の後、 9 4 てにて 1 分間、 5 5 ·(：にて 1 分間及び 7 2 てにて 1 分間の 4 5 サイ クルを行い、 そして次に 7 2 てにて 1 0分間イ ンキュベー ト した。 約 4 5 0塩基対の D N A断片を 1 . 5 %低融点ァガロースゲルを 用いて精製し、 H i n d lll 及び B a m H Iにより消化し、 そ して 次に H E F発現ベクター H E F — V H — g r 1 にク ローニングした o E F — 1 プラ イ マ ー （配列番号 ： 6 6 ) および H I Pブラ イ マ ー (配列番号 ： 6 7 ) を用いて、 D N A配列決定の後、 正しい H鎮 V 領域のア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A断片を舍むプラス ミ ドを H E F - R V H a - g r 1 と命名した。 本プラス ミ ド H E F — R V H a - ε τ 1 に舍まれる H鎖 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を 配列番号 ： 3 8 に示す。 再構成ヒ ト W 5 一 抗体 H V領域しつ各ハ'一 ヨ ン 「 b — . ― - 」 ， 「 d 」 ， 「 e 」 ， 「 ί 」 ， 「 g 」 ， 「 ίι 」 を以下のよ う に して 作製した。
バージ ョ ン 「 b 」 （ R V H b ) は、 4 7 位のロイ シ ン力く ト リ ブ ト フ ァ ンに変異するよう に設計した変異原ブラ イ マー L T W 1 (配列 番号 ： 3 9 ) および L T W— 2 (配列番号 ： 4 0 ) を用い、 両端を 規定するブライ マ一と しては R V H 5 ' (配列番号 ： 3 6 ) および R V H 3 ' (配列番号 ： 3 7 ) を用いて、 ブラス ミ ド H E F — R V H a — g r l を铸型 D N Aと して、 P C R法により増幅し、 プラス ミ ド H E F — R V H b — g r 1 を得た。 本ブラス ミ ド H E F— R V H b - g r 1 に舍まれる H鎖 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列 を配列番号 ： 4 1 に示す。
バージョ ン 「 c 」 は、 4 1 位のグルタ ミ ンがプロ リ ンに変異する ように設計した変異原ブラ イ マ一 Q T P 1 (配列番号 ： 4 2 ) およ び Q T P 2 (配列番号 ： 4 3 ) を用い、 プラス ミ ド H E F — R V H a — g r l を铸型 D N Aと して、 P C R法により増幅し、 プラス ミ ド H E F — R V H c— g r 1 を得た。 本プラス ミ ド H E F — R V H c - g r 1 に含まれる H鑌 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を 配列番号 ： 4 4 に示す。
バージョ ン Γ d 」 は、 変異原プライ マーと して Q T P 1 および Q T P 2を用い、 プラス ミ ド H E F — R V H b - g r 1 を铸型 D N A と してブラス ミ ド H E F — R V H d — g r 1 を得た。 本ブラス ミ ド H E F - R V H d - g r l に舍まれる H鎮 V領域のァ ミノ酸配列お よび塩基配列を配列番号 ： 4 5 に示す。
バージョ ン 「 e j は、 4 0位のァラニンがプロ リ ンに変異するよ うに設計した変異原ブライ マ一 A T P 1 (配列番号 ： 4 6 ) および A T P 2 (配列番号 ： 4 7 ) を用い、 プラス ミ ド H E F — R V H d - g 7 ] を誇型 D A 上 し て増幅 し 、 プ - 一へ - '· H E F — P V H - g r 1 を得た。 本プラ ス ミ ド H E F — R V H e — 1 に舍まれ る H鎖 V領域に舍まれるァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ：
4 8 に示す。
バージ ョ ン 「 ί 」 は、 4 4位のグ リ シ ンがァ ラ ニ ンに変異する よ う に設計した変異原ブライ G T A 1 (配列番号 ： 4 9 ) および G T A 2 (配列番号 ： 5 0 ) を用い、 プラ ス ミ ド H E F — R V H d - g τ 1 を铸型 D N Aと して増幅し、 プラ ス ミ ド H E F — R V H f - g 7 1 を得た。 本プラ ス ミ ド H E F — R V H f — g r 1 に舍まれ る H鑌 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ： 5 1 に示 す。
ジ ョ ン 「 g 」 は、 6 7位のロ イ シ ンがフ エ 二ルァ ラ ニ ンに変 異するよう に設計した変異原ブラ イ マ一 L T F 1 (配列番号 ： 5 2 ) および L T F 2 (配列番号 ： 5 3 ) を用い、 プラ ス ミ ド H E F — R V H d — g r 1 を铸型 D N Aと して増幅し、 プラ ス ミ ド H E F — R V H g - g r 1 を得た。 本プラ ス ミ ド H E F — R V H g — 1 に舍まれる H鎖 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ：
5 に示す。
バ一ジ ョ ン 「 h 」 は、 変異原プラ イ マーと して L T F 1 および L T F 2 を用い、 ブラス ミ ド H E F — R V H b - g r 1 を铸型 D N A と して増幅し、 ブラ ス ミ ド H E F — R V H h — g r 1 を得た。 本プ ラス ミ ド H E F — R V H h — g r 1 に舍まれる H鎮 V領域のァ ミ ノ 酸配列および塩基配列を配列番号 ： 5 5 に示す。
再構成ヒ ト W S - 4抗体 L鑌 V領域の作製
再構成ヒ ト W S — 4抗体 L鎖 V領域をコー ドする D N Aを次の様 にして設計した。 ヒ ト抗体 R E I の F Rをコー ドする D N A配列と マ ウ ス W S — 4 抗体 L鎖 V領域の C D Rをコー ドする D N A配列が 連結される よ う に再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L ί. V領域をコ一 ドす 全長 D Ν Αを設計した。
次に、 この D N A配列のそれぞれ 5 ' 側及び 3 ' 側に H i n d 11 1 認識部位/ K 0 Z A Kコ ンセ ンサス配列及び B a m H I 認識部位 /スブラ イ ス ドナー配列をそれぞれ付加して、 H E F発現ベク ター に挿入できるよう にした。 こ う して設計した D N A配列をほぼ均等 な長さの 4本のオ リ ゴヌク レオチ ドに分け、 そして次に、 これらの オ リ ゴヌク レオチ ドのアセ ンブリ ーを妨害する可能性のあるオ リ ゴ ヌク レオチ ド中の二次構造についてコ ンビューター解折した。
4 本のオ リ ゴヌク レオチ ド配列を配列番号 ： 5 6〜 5 9 に示す。 これらのオ リ ゴヌ ク レオチ ドは ] 0 6 〜 1 2 4塩基の長さを有し、 隣接する 2本のオ リ ゴヌク レオチ ドは互いに 1 9 〜 2 3塩基の才ー バラ ップ領域を有する。 4 本のオ リ ゴヌク レオチ ドの内 L F 1 (配 列番号 ： 5 6 ) 、 L F 3 (配列番号 ： 5 8 ) はセ ンス D N A配列を 有し、 そ して他の L F 2 (配列番号 ： 5 7 ) 、 L F 4 (配列番号 ： 5 9 ) はア ンチセ ンス D N A配列を有する。 これらオ リ ゴヌ ク レオ チ ドを前記の H F 1 〜 4 と同様の方法で合成した。
ア ッ セ ンブリ ーは、 1 O O ngずつの 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド及 び 5 u の A m p 1 i T a qを舍有する 9 8 1 の P C R混合物を 、 9 4 'Cにて 3分間の最初の変性の後、 9 4 てにて 2分間、 5 5 て にて 2分間及び 7 2 て にて 3分間を 1 サイ ク ルと し、 これを 2 サイ ク ル行った。 l O O p moleずつの R V L 5 ' プラ イ マー （配列番号 : 6 0 ) 及び R V L 3 ' プラ イ マー （配列番号 ： 6 1 ) を外部ブラ イ マ一と して添加した後、 P C R反応液を 5 0 μ 1 の鉱油で覆い、 そして 9 4 てにて 3分間の最初の変性の後、 9 4 'Cにて 1 分間、 5 5 て にて 1 分間及び 7 2 て にて 1 分間を 1 サイ クルと してこ れを 3 0 サイ クルを行い、 そ して次に 7 2 てにて 1 0分間イ ンキュベー ト した （ 13参照） 。
約 4 0 0塩基対の D N A断片を 1 . 5 %低融点ァガロースゲルを 用いて精製し、 H i n d III 及び B a m H I によ り消化し、 そ して 次に H E F発現ベク ター H E F — V L — g にク ローユングした。 E F — 1 プラ イ マ一 （配列番号 ： 6 G ) および K I Pプラ イ マー （ 配列番号 ： 6 8 ) を用いて D N A配列决定の後、 正しい L鎖 V領域 のア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A断片を含むブラ ス ミ ドを H E F 一 R V L a — g と命名した。 本ブラ ス ミ ド H E F — R V L a — g κ に舍まれる Η鎖 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列番号 ： 6 2 に示す。
バージ ョ ン 「 b 」 （ R V L b ) は、 7 1 位のフエ二ルァ ラニ ンが チロ シ ンに変異するよう に設計した変異原プラ イ マー F T Y 1 (配 列番号 ： 6 3 ) および F T Y 2 (配列番号 ： 6 4 ) を用い、 両端を 規定するブラ イ マ一と しては R V L 5 ' (配列番号 ： 6 0 ) および R V L 3 ' (配列番号 ： 6 1 ) を用いて、 ブラス ミ ド H E F — R V L a — g cを铸型 D N Aと して、 P C R法により増幅し、 プラス ミ ド H E F — R V L b — を得た。 本ブラ ス ミ ド H E F — R V L b - g κ に舍まれる L鎮 V領域のァ ミ ノ酸配列および塩基配列を配列 番号 ： 6 5 に示す。
再構成ヒ ト W S — 4抗体の各鎖の抗原結合活性を評価するため、 まず、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖の 「 a 」 パージョ ンための発現 ベク ター H E F — R V L a — g とキメ ラ W S — 4 抗体 H鎖のため の発現べク タ一 H E F — c h W S 4 H — g r l とにより C O S細胞 を前記のよう にして同時 ト ラ ンスフエ ク ショ ン し、 前記のよう に し て培養上清を回収した後、 前記実施例 4 E L I S Aに記載のとおり の方法を用いて、 産生された抗体について産生抗体量および抗原結 合活性を測定した。 この結果を図 4 に示す。 図 4 に示すよう に陽性 対照と し てのキ メ ラ抗体 （ c h L / c h H ) および再構成 L鍈と キ メ ラ H鎖とからなる抗体 （ R V L a / c h H ) との間には抗原結合 性に差がないこ とが確認された。
同時に、 キメ ラ W S — 4 抗体 L鎖のための発現ベクター H E F — c h W S 4 L _ g と再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H鎮の 「 a 」 パージ ヨ ンとの組み合せを評価するため、 両者を C O S細胞に同時 ト ラ ン スフ ヱ ク シ ョ ン し、 前記実施例 4 E L I S Aに記載のとおり の方法 を用いて、 得られた抗体について産生抗体量および抗原結合活性を 測定した。 その結果、 こ の抗体 （ c h L / R V H a ) には抗原結合 活性が見られなかった （図 4 を参照のこ と） 。
前記のごと く、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖の 「 a 」 バージ ョ ン ( R V L a ) はキメ ラ W S — 4抗体 L鎖と同等の結合活性を示した ので、 これ以後の再構成 H鎖各バージ ョ ンの評価には、 再構成 H鎮 各バージョ ンと再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎮の 「 a 」 バージ ョ ン （ R V L a ) を C O S細胞に同時 ト ラ ンスフ エ ク シ ョ ンする こ とによ り行なつた。
その結果、 「 b 」 ， 「 d 」 ， 「 e j , 「 f j , 「 g 」 ， 「 h 」 の 各再構成 H鎮バージ ョ ンを有する抗体は、 陽性対照であるキメ ラ W S - 4抗体 （ c 1 / c h H ) に匹敵する程度の抗原結合性を示し 、 こ の組み合せがヒ ト抗体における機能的抗原結合部位を形成する こ とが示唆された。 しかし、 産生量については、 「 g 」 バージ ョ ン
( R V H g ) 以外はいずれもキメ ラ W S — 4抗体 （ c h L / c h H ) より低かった。 なお、 H鎖バージ ョ ン 「 c j を有する抗体には抗 原結合活性が見られなかった （図 5 を参照のこ と ） 。
このこ とから、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖の 「 a 」 バージ ョ ン
( R V L a ) な らびに再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H鎮の 「 g 」 パージ ヨ ン （ R V H g ) を有する抗体は、 良好な抗原結合性を示す機能的 抗原結合部位を再形成 - C 0 S細胞：こ同時 ト -' ン ス フ 二：' ：· 、 する こ とによ り キメ ラ W S — 4 抗体 （ c h L / c h H ) に匹敵する 程度の産生量を示すこ とが示唆された。
次に、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖の 「 b 」 バージ ョ ン （ R V L b ) を用いて、 H鎖各バージ ョ ン と C O S細胞に同時 ト ラ ンス フ ユ ク シ ヨ ン し、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖の 「 b 」 バージ ョ ン （ R V L b ) の評価をおこなった。 その結果、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 「 g 」 バージョ ンを有する抗体 （ R V L b / R V H g ) だけが 、 陽性対照であるキメ ラ W S — 4 抗体 （ c h L / c h H ) に匹敵す る程度の抗原結合性を示し、 こ の組み合せがヒ ト抗体における機能 的抗原結合部位を形成する こ とが示唆された。 また、 産生量につい ても、 「 g 」 バージョ ン （ R V H g ) 以外はいずれもキメ ラ W S — 抗体 （ c h L / c h H ) より低かった （図 6 を参照のこ と） 。 前記の評価において、 キメ ラ W S — 4抗体 （ c h Lノ c h H ) に 匹敵する産生量と I L 一 8 に対する結合活性を示した 2種の再構成 ヒ ト抗休 （ R V L a Z R V H g と R V L b Z R V H g ) をそれぞれ プロテ ィ ン Aカ ラムで精製して、 実施例 4 E L I S Aに記載の方法 で結合活性をより正確に評価した。 その結果、 キメ ラ W S — 4抗体 ( c h L / c h H ) 、 R V L a / R V H g抗体並びに R V L b Z R V H g抗体のいずれも同程度の結合活性を示した （図 7 参照のこ と こ の こ とから、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 L鎖の 「 a 」 バージ ョ ン ( R V L a ) あるいは 「 b 」 バージ ョ ン （ R V L b ) と、 再構成ヒ ト W S — 4 抗体 H鎖の 「 g 」 バージ ョ ン （ R V H g ) を有する抗体 は、 良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成し、 C O S細胞に同時 ト ラ ンス フ エ ク シ ョ ンする こ とによ り キ メ ラ W S — 4 抗体 （ c h L / c h H ) に匹敵する程度の産生量を示すこ とが示唆 された <
再構成ヒ ト W S — 4抗体の L鎖 「 a 」 バージョ ン （ R V L a ) と 同 H鎖 「 g 」 バージ ョ ン （ R V H g ) 、 または同 L鍈 「 b 」 パージ ヨ ン （ R V L b ) と同 H鎖 「 g j バージョ ン （ R V H g ) からなる 再構成ヒ ト抗体の I L一 8 レセプターに対する I L— 8結合阻害活 性を、 リ ガン ドレセプター結合阻害ァ ッセィ により評価した。
健常人より へバリ ン採血した約 1 0 O mlの血液を、 1 5 mlの M o n 0 - P 0 1 y分離溶液 （ I C N B i o m e d i c a l s社製） に 3 5 mlずつ重層し、 添付の指示書に従い遠心分離をおこなってヒ ト好中球層を単離した。 この細胞を 1 % B S A添加 R P M I — 1 6 4 0培地にて洗浄した後、 混入した赤血球を 1 5 0 mMの塩化ア ンモ ニゥム溶液にて除去した。 これを遠心分離した後、 細胞を 1 % B S A添加 R P M I — 1 6 4 0培地にて洗浄し、 2 x l 07 Cells/ml の細胞濃度になるよう に再懸濁した。 この細胞懸濁液の好中球の舍 有率は、 サイ トスピン （ S h a n d o n社） による塗抹標本を D i f f - Q u i k ( ミ ド リ十字社製） 染色して測定した結果 9 5 %以 上であった。
上記好中球懸濁液を遠心分離し、 結合バッ ファー （ 1 % B S A及 び 0. 1 %アジ化ナ ト リ ウムを舍む D— P B S ) にて細胞濃度 2 X
1 0 Cel Isノ mlになるように再魅濯した。 この時、 好中球上の F c レセプターをあらかじめ飽和する目的で、 本発明のヒ ト抗体と同 一の F c部分を有する S K 2キメ ラ抗体 （国際特許出願出願番号 P
C T/ J P 9 4 Z 0 0 8 5 9参照） とその抗原である ヒ ト I L一 6 をそれぞれ濃度約 5 0 / g Zmlおよび約 4 0 ng/mlになるよう に添 加し、 氷温中で 3 0分間ィ ンキュベー ト した。
125 I で放射標識した I L一 8 ( 7 4 T B q /mm o l . A m e r s h a m社製） と未標識 I L一 8 ( A m e r s b a m社製） を各 濃度が 4 n ε / にな る よ う に結合ハ ·. フ 一にて混合し調製 し ： キ メ ラ W S — 4抗体 （ c h L / c h H ) 、 再構成ヒ ト抗体 （ R V L a Z R V H gおよび R V L b / R V H g ) 、 陰性対照のヒ ト抗体 （ P A E S E L 卞 L O R E I 社製） あるいは陽性対照のマウ ス W S— 4抗体のそれぞれを結合バ ッ フ ァ 一にて濃度 2 0 0 0 ng/m I力、ら約 8 ng/mlまで 2倍段階希釈した。 I L 一 8溶液ならびに各抗体溶液 をそれぞれ 5 0 1 ずつ混合し氷温中で 3 0分間ィ ンキ ュ ベー ト し た。 その後、 上記好中球懸濁液 1 0 0 1 を添加し、 更に 1 5分毎 に撹拌しながら氷温中で 1 時間イ ンキ ュ ベー ト した。 イ ンキュ ベー ト後、 こ の細胞懸濁液を 2 0 0 1 の 2 0 %サ ッ カ ロース溶液に重 層し、 遠心、 凍結させた。 細胞に結合した I L一 8 を測定するため 、 細胞沈渣を切断し、 r 一 カ ウ ンター （ァ ロ カ社製） で放射活性を 測定した。 その結果を図 8に示す。
再構成ヒ ト W S— 4抗体の L鎮 「 a 」 バージ ョ ン （ R V L a ) と 同 H鎖 「 g 」 バージ ョ ン （ R V H g ) 、 または同 L鎮 「 b 」 パージ ヨ ン （ R V L b ) と同 H鎖 「 g 」 バージ ョ ン （ R V H g ) を有する 抗体は、 I L — 8 レセプターに対する I L — 8の結合に対して、 キ メ ラ抗体 （ c h L / c h H ) と同程度の結合阻害活性を有する こ と が明らかになった。
なお、 前記プラス ミ ド H E F— R V L a — g を有する大腸菌は E s c h e r i c h i a c o 1 i D H 5 or ( H E F - R V L a - g A: ) 、 およびプラス ミ ド H E F— R V H g — g r 1 を舍有する 大腸菌は E s c h e r i c h i a c o l i J M 1 0 9 ( H E F - R V H g - g r 1 ) と して工業技術院生命工学工業技術研究所 （ 茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 3号） に、 平成 6年 7月 1 2 日 に、 各 々 F E R M B P — 4 7 3 8および、 F E R M B P— 4 7 4 1 と してブタぺス ト条約に基づき国際寄託された。 券者例 1 . ハィ ブリ ドー マ W？ — 4 ^作
抗ヒ ト I L — 8 モノ ク ローナル抗体を産生するハイ プリ ドーマは 、 ヒ ト I L — 8 で免疫した B A L Bノ c マウスの脾臓細胞とマウ ス 骨髄腫細胞 P 3 X 6 3 - A g 8 . 6 5 3 をポ リ エチ レングリ コール を用いた常法により融合して作製した。 ヒ ト I L — 8 と結合する活 性を指標と したスク リ ーニ ングを行い、 ハイ ブリ ドーマ W S — 4 を 樹立した （ K o , Υ - C . ら、 J . I m m u n o l . M e t h o d s , 1 4 9 , 2 2 7 - 2 3 5 , 1 9 9 2 ) β 産業上の利用可能性
本発明はヒ ト I L — 8 に対する再構成ヒ ト抗体を提供し、 この抗 体においてはヒ ト抗体の V領域の C D Rがヒ ト I L — 8 に対するマ ウスモノ ク ローナル抗体の C D Rにより置き換えられている。 この 再構成ヒ ト抗体の大部分がヒ ト抗体に由来し、 そして C D Rは元来 、 抗原性が低いこ とから、 本発明の再構成ヒ ト抗体はヒ ト に対する 抗原性が低く 、 そしてそれ故に医学療法用と して期待される。
特許協力条約に基 く規則 1 3規則の 2 の寄託された微生物への言 及
国際寄託当局
名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 1 号
受託番号及び寄託曰
( 1 ) Escherichia col i DH5 (HEF - R Vし a - g A: )
受託番号 ： FERM BP-4738
寄 託 日 ： 1994年 Ί 月 12日
( 2 ) Escherichia col i DH5 a (HEF - chWS4し- g κ )
受託番号 ： FERM BP- 4739 寄 託 日 ： 1994年 7 月 12日
( 3 ) Escherichia col i JM109 (1IEF- chWS4H- g r 1)
受託番号 ： FERM BP-4740
寄 託 日 ： 1994年 7月 12日
( 4 ) Escherichia col i JM109 (HEF- VHg-g τ 1)
受託番号 ： FERM BP-4741
寄 託 日 ： 1994年 7 月 12日 配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ·' 議
鎖の数 ： 一本锁
ト ポロ ジ一 直鎮状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 K V 1
配列
ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40
3 配列番号 ： 2 9 配列の長さ ： 3 9
配列の型 ： 核酸
钹の数 ： 一本鎖
トボロ ジ一 ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 2
配列
ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 配列番号 ： 3
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本镇
ト ボロ ジー ： 直鑌状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 3
配列
ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 4 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本钹
トボ口 ジ一 直鑌状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M K V 4
配列
ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 5
配列
ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 6
配列
37
ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTCYTSAGYT YCTGRGG 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 4 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ ロ ジー 直钹状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M K V 7
配列
ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41 配列番号 ： 8
配列の長さ ： 4 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ 口 ジ一 直 m状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M K V 8
配列
ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41 配列番号 ： 9
配列の長さ ： 3 5
配列の型 ： 核酸
鎮の数 ： 一本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 9
配列
ACTAGTCGAC ATCGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35 配列番号 ： 1 0
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 1 0
配列
ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTCTC TATTTCT 37 配列番号 ： 1 1
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本钹
トボ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K V 1 1
配列
ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38 配列番号 ： 1 2
配列の長さ ： 2 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鈸
トポロ ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M K C
配列
GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27 配列番号 ： 1 3
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 1
配列
ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37 配列番号 ： 1 4
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ ロ ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 2
配列
ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36 配列番号 ： 1 5
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー 1&钹状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 H V 3
配列
ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37 配列番号 ： 1 6
配列の長さ ： 3 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロ ジー 直鎮状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M H V 4
配列
ACTAGTCGAC ATGRACTTTG CGYTCAGCTT GRTTT 35 配列番号 ： 1 Ί
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口ジー ： 直镇状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 5
配列
ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40 配列番号 ： 1 8
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ボロ ジー 直钹状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M H V Γ)
配列
ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37 配列番号 ： 1 9
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー 直鎖状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M H V 7
配列
ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36 配列番号 ： 2 0
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一木鎖
ト ポ ロ ジー ： 直钹状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 8
配列
ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG Q3 配列番号 ： 2 1
配列の長さ ： 4 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本钹
トポ口 ジ一 直 m状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 M H V 9
配列
ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40 配列番号 ： 2 2
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ポ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 1 0
配列
ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37 配列番号 ： 2 3
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ： 核酸
鈸の数 ： 一本鎖
トボ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 1 1
配列
ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38 配列番号 ： 2 4
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ボロ ジー ： 直锁状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： M H V 1 2
配列
ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 2 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口 ジー ： 直鑌状
配列の種類 ： 合成 D A
配列の名称 ： M H C
配列
GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28 配列番号 ： 2 6
配列の長さ ： 3 8 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A
配列の名称 ： W S 4 V し
起源
生物名 ： マ ウ ス 直接の起源
ク ロー ン ： P U C - W S 4 - V L 特徴 ： • • 6 0 s i g p e p t i d e
1
6 1 • • 3 8 2 m a t p e p t i d e 配列
ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GGG TTG CTG CTG CTG TGG CTT ACA 48
Met Ser Val Leu Thr Gin Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr -20 -15 -10 -5
GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT 96
Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser
- 1 1 5 10
GCA TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG ATT 144 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Glu He
15 20 25
ATT TAC AGT TAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT 192 lie Tyr Ser Tyr し eu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro
30 35 40
CAG CTC CTG GTC TAT AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG TCA TCA 240 Gin Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser
45 50 55 60
AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGC ACA CAG TTT TCT CTG CGG ATC AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Arg lie Ser
65 70 75
AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT CAT TTT 336 Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Phe
80 85 90 GGT TTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA CTC AAA C 382 Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
95 100 105
配列番号 ： 2 7
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポ口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： c D N A
配列の名称 ： W S 4 V H
起源
生物名 ： マ ウ ス
直接の起源
ク ロ ー ン ： p U C— W S 4 — - V H
特徴 ： 1 . . 5 7 s i g p e p t i d e
5 8. . 4 2 4 m a t p e p t i d e
配列
ATG AAG TTG TGG TTA AAC TGG GTT TTT CTT GTG ACA CTT TTA AAT GGT 48 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly
-19 -15 -10 -5
ATC CAG TGT GAG GTG AAA CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG ATA CAG 96 lie Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu He Gin
-1 1 5 10
CCT GGG GAT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GTA ACC TCT GGG TTC ACC TTC 144 Pro Gly Asp Ser leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Sor Gly Phe Thr Phe
15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT 192
Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Va l Arg Gi n Pro Pro G ly Lys Ala Leu
30 35 40 45
GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC ΑΛΤ GGT TAC ACA AGA GAG 240
G l u Trp Val G ly Leu He Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg G l u
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT GAT TCC 288
Tyr Ser A la Ser Val lys Gly Arg Phe Thr l i e Ser Arg Asp Asp Ser
65 70 75
CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GGT GAG GAC AGT 336
Gin Ser I】e Leu Tyr Leu G i n Me t Asn Thr Leu Arg Gly Gl u Asp Ser
80 85 90
GCC ACT TAT TAC TGT GCA CGA GAG AAC TAT AGG TAC GAC GTA GAG CTT 384
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA G 424
Ala Tyr Trp Gly G in Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
HO 115 120 配列番号 ： 2 8
配列の長さ ： 3 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口 ジ一 ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： c h V L後方ブラ イ マ ー
配列
ACAAAGCTTC CACCATGAGT GTGCTCACTC AGGT 34 配列番号 ： 2 9
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： c h V H後方ブラ イ マ一
配列
GATAAGCTTC CACCATGAAG TTGTGGTTAA ACTGGGT 37 配列番号 ： 3 0
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鈸
トポロ ジー ： 直钹状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： c h V L前方プラ イ マ一
配列
CTTGGATCCA CTCACGTTTG AGTTCCAGCT TGGTGCC 37 配列番号 ： 3 1
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鑌の数 ： 一本鎖
ト ポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： c h V H前方プラ イ マー
配列
GTCGGATCCA CTCACCTGCA GAGACAGTGA CCAGAGT 37 配列番号 ： 3 2
配列の長さ ： 1 3 7
配列の型 ： 核酸
鑌の数 ： 一本鎮
トボ口 ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： H F ]
配列
TAAGCTTCCA CCATGGAGTT TGGGCTGAGC TGGGTTTTCC TTGTTGCTAT TTTAAAGGGT 60 GTCCAGTGTG AAGTGCAGCT GTTGGAGTCT GGGGGAGGCT TGGTCCAGCC TGGGGGTTCT 120 CTGAGACTCT CATGTGC 137 配列番号 ： 3 3
配列の長さ ： 1 4 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本锁
トボ口 ジー '· 直鑌状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： H F 2
配列
GCACTGTACT CTCTTGTGTA ACCATTGGCT TTGTTTCTAA TGAGACCCAC CAACTCTAGC 60 CCTTTCCCTT GAGCTTGGCG GACCCAGCTC AGGTAGTAAT CACTGAAGGT GAATCCAGAG 120 GCAGCACATG AGAGTCTCAG AGA 143 配列番号 ： 3 4
配列の長さ ： 1 1 3
配列の型 ： 核酸
鎮の数 ： 一木鎮
ト ポロ ジー ： 直鎖状 配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： H F 3
配列
TACACAAGAG AGTACAGTGC ATCTGTGAAG GGCAGACTTA CCATCTCAAG AGAAGATTCA 60 AAGAACACGC TGTATCTGCA AATGAGCAGC CTGAAAACCG AAG/ICTTGGC CGT 113 配列番号 ： 3 5
配列の長さ ： 1 1 7
配列の型 ： 核酸
鑌の数 ： 一木鈸
ト ボロ シ一 直鎖状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 H F 4
配列
TCGGATCCAC TCACCTGAGG AGACGGTGAC CAGGGTTCCC TGGCCCCAGT AAGCAAGCTC 60 TACGTCGTAG CGATAGTTCT CTCTAGCACA GTAATACACG GCCAAGTCTT CGGTTTT 117 配列番号 ： 3 6
配列の長さ ： 3 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： -- 本鎖
トポロ ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H 5 ' ブラ イ マ ー
配列
GATAAGCTTC CACCATGGAG TTTGGGCTGA GCTGGGT 37 配列番号 ： 3 7
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ： 核酸 鎮の数 ： 一本鎮
トボ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H 3 ' プラ イ マー
配列
GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA C 31 配列番号 ： 3 8
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鑌の数 ： ニ本鎮
トボロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H a
起源
生物名 ： マゥス及びヒ ト
直接の起源
ク ロー ン H E F - R V H a - g r l
ア ミ ノ 酸 一 1 9 1 ： 〗 e a d e
ア ミ ノ酸 1 - 3 0 ： F R I
ア ミ ノ 酸 3 1 - 3 5 ： C D R 1
ア ミ ノ酸 3 6 - 4 9 : F R 2
ア ミ ノ酸 5 0 - 6 8 ： C D R 2
ア ミ ノ酸 6 9 - 1 0 0 : F R 3
ア ミ ノ 酸 1 0 1 - 1 1 1 C D R 3
ア ミ ノ酸 1 1 2 - 1 2 2 F R 4
配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala He Leu Lys Gly
-19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
-1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CAA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Sor Trp Val Arg Gin Ala Gin Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
GAG TTG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240
Glu Leu Val Gly Leu He Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288
Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg L-u Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336
Lys Asn Thr Leu Tyr し eu Gin Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG CTC ACC GTC TCC TCA G 24
Ala Tyr Trp Gly in Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列番号 ： 3 9
配列の長さ ： 3 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ·· 合成 D N A
配列の名称 ： L T W 1
配列
GGCTAGAGTG GGTGGGTCTC ATTAGAAACA AAGC 34 配列番号 ： 4 0
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： L T W 2
配列
GAGACCCACC CACTCTAGCC CTTTCCCTTG AGCTTG 36 配列番号 ： 4 1
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本锁
ト ボ 口 ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H b
起源
生物名 ： マ ウ ス及びヒ ト 直接の起源
ク ロー ン ： H E F - R V H b - g r 】
ア ミ ノ 酸 ― 1 9 一 一 1 l e a d e r
ア ミ ノ 酸 1 - 3 0 F R 1
ア ミ ノ 酸 3 1 - 3 5 C D R 1
ア ミ ノ 酸 3 6 - 9 F R 2
ア ミ ノ 酸 5 0 - 6 8 C D R 2
ア ミ ノ 酸 6 9 - 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ 酸 1 0 1 - 1 1 1 ： C D R 3
ア ミ ノ 酸 1 1 2 - 1 2 2 ： F R 4
配列
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly leu Ser Trp Val Phe leu Val Ala lie Leu Lys Gly
-19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
- 1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg し eu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CAA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Gin Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC ΑΛΤ GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly eu lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Are Glu
50 55 60 TAC AGT GCA TCT CTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288
Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg し eu Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336
Lys Asn Thr Leu Tyr し eu Gin Met Ser Ser し eu Lys Thr Glu Asp し eu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424
Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列番号 ： 4 2
配列の長さ ： 3 2
配列の型 ： 核酸
鑌の数 ： 一本鎮
ト ポロ ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： Q T P 1
配列
TGGGTCCGCC AAGCTCCAGG GAAAGGGCTA GA 32 配列番号 ： 4 3
配列の長さ ： 3 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一木鎮
トボ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 配列の名称 ： Q丁 P 2
配列
TCTAGCCCTT TCCCTGGAGC TTGGCGGACC CA 32 配列番号 ： 4 4
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本钹
トポ口 ジー ： 直鑌状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H c
起源
生物名 ： マ ウ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ローン H E F - R V H c - g r l
ア ミ ノ 酸 — 1 9 —— 1 ： 】 e a d e
ア ミ ノ酸 1 - 3 0 F R 1
ア ミ ノ酸 3 1 - 3 5 C D R 1
ア ミ ノ 酸 3 6 - 4 9 F R 2
ア ミ ノ 酸 5 0 - 6 8 C D R 2
ア ミ ノ 酸 6 9 - 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ 酸 1 0 1 — 1 1 1 : C D R 3
ア ミ ノ酸 1 1 2 — 1 2 2 : F R 4
配列
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly
-19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
-1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr し eu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
GAG TTG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 G】u Leu Va】 Gly Leu He Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg し eu Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AftC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr leu Gin Met Ser Ser Leu し ys Thr Glu Asp Leu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列番号 ： 4 5
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸 鎮の数 ： 二本縝
トボ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H d
起源
生物名 ： マゥ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ロー ン H E F - R V H d - g r 1
ア ミ ノ酸 - 1 9 - - 1 l e a d e r
ア ミ ノ 酸 1 - 3 0 F R 1
ア ミ ノ酸 3 1 - 3 5 C D R 1
ア ミ ノ酸 3 6 - 4 9 F R 2
ア ミ ノ 酸 5 0 - 6 8 C D R 2
ア ミ ノ酸 6 9 - 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ 酸 1 0 1 - 1 1 1 : C D R 3
ア ミ ノ酸 1 1 2 - 1 2 2 ： F R 4
配列
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
-1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gl Leu l ie Arg Asn Lys Ala Asn G ly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr He Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu G in Met Ser Ser Leu Lys Thr Gl u Asp Leu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gl u Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
配列番号 ： 4 6
配列の長さ ： 2 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジ一 直，状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 A T P 1
配列
TGGGTCCGCC AACCTCCAGG GAAAGG 26 配列番号 ： 4 7
配列の長さ ： 2 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鑌
トボ口 ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： A T P 2
配列
CCTTTCCCTG GAGGTTGGCG GACCCA 26 配列番号 ： 4 8
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鈸
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H e
起源
生物名 ： マ ウ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ローン H E F - R V H e - g r l
ア ミ ノ 酸 1 9 一 1 1 e a d e
ア ミ ノ酸 1 3 0 F R 1
ア ミ ノ酸 3 1 3 5 C D R 】
ア ミ ノ 酸 3 6 4 9 F R 2
ア ミ ノ 酸 5 0 6 8 C D R 2
ア ミ ノ 酸 6 9 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ酸 1 0 1 - 1 1 1 : C D R 3 ア ミ ノ 酸 1 1 2 — 1 2 2 : F R 4 配列
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu Lys Gly
-19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
-1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA CCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45
GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg し eu Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
配列番号 ： 4 9
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー 直鎮状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 G T A 1
配列
CAAGCTCCAG GGAAAGCGCT AGAGTGGGT 29 配列番号 ： 5 0
配列の長さ ： 2 9
配列の型 ： 核酸
鎮の数 ： 一本鎖
ト ボ口 ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： G T A 2
配列
ACCCACTCTA GCGCTTTCCC TGGAGCTTG 29 配列番号 ： 5 1
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A 配列の名称 ·· R V Η ί
起源
生物名 ： マ ウ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ロー ン H E F - R V Η f - g r 1
ア ミ ノ 酸 一 1 9 一一 1 l e a d e r
ア ミ ノ 酸 1 - 3 0 F R 1
ア ミ ノ 酸 3 1 - 3 5 C D R 1
ア ミ ノ 酸 3 6 - 9 F R 2
ア ミ ノ 酸 5 0 - 6 8 C D R 2
ア ミ ノ 酸 6 9 - 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ 酸 1 0 1 - 1 1 1 ： C D R 3
ア ミ ノ 酸 1 1 2 - 1 2 2 ： F R 4
配列
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly し eu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala lie Leu lys Gly -19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gin Cys Glu Val Gin leu し eu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
- 1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser leu Arg し eu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Fhe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GCG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Ala Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu lie Arg Asn し ys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val し ys Gly Arg Leu Thr He Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 し ys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu し ys Thr Glu Asp Leu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424
Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列番号 ： 5 2
配列の長さ ： 2 3
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： L T F 1
配列
GTGAAGGGCA GATTTACCAT CTC
23 配列番号 ： 5 3
配列の長さ ： 2 3
配列の型 ： 核酸 鎮の数 ： 一本鎖
ト ボ 口ジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： L T F 2
配列
GAGATGGTAA ATCTGCCCTT CAC 23 配列番号 ： 5 4
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
ト ボ口 ジ一 直鎖状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 R V H g
起源
生物名 ： マウ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ローン H E F - R V H g - g r l
ア ミ ノ酸 1 9 一 1 1 e a d e
ア ミ ノ 酸 1 3 0 F R 1
ア ミ ノ酸 3 1 3 5 C D R 1
ア ミ ノ 酸 3 6 4 9 F R 2
ア ミ ノ 酸 5 0 6 8 C D R 2
ア ミ ノ 酸 6 9 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ 酸 1 0 1 - 1 1 1 C D R 3
ア ミ ノ 酸 1 1 2 - 1 2 2 F R 4
配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala He Leu Lys Gly
-19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
-1 1 5 10
CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45
GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA TTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288
Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Are Phe Thr 【le Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424
Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Va! Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列番号 ： 5 5
配列の長さ ： 4 2 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V H h
起源
生物名 ： マ ウ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ローン H E F - R V H h - g r l
ア ミ ノ酸 1 9 一 1 1 e a d e
ア ミ ノ酸 1 3 0 F R 1
ア ミ ノ酸 3 1 3 5 C D R 1
ア ミ ノ酸 3 6 4 9 F R 2
ア ミ ノ酸 5 0 6 8 C D R 2
ア ミ ノ酸 6 9 1 0 0 ： F R 3
ア ミ ノ酸 1 0 1 - 1 1 1 : C D R 3
ア ミ ノ酸 1 1 2 - 1 2 2 ： F R 4
配列
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala He Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5
GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
-1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
15 20 25
AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CAA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Gin Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45
GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu
50 55 60
TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA TTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser
65 70 75
AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 lys Asn Thr し eu Tyr leu Gin Met Ser Ser Leu し ys Thr Glu Asp ten
80 85 90
GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu
95 100 105
GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列番号 ·. 5 6
配列の長さ ： 1 2 4
配列の型 ： 核酸
鑌の数 ： 一本鎖
トポロ ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A 配列の名称 ： L F 1
配列
TTGAAGCTTC CACCATGGGA TGGAGCTGTA TCATCCTCTT CTTGGTAGCA ACAGCTACAG 60 GTGTCCACTC CGACATCCAG ATGACCCAGA GCCCAAGCAG CCTGAGCGCC AGCGTAGGTG 120 ACAG 124 配列番号 ： 5 7
配列の長さ ： 1 2 2
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鑌
トポロ ジー ： 直鑌状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： L F 2
配列
GCATTGTAGA TCAGCAGCTT TGGAGCCTTT CCTGGCTTCT GCTGGTACCA TGCTAAATAA 60 CTGTAAATAA TCTCGCTTGC TCGACAGGTG ATGGTCACTC TGTCACCTAC GCTGGCGCTC 120
AG 122 配列番号 ： 5 8
配列の長さ ： 1 2 1
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： し F 3
配列
AGCTGCTGAT CTACAATGCA AAAACCTTAG CAGATGGAGT GCCAAGCAGA TTCAGCGGTA 60 GCGGTAGCGG TACCGACTTC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG GACATCGCTA 120 C 121 配列番号 ： 5 9
配列の長さ ： 1 0 6
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジ一 .' 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： L F 4
配列
GTAGGATCCA CTCACGTTTG ATTTCGACCT TGGTCCCTTG GCCGAACGTC CGflGGAAAAC 60 CAAAATGATG TTGGCAGTAG TAGGTAGCGA TGTCCTCTGG CTGGAG 106 配列番号 ： 6 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
ト ボロ ジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V L 5 '
配列
TTGAAGCTTC CACCATGGGA 20 配列番号 ： 6 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボ口 ジ一 直鎖状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 R V L 3 '
配列 GTAGGATCCA CTCACGTTTG 20 配列番号 ： 6 2
配列の長さ ： 3 7 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： ニ本鎮
トボロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V L a
起源
生物名 ： マゥス及びヒ ト
直接の起源
ク α一ン H E F - R V L a - g *
ァ ミ ノ酸 一 1 9 —— 1 ： 1 e a d e r
ァ ミ ノ酸 1 2 3 ： F R 1
ァ ミ ノ酸 2 4 3 4 ： C D R 1
ァ ミ ノ 酸 3 5 4 9 ： F R 2
ァ ミ ノ酸 5 0 5 6 ： C D R 2
ァ ミ ノ酸 5 7 8 8 ： F R 3
ァ ミ ノ 酸 8 9 9 7 ： C D R 3
ァ ミ ノ酸 9 8 1 0 7 ： F R 4
配列
ATG GGA TGG AGC TGT ΛΤ (： ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Cly -19 -15 -10 -5
GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp I】e Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
-1 1 5 10 AGC GTA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TCT CGA GCA AGC GAG ATT ATT 144 Ser Va l Gly Asp Arg Val Thr l ie Thr Cys Arg A la Ser Gl u He He
15 20 25
TAC AGT TAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
30 35 40 45
CTG CTG ATC TAC AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGA GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu l ie Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr l ie Ser Ser
65 70 75
CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAT CAT TTT GGT 336 Leu Gin Pro Glu Asp l ie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Phe Gly
80 85 90
TTT CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTC GAA ATC AAA C 379 Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu l ie Lys
95 100 105
配列番号 ： 6 3
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロジー ： 直鎮状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： F T Y 1
配列
AGCGGTAGCG GTACCGACTA CACCTTC/ICC ATCAGCAG 8 配列番号 ： 6 4
配列の長さ ： 3 8
配列の型 ·· 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トボロ ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： F T Y 2
配列
CTGCTGATGG TGAAGGTGTA GTCGGTACCG CTACCGCT 38 配列番号 ： 6 5
配列の長さ ： 3 7 9
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トボロジ一 ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： R V L b
起源
生物名 ： マ ウ ス及びヒ ト
直接の起源
ク ローン ： H E F— R V L b — g
ア ミ ノ酸 一 1 9 —— 1 : l e a d e r
ア ミ ノ酸 1 一 2 3 : F R 1
ア ミ ノ酸 2 4 — 3 4 : C D R 1
ア ミ ノ酸 3 5 — 4 9 : F R 2
ア ミ ノ酸 5 0 — 5 6 : C D R 2
ア ミ ノ 酸 5 7 — 8 8 : F R 3
ア ミ ノ酸 8 9 — 9 7 : C D R 3 ア ミ ノ 酸 9 8 - 1 0 7 ： F R 4
配列
ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Me t G ly Trp Ser Cys l ie l ie し eu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 - 10 -5
GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
- 1 1 5 10
AGC GTA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT CGA GCA AGC GAG ATT ATT 144 Ser Val G】y Asp Arg Val Thr l ie Thr Cys Arg Ala Ser Glu l ie l ie
15 20 25
TAC AGT TAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly lys Ala Pro し ys 30 35 40 45
CTG CTG ATC TAC AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGA GTG CCA AGC AGA 240 leu Leu He Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser G l y Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr He Ser Ser
65 70 75
CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAT CAT TTT GGT 336 Leu Gin Pro Glu Asp l ie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Phe Gly
80 85 90
TTT CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTC GAA ATC AAA C 379 Phe Pro Arg Thr Phe G ly Gin Gly Thr Lys Val Gl u l ie Lys
95 100 105 配列番号 ： 6 6
配列の長さ ： 1 8
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎮
トボロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： E F 1
配列
CAGACAGTGG TTCAAAGT 18 配列番号 ： 6 7
配列の長さ ： 1 7
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジ一 直鎖状
配列の種類 合成 D N A
配列の名称 H I P
配列
GCCCCAAAGC CAAGGTC 17 配列番号 ： 6 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類 ： 合成 D N A
配列の名称 ： K I P
配列
AACTCAATGC TTTAGGCAAA 20

Claims

. c-
1 . ヒ ト イ ンタ ーロ イ キ ン一 8 ( I L — 8 ) に対するマ ウ スモ ノ ク ローナル抗体の軽鎖 （ L鎖） 可変領域 （ V領域） 。
2 . 配列番号 ： 2 6 に示されるア ミ ノ 酸配列またはその一部を有 する請求項 1 に記載の L鎮 V領域。
3 . ヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体の重鎖 ( H 鎖） V領域。
4 . 配列番号 ： 2 7 に示されるア ミ ノ酸配列またはその一部を有 する請求項 3 に記載の H鎖 V領域。
5 . ヒ ト L鎖定常領域 （ C領域） 、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマ ウスモノ ク ローナル抗体の L鎖 V領域を含んで成るキメ ラ L鎖。
6 . 前記マ ウ ス L鎖 V領域が配列番号 ： 2 6 に示されるア ミ ノ 酸 配列またはその一部を有する請求項 5 に記載のキメ ラ L鎖。
7 . ヒ ト H鎖 C領域、 及びヒ ト I L— 8 に対するマウ スモノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 V領域を含んで成るキヌ ラ H鎮。
8 . 前記マウ ス H鎖 V領域が配列番号 ： 2 7 に示されるア ミ ノ酸 配列ま たはその一部を有する請求項 7 に記載のキ メ ラ H鎖。
9 . ( 1 ) ヒ ト L鎖定常領域 （ C領域） 、 及びヒ ト I L— 8 に対 するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の L鎮 V領域を含んで成る L鎮 ； 並 びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマ ウ スモ ノ ク ローナル抗体の H鎮 V領域を含んで成る H鑌 ；
を含んで成るキメ ラ抗体。
10. 前記マウ ス L鎮 V領域が配列番号 ： 2 6 に示されるア ミ ノ酸 配列またはその一部を有し、 そ して前記マウ ス H鑌 V領域が配列番 号 ： 2 7 に示されるア ミ ノ酸配列またはその一部を有する、 請求項 9 に記載のキ ゾ ラ抗体。
11. ヒ ト I L — 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の L鎖 V領 域の相補性決定領域 （ C D R ) 。
12. 下記並びに配列番号 ： 2 6 に示されるア ミ ノ酸配列またはそ の一部を有する、 請求項 1 1 に記載の C D R。
C D R 1 ； Arg Ala Ser Glu lie lie Tyr Ser Tyr Leu Ala
C D R 2 ； Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
C D R 3 ； Gin His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr
13. ヒ ト I L一 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の H鎮 V領 域の C D R。
14. 下記並びに配列番号 ： 2 7 に示されるァ ミ ノ酸配列またはそ の一部を有する、 請求項 1 3 に記載の C D R。
C D R 1 ； Asp Tyr Tyr Leu Ser
C D R 2 ； Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Ty r Ser Ala Ser Val Lys Gly
C D R 3 ； Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala Tyr
15. ( 1 ) ヒ ト L鎮 V領域のフ レームワーク領域 （ F R ) 、 及び ( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体の L鎮 V 領域の C D R、 を含んで成るヒ ト I L一 8 に対する抗体の再構成 （ r e s h a p e d ) ヒ ト L鎖 V領域。
16. 前記 C D Rが請求項 1 2 に示されるア ミ ノ酸配列またはその —部を有する、 請求項 1 5 に記載の再構成ヒ ト L鑌 V領域。
17. 前記 F Rがヒ ト抗体 R E I に由来する、 請求項 1 5及び 1 6 に記載の再構成ヒ ト L鎖 V領域。
18. 前記 L鎮 V領域が、 表 2 において R V L a又は R V L b と し て示されるァ ミ ノ酸配列またはその一部を有する請求項 1 5 に記載 の再構成ヒ ト L鎖 V領域。
. ： : : ' ヒ ト H ^ Y 域〇 . 及
( 2 ヒ ト I L 一 8 に対するマ ウ スモ ノ ク ロ 一十 ル抗体の H鎖 V 領域の C D R、 を含んで成る、 ヒ ト I L 一 8 に対する抗体の再構成 ヒ ト H鎮 V領域。
20. 前記 C D Rが請求項 1 4 に示されるァ ミ ノ酸配列またはその 一部を有する、 請求項 1 9 に記載の再構成ヒ ト H鎮 V領域。
2】. 前記 F R 1 , 2 , 3がヒ ト抗体 V D H 2 6 に、 および F R 4 が 4 B 4 に由来する、 請求項 1 9及び 2 0 に記載の再構成ヒ ト H鎮 V領域。
22. 前記 H m V領域が、 表 3および表 4 における R V H a , V H t' , R V H c , R V H d , V H e , R V H f , R V H s、 又は R V H h と して示されるア ミ ノ酸配列またはその一部を有する、 請 求項 1 9 に記載の再構成ヒ ト H鎖 V領域。
23. ( 1 ) ヒ ト L鎮 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及び匕 ト I L 一 8 に対するマウ スモノ ク ロ ーナル抗体の L鎖 C D Rを含んで成る L鎖 V領域、 を含んで成る ヒ ト I L 一 8 に対する再構成ヒ ト抗体の L鑌。
24. 前記ヒ ト L鎖 C領域がヒ ト C κ領域であり、 ヒ ト L鎖 F Rが R E I に由来し、 前記 L鎮 C D Rが請求項 1 2 に示されるア ミ ノ酸 配列またはその一部を有する、 請求項 2 3 に記載の再構成ヒ ト抗体 L鎖。
25. 前記 L鎖 V領域が表 2 において R V L a又は R V L b と'して 示されるア ミ ノ 酸配列またはその一部を有する、 請求項 2 3 に記載 の再構成ヒ ト抗体 L鎖。
26. ( 1 ) ヒ ト H鑌 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鎮 V領域、 を含んで成る ヒ ト ； i- 一 s に対する再構成ヒ ト抗体 H ,
27. 前記ヒ ト H鎮 C領域がヒ ト C r 1 領域であり、 前記ヒ ト H鎖 F R 1 , 2 , 3 がヒ ト抗体 V D H 2 6 に、 ヒ ト抗体 F R 4 が 4 B 4 に由来し、 前記 H鎖 C D Rが請求項 1 4 に示されるア ミ ノ 酸配列ま たはその一部を有する、 請求項 2 6 に記載の再構成ヒ ト抗体 Η ί 。
28. 前記 Η鎮 V領域が表 3 および表 4 における R V H a , R V H b , R V H c , R V H d , R V H e , R V H f , R V H g及び R V H h と して示されるア ミ ノ 酸配列またはその一部を有する、 請求項 2 6 に記載の再構成ヒ ト抗体 H鑌。
29. ( A ) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体の L鎖 C D Rを含んで成る L鑌 V領域、 を舍んで成る L 鎖 ； 並びに
( B ) ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L 一 8 に対するマウ スモ ノ ク ロ ーナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鎖 V領域、 を含んで成る H 鎖 ；
を含んで成る ヒ ト I L 一 8 に対する再構成ヒ ト抗体。
30. 前記 L鑌 C D Rが請求項 1 2 に示されるァ ミ ノ酸配列または その一部を有し、 前記 H鑌 C D Rが請求項 1 4 に示されるア ミ ノ 酸 配列ま たはその一部を有する、 請求項 2 9 に記載の再構成ヒ ト抗休
31. 前記 L鑌 C D Rが請求項 1 2 に示されるァ ミ ノ酸配列または その一部を有し、 前記 H鑌 C D Rが請求項 1 4 に示されるア ミ ノ 酸 配列ま たはその一部を有し ； 前記ヒ ト L鎖 F Rがヒ ト抗体 R E 1 に 由来し ； 前記ヒ ト H鎖 F R 1 , 2 , 3 がヒ ト抗体 V D H 2 6 に、 F R 4 がヒ ト抗体 4 B 4 に由来し、 前記ヒ ト L鎮 C領域は ヒ ト C 領 域であ ； ： そ して前記 ヒ ト H ¾ C領域は ヒ ト C 1 領 ある 、 請 求項 2 9 に記載の再構成ヒ ト抗体。
32. 前記 L鎖 C D Rが請求項 1 2 に示されるァ ミ ノ酸配列または その一部を有し、 前記 H鎮 C D Rが請求項 1 4 に示されるア ミ ノ 酸 配列またはその一部を有し ； 前記ヒ ト L鎮 F Rがヒ ト抗体 R E I に 由来し ； 前記ヒ ト H鎖 F R し 2 , 3 がヒ ト抗体 V D H 2 6 に、 F R 4 がヒ ト抗体 4 B 4 に由来し、 前記ヒ ト L鎖 C領域は C κ領域で あり ； そ して前記ヒ ト Η鎖 C領域は C 4 である、 請求項 2 9 に記 載の再構成ヒ ト抗体。
33. 前記し fi V領域が表 2 において R V L a又は R V L b と して 示されるア ミ ノ 酸配列またはその一部を有する、 請求項 2 9 に記載 の再構成ヒ ト抗体。
34. 前記 H鎖 V領域が表 3 および表 4 における R V H a , R V H b , R V H c , R V H d , R V H e , R V H f , R V H g、 又は R V H h と して示されるァ ミ ノ 酸配列またはその一部を有する、 請求 項 2 9 に記載の再構成ヒ ト抗体。
35. ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域 ； 及び
( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の L鎖 V 領域 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L一 8 に対する抗体のキメ ラ L鑌をコー ドす る D N A。
36. 前記 L鎮 V領域が配列番号 ： 2 6 に示されるァ ミ ノ酸配列ま たはその一部をコー ドする、 請求項 3 5 に記載の D N A。
37. 前記 L鎖 V領域が配列番号 ： 2 6 に示されるヌ ク レオチ ド配 列またはその一部を有する請求項 3 5 に記載の D N A。
38. ( 1 ) ヒ ト H镇 C領域 ； 及び
( 2 ) ヒ ト I L — 8 に対するマ ウ スモ ノ ク ローナル抗体の H鎖 V を舎んで成る、 ヒ ト I L 一 8 に対する抗体のキメ ラ H鎖をコー ドす る D N A。
39. 前記 H鎖 V領域が配列番号 ： 2 7 に示されるァ ミ ノ酸配列ま たはその一部をコー ドする、 請求項 3 8 に記載の D N A
， £-7； 1 ·' XI |1
U . Hij 6L U v U ·¾¾ノ ' yしプリ ' ヽ くし ， cJ ゾ' ン 3 .' I' b 列またはその一部を有する請求項 3 8 に記載の D N A
41. ヒ ト I L 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体の L $1 V領 域をコー ドする D N A
42. 前記 L鎖 V領域が配列番号 ： 2 6 に示されるァ ミ ノ酸配列ま たはその一部をコー ドする、 請求項 4 1 に記載の D N A。
43. 前記 L鎖 V領域をコー ドする D N Aが配列番号 ： 2 6 に示さ れるヌ ク レオチ ド配列またはその一部を有する、 請求項 4 1 に記載 の D N A
44. ヒ ト I L 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の H鎮 V領 域をコー ドする D N A
45. 前記 H鎮 V領域が配列番号 ·· 2 7 に示されるァ ミ ノ酸配列ま たはその一部をコー ドする、 請求項 4 4 に記載の D N A
46. 前記 H鎖 V領域をコー ドする D N Aが配列番号 ： 2 7 に示さ れるヌ ク レオチ ド配列またはその一部を有する、 請求項 4 4 に記載 の D N A
47. ヒ ト I L — 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の L鎮 V領 域の C D Rをコー ドする D N A
48. 前記 C D Rが請求項 1 2 に示されるァ ミ ノ酸配列またはその 一部をコー ドする、 請求項 4 7 に記載の C D Rをコー ドする D N A
49. 前記 C D Rが配列番号 ： 2 6 に示されるヌ ク レオチ ド配列ま
1 0 た はそ（- '一部を有 · . 請求1 mマ に記敢 C D Rを コ ー ド る Γ Ν Α
50. ヒ ト I L 8 に対するマ ウ スモ ノ ク ローナル抗体の Η鎖 V領 域の C D Rをコー ドする D N A
51. 前記 C D Rが請求項 1 4 に示されるァ ミ ノ酸配列またはその
r
ョレ ^ 3 ' 、 ·Κ ' iiし * y w
52. 前記 C D Rが配列番号 ： 2 7 に示されるヌ ク レオチ ド配列ま たはその一部を有する、 請求項 5 0 に記載の C D Rをコー ドする D N A。
53. ( 1 ) ヒ ト L鎖 V領域の F R、 及び
( 2 ) ヒ ト I L 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナル抗体の L鑌 V 領域の C D R、 を含んで成る、 ヒ ト I L 8 に対する抗体の再構成 ヒ ト L鎖 V領域をコー ドする D N A
54. 前記 C D Rが請求項 1 2 に示されるァ ミ ノ酸配列またはその 一部を有する、 請求項 5 3 に記載の再構成ヒ ト L鎖 V領域をコー ド する D N A
55. 前記 F Rがヒ ト抗体 R E I に由来する、 請求項 5 3及び 5 4 に記載の再構成ヒ ト L鎮 V領域をコー ドする D N A
56. 前記 L鎮 V領域が表 2 における R V L a 又は R V L b と して 示されるァ ミ ノ酸配列またはその一部をコー ドする、 請求項 5 3 に 記載の D N A
57. 配列番号 ： 6 2又は配列番号 ： 6 5 に示されるヌ ク レオチ ド 配列またはその一部を有する請求項 5 3 に記載の D N A
58. ( 1 ) ヒ ト H鎖 V領域の F R、 及び
( 2 ) ヒ ト I L 8 に対するマウ スモノ ク ローナル抗体の H鎖 V 領域の C D R、 を舎んで成る、 ヒ ト I L — 8 に対する抗体の再構成 ヒ ト H鎮 V領域をコー ドする D N A
59. 前記 C D Rが請求項 1 4 に示される ： ノ 酸配列また： tそ —部を有する、 請求項 5 8 に記載の再構成ヒ ト H鎮 V領域をコー ド する D N A
60. 前記 F R 1 , 2 , 3 がヒ ト抗体 V D H 2 6 に、 並びに F R 4 がヒ ト抗体 4 B 4 に由来する、 請求項 5 8及び 5 9 に記載の再構成 li ϊ , V pjj J¾ '<£ [ i ¾J
61. H鎖 V領域が表 3 および表 4 における R V H a . R V H b , R V H c , R V H d , R V H e , R V H f , R V H g、 又は R V H h と して示されるア ミ ノ酸配列またはその一部をコー ドする、 請求 項 5 8 に記載の再構成ヒ ト H鎖 V領域をコー ドする D N A
62. 配列番号 ： 3 8 , 4 1 , 4 4 , 4 5 , 4 8 , 5 1 , 5 4 ·、 又 は、 5 5 に示されるヌ ク レオチ ド配列またはその一部を有する、 請 求項 4 8 に記載の D N Αβ
63. ( 1 ) ヒ ト L鎮 C領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト F R、 及びヒ ト I L — 8 に対するマウ スモ ノ ク ローナ ル抗体の C D Rを含んで成る L鎖 V領域 ；
を含んで成る ヒ ト I L一 8 に対する抗体の再構成ヒ ト L鑌をコー ド する D N A
64. 前記 L鎖 V領域が表 2 における R V L a又は R V L b と して 示されるア ミ ノ酸配列またはその一部をコー ドする、 請求項 6 3 に 記載の D N A
65. 前記 L鎖 V領域が配列番号 ： 6 2又は配列番号 ： 6 5 に示さ れるヌ ク レオチ ド配列またはその一部を有する請求項 6 3 に記載の D N A
66. 前記ヒ ト L鎖 C領域がヒ ト L鎮 C X領域である請求項 6 3 , 6 4 , 6 5 に記載の D N A
67. ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域 ； 並びに ( 2 ) ヒ ト F Γ 、 及ひ' ヒ ト 1 L 一 S ：こ ¾す る マ ウ ス モ ノ ク 匚'一 ル抗体の C D Rを含んで成る Η鎖 V領域 ：
を含んで成る ヒ ト I L — 8 に対する抗体の再構成ヒ ト Η鎮をコー ド する D N A。
68. H鎮 V領域が表 3 および表 4 における R V H a , R V H b , H V H c , V H l , V H e , R v H i , R V H g 、 又は R V h と して示されるア ミ ノ酸配列またはその一部をコー ドする、 請求 項 6 7 に記載の再構成ヒ ト H鎮をコー ドする D N A。
69. 前記 H鎖 V領域が配列番号 ： 3 8 , 4 1 , 4 4 , 4 5 , 4 8 , 5 1 , 5 4 、 又は、 5 5 に示されるヌ ク レオ チ ド配列またはその 一部を有する請求項 6 7 に記載の D N A。
70. 前記ヒ ト H鎮 C領域がヒ ト H鎖 C r 1 領域である請求項 6 7 , 6 8 , 6 9 に記載の D N A。
71. 前記ヒ ト H鎮 C領域がヒ ト H鎖 C r 4領域である請求項 6 7 , 6 8 , 6 9 に記載の D N A。
72. 請求項 3 5 ， 3 6 , 3 7 , 3 8 , 3 9 , 4 0 , 6 3 , 6 4 , 6 5 , 6 6 , 6 7 , 6 8 , 6 9 , 7 0及び 7 1 のいずれか 1 項に記 載の D N Aを含んで成るベクター。
73. 請求項 7 2 に記載のベクターにより形 S転換された宿主細胞
74. ヒ ト I L 一 8 に対するキメ ラ抗体の製造方法であって、 請求 項 3 5 , 3 6 , 3 7 のいずれか 1 項に記載の D N Aを舎んで成る発 現ベクター及び請求項 3 8 , 3 9 , 4 0 のいずれか 1 項に記載の D N Aを含んで成る発現ベクターにより 同時形質転換された宿主細胞 を培養し、 そ して目的とする抗体を回収する、 段階を含んで成る方 法。
75. ヒ ト I L — 8 に対するキメ ラ抗体の製造方法であって、 請求 項 3 3 6及び 3 7 Oいずれか I 項に記載の D N ARひ'請求項？ 8 , 3 9 : 4 0 のいずれか 1 項に記載の D N Aを舍んでなる発現べ クタ一によ り形質転換された宿主細胞を培養し、 そ して目的とする 抗体を回収する、 段階を含んで成る方法。
76. ヒ ト I L一 8 に対する再構成ヒ ト抗体の製造方法であって、 請求項 b 3 , 6 4 , 6 5 , 6 6 い s ή 7、 i に iiC の D '、 A -2： a んで成る発現ベクター及び請求項 6 7 , 6 8 , 6 9 ' 7 0及び 7 1 のいずれか 1 項に記載の D N Aを含んで成る発現ベクターにより同 時形質転換された宿主細胞を培養し、 そして目的とする抗体を回収 する、 段階を含んで成る方法。
77. ヒ ト I L一 8 に対する再構成ヒ ト抗体の製造方法であって、 請求項 6 3 , 6 4 , 6 5及び 6 6 のいずれか 1 項に記載の D N A及 び請求項 6 7 , 6 8 , 6 9 , 7 0 , 7 1 のいずれか 1 項に記載の D Ν Αを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培 養し、 そして目的とする抗体を回収する、 段階を含んで成る方法。
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